Artykuł metodologiczny

Analiza wzbogacenia witaminy A w 13C w próbkach biologicznych za pomocą chromatografii gazowej, stosunku spalania i izotopów spektrometrii mas

490 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/68571

⸱

14 listopada 2025

 ,  ,  , 
1Department of Nutritional Sciences, University of Wisconsin-Madison

W tym artykule

Podsumowanie

Niniejszy artykuł opisuje analizę surowicy, mleka matki i próbek wątroby dla 13wzbogaceń C retinolu i retinylowych esterów do zastosowań śledzących. Do oczyszczania i ilościowego określenia stężeń retinolu stosuje się wysokowydajną chromatografię cieczową, a do analizy oczyszczonych ekstraktów stosuje się chromatografię gazową-spalanie-izotopowe proporcje stosunku (GC-C-IRMS).

Streszczenie

Witamina A jest kluczowa dla zdrowia, ale ocena jej statusu jest trudna. Witamina A krążąca we krwi jest kontrolowana homeostastycznie i często nie odzwierciedla niedoboru ani nadmiaru witaminy A. Stosowanie 13witaminy C-witaminy A pozwala śledzić i ilościowo określać całkowite zapasy witaminy A w organizmie oraz dodatkowe informacje o farmakokinetyce i metabolizmie. Protokół ten opisuje ekstrakcję, oczyszczanie i wyznaczenie wzbogacenia witaminy A o 13izotopów w surowicy, mleku matki i próbkach tkanek za pomocą chromatografii gazowej-spalania-stosunku izotopów spektrometrii mas (GC-C-IRMS). Analiza z użyciem GC-C-IRMS dostarcza czułych i precyzyjnych wartości wzbogacenia, szczególnie dla próbek z wzbogaceniami o 13°C blisko naturalnych poziomów liczebności. Pozwala to na elastyczność w projektowaniu badań, stosując mniejsze dawki śledzące i długoterminowe pobieranie próbek farmakokinetycznych. Krótko mówiąc, do surowicy 0,4 do 1 mL dodaje się etanol do wytrącenia białek, C-23 β-apo-karotenol jako standard wewnętrzny, a do ekstrakcji retinoidów używa się heksanu. Następnie ekstrakt jest ponownie zawieszany w metanolu i oczyszczany za pomocą HPLC. Frakcja retinolu jest następnie zawieszana w heksanie i wstrzykiwana do układu GC-C-IRMS. Atom % (At%) jest bezpośrednio obliczany w odniesieniu do dwutlenku węgla, który jest kalibrowany względem standardu sacharozy za pomocą analizatora pierwiastkowego. Inne typy tkanek analizowane przez GC-C-IRMS to mleko matki i wątroba po zmydlaniu. Techniki ekstrakcji fazy stałej mogą być stosowane do oczyszczenia tych lub innych złożonych macierzy. Ponadto do IRMS można podłączyć analizator pierwiastkowy do analizy próbek żywności pod kątem łącznej zawartości 13C.

Wprowadzenie

Witamina A (VA) to niezbędny mikroskładnik niezbędny do widzenia, funkcji odpornościowej, różnicowania komórek oraz regulacji metabolizmu. Optymalizacja statusu VA pozostaje globalnym wyzwaniem zdrowotnym, ponieważ niedobór lub nadmiar może negatywnie wpływać na wyniki zdrowotne. Dokładna ocena statusu VA jest kluczowa dla badań klinicznych lub populacyjnych, które kierują odpowiednimi interwencjami. Jednak samo stężenie retinolu w surowicy jest słabym biomarkerem i narzędziem diagnostycznym, ponieważ jest homeostatycznie regulowane w szerokim zakresie całkowitych zapasów organizmu (TBS) i jest podatne na stan zapalny oraz inne niedobory składników odżywczych 1,2.

Izotopowo znakowane znaczniki znacząco zmieniły badania VA, umożliwiając ilościową ocenę TBS za pomocą testu rozcieńczania izotopów retinolu (RID) 3,4,5. W przypadku RID podaje się smugiwacz VA wzbogacony o 13C lub 2H, który równoważy się z zapasami organizmu, a stosunek tracerów retinolu do śladu w surowicy (TTR) mierzy się za pomocą MS. Do obliczenia TBS 5,6 stosuje się równanie rozcieńczenia izotopów przy określonych założeniach związanych z metabolizmem VA.

