Artykuł metodologiczny

Detekcja metaboliczna w czasie rzeczywistym w żywych komórkach przy użyciu hiperpolaryzowanego 13C NMR

DOI:

10.3791/68539

⸱

8 lipca 2025

 ,  ,  ,  , 
1Institute for Quantum Life Science, National Institutes for Quantum Science and Technology, 2Institute of Pure and Applied Sciences, University of Tsukuba, 3Department of Applied Biological Chemistry, Graduate School of Agriculture, Osaka Metropolitan University, 4Center of Quantum Life Science for Structural Therapeutics (cQUEST), Chiba University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten integruje niestandardowy system bioreaktora z hiperspolaryzowaną spektroskopią NMR ¹³C w celu pomiaru metabolizmu pirogronianu w czasie rzeczywistym w żywych komórkach, poprawiając odtwarzalność i dokładność kinetyczną w badaniach metabolicznych i badaniach przesiewowych leków.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W protokole przedstawiono metodę integracji zbudowanego we własnym zakresie systemu bioreaktora ze spektroskopią hiperspolaryzowanego 13-stopniowegomagnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) w celu pomiaru metabolizmu pirogronianu w żywych komórkach w czasie rzeczywistym. Protokół nakreśla budowę systemu bioreaktora, który umożliwia precyzyjne określenie czasu wstrzykiwania hiperspolaryzowanego substratu i akwizycji sygnału NMR przy jednoczesnym utrzymaniu stabilnego środowiska hodowli komórkowej. Metoda ta niezawodnie wykrywa metaboliczną przemianę pirogronianu w mleczan w ciągu 60 sekund pomiaru, zachowując przy tym wystarczający stosunek sygnału do szumu w całym procesie. Możliwość mieszania in situ systemu przyspiesza wykrywanie sygnału NMR i zmniejsza straty relaksacyjne T1. Protokół zawiera również szczegółowe instrukcje dotyczące przygotowania żeli alginianowych do kapsułkowania komórek i umieszczania ich w bioreaktorze. Proponowana metoda wykazuje lepszą odtwarzalność i dokładność kinetyczną w porównaniu z metodami konwencjonalnymi, co wskazuje na potencjalne zastosowania w badaniach nad metabolizmem nowotworów i badaniach przesiewowych leków. Dalsze udoskonalenia systemu, takie jak przyjęcie alternatywnych matryc żelowych, mogą zwiększyć jego wszechstronność w różnych badaniach biologicznych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hiperpolaryzowany NMR, szczególnie poprzez dynamiczną polaryzację jądrową (DNP), znacznie zwiększa intensywność sygnału NMR1 i umożliwia śledzenie zmian metabolicznych w czasie rzeczywistym ze znacznie lepszą czułością 2,3. Technika ta została z powodzeniem zastosowana w różnych systemach biologicznych, w tym drożdżach 4,5, modelach komórek rakowych 6,7,8 i mikroorganizmach 9,10. Jest również używany do monitorowania kluczowych szlaków metabolicznych, takich jak glikoliza11,12, homeostaza redoks13,14 i regulacja pH15,16. Poza badaniami podstawowymi, hiperpolaryzowany NMR jest obecnie wykorzystywany w obrazowaniu klinicznym za pomocą MRI, umożliwiając ocenę metaboliczną od skali komórkowej do skali całego ciała17. Osiągnięcia te podkreślają rosnące zapotrzebowanie na dostępne protokoły, które ułatwiają szersze zastosowanie hiperspolaryzowanego NMR w różnych kontekstach biologicznych.

Pomimo swojej wszechstronności, implementacja pomiarów metabolicznych w czasie rzeczywistym w żywych komórkach za pomocą hiperspolaryzowanego NMR pozostaje wyzwaniem technicznym. Konwencjonalne systemy często opierają się na złożonych, specyficznych dla laboratorium konfiguracjach, które nie są odtwarzalne i są trudne do obsługi bez rozległej wiedzy specjalistycznej 8,18,19,20. Stanowi to poważną barierę dla naukowców dążących do zastosowania tej technologii w badaniach biologicznych lub translacyjnych. W porównaniu z alternatywnymi metodami, takimi jak obrazowanie optyczne lub spektrometria mas, hiperpolaryzowany 13C NMR umożliwia nieinwazyjne, czasowo-rozdzielcze monitorowanie określonych reakcji metabolicznych bez destrukcyjnego pobierania próbek. Dostarcza bezpośrednich informacji biochemicznych z czasową precyzją, dzięki czemu doskonale nadaje się do dynamicznych badań metabolizmu komórkowego.

Aby rozwiązać te problemy, w badaniu przedstawiono praktyczny i powtarzalny protokół specjalnie zaprojektowany, aby umożliwić naukowcom wykonywanie hiperpolaryzowanych pomiarów NMR metabolizmu żywych komórek przy minimalnych przeszkodach technicznych. Opisano kompleksową metodę podstawowego pomiaru metabolizmu pirogronianu w żywych komórkach. Chociaż protokół ten można zastosować do innych 13sond znakowanych C, pirogronian jest szczególnie odpowiedni ze względu na szybki wychwyt komórkowy, dobrze scharakteryzowane szlaki metaboliczne i centralną rolę w metabolizmie komórkowym. Procedura składa się z: (i) przygotowania próbek komórek, (ii) enkapsulacji w żelach alginianowych, (iii) hiperpolaryzacji przy użyciu polaryzatora DNP oraz (iv) pomiaru 13C NMR w czasie rzeczywistym w spektrometrze 400 MHz (rysunek 1). Ponadto podano kluczowe parametry do budowy systemu bioreaktora, aby zapewnić odtwarzalność i kompatybilność ze standardowym sprzętem NMR. Protokół jest zoptymalizowany pod kątem łatwości wdrożenia przy użyciu dostępnych na rynku komponentów i ma na celu pomóc badaczom, zwłaszcza tym początkującym w tej technice, określić jej przydatność dla ich potrzeb eksperymentalnych.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Konfiguracja bioreaktora (rysunek 2A-B)

  1. Montaż rurki NMR
    1. Do wprowadzenia rurki NMR należy użyć zakręcanej rurki NMR (średnica 10 mm, długość 178 mm) z otwartą nasadką.
    2. Przygotować przegrodę w fiolce z silikonem/PTFE (o średnicy 9 mm) i włożyć przez nią rurkę PEEK w celu szczelnego uszczelnienia (rysunek uzupełniający 1).
    3. Włóż przegrodę z chemoodporną rurką PEEK (średnica wewnętrzna 1,0 mm, średnica zewnętrzna 1,6 mm, grubość ścianki 0,3 mm, długość 1 m) do otworu zmodyfikowanej nasadki.
    4. Umieść przegrodę między rurką NMR a jej otwartą nasadką i zabezpiecz ją, mocno zamykając nasadkę. Ta konfiguracja utrzymuje przegrodę na miejscu i zapewnia wystarczające uszczelnienie, aby zapobiec wyciekowi podczas perfuzji lub wstrzyknięcia.
  2. Ustawianie rurki doprowadzającej medium (Rysunek 2C)
    1. Podłącz rurkę PEEK do portów wlotowych i wylotowych rurki NMR, aby umożliwić ciągłą perfuzję. Zabezpiecz połączenia za pomocą zestawu złączek bezkołnierzowych, aby zapobiec wyciekom.
  3. Instalowanie elementów ocieplających medium
    1. Podłącz rurkę PEEK do pompy perystaltycznej regulowanej do stabilnego natężenia przepływu około 0,2 ml/min, zapewniając ciągłą cyrkulację medium za pośrednictwem zewnętrznego zestawu cyrkulacyjnego. Umieścić zbiornik pożywki w łaźni wodnej ustawionej na 37 °C, aby utrzymać temperaturę.
  4. Dodawanie składnika zapobiegającego wyciekom żelu
    1. Wytnij gęstą gąbkę, aby pasowała do średnicy rurki NMR. Włóż gąbkę do dna tuby, aby zapobiec wyciekowi żelu alginianowego, umożliwiając jednocześnie przepływ medium.
  5. Produkcja i włożenie wydrukowanego w 3D elementu mocującego gąbkę (Rysunek 2D-F)
    1. Drukuj 3D cylindryczny uchwyt (średnica zewnętrzna 9,1 mm, długość 20 mm, z centralnym otworem o średnicy 1,5 mm) przy użyciu żywicy fotopolimerowej kompatybilnej ze stereolitograficznym drukiem 3D. Specyfikacje projektowe znajdują się w załączonym pliku uzupełniającym 1.
    2. Włóż kapilarę ze szkła borokrzemianowego (średnica zewnętrzna 1.5 mm, średnica wewnętrzna około 0.9 mm, długość 90 mm) przez wstępnie uformowany otwór uchwytu wydrukowanego w 3D.
    3. Przymocuj gąbkę do platformy na uchwycie za pomocą żywicy utwardzanej promieniami UV o właściwościach wodoodpornych. Utwardzaj przez 30 s w świetle UV, aby zapewnić zestalenie.
    4. Włóż zmontowany uchwyt z gąbką do probówki NMR.

2. Przygotowanie komórek (rozpocznij 2 tygodnie przed pomiarem)

  1. Szybko rozmrozić zamrożone zasoby komórkowe (SCCVII lub HeLa) w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Przenieś około 1 × 106 komórek do 10 ml pożywki RPMI-1640 uzupełnionej 10% (v/v) płodowej surowicy bydlęcej i 1% (v/v) penicyliny-streptomycyny.
  2. Hoduj komórki w temperaturze 37 °C z 5% CO2 i pasuj je co 2-3 dni po osiągnięciu 70%-80% konfluencji. Kontynuuj hodowlę przez około 2 tygodnie, aby uzyskać ~4 x 107 komórek, oszacowanych z pięciu 10 cm szalek wyhodowanych do około 90% zbiegu (każda daje ~8 x 106 komórek).

3. Przygotowanie żelu alginianowego

  1. Przygotowanie roztworu alginianu
    1. Rozpuść proszek alginianu sodu klasy biologicznej w wodzie dejonizowanej, aby przygotować 2% (w/v) roztwór. Roztwór inkubować przez noc w temperaturze 25 °C lub wyższej, delikatnie mieszając od końca do końca. Użyj rotatora rurkowego ustawionego na około 10-20 obr./min, aby zapobiec powstawaniu pęcherzyków i zapewnić równomierne rozpuszczenie.
  2. Enkapsulacja komórek w żelu alginianowym
    1. Dodaj 2 ml 0,25% (v/v) trypsyny-EDTA do 10 cm naczynia. Przechyl naczynie, aby pokryć całą powierzchnię i odessać nadmiar trypsyny-EDTA.
    2. Inkubować naczynie w temperaturze 37 °C przez 2 minuty.
    3. Dodaj 10 ml pożywki hodowlanej do naczynia. Delikatnie pipetuj w górę i w dół, aby odłączyć komórki. Zebrać całą zawiesinę komórek do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
    4. Pobrać około 10 μl zawiesiny i policzyć liczbę komórek za pomocą licznika komórek. Zazwyczaj do kolejnych zabiegów potrzeba około 1 ×10 7 komórek, ale rzeczywista liczba powinna zostać potwierdzona pomiarem.
    5. Odwirować pozostałą zawiesinę komórkową o stężeniu 120 × g przez 5 minut. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 4 ml 2% (m/v) roztworu alginianu. Pipetować powoli, aby zminimalizować powstawanie pęcherzyków.
  3. Tworzenie żelu przez sieciowanie wapniem (ryc. 3)
    1. Dodać 10 ml 50 mM roztworu CaCl2 do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml (ryc. 3A).
    2. Pobrać 300 μl mieszaniny komórek i alginianów do strzykawki o pojemności 0,5 ml wyposażonej w igłę 30 g o długości 10 mm i przymocować ją do nasadki probówki wirówkowej (ryc. 3B).
    3. Zamknąć szczelnie nakrętkę probówki wirówkowej przymocowaną do niej strzykawką i delikatnie odwirować cały zestaw pod ciśnieniem 200 × g przez 5 minut. Po odwirowaniu usunąć roztwór supernatantu i ponownie zawiesić żel obciążony komórkami w pożywce (Rysunek 3C-D).
  4. Ładowanie żelu do probówki NMR
    1. Przenieś żel otoczony komórkami do probówki NMR za pomocą pipety Pasteura. Włóż uchwyt gąbki i upewnij się, że jest szczelnie zamknięty.
    2. Zbiornik pożywki (zawierający 5% (v/v) D2O) przygotowany w kroku 1.3.2 w łaźni wodnej należy wstępnie ogrzać do temperatury 37 °C i wprowadzić go w cyrkulację z szybkością około 500 μl/h w celu ustabilizowania warunków.
    3. Upewnij się, że nie ma wycieków przed włożeniem rurki NMR do magnesu. Trzymając rurkę PEEK prosto, włóż rurkę NMR do magnesu. Dostosuj rozmiar żelu, liczbę kulek i prędkość pipetowania w zależności od typu komórki i wymagań eksperymentalnych.

4. Przygotowanie sondy hiperpolaryzacyjnej za pomocą polaryzatora DNP (rysunek 4)

  1. Przygotowanie fiolki z próbką
    1. Dodać 18 μl [1-13C] kwasu pirogronowego (14,2 M) domieszkowanego 25 mM OX063 do fiolki z próbką. Podłączyć fiolkę do ścieżki płynu systemu polaryzacyjnego DNP.
  2. Polaryzacja próbki
    1. Umieścić fiolkę w zespole otworu polaryzatora DNP (6.7 T, 1.25 K, 1.2 mbar). Stosować promieniowanie mikrofalowe o częstotliwości około 188 GHz (22 mW) przez 60-80 minut.
  3. Monitorowanie sygnału podczas polaryzacji
    1. Użyj półprzewodnikowego spektrometru NMR wbudowanego w system DNP, aby monitorować natężenie sygnału 13C. Nagrywaj dane sygnału co 5 minut za pomocą oprogramowania NMR (SPINit).
  4. Rozpuść i przygotuj hiperspolaryzowany roztwór
    1. Szybko rozpuścić spolaryzowaną próbkę w 3,2 ml podgrzanego buforu do rozpuszczania (40 mM Tris, 50 mM NaCl, 80 mM NaOH, 100 mg/L EDTA). Upewnij się, że roztwór osiąga temperaturę biologiczną (308-313 K, pH ~ 7) przed przekazaniem do pomiaru NMR.
      UWAGA: Zachowaj ostrożność podczas obchodzenia się z komponentami wysokociśnieniowymi. Podgrzej wstępnie bufor do rozpuszczania do temperatury ~461 K, aby zapewnić wydajny transfer i integralność próbki.

5. Konfiguracja NMR

  1. Przygotowanie spektrometru NMR
    1. Załaduj próbkę do probówki NMR i włóż ją do spektrometru.
    2. Wykonuj blokowanie, dostrajanie, dopasowywanie i podkładkowanie na konsoli NMR przy użyciu zautomatyzowanej procedury z wstawioną próbką, aby zoptymalizować rozdzielczość spektralną i stabilność sygnału.
  2. Ustawianie parametrów akwizycji
    1. Załaduj sekwencję impulsów 13C (np. zg2d) z włączonym odsprzęganiem protonów (np. 13-CPD).
    2. Ustaw kąt odwrócenia na 90° za pomocą impulsu 1 μs (P1). Ustaw czas akwizycji na 1,376 s, szerokość widmową na 23 663 Hz, a liczbę punktów akwizycji (TD) na 65 536. Ustaw opóźnienie relaksacji (D1) na 0 s.
    3. Ustaw liczbę przyrostów czasu (TD1) na 150, aby uzyskać 150 widm sekwencyjnych w trybie pseudo-2D. Dostosuj wzmocnienie odbiornika do niskiej wartości (np. ~1), aby uniknąć nasycenia sygnału z hiperspolaryzowanych próbek.
      UWAGA: Ze względu na wysokie natężenie sygnału hiperpolaryzowanego NMR, ustaw wzmocnienie odbiornika na niską wartość (np. ~1), co zwykle odpowiada mniej niż 1% maksymalnego dostępnego wzmocnienia. Wzmocnienie odbiornika jest wewnętrznym, niejednostkowym parametrem, który steruje wzmocnieniem sygnału. Zbyt wysokie wartości mogą spowodować nasycenie sygnału.

6. Pomiar NMR

  1. Przygotowanie do pomiaru
    1. Napełnij całą ścieżkę rurki wlotowej od rurki wlotowej do rurki NMR buforem do rozpuszczania, aby uniknąć uwięzienia powietrza (Rysunek 2B). Rurka wlotowa służy zarówno do wstrzykiwania sondy o średniej perfuzji, jak i hiperpolaryzacji.
    2. Dokładnie sprawdź, czy w rurce wlotowej lub wewnątrz rurki NMR nie ma pęcherzyków powietrza, ponieważ pęcherzyki w tym obszarze mogą zakłócać akwizycję sygnału podczas pomiarów NMR.
  2. Preparat do wstrzykiwania roztworu hiperpolaryzacyjnego
    1. Zatrzymać pompę perystaltyczną, aby tymczasowo zatrzymać krążenie medium przed wstrzyknięciem hiperspolaryzowanego roztworu przez rurkę wlotową.
    2. Rozpocznij akwizycję widmową około 10 s przed rozpuszczeniem hiperspolaryzowanego substratu, aby upewnić się, że sygnał zostanie przechwycony natychmiast po przybyciu do miejsca detekcji NMR po wstrzyknięciu.
    3. Pobrać 1 ml roztworu za pomocą strzykawki, gdy wychodzi z polaryzatora DNP.
  3. Wstrzyknięcie roztworu hiperpolaryzacyjnego i potwierdzenie sygnału
    1. Przełącz zawór trójdrogowy na wlocie bioreaktora do pozycji B, aby wstrzyknąć hiperspolaryzowany roztwór do probówki NMR.
    2. Po wstrzyknięciu przestawić zawór z powrotem do pozycji A, aby wznowić cyrkulację medium i zapobiec przepływowi wstecznemu.
    3. Potwierdź pomyślne wstrzyknięcie i przybycie substratu, obserwując wzrost sygnału zaniku swobodnej indukcji (FID) w oprogramowaniu do akwizycji.

7. Przetwarzanie i analiza danych

  1. Przetwarzanie danych spektralnych
    1. Załaduj czasowo rozdzielcze widmo NMR do oprogramowania do przetwarzania danych. Jeśli dane są przechowywane w formacie pliku ser, zlokalizuj i załaduj odpowiedni plik.
  2. Analiza widm
    1. Wykonaj transformację Fouriera (FT), aby przekonwertować surowy FID na dziedzinę częstotliwości. Zastosuj korekcję fazy ręcznie lub automatycznie. Przeprowadzić korekcję linii bazowej, aby usunąć zniekształcenia.
  3. Wizualizacja przemiany metabolitów
    1. Wykreśl sygnały przebiegu w czasie dla pirogronianu C1 (~171 ppm) i mleczanu C1 (~183 ppm).
  4. Kwantyfikacja przemian metabolicznych
    1. Obliczyć pole pod krzywą (AUC) dla pików pirogronianu i mleczanu.
    2. Określić stosunek [mleczanu]/[pirogronianu], dzieląc AUC mleczanu przez AUC pirogronianu.
      UWAGA: AUC jest używany zamiast wysokości piku, aby zminimalizować wpływ artefaktów dzwonienia spowodowanych dużym hiperspolaryzowanym sygnałem pirogronianowym [1-¹³C]. Wartości AUC uzyskuje się przez proste zsumowanie natężeń sygnału w zdefiniowanym zakresie całkowania dla każdego piku.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym badaniu sfabrykowany system sprzężono z hiperspolaryzowaną spektroskopią 13C NMR w celu zmierzenia metabolizmu pirogronianu w żywych komórkach w czasie rzeczywistym. Główne sygnały wykryte w widmie 1D 13C NMR odpowiadały pirogronianowi (około 171 ppm) i mleczanowi (około 183 ppm)21, co pozwoliło nam ocenić metaboliczną konwersję pirogronianu do mleczanu w warunkach fizjologicznych (ryc. 4).

Jakość spektralna i dynamika sygnału
Reprezentatywne wyniki wielokrotnych pomiarów na tej samej próbce przy użyciu komórek SCCVII - linii raka płaskonabłonkowego myszy często używanej w hiperspolaryzowanych badaniach MRI - przedstawiono na rycinie 5. Pierwszy pomiar wykazał wyraźny wzrost sygnału mleczanowego, co wskazuje na aktywną konwersję metaboliczną. Jednak kolejne pomiary wykonywane w odstępach 1,5 h wykazały postępujący spadek aktywności metabolicznej. Ta zależna od czasu redukcja prawdopodobnie odzwierciedla stres biologiczny lub adaptację wywołaną przez początkowe wstrzyknięcie pirogronianu. Warto zauważyć, że podobną przejściową modulację metaboliczną odnotowano in vivo przy użyciu hiperspolaryzowanego MRI i EPRI, gdzie natlenienie guza tymczasowo zmniejszyło się po podaniu pirogronianu22. Wyniki te pokazują, że powtarzalność tych pomiarów umożliwia nieniszczące śledzenie dynamicznych zmian metabolicznych – zaleta, która jest trudna do osiągnięcia przy użyciu metod destrukcyjnych23.

Aby ocenić możliwość zastosowania tego protokołu do innych typów komórek, przeprowadzono dodatkowe pomiary przy użyciu komórek HeLa, szeroko stosowanej ludzkiej linii komórek nowotworowych. Jak pokazano na rysunku 6, komórki HeLa wykazywały również wyraźną konwersję pirogronianu do mleczanu. Chociaż intensywność sygnału stopniowo zmniejszała się z powodu relaksacji T1, stosunek sygnału do szumu pozostał wystarczający przez cały okres akwizycji 60 s. Odkrycia te sugerują, że obecny protokół ma szerokie zastosowanie i może służyć jako wszechstronne narzędzie do profilowania metabolicznego w czasie rzeczywistym w różnych typach komórek.

Podczas gdy szybki zanik sygnału jest nieodłącznym ograniczeniem NMR opartego na DNP, nasz system mieszania in situ minimalizuje opóźnienie między rozpuszczeniem a pomiarem, zwiększając w ten sposób czułość wykrywania. Dalsze udoskonalenia, takie jak optymalizacja składu matrycy żelowej, mogą rozszerzyć możliwości zastosowania tej metody do szerszego zakresu systemów biologicznych.

figure-results-1
Rysunek 1: Schemat ideowy ogólnego przepływu pracy od hodowli komórkowej do hiperspolaryzowanego pomiaru NMR. Proces rozpoczyna się od hodowli komórkowej (~2 tygodnie), a następnie przygotowania żelu alginianowego (~60 min) w celu kapsułkowania komórek w celu stabilnego pomiaru. Następnie przeprowadza się hiperpolaryzację za pomocą systemu polaryzatora DNP (~60 min), a pomiar NMR za pomocą spektrometru NMR 400 MHz (~5 min). Zdjęcia po prawej stronie pokazują odpowiednie instrumenty używane w tym przepływie pracy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Konfiguracja bioreaktora do pomiaru hiperpolaryzacji NMR. (A) Schemat ideowy konfiguracji bioreaktora. Pożywka hodowlana jest wprowadzana do probówki NMR przez wlot A, a następnie kierowana do odpadów. Koraliki alginianowe zawierające żywe komórki umieszcza się w probówce NMR. Podczas hiperpolaryzowanych pomiarów NMR sonda hiperpolaryzowana jest wstrzykiwana przez wlot B, oznaczony jako wlot sondy hiperpolaryzowanej. (B) Zdjęcie całego zestawu bioreaktora, z wyraźnie oznakowanymi rurkami dolotowymi i wylotowymi. (C) Zbliżenie przełącznika rurki wlotowej, pokazujące wlot A (średnia perfuzja) i wlot B (wtrysk sondy hiperpolaryzacyjnej). (D) projekt CAD i (E) reprezentatywne zdjęcie wydrukowanego w 3D elementu mocującego gąbkę umieszczonego wewnątrz probówki NMR. Komponent zawiera otwór do prowadzenia szklanej kapilary, która dostarcza hiperspolaryzowany roztwór substratu oraz platformę do trzymania gąbki. Sam komponent nie przylega ściśle do wewnętrznej ścianki rurki NMR; (F) zamiast tego wkłada się wokół niego gąbkę, aby wypełnić lukę. Taka struktura stabilizuje element i umożliwia przepływ medium odpadowego w górę przez gąbkę, eliminując potrzebę stosowania dodatkowego otworu wylotowego. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rycina 3: Przygotowanie żelu alginianowego. (A) Schematyczna ilustracja oraz (B) fotografia aparatu do formowania kulek żelu alginianowego. Zdjęcie po lewej stronie pokazuje całą konfigurację, w tym probówkę wirówkową ze strzykawką przymocowaną do zmodyfikowanej pokrywy. Ilustracja w prawym górnym rogu przedstawia pokrywkę z małym otworem na końcówkę strzykawki, podczas gdy ilustracja w prawym dolnym rogu przedstawia pokrywkę z kwadratowym otworem zapewniającym stabilne ustawienie strzykawki. Probówka wirówkowa jest wstępnie napełniona 10 ml roztworu chlorku wapnia, dzięki czemu roztwór alginianu wychodzący z końcówki strzykawki ulega żelowaniu, tworząc kulki żelu alginianowego. (C) Reprezentatywny obraz mikroskopowy przedstawiający morfologię kulek żelu alginianowego. (D) Reprezentatywny obraz mikroskopowy przedstawiający morfologię kulek żelu alginianowego zawierających komórki HeLa. Podziałka = 200 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Schematyczne przedstawienie etapów przygotowania do pomiaru NMR i hiperpolaryzacji. Podczas ~60-minutowego procesu narastania DNP konfiguracja NMR jest wykonywana równolegle, aby zminimalizować opóźnienia. Przygotowanie obejmuje załadowanie kulki alginianowej do probówki NMR, a następnie regulację blokady 1H, podkładkowanie i strojenie sondy, aby zapewnić, że system jest gotowy do natychmiastowego pomiaru. Po rozpuszczeniu i zmieszaniu in situ , czasoworozdzielcza spektroskopia 13C NMR ujawnia wyraźne piki pirogronianu i mleczanu. Piki obserwowane przy około 171 ppm, 179 ppm i 183 ppm odpowiadają odpowiednio pirogronianowi, hydratowi pirogronianu i mleczanowi. Do pomiaru NMR użyto około 4 × 107 komórek HeLa zamkniętych w żelu alginianowym. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 5: Czasowo-rozdzielcze wykrywanie sygnałów pirogronianu i mleczanu w powtarzanych pomiarach. Hiperspolaryzowane widma 13C NMR tej samej próbki zamkniętej w komórkach SCCVII uzyskano w odstępach 1,5 godziny w celu oceny wykonalności powtarzających się pomiarów nieniszczących. Szczytowe intensywności pirogronianu (otwarte okręgi) i mleczanu (wypełnione okręgi, skalowane o 1000×) są wykreślane w czasie dla każdej akwizycji. (A) Pierwszy pomiar. (B) Drugi pomiar, po 1,5 h, ujawnia wyraźne zmniejszenie produkcji mleczanu. (C) Trzeci pomiar, po kolejnych 1,5 godzinach, potwierdził utrzymującą się niską aktywność metaboliczną. Analiza ilościowa oparta na polu pod krzywą (AUC) wykazała, że stosunek [mleczanu]/[pirogronianu] zmniejszył się z 0,00134 (pierwszy pomiar) do 0,00019 (drugi) i 0,00027 (trzeci). Końcowe stężenie komórek w żelu alginianowym wynosiło około 1,0 × 107 komórek/ml (4 × 107 komórek w 4 ml). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-6
Rycina 6: Konwersja pirogronianu do mleczanu w komórkach HeLa. Hiperspolaryzowane sygnały 13C NMR pirogronianu i mleczanu mierzono w czasie w żywych komórkach HeLa. Natężenie sygnału pirogronianowego jest normalizowane do maksymalnej wartości w czasie zero. Intensywność sygnału mleczanu jest skalowana przez współczynnik 103 w celu zapewnienia widoczności. Analiza ilościowa oparta na polu pod krzywą (AUC) wykazała stosunek [mleczanu]/[pirogronianu] wynoszący 0,00121. Końcowe stężenie komórek w żelu alginianowym wynosiło około 7,5 × 106 komórek/ml (3 × 107 komórek w 4 ml). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek uzupełniający 1. Reprezentatywne obrazy przegrody fiolki używanej w systemie bioreaktora. (A) Przegroda silikonowa/PTFE (średnica 9 mm) przed użyciem. (B) Ta sama przegroda w rzeczywistym użyciu, z rurką PEEK wprowadzoną przez przebite otwory. Elastyczność materiału przegrody pozwala na ponowne uszczelnienie wokół rurki, utrzymując hermetyczne warunki podczas wstrzykiwania hiperspolaryzowanego substratu. Kliknij tutaj, aby pobrać ten rysunek

Rysunek uzupełniający 2: Rozdzielcze w czasie hiperspolaryzowane widmo 13C NMR uzyskane po mieszaniu zewnętrznym. Reprezentatywne czasowo-rozdzielcze spektrum metabolizmu pirogronianu [1-13C] mierzone za pomocą laboratoryjnego systemu NMR po zewnętrznym zmieszaniu hiperspolaryzowanego pirogronianu i komórek znajdujących się na zewnątrz probówki NMR. Kliknij tutaj, aby pobrać ten rysunek

Plik uzupełniający 1: Projekt CAD uchwytu cylindrycznego. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Krytyczne etapy protokołu
Sukces tego protokołu zależy od kilku krytycznych kroków. Po pierwsze, ważne jest, aby zapewnić prawidłowe rozpuszczenie i przeniesienie hiperspolaryzowanego pirogronianu 13C, aby utrzymać wysoki stosunek sygnału do szumu. Aby uchwycić wczesną metaboliczną konwersję pirogronianu do mleczanu, czas wstrzyknięcia sondy hiperpolaryzacyjnej i akwizycji NMR muszą być zsynchronizowane. Ponadto ważne jest, aby utrzymać żywotność komórek przez cały czas trwania eksperymentu. Odchylenia od tych parametrów mogą skutkować zmniejszoną aktywnością metaboliczną i utratą sygnału.

Modyfikacje i rozwiązywanie problemów z metodą
Chociaż protokół ten zapewnia solidne podejście do monitorowania metabolizmu w czasie rzeczywistym, pewne modyfikacje mogą poprawić jego zastosowanie. Na przykład dostosowanie kąta odwrócenia akwizycji NMR może zrównoważyć intensywność sygnału i zanik polaryzacji w celu optymalizacji gromadzenia danych. Ponadto, chociaż wprowadzono metodę stabilnego przygotowywania żeli alginianowych o określonej wielkości, rozmiar żeli, które mają zostać utworzone, można łatwo dostosować, wybierając strzykawkę lub igłę. Może to przyczynić się do odtworzenia środowiska hipoksyjnego24 , a także zapobiec ucieczce komórek z rurki NMR. Ponadto żel alginianowy staje się gęsty i lepki wewnątrz probówki NMR, szczególnie w obszarze pomiaru NMR. Jeśli powietrze dostanie się do środka podczas wstrzykiwania pożywki hodowlanej lub sondy hiperpolaryzacyjnej z rurki PEEK, prawdopodobnie pozostanie w miejscu pomiaru NMR, co doprowadzi do obniżenia jakości widma.

Ograniczenia metody
Chociaż pomiary hiperpolaryzacyjne mają tę zaletę, że charakteryzują się wysoką czułością sygnałów NMR, mają one nieodłączne ograniczenia. Ze względu na relaksację T1 hiperspolaryzowanego pirogronianu 13C, czas trwania pomiarów metabolicznych jest ograniczony do około 1 minuty, co ogranicza obserwację długotrwałych zmian metabolicznych. Ponadto trudno jest zmierzyć próbkę komórki kilka godzin po jej jednokrotnym pomiarze, co może być związane z kapaniem dużej ilości pirogronianu podczas jednego pomiaru. Jest to równoznaczne z faktem, że pokrewne grupy zmierzyły widma dzień później,18, a interwał pomiaru musi być tak długi.

Znaczenie metody w porównaniu z istniejącymi technikami
W porównaniu z konwencjonalnymi testami metabolicznymi, nasza metoda ma przewagę nad pomiarami punktów końcowych, takimi jak spektrometria mas i testy biochemiczne, ponieważ zapewnia wgląd w metabolizm komórkowy w czasie rzeczywistym. Chociaż podobne hiperspolaryzowane widma NMR można uzyskać bez użycia bioreaktora, możliwość natychmiastowego rozpoczęcia pomiarów z mieszaniem in situ jest korzystna, biorąc pod uwagę szybkość relaksacji. Ponadto komórki można wstępnie ustawić w stabilnym środowisku przed wstrzyknięciem, co poprawia odtwarzalność i dokładność kinetyczną analizy metabolicznej. Ta zaleta jest wspierana przez dodatkowy eksperyment (rysunek uzupełniający 2), w którym widma czasowo-rozdzielcze uzyskano przy użyciu laboratoryjnego systemu NMR po zewnętrznym mieszaniu. W tej konfiguracji opóźnienie wynoszące około 30 s między mieszaniem a akwizycją sygnału prowadziło do znacznej utraty polaryzacji, szczególnie wpływając na wykrywanie mleczanu. Potwierdza to, że mieszanie in situ poprawia wierność pomiarów kinetycznych w warunkach szybkiego rozpaduT1 . Warto jednak zauważyć, że intensywność sygnału w tej konfiguracji in situ była niższa, prawdopodobnie z powodu rozcieńczenia spowodowanego przez średnią perfuzję - problem, który pozostaje do optymalizacji.

Znaczenie i potencjalne zastosowania
Metoda ta może utorować drogę do zastosowań w zrozumieniu właściwości metabolicznych różnych form życia. Pomiar strumieni metabolicznych w czasie rzeczywistym umożliwia naukowcom dynamiczną ocenę skutków działania inhibitorów metabolicznych. Zintegrowanie tego podejścia z innymi technikami pomiarowymi może jeszcze bardziej zwiększyć dokładność analizy metabolizmu wewnątrzkomórkowego.

Przewidujemy praktyczny eksperymentalny przepływ pracy, w którym destrukcyjna, wysokoprzepustowa metabolomika jest wykorzystywana do identyfikacji potencjalnych szlaków, a następnie walidacja w czasie rzeczywistym przy użyciu hiperspolaryzowanego 13C NMR w celu oceny funkcji enzymu i dynamiki strumienia w żywych komórkach. Takie podejście umożliwia bezpośrednie wykrywanie przejściowych odpowiedzi metabolicznych w warunkach fizjologicznych - co jest trudne do osiągnięcia przy użyciu testów immunologicznych lub czujników fluorescencyjnych, które zwykle mierzą statyczne poziomy metabolitów lub wymagają sond egzogennych. Podczas gdy obrazowanie fluorescencyjne i testy immunologiczne są niezbędne odpowiednio do lokalizacji przestrzennej i wysokoprzepustowych badań przesiewowych, hiperpolaryzowany NMR zapewnia uzupełniający odczyt funkcjonalny, który wychwytuje kinetykę reakcji w sposób nieniszczący. Strategia ta nie tylko ułatwia wgląd mechanistyczny na poziomie komórkowym, ale także służy jako pomost do zastosowań diagnostycznych w skali tkanki lub organizmu. W szczególności zdolność do rejestrowania funkcjonalnych zmian metabolicznych w czasie rzeczywistym może pomóc we wczesnym wykrywaniu zaburzeń metabolicznych i reakcji terapeutycznych w złożonych systemach biologicznych.

Poczyniono również postępy w opracowywaniu sond metabolicznych ukierunkowanych na różne szlaki metaboliczne i syntetyczne substraty przeznaczone dla określonych enzymów, rozszerzając możliwości badań metabolicznych25,26. Co więcej, postępy w technikach hiperpolaryzacji, takie jak dostarczanie hiperspolaryzowanych substratów bezpośrednio z polaryzatora do NMR przez tunel magnetyczny27- mogą poprawić retencję sygnału i rozszerzyć potencjalne zastosowania tej metody w badaniach biomedycznych.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prace te były wspierane przez JSPS KAKENHI Grant Number 23KJ2179 i 24K17833 (dla T.U.), 23K27561 (dla Y.T.); MEXT Q-LEAP [JPMXS0120330644 (do Y.T.)]; oraz MEXT Promocja Rozwoju Wspólnego Projektu Systemu Użytkowania/Badań: Koalicja Uniwersytetów na rzecz Programu Doskonałości Badawczej (CURE) Grant nr JPMXP1323015488 (program Spin-L nr spin24XQ007).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
[1-13C] kwas pirogronowyCambridge Isot ope Laboratories, Inc.Zobacz materiał CLM-8077
Drukarka 3DElegooSaturn 2
Chlorek wapniaNacalai Tesque, Inc.06729-55
D2OSigma-Aldrich151882
Zestaw cyrkulacji zewnętrznej do pompyJAKO JEDNOŚĆ1-4141-02
Surowica bydlęca płoduGibco (firma Gibco)10270106
Zestaw montażowy bez kołnierzaGL Sciences Inc.6010-46390
Szklana kapilara z rdzeniemNarishige powiedział:GDC-1.5Średnica wewnętrzna ~0,9 mm, długość 90 mm
Magnetyczna pompa obiegowaJAKO JEDNOŚĆ1-4141-01
MestReNovaBadania MestrelabOprogramowanie do przetwarzania i analizy spektralnej NMR
Moja strzykawka do strzałówKorporacja Nipro82770,5 mL/100U, 30G x 10 mm, 140 szt.
OX063 powiedział:  Oxford Instruments Co. Ltd.  oraz Polarize IVS Co. Ltd. -
Rurka PEEKJAKO JEDNOŚĆ3-780-05
penicylina-streptomycynaNacalai Tesque, Inc.26252-94
Pompa Peristaltic Bio MiniLotnisko ATTO1221200Wysoka precyzja, szerokie natężenie przepływu zapewnia stabilny przepływ medium
ŻywicaTechnologia SirayaPrzydymiona czerń
RPMI-1640 ŚredniNacalai Tesque, Inc.30264-85
Przegroda w fiolce silikon/PTFEGL Sciences Inc.1030-50009
Alginian sodu 80-120FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation194-13321
Oprogramowanie SPINitRS2DOprogramowanie NMR w polaryzatorze DNP
Gąbka--Dostępna w handlu gąbka przycięta na wymiar do stabilizacji żelu
Zawór odcinający trójdrogowyJAKO JEDNOŚĆ3-6247-04
TopspinBrukerOprogramowanie do akwizycji i przetwarzania danych NMR
Trypsyna-EDTA (0,25%)Thermo Fisher Naukowy07086-74
Żywica utwardzana promieniami UVBONDICBD-SKCJ
Kąpiel wodnaJAKO JEDNOŚĆ1-5832-41Robot termiczny TR serii TR-1α do utrzymania 37 ° Temperatura C
Wilmad Zakręcana rurka NMRSigmaZ271977Częstotliwość 400 MHz, średnica 10 mm, L 178 mm.

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ardenkjaer-Larsen, J. H., et al. Increase in signal-to-noise ratio of >10,000 times in liquid-state NMR. Proc Natl Acad Sci USA. 100 (18), 10158-10163 (2003).
  2. Comment, A., Merritt, M. E. Hyperpolarized magnetic resonance as a sensitive detector of metabolic function. Biochemistry. 53 (47), 7333-7357 (2014).
  3. Balzan, R., et al. Dissolution Dynamic Nuclear Polarization Instrumentation for Real-time Enzymatic Reaction Rate Measurements by NMR. J Vis Exp. (108), e53548(2016).
  4. Liu, M., Hilty, C. Metabolic measurements of nonpermeating compounds in live cells using hyperpolarized NMR. Anal Chem. 90 (2), 1217-1222 (2018).
  5. Sannelli, F., Jensen, P. R., Meier, S. In-cell NMR approach for real-time exploration of pathway versatility: substrate mixtures in nonengineered yeast. Anal Chem. 95 (18), 7262-7270 (2023).
  6. Harris, T., Eliyahu, G., Frydman, L., Degani, H. Kinetics of hyperpolarized 13C1-pyruvate transport and metabolism in living human breast cancer cells. Proc Natl Acad Sci USA. 106 (43), 18131-18136 (2009).
  7. Rao, Y., et al. Hyperpolarized [1-13C]pyruvate-to-[1-13C]lactate conversion is rate-limited by monocarboxylate transporter-1 in the plasma membrane. Proc Natl Acad Sci USA. 117 (36), 22378-22389 (2020).
  8. Mathiassen, T. B. W., et al. Hyperpolarized 13C NMR for longitudinal in-cell metabolism using a mobile 3D cell culture system. J Magn Reson Open. 16 - 17 (100131), 100131(2023).
  9. Meier, S., et al. Hyperpolarized 13C NMR reveals pathway regulation in Lactococcus lactis and metabolic similarities and differences across the tree of life. Molecules. 29 (17), 4133(2024).
  10. Sriram, R., et al. Detection of bacteria-specific metabolism using hyperpolarized [2-13C]pyruvate. ACS Infect Dis. 4 (5), 797-805 (2018).
  11. Park, J. M., et al. Hyperpolarized sodium [1-13C]-glycerate as a probe for assessing glycolysis in vivo. J Am Chem Soc. 139 (19), 6629-6634 (2017).
  12. Singh, J., et al. Probing carbohydrate metabolism using hyperpolarized 13C-labeled molecules. NMR Biomed. 32 (10), e4018(2019).
  13. Bohndiek, S. E., et al. Hyperpolarized [1-13C]-ascorbic and dehydroascorbic acid: vitamin C as a probe for imaging redox status in vivo. J Am Chem Soc. 133 (30), 11795-11801 (2011).
  14. Yamamoto, K., et al. Real-time insight into in vivo redox status utilizing hyperpolarized [1-13C] N-acetyl cysteine. Sci Rep. 11 (1), 12155(2021).
  15. Düwel, S., et al. Imaging of pH in vivo using hyperpolarized 13C-labelled zymonic acid. Nat Commun. 8 (1), 15126(2017).
  16. Chen, J., Hackett, E. P., Singh, J., Kovács, Z., Park, J. M. Simultaneous assessment of intracellular and extracellular pH using hyperpolarized [1-13C]alanine ethyl ester. Anal Chem. 92 (17), 11681-11686 (2020).
  17. Eills, J., et al. Spin hyperpolarization in modern magnetic resonance. Chem Rev. 123 (4), 1417-1551 (2023).
  18. Keshari, K. R., et al. Hyperpolarized 13C spectroscopy and an NMR-compatible bioreactor system for the investigation of real-time cellular metabolism. Magn Reson Med. 63 (2), 322-329 (2010).
  19. Sriram, R., et al. Real-time measurement of hyperpolarized lactate production and efflux as a biomarker of tumor aggressiveness in an MR compatible 3D cell culture bioreactor. NMR Biomed. 28 (9), 1141-1149 (2015).
  20. Mangas-Florencio, L., et al. A DIY bioreactor for in situ metabolic tracking in 3D cell models via hyperpolarized 13C NMR spectroscopy. Anal Chem. 97 (3), 1594-1602 (2025).
  21. Hill, D. K., et al. Model free approach to kinetic analysis of real-time hyperpolarized 13C magnetic resonance spectroscopy data. PLoS One. 8 (9), e71996(2013).
  22. Saito, K., et al. 13C-MR spectroscopic imaging with hyperpolarized [1-13C]pyruvate detects early response to radiotherapy in SCC tumors and HT-29 tumors. Clin Cancer Res. 21 (22), 5073-5081 (2015).
  23. Sengupta, D., Pratx, G. Imaging metabolic heterogeneity in cancer: from PET to hyperpolarized MRI. Mol Cancer. 15, 43(2016).
  24. Read, G. H., et al. Three-dimensional alginate hydrogels for radiobiological and metabolic studies of cancer cells. Colloids Surf B Biointerfaces. 171, 197-204 (2018).
  25. Meier, S., Jensen, P. R., Karlsson, M., Lerche, M. H. Hyperpolarized NMR probes for biological assays. Sensors. 14 (1), 1576-1597 (2014).
  26. Kondo, Y., Nonaka, H., Takakusagi, Y., Sando, S. Design of nuclear magnetic resonance molecular probes for hyperpolarized bioimaging. Angew Chem Int. Ed. 60 (27), 14779-14799 (2021).
  27. Milani, J., et al. A magnetic tunnel to shelter hyperpolarized fluids. Rev Sci Instrum. 86 (2), 024101(2015).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Metabolizm pirogronianusystem bioreaktoraenkapsulacja kom rekel alginianowydynamiczna polaryzacja j drowakonwersja mleczanuprofilowanie metaboliczneprzesiewanie lek w

Powiązane artykuły