Zoptymalizowany przebieg pracy w zakresie izolacji i długotrwałej hodowli komórek glejaka pochodzących od pacjenta, zachowujących oryginalne cechy guza

Podsumowanie

To badanie przedstawia ustandaryzowany protokół tworzenia linii komórkowych glejaka pochodzącego od pacjenta (PDGC), zapewniając ich genetyczną i fenotypową wierność. System hodowli adherentnej wspomagany ekstraktem z macierzy błony podstawnej zwiększa wzrost i jednorodność komórek, dzięki czemu modele te są cenne dla badań przesiewowych leków i badań nad GBM.

Streszczenie

Glejak wielopostaciowy (GBM) jest najbardziej agresywnym pierwotnym nowotworem mózgu, charakteryzującym się wysoką heterogenicznością i opornością na standardowe terapie. Tradycyjne linie komórkowe glejaka często nie zachowują specyficznych dla pacjenta cech genetycznych i fenotypowych, co ogranicza ich znaczenie translacyjne. Aby rozwiązać ten problem, utworzyliśmy 50 linii komórkowych glejaka (PDGC) pochodzących od pacjentów przy użyciu systemu hodowli nerwowych komórek macierzystych bez surowicy. Protokół ten określa pobieranie, przetwarzanie i długoterminową hodowlę próbek guza uzyskanych od pacjentów z GBM, zapewniając zachowanie kluczowych cech molekularnych. Nasza metodologia obejmuje enzymatyczną dysocjację tkanek, lizę czerwonych krwinek i hodowlę adherentną wspomaganą ekstraktem macierzy błony podstawnej, która poprawia żywotność komórek i ułatwia wysokoprzepustowe badania przesiewowe leków. Charakterystyka PDGC za pomocą sekwencjonowania całego genomu i transkryptomicznego oraz barwienia immunofluorescencyjnego potwierdza zachowanie przez nie typowych zmian genetycznych GBM oraz markerów neuronalnych komórek macierzystych i progenitorów. Dodatkowo komórki te wykazują potencjał rakotwórczy w modelach ksenoprzeszczepów. Optymalizując warunki hodowli, protokół ten zapewnia ustandaryzowane ramy do generowania biologicznie istotnych modeli GBM w celu wspierania odkryć terapeutycznych i badań mechanistycznych.

Wprowadzenie

Glejak, najczęstszy pierwotny guz wewnątrzczaszkowy, wywodzi się z nerwowych komórek macierzystych lub progenitorowych, które przeszły mutacje genetyczne¹. Światowa Organizacja Zdrowia klasyfikuje glejaki do klas 1-4 na podstawie cech patologicznych i molekularnych, od niskiego do wysokiego stopnia². Glejak wielopostaciowy (GBM), glejak 4. stopnia, stanowi około 57% wszystkich glejaków i 48% wszystkich pierwotnych nowotworów złośliwych ośrodkowego układu nerwowego³. Pacjenci z GBM mają złe rokowania, z medianą czasu przeżycia poniżej 2 lat i 5-letnim wskaźnikiem przeżycia wynoszącym zaledwie 5,4%⁴. Standardowe leczenie obejmuje maksymalnie bezpieczną resekcję, a następnie radioterapię i chemioterapię temozolomidem⁵. Pomimo tych interwencji, GBM pozostaje nieuleczalny ze względu na swój infiltracyjny charakter i wrodzoną oporność na terapie, co stwarza pilną potrzebę nowych metod leczenia.

Badacze często używają linii komórek nowotworowych pochodzenia ludzkiego jako modeli do badania rozwoju raka i mechanizmów terapeutycznych. Jednak klasyczne linie komórkowe glejaka utrzymywane w pożywce zawierającej surowicę i intensywnie pasażowane in vitro wykazują znaczące zmiany w cechach fenotypowych i profilach genetycznych w porównaniu z nowotworami pacjentów^6,7,8. W związku z tym przedkliniczne modele przesiewowe oparte na tych liniach komórkowych często nie są w stanie zidentyfikować celów terapeutycznych i cząsteczek, które skutecznie przekładają się na warunki kliniczne. Powodzenie leczenia GBM jest dodatkowo skomplikowane ze względu na niejednorodność i plastyczność guza⁹. Ta heterogeniczność przejawia się nie tylko w podtypach transkryptomicznych (np. proneuralnych, mezenchymalnych), ale także w różnych stanach rozwojowych komórek składowych¹⁰. GBM wykorzystuje mechanizmy neurorozwojowe i zawiera subpopulacje komórek macierzystych glejaka (GSC), które napędzają proliferację guza i wykazują zwiększoną odporność na radioterapię i chemioterapię^11,12. Hodowla komórek glejaka pochodzących od pacjenta w pożywce z nerwowych komórek macierzystych bez surowicy skutecznie zachowuje spektrum mutacji i wzorce ekspresji genów pierwotnego guza, zachowując jednocześnie częściową charakterystykę GSC⁸.

W porównaniu do modeli hodowli neurosfery, hodowla przylegająca wspomagana ekstraktem z macierzy błony podstawnej sprzyja bardziej stabilnemu i szybkiemu wzrostowi komórek, co czyni ją bardziej odpowiednią do badań chemicznych i genetycznych¹³. Korzystając z tego podejścia, ustaliliśmy 50 linii komórkowych GBM pochodzących od pacjentów i scharakteryzowaliśmy je za pomocą sekwencjonowania całego genomu, sekwencjonowania transkryptomicznego i badań przesiewowych biblioteki leków FDA w celu zbadania potencjalnych strategii terapeutycznych. Ten zasób naprzód badania nad glejakiem, a szczegółowe wyniki zostały opublikowane w naszych poprzednich badaniach¹⁴. W tym miejscu opisujemy metodologię zastosowaną do opracowania linii komórkowych glejaka pochodzącego od pacjenta (PDGC).

Protokół

Ten protokół wykorzystuje pobrane od pacjenta próbki tkanki glejaka i krwi uzyskane dzięki współpracy ze szpitalem. Wszystkie procedury pobierania próbek i protokoły eksperymentalne zostały zatwierdzone przez Komisję Etyczną Szpitala Tiantan w Pekinie, Stołecznego Uniwersytetu Medycznego (KY 2020-093-02 i KY 2014-021-02). Pacjenci wyrażają podpisaną świadomą zgodę przed zabiegiem, a wszystkie informacje dotyczące tożsamości są poddawane anonimizacji przed przekazaniem próbek do laboratorium. Badacze muszą uzyskać zgodę swojej instytucjonalnej komisji bioetycznej i uzyskać zgodę pacjenta przed wdrożeniem tego protokołu.

1. Przygotowanie przed przetworzeniem próbki

1. Sterylizuj nożyczki, pęsety i inne narzędzia przez autoklawowanie.
2. Przygotować pożywkę hodowlaną PDGC, łącząc 47,5 ml DMEM/F12, 500 μl N2, 1 ml witaminy B27, 500 μl 100x penicyliny/streptomycyny, 250 μl 100x substytut glutaminy, 100 μl 2,5 M HEPES, 100 μL 30% glukozy, 50 μL 50 mM β-merkaptoetanolu, 1,5 ml 1 μg/ml naskórkowego czynnika wzrostu (EGF), i 1,5 ml 1 μg/ml zasadowego czynnika wzrostu fibroblastów (bFGF).
3. Przygotuj 1x Bufor do lizy czerwonych krwinek (ACK), rozpuszczając 8,29 g chlorku amonu, 1 g wodorowęglanu potasu i 37 mg EDTA w wodzie, a następnie rozcieńczając do 1 l.
4. Wysterylizowane narzędzia, bufor PBS, pojemniki na odpady, probówki wirówkowe i inne materiały należy umieścić w komorze bezpieczeństwa biologicznego i przeprowadzić dezynfekcję promieniami UV przez 30 minut.
5. Umieść ciekły azot w izolowanym pojemniku.

2. Pobieranie próbek od pacjentów

UWAGA: Przeprowadzaj wszystkie procedury pobierania tkanek w ściśle sterylnych warunkach, aby zapobiec skażeniu bakteryjnemu kolejnych kultur komórkowych. Utrzymuj technikę aseptyczną w całym procesie pracy.

1. Pobrać próbki krwi przed operacją i wyciąć tkankę nowotworową z mózgu pacjenta. W przypadku dużych, wysoce naciekających guzów, w których odróżnienie guza od otaczającej normalnej tkanki jest trudne, zmaksymalizuj resekcję tkanki okołonowotworowej, zachowując jednocześnie krytyczne funkcjonalne obszary mózgu. Oddzielić około 500-2000^mm3 tkanki rdzenia guza i umieścić w 15 ml probówek wirówkowych zawierających 10 ml hipotermicznej pożywki konserwującej.
2. Zamknij probówki z próbkami, umieść je w pojemniku na lód i szybko przetransportuj do laboratorium w celu przetworzenia.
   UWAGA: Upewnij się, że odstęp czasu między pobraniem próbki a przetworzeniem nie przekracza 6 godzin w temperaturze 4 °C. Podczas pobierania próbki należy ostrożnie wykluczyć spaloną tkankę i obszary martwicy guza. Powierzchnia nacięć tkanek jest często przypalana przez nóż elektryczny używany podczas operacji, co może zagrozić żywotności komórek w hodowli.

3. Przetwarzanie próbek krwi

1. Odwirować probówki z próbkami krwi o masie 1 000 × g przez 10 minut i wyrzucić górną warstwę osocza.
2. Przenieść pozostałą warstwę białych krwinek i czerwonych krwinek do probówki wirówkowej o pojemności 50 ml. Dodaj 10 ml 1x ACK i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 5 minut, aby zejść czerwone krwinki.
3. Dodać 40 ml PBS, aby zakończyć lizę, delikatnie wymieszać i odwirować przy 1,000 × g przez 10 minut.
4. Odrzucić supernatant, dodać 3 ml 1x ACK i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut do drugiego etapu lizy krwinek czerwonych.
5. Dodać 12 ml PBS, aby zakończyć lizę, delikatnie wymieszać i odwirować przy 1,000 × g przez 10 minut.
6. Odrzucić supernatant, ponownie zawiesić osad komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) w 1 ml PBS, przenieść do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml i odwirować przy 510 × g przez 10 minut.
7. Odrzucić supernatant, zamrozić osad PBMC w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C.

4. Przetwarzanie tkanki nowotworowej

1. Usunąć roztwór do konserwacji tkanek z probówki z próbką i umyć tkankę w PBS w celu usunięcia widocznych skrzepów krwi i tkanki martwiczej. Wykonaj drugie płukanie PBS na pozostałej tkance.
2. Wyciąć najbardziej nienaruszoną część tkanki i utrwalić przez noc w 4% paraformaldehydzie (PFA) w temperaturze 4 °C.
   UWAGA: Rozmiar utrwalonej tkanki wynosi około 10 mm. Pomiń ten krok, jeśli próbka jest mała.
3. Pokrój 2-4 małe kawałki tkanki, przenieś do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml, zamroź w ciekłym azocie i przechowuj w temperaturze -80 °C.
   UWAGA: Rozmiar małych fragmentów tkanek zwykle waha się od 5 do 10 mm, w zależności od ilości DNA i RNA wymaganej do sekwencjonowania.
4. Umieść pozostałą tkankę nowotworową w probówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml i zmiel na drobną pastę za pomocą nożyczek, trzymając na lodzie.
5. Dodać 1-3 ml roztworu do odrywania komórek i przenieść zmieloną tkankę do probówki wytrawiającej. Trawić tkankę za pomocą dysocjatora tkankowego w temperaturze 37 °C przez 16 minut.
6. Dodaj 3x objętość PBS, aby zatrzymać trawienie i przenieś zawiesinę komórkową do probówki wirówkowej z sitkiem o wielkości 70 μm. Delikatnie zmiel tkankę przez sitko za pomocą małego pręta, aby zmaksymalizować zbieranie komórek. Wirować przy 510 × g przez 10 minut i usunąć supernatant.
7. Dodaj 1-3 ml 1x ACK i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 5 minut, aby lizować czerwone krwinki. Dodaj 4x objętość PBS, aby zatrzymać lizę, delikatnie wymieszaj i odwiruj przy 510 × g przez 10 minut, aby usunąć supernatant.
8. Zawiesić komórki w pożywce PDGC i część nasienną zawiesiny komórkowej na płytkach hodowlanych. Umieścić płytki w inkubatorze do hipoksyjności w temperaturze 37 °C. Zamrozić pozostałe komórki w pożywce hodowlanej zawierającej 10% DMSO.
   UWAGA: Zazwyczaj w przypadku próbek tkanek o średnicy około 10-20 mm wysiewamy około 1/3 do 1/10 zawiesiny komórek do 6-centymetrowego naczynia z 3 ml pożywki hodowlanej, a pozostałe komórki są kriokonserwowane w 2-4 fiolkach, w zależności od wydajności komórek.
9. Pokryj płytki, dodając ekstrakt z macierzy błony podstawnej do lodowatego PBS w stosunku 1:100 i inkubuj płytki w temperaturze pokojowej w inkubatorze z wytrząsaniem przez 2 godziny. Wyrzuć PBS przed dodaniem pożywki hodowlanej PDGC.
   UWAGA: Wykonaj wszystkie kolejne pasaże komórkowe i hodowlę za pomocą płytek pokrytych ekstraktem z macierzy błony podstawnej.
10. Po 2 dniach przenieś wyhodowane komórki na płytki pokryte ekstraktem z macierzy błony podstawnej, aby umożliwić adhezję i wzrost komórek.

5. Hodowla komórkowa i pasaż

1. Gdy komórki przylgną do płytek hodowlanych, usuń nieprzylegające komórki i wymieniaj lub uzupełniaj pożywkę hodowlaną co 2-3 dni.
   UWAGA: Zdolność adhezji różni się w zależności od ogniwa. Nawet w obecności ekstraktu z macierzy błony podstawnej niewielka frakcja komórek może pozostać nieprzylegająca, taka jak BNI7-11, która wymaga ciągłej hodowli zawiesinowej. Ponadto niektóre komórki wykazują częściowo przylegający wzorzec wzrostu, taki jak BNI20. Dlatego niezbędna jest dokładna obserwacja stanu komórek. W przypadku komórek nieprzylegających można zauważyć wzrost zawieszonych komórek. Jeśli agregaty komórkowe wyglądają jak ciemne, podobne do bawełny struktury i nie wykazują znaczących zmian w czasie, zazwyczaj nie są zdolne do długotrwałej ekspansji.
2. Gdy komórki osiągną zbieg, dodaj roztwór dysocjacyjny komórek, aby odłączyć komórki. Zakończyć dysocjację za pomocą 3x PBS i odwirować przy 250 × g przez 3 min. Przejdź komórki w stosunku 1:2 do 1:4. Zamrozić pozostałe komórki w pożywce hodowlanej zawierającej 10% DMSO.
3. Kontynuuj pasażowanie przez co najmniej 10-20 pokoleń, aby ustalić stabilną linię komórkową.
   1. Dokumentuj morfologię komórek za pomocą obrazów podczas każdego przejścia i zapisuj numery pasaży. Wyraźnie oznacz początkowe zamrożenie komórek szczegółowymi informacjami (np. numerami przejść).
   2. Gdy linia komórkowa się ustabilizuje, zbierz 2-3 probówki z granulkami komórek (300 000-1 000 000 komórek/probówkę) i przechowuj w temperaturze -80 °C.

6. Kolejne operacje eksperymentalne

1. W przypadku próbek utrwalonych w PFA, po utrwaleniu przez noc, próbki należy odwodnić przez stopniowaną serię roztworów etanolu przez sekwencyjne zanurzenie w 60% etanolu, 70% etanolu, 80% etanolu, 90% etanolu, 95% etanolu i dwóch przemianach 100% etanolu, każda przez 40 minut. Następnie należy oczyścić próbki w dwóch przemianach ksylenu, każda przez 40 minut, a następnie naciekać dwiema zmianami roztworu parafiny, każda przez 40 minut. Na koniec osadź odwodnione i naciekane próbki w blokach parafinowych w celu późniejszego przekroju i barwienia¹⁵.
2. W przypadku granulek PBMC, tkanki nowotworowej lub próbek komórek nowotworowych przechowywanych w temperaturze -80 °C, należy wyodrębnić DNA i RNA do różnych badań omicznych, w tym sekwencjonowania całego genomu, sekwencjonowania egzomu, sekwencjonowania masowego RNA i sekwencjonowania RNA pojedynczej komórki w razie potrzeby.
3. Użyj stabilnych linii komórkowych PDGC do ustanowienia modelu ksenoprzeszczepu myszy, wysokoprzepustowych badań przesiewowych leków, badań mechanizmów i innych powiązanych eksperymentów.
   1. Aby ustalić wewnątrzczaszkowy ortotopowy model ksenoprzeszczepu PDGC, należy zdysocjować i policzyć komórki, a następnie zawiesić je ponownie w mieszaninie 1:1 ekstraktu z macierzy błony podstawnej i lodowatego PBS do końcowego stężenia 100 000 komórek/μl. Wstrzyknąć 5 μl zawiesiny komórkowej stereotaktycznie do lewego prążkowia 6-8-tygodniowych myszy z niedoborem odporności za pomocą mikrostrzykawki i standardowego instrumentu stereotaktycznego. Ustawić współrzędne iniekcji względem bregmy w następujący sposób: +0,5 mm przednio-tylna (AP), -1,9 mm przyśrodkowo-boczna (ML) i -3,6 mm grzbietowo-brzuszna (DV).
   2. Wygeneruj PDGC eksprymujące lucyferazy i ustanów ksenoprzeszczepy wewnątrzczaszkowe do bioluminescencyjnego obrazowania wzrostu guza.
      1. Upakuj gen reporterowy lucyferazy-tdPomidor w cząsteczki lentiwirusa, a następnie zainfekuj PDGC upakowanym lentiwirusem, aby ustalić stabilną ekspresję¹⁶.
      2. Po zakażeniu posortuj komórki tdPomidorowo-dodatnie za pomocą cytometrii przepływowej, aby uzyskać stabilną populację komórek wykazujących ekspresję lucyferazy.
      3. Przed obrazowaniem należy wstrzyknąć D-lucyferynę dootrzewnowo w dawce 10 μl/g masy ciała za pomocą 15 mg/ml roztworu D-lucyferyny. Znieczulij myszy izofluranem i odczekaj 10 minut po wstrzyknięciu D-lucyferyny. Umieść myszy w systemie obrazowania bioluminescencyjnego. Ustaw czas ekspozycji na tryb automatyczny podczas obrazowania¹⁷.

Wyniki

Rysunek 1 przedstawia kompleksowy przegląd przepływu pracy protokołu. Próbki od pacjentów obejmują krew obwodową i tkankę rdzenia guza. Próbki krwi poddawane są wirowaniu w celu usunięcia osocza, a następnie dwóm rundom lizy ACK w celu uzyskania PBMC, które służą jako kontrole do analiz sekwencjonowania. Próbki guza są myte PBS w celu usunięcia skrzepów krwi i obszarów martwiczych przed przetworzeniem na małe fragmenty. Wiele fragmentów tkanek jest kriokonserwowanych w celu przyszłej ekstrak...

Dyskusja

Niejednorodność GBM stanowi poważne wyzwanie w zakresie leczenia. Konwencjonalne linie komórkowe GBM często rozwijają jednorodne tło genetyczne i tracą cechy guza pacjenta po przedłużonej hodowli w pożywce zawierającej surowicę, co ogranicza ich wartość translacyjną. Optymalizacja warunków hodowli GBM i standaryzacja procesów przetwarzania próbek od pacjentów są niezbędne do maksymalizacji ograniczonych zasobów klinicznych w badaniach. Kompleksowy system modelowania komórek GBM poszerzy naszą wiedzę na temat heterogenicz...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
70 μ m sitko do komórek	Falcon	352350
Roztwór do odrywania komórek Accutase	BioLegend	423201
Chlorek amonu	Aladdin	60-92-4
Przeciwciało anty-Sox2	Merckmillipore	AB5603
Podłoże montażowe zapobiegające blaknięciu z DAPI	Beyotime	P0131
Przeciwciało anty-Nestin	NOVUS	NB100-1604
B27 bez suplementu witaminowego	Gibco	12587010
BD FACSAria Cytometr przepływowy fuzyjny	BD Biosciences	/
Naczynie do hodowli komórkowych	NEST	705001
D-Lucyferyna, sól potasowa	Invitrogen	L2916
DMEM/F12	Gibco	C11330500BT
DMSO	Sinopharm	30072418
EDTA	BBI Life Sciences	A600107-0500
Glukoza	Sangon Biotech	A50991-0500
GlutaMAX	Gibco	35050-061	substytut glutaminy
Zestaw do barwienia Hematoksyliny-Eozyny	Solarbio	G1120
HEPES	Beyotime	ST090
Ludzki bFGF	Orygeneza	TP750002
Ludzka EGF	Novoprotein	C029-500μ g
HypoThermosol FRS	Biolife Solutions	101104	hipotermiczne podłoże konserwujące
Isoflurane	RWD Life Science	R510-22-10
IVIS Lumina XR III	PerkinElmer	/	system obrazowania bioluminescencyjnego
Matrigel	Corning 356231		ekstrakt z matrycy błony podstawnej
Mikrostrzykawka	Hamilton	80300
N2 Suplement	Gibco	17502048
Nunclon Sphera 6-dołkowa płytka	Thermo Scientific	174932	ultra niskie płytki mocujące
Paraformaldehyd	Bufor Sangon Biotech	A500684-0500
PBS	Solarbio	P1010-100*2L
Penicylina/Streptomycyna	Solarbio	P8420/S8290
Wodorowęglan potasu	Sangon Biotech	A501195-0500
RWD Dysocjator tkankowy	RWD Nauki przyrodnicze	DSC-410
Standardowy instrument stereotaktyczny	RWD Life Science	68801
Probówka do przetwarzania próbek tkanek	RWD Life Science	SCT-100
β-merkaptoetanol	Sigma	M3148-100mL