Do określenia stężenia retinolu w surowicy TTR można stosować liczne kombinacje chromatografii i MS (np. GC-MS, LC-MS, LC-MS/MS). Precyzja analityczna jest kluczowa dla dokładnych szacunków RID, ponieważ TBS są odwrotnie proporcjonalne do TTR. LC-MS/MS doskonale nadaje się do zastosowań o wysokiej przepustowości przy użyciu silnie oznakowanych znaczników i stosunkowo wysokich dawek znaczników. Typowe metody LC-MS/MS podają względne odchylenia standardowe retinolu (RSD) na poziomie 3-6% dla testu intra-testowego i <8% dla testuinter-testu 7, jednak dane dotyczące dokładności i precyzji TTR są ograniczone. Dla porównania, chromatografia gazowa-spalanie-spektrometria mas stosunek izotopów (GCCIRMS) oferuje wyjątkową precyzję dla wzbogacenia 13C-retinolem, z typowymi RSD obfitości izotopów 13C/12C wynoszącymi ~0,02-0,05 8,9. Pozwala to precyzyjnie określać stężenia śladników w próbkach, gdzie wzbogacenie jest niskie. Zastosowanie IRMS do zastosowań RID pozwala na uzyskanie odpowiedniego sygnału analitycznego przy użyciu mniejszej masy znacznika i mniejszej liczby oznakowanych atomów w znaczniku, co pozwala na obniżenie kosztów związanych z dawkami znacznika.

Niniejszy artykuł przedstawia analizę 13C-retinolu z krwi, mleka matki i tkanek z użyciem GC-C-IRMS. W zależności od badanej próbki biologicznej, analiza 13retinolu znakowanego C-za pomocą GC-C-IRMS rozpoczyna się od jednej z kilku potencjalnych metod ekstrakcji izolujących związki niepolarne zawierające znakowany retinol. W przypadku próbek surowicy polega to na ekstrakcji ciecz-ciecz poprzez dodanie etanolu i heksanu oraz zebranie frakcji heksanu. W przypadku testu mleka matki próbki najpierw są saponifikowane wodorotlenkiem potasu, a następnie przeprowadza podobną ekstrakcję płynną jak w surowicy. Próbki mleka matki są również oczyszczane za pomocą wkładów do ekstrakcji fazy stałej, aby zmniejszyć ilość pozostałych lipidów. Jeśli pobiera się z tkanki (np. wątroby), próbka jest mielona bezwodnią siarczanem sodu w celu usunięcia wody, ekstrahowana chlorkiem metylenu i filtrowana do kolby objętościowej lub okrągłego dna w celu rotacyjnego odparowania. Aliquot jest suszony, ponownie zawieszany w etanolu, saponizowany i ekstrahowany tą samą metodą co mleko matki. Te niepolarne roztwory z każdej próbki są suszone pod azotem i rekonstytuowane w metanolu do oczyszczania i ilościowego pomiaru w wysokowydajnej chromatografii cieczowej (HPLC).

Czułość IRMS pozwala na określenie wzbogacenia próbek o niskim wzbogaceniu próbki, takich jak próbki farmakokinetyczne do długoterminowych modelów matematycznych lub próbki tkanek pozawątrobowych do precyzyjnego śledzenia metabolizmu VA. Zaproponowano testy RID w parze w pojedynczych dawkach, aby ocenić status VA przed i po interwencji w celu określenia skuteczności u teoretycznych uczestników10, co mogłoby być obiecującym podejściem, jeśli zostanie zweryfikowane u ludzi. IRMS jest w stanie wykrywać znaczniki VA w pobliżu naturalnych wartości wzbogacenia, co pozwala na długie okna obserwacji i elastyczność w protokołach próbkowania.

Mleko matki okazało się mniej inwazyjną alternatywną metodą próbkowania przy ocenie statusu VA1. Retinol z mleka matki może być wykorzystywany jako źródło próbek do testu RID i wykazał silną korelację z wartościami RID pochodzącymi z surowicy u kobiet w Zambii z niskimi zapasami VA11. W przypadku tkanek i próbek mleka matki techniki ekstrakcji w fazie stałej mogą pomóc w oczyszczaniu tych próbek w złożonych matrycach. IRMS był również wykorzystywany do rozróżniania źródeł pokarmowych VA oraz określania względnych wkładów w diecie, wykorzystując zmiany w naturalnej obfitości retinolu w surowicy 13°C 9,12,13. Analizator pierwiastkowy może być również używany wraz z IRMS do analizy próbek żywności pod kątem całkowitej zawartości 13C i porównania z wzbogacaniem VA.

Przy stosowaniu etykiet 13C kluczowe jest zrozumienie bazowego wzbogacenia retinolu 13C, ze względu na naturalnie występujące 13C(~1,1% całkowitego węgla), które może się różnić w zależności od źródeł VA spożywanego zarówno przez osoby, jak i populacje. Dlatego dla najlepszej dokładności na poziomie indywidualnym zaleca się pobranie próbki krwi na bazie. Dla ocen populacyjnych można wygenerować oszacowanie oparte na populacji, wykorzystując losowo wybraną podgrupę lub oddzielne osoby z tej samej grupypopulacji 14.

Protokół

1. Ekstrakcja retinolu z próbek biologicznych

UWAGA: Wszystkie procedury obsługi i pobierania próbek są prowadzone pod żółtym lub UV filtrowanym światłem, aby zminimalizować degradację.

  1. Ekstrakcja z surowicy
    1. Pipetą podaj 1 mL surowicy (lub tyle, ile jest dostępne) do szklanej probówki o wymiarach 13 x 100 mm (lub podobnych rozmiarów). Zapisz objętość użytej surowicy.
      UWAGA: Zaleca się stosowanie pipety o dodatnim przesunięciu (dodatniej przesunięcia).
    2. Dodaj 1,5x objętość etanolu 200 proof.
    3. Dodaj 25 μL standardu wewnętrznego, na przykład C-23 β-apo-karotenolu (syntetyzowanego z retinalu całkowicie trans-trans, abs = 0,9)9. Zakręć próbkę i wymieszaj przez 15 sekund.
    4. Dodaj 1 ml heksanu, wymieszaj przez 15 sekund i wiruj przez 2 minuty (~1 300 × g) w temperaturze pokojowej.
    5. Używając pipety Pasteura, ostrożnie pipetuj górną warstwę heksanu do nowej szklanej probówki (12 x 75 mm lub 13 x 100 mm).
    6. Powtarzaj kroki 1.1.4 i 1.1.5 2 razy, łącząc trzy ekstrakty heksanu w drugiej probówce. Umieść zebrany ekstrakt heksanu pod delikatnym strumieniem azotu, aż wyschnie.
    7. Dodaj 100 μl metanolu do wysuszonej próbki i natychmiast ją zakręć. Mieszaj roztwór wzdłuż boków probówki, a następnie mieszaj próbkę przez 15 sekund.
    8. Umieść próbki w zamrażarce o temperaturze -80 °C na co najmniej 5 minut.
      UWAGA: Próbki mogą pozostawać przechowywane na tym etapie w temperaturze -80 °C do następnego dnia.
  2. Pobieranie próbek mleka matki
    1. Całkowicie rozmroz próbki mleka i delikatnie odwróć kilka razy, aby upewnić się, że próbki są jednolite. Do szklanej rurki wirówki z śrubą o pojemności 10 mL odmierzyć aliquot mleka o pojemności 0,5-1,5 mL (standardowe 1,0 mL) i zapisać objętość użytej objętości.
    2. Dodaj 1,5x objętość etanolu 200 proof (zawierającego 0,1% butylowanego hydroksytoluenu (w:v)), wymieszaj z wirem przez 15 sekund.
    3. Dodaj 25 μL standardu wewnętrznego, na przykład C-23 β-apo-karotenolu (syntetyzowanego z retinalu all-trans, abs = 0,9)15. Zakręć próbkę i wymieszaj za pomocą wiru.
    4. Dodaj 0,8x objętość próbki mleka 50:50 wodorotlenku potasu do wody (przygotowanej jako w:v, np. 50 g KOH rozpuszczonego w 50 mL wody), mieszaj przez wir przez 15 sekund.
      UWAGA: KOH:woda powinna być przygotowywana w plastikowych pojemnikach (np. HDPE).
    5. Saponify próbki przez 1 godzinę w kąpieli wodnej o temperaturze 45 °C, a następnie krótko mieszaj z wirem co 15 minut.
    6. Dodaj zimną, dejonizowaną lub odwróconą osmozę w tej samej objętości, co początkowa objętość mleka.
    7. Dodaj 1 ml heksanu, mieszaj przez 15 sekund i wiruj przez 2 minuty (~1 300 × g) w temperaturze pokojowej.
    8. Używając pipety Pasteura, ostrożnie pipetuj górną warstwę heksanu do nowej szklanej probówki (12 x 75 mm lub 13 x 100 mm).
    9. Powtórz kroki 1.2.7 i 1.2.8 jeszcze dwa razy, gromadząc heksan w drugiej tubie.
    10. Każdą próbkę poddajemy ekstrakcji fazy stałej (SPE); rozpocznij od podłączenia potrzebnych wkładów SPE (PE 500 mg/3 mL -NH2) do kolektora próżniowego.
    11. Kondycjonuj każdy wkład, przepuszczając przez niego 3 x 2 mL heksanu, nigdy nie pozwalając na spadek poziomu rozpuszczalnika poniżej górnej części materiału opakowania. Zbierz heksan do szklanej rurki o wymiarach 16 x 75 mm i odpowiednio go utylizuj.
    12. Ładuj próbki do wkładów i przeciągaj je z próżnią, aż rozpuszczalnik znajdzie się tuż nad poziomem materiału opakowania. Opłucz każdy wkład 3 x 2 mL heksanu w taki sam sposób jak w kroku 1.2.11. Pozbądź się rozpuszczalnika odpadowego i wymień szklane probówki na nowe o tym samym rozmiarze, oznaczone identyfikatorem próbki.
    13. Przepłucz retinol 3 x 2 mL chlorku metylenu, zbierając tę frakcję.
    14. Susz eluat pod azotem i rekonfunduj w 100 μL metanolu (klasa MS). Wymieszaj próbkę za pomocą wiru i mieszaj rozpuszczalnik po wszystkich stronach probówki. Wirówka przez 20-30 sekund.
    15. Umieść próbki w zamrażarce o temperaturze -80 °C na co najmniej 5 minut.
      UWAGA: Próbki mogą pozostawać przechowywane na tym etapie w temperaturze -80 °C do następnego dnia.
  3. Pobieranie próbek wątroby
    1. W szklanym lejku o średnicy 8 cm złóż i umieść papier filtrujący Whatman #1 o średnicy 15 cm w kształcie stożka. Pod lejek umieść kolbę objętościową o pojemności 50 mL.
    2. Rozmroz tkankę i waż 0,5 g, czyli tyle próbki, ile jest dostępne. Zapisz masę użytej tkanki.
    3. Przełóż próbki do moździerza i tłuczka i zmiel z około 5 g siarczanu sodu.
    4. Dodaj 250 μL wewnętrznego standardu, takiego jak C-2315.
      UWAGA: Estryfikowane formy witaminy A (tj. octan retynylu, butyran retynylu) nie powinny być stosowane, ponieważ próbka ostatecznie zostanie zmylona, co uczyni standard nie do odróżnienia od endogennego retinolu.
    5. W okapu wsyp 10-15 ml chlorku metylenu do moździerza wraz z mieloną próbką wątroby i delikatnie wymieszaj tłuczkiem.
    6. Wlej chlorek metylenu przez papier filtracyjny do kolby objętościowej.
    7. Powtórz kroki 1.3.5 i 1.3.6 jeszcze dwa razy, aby upewnić się, że całkowity rozpuszczalnik w kolbie objętościowej pozostaje poniżej linii.
    8. Użyj pipety Pasteura, aby spłukać pozostałą zawartość zaprawy do lejka za pomocą chlorku metylenu. Kontynuuj dodawanie chlorku metylenu do lejka pipetą Pasteura, aż rozpuszczalnik w kolbie objętościowej osiągnie linię. Zakręć kolbę objętościową, a podczas jej zabezpieczania odwróć kolbę kilka razy.
    9. Wlej około 10 mL ekstraktu z chlorku metylenu do kolby Erlenmeyera o pojemności 25 mL. Przelej 5 mL roztworu do szklanej rurki do wirówki o pojemności 10 mL z nakrętką na zakrętkę. Susz próbkę pod delikatnym strumieniem gazu azotowego.
    10. Próbkę rekonfunduj w 2 mL etanolu + 0,1% butylowanego hydroksy-toluenu i wiru, aby wymieszać próbkę.
    11. Dodaj 0,8 mL wodorotlenku potasu w formie 50:50 (w:v) do wody i mieszaj wirem przez 15 sekund.
    12. Saponify próbki przez 1 godzinę w kąpieli wodnej o temperaturze 45 °C, a następnie krótko mieszaj z wirem co 15 minut.
    13. Dodaj 0,1 mL zimnej wody zdejonizowanej lub odwróconej osmozy.
    14. Dodaj 1 ml heksanu, mieszaj przez wir przez 15 sekund i wiruj przez 2 minuty (~1 300 × g).
    15. Używając pipety Pasteura, ostrożnie pipetuj górną warstwę heksanu do nowej szklanej probówki (12 x 75 mm lub 13 x 100 mm).
    16. Powtórz kroki 1.3.14 i 1.3.15 jeszcze dwa razy, gromadząc heksan w drugiej tubie.
    17. Osusz zgromadzony heksan pod azotem i odtworz w 100 μL metanolu (klasy MS). Wymieszaj próbkę za pomocą wiru i mieszaj rozpuszczalnik po wszystkich stronach probówki. Wiruj przez 20-30 sekund i umieść próbki w zamrażarce o temperaturze -80 °C na co najmniej 5 minut.
      UWAGA: Próbki mogą pozostawać przechowywane na tym etapie w temperaturze -80 °C do następnego dnia.

2. Oczyszczanie i ilościowe oczyszczanie próbek za pomocą wysokowydajnej chromatografii cieczowej

  1. Przygotuj system HPLC 1 z kolumną C18 (5 μm, 4,6 x 250 mm) i detektorem UV-Vis ustawionym na 325 nm.
  2. Przygotuj fazę mobilną acetonitrylu 92:8, mierząc objętości acetonitrylu i wody osobno, a następnie wlewając wodę do acetonitrylu. Przefiltruj mieszany roztwór próżniowo, aby usunąć rozpuszczony gaz.
  3. Włącz system HPLC 1, wykonaj czyszczenie rozpuszczalnika na HPLC, jeśli jest to konieczne, a następnie ustaw przepływ na 1 mL/min przez co najmniej 15 minut, aby system był w pełni wyrównany.
  4. Wstrzyknij standardy do systemu HPLC.
    1. Aby ilościowo określić stężenia retinolu, wstrzyknij 25 μL wewnętrznego roztworu standardu C-23 i zapisz wynik 3 razy, aby porównać z próbkami.
    2. Wstrzyknij standard retinolu, aby określić dokładny czas retencji systemu używanego do prowadzenia zbierania frakcji i ilościowania retinolu.
  5. Przygotuj system HPLC 2 (komponenty są takie same jak w systemie 1). Jeśli używasz jednego systemu HPLC do obu etapów, zamień kolumnę używaną do pierwotnego oczyszczania drugą, identyczną, aby zminimalizować potencjalne przenoszenie związków z próbek.
  6. W systemie 2 filtruj metanol próżniowo, oczyszczaj fazę mobilną HPLC, a następnie przepuszczaj 0,7 mL/min przez 20 minut do wyrównania.
  7. Pobieraj próbki pojedynczo z zamrażarki o temperaturze -80 °C i wiruj w 1300 × g przez 30 sekund w temperaturze pokojowej.
  8. Wstrzyknij pełną próbkę do HPLC, unikając materiału z granulacji. Zacznij rejestrować, czy ilościowo określasz retinol.
  9. Zbierz pik retinolu do małej szklanej rurki (12 x 75 mm lub 13 x 100 mm), gdy rozpuszczalnik przechodzi przez detektor. Zbierz środkową część piku, aby zmaksymalizować czystość, zazwyczaj wartości absorpcji powyżej 0,1 jednostki absorbancji (Rysunek 1), które można dostosować w zależności od stężenia retinolu w próbce. Poczekaj, aż szczyt C-23 się wyludzi i zatrzymaj nagrywanie.
  10. Sucha próbka pod delikatnym strumieniem azotu.
  11. Dodaj 100 μL metanolu (klasy MS) do wysuszonej próbki i natychmiast zakręci. Mieszaