Indywidualne dla pacjenta organoidalne rogówki pochodzenia iPSC w badaniach nad zaburzeniami rogówki związanymi z aniridią

Ali Can Koç; Gaye Su Yiğit; Semih Numan Göçmez; Mustafa Titiz; Sinan Güven

doi:10.3791/68556

Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Indywidualne dla pacjenta organoidalne rogówki pochodzenia iPSC w badaniach nad zaburzeniami rogówki związanymi z aniridią

141 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/68556

⸱

28 lipca 2026

Ali Can Koç¹^,² , Gaye Su Yiğit¹^,² , Semih Numan Göçmez¹^,² , Mustafa Titiz¹^,² , Sinan Güven¹^,²^,³

¹Izmir Biomedicine and Genome Center, ²Izmir International Biomedicine and Genome Institute, Dokuz Eylül University, ³Department of Medical Biology and Genetics, Faculty of Medicine, Dokuz Eylül University

W tym artykule

Podsumowanie

Opisujemy protokół generowania organoidów rogówki z komórek iPSC pochodzących od pacjentów z aniridy, tworząc model specyficzny dla pacjenta do badania zaburzeń rogówki. Te organoidy naśladują kluczowe cechy strukturalne i funkcjonalne, zapewniając niezawodną platformę in vitro do badania mechanizmów chorobowych, testowania potencjalnych terapii i rozwijania spersonalizowanych podejść regeneracyjnych dla chorób przedniego odcinka oka.

Streszczenie

Aniridia to rzadkie wrodzone zaburzenie oka charakteryzujące się częściowym lub całkowitym brakiem tęczówki, często wiążące się z zmętnieniem rogówki i niedoborem komórek macierzystych rogówki. Podstawowe mutacje genetyczne, przede wszystkim wpływające na gen PAX6, zakłócają zarówno rozwój, jak i funkcję rogówki. Najczęstszymi objawami okulistycznymi oprócz wad tęczówki są nyttagmus, hipoplazja dołka żółtego, zaćma, jaskra oraz keratopatia związana z aniridy (AAK). Chociaż modele in vivo oferują cenne informacje o patologii aniridii, modele in vitro pochodzące od pacjentów są niezwykle istotne dla badania mechanizmów chorobowych i oceny potencjalnych terapii. W niniejszym badaniu przedstawiamy model in vitro AAK wykorzystujący komórki pluripotencjalne pochodzenia pacjenta (iPSCs). Nasz protokół obejmuje stopniowe różnicowanie iPSCs w komórki nabłonkowe rogówki w obrębie samoorganizujących się trójwymiarowych organoidów, które naśladują natywne środowisko rogówki. Poprzez optymalizację warunków kultury różnicowania, z powodzeniem wygenerowaliśmy organoidy rogówki, które zawierają odrębne populacje komórek rogówki, odtwarzając kluczowe cechy strukturalne i funkcjonalne ludzkiej rogówki.

Wprowadzenie

Różnica jest naczyniowatym, przezroczystym tkanki tworzącym zewnętrzną warstwę oka, składającą się głównie z trzech warstw: warstwy zewnętrznej nabłonkowej, warstwy stromy zawierającej bogatą w kolagen macierz pozakomórkową zaludnioną przez keratocyty oraz warstwy komórek śródbłonka¹. Różnica odgrywa istotną rolę w widzeniu, chroniąc struktury oka i załamując światło.

Aniridia to rzadkie, wrodzone zaburzenie oka, wywołane przede wszystkim przez heterozygotyczne mutacje w genie paired box gene 6 (PAX6), będącym głównym regulatorem rozwoju oka, i charakteryzujące się częściowym lub całkowitym brakiem tęczówki². Oprócz hipoplazji lub braku tęczówki, większość pacjentów rozwija postępujące nieprawidłowości rogówki, zbiorczo nazywane keratopatie związane z anirydią (AAK), które obejmują wady nabłonka, dysfunkcję komórek macierzystych rogówki, zmiany stromy oraz postępujące zmętnienie rogówki, prowadzące ostatecznie do upośledzenia wzroku. AAK występuje u około 78–90% pacjentów z anirydią, a ich nasilenie rośnie z czasem³. Naszym celem było ustanowić szczegółowy i możliwy do powtórzenia protokół wytwarzania organoidalnych rogówek z komórek macierzystych pluripotencjalnych pochodzących od pacjentów z anirydią (iPSC), aby modelować związane z chorobą zmiany rogówki in vitro. Chociaż modele zwierzęce i badania ex vivo dostarczyły cennych informacji na temat patogenezy anirydii, gatunkowe różnice i ograniczony dostęp do tkanki pacjenta ograniczają ich zastosowanie kliniczne.

Pochodzące z ludzkich iPSC organoidalne tkanki wyłonili się jako potężne systemy in vitro do modelowania ludzkiego rozwoju i chorób⁴^,⁵. Organoidalne rogówki, w szczególności, umożliwiają generowanie trójwymiarowych struktur przypominających tkanki, które bardziej przypominają natywną architekturę rogówki, w tym warstwową organizację nabłonka, interakcje stromy – nabłonek oraz osadzanie macierzy zewnątrzkomórkowej, w porównaniu z konwencjonalnymi dwuwarstwowowymi kulturami monowarstwy, które nie mają organizacji przestrzennej, fizjologicznych interakcji komórka – komórka oraz złożoności mikrośrodowiska⁴^,⁵. Zgłoszono kilka strategii różnicowania, w tym podejścia oparte na SEAM i sterowanie przez progenity oczne, które pozwalają generować tkanki podobne do rogówki z iPSC⁶. Te podejścia zazwyczaj obejmują początkową fazę indukcji linii ocznej, a następnie progresywne określenie tkanki i selekcję z heterogenicznych populacji progenitorów ocznych. Tworzenie organoidalnych rogówek daje możliwość badania różnych typów komórek obecnych w tkankach rogówki⁷^,⁸. Co więcej, organoidalne rogówki pochodzące z iPSC pacjentów z anirydią umożliwiają badanie genetycznego podłoża choroby i oferują unikalną okazję do badania anirydii.

W tym protokoli, zarówno linie iPSC typu dzikiego, jak i pochodzące od anirydii są poddawane identycznej, wieloetapowej strategii różnicowania, która obejmuje sekwencyjne narażenie na różnicowanie (DM), różnicowanie siatkówki (RDM) oraz środowisko różnicowania rogówki (CDM) przez przedłużony okres kultury trwający tygodnie. Krytycznym etapem eksperymentu jest przejście z kultury adhezywnej do warunków zawiesinowych, podczas którego wybrane podobne do rogówki regiony są utrzymywane, aby promować samoorganizację nabłonka.

Podczas gdy to podejście wspiera powtarzalne generowanie podobnych do rogówki struktur nabłonkowych nadających się do porównawczego modelowania chorób, nie odwzorowuje w pełni złożonych cech in vivo, takich jak unerwienie nerwowe lub pełną organizację niszy limbalną, co należy wziąć pod uwagę przy ocenie przydatności metody.

W tym kontekście opisujemy znormalizowany protokół wytwarzania organoidalnych rogówek z iPSC pochodzących od pacjentów z mutacjami genu PAX6 związanymi z anirydią. Co ważne, sama strategia różnicowania nie jest modyfikowana między liniami typu dzikiego i pochodzącymi od anirydii; zamiast tego, fenotyp związany z chorobą pojawia się z genetycznego podłoża pacjenta w ramach w innym przypadku jednolitego eksperymentalnego szkieletu.

Ogólnie rzecz biorąc, ta metoda zapewnia solidną i możliwą do powtórzenia platformę do badania rozwoju rogówki i mechanizmów chorób związanych z anirydią i może służyć jako podstawa dla przyszłych badań mechanistycznych i translacyjnych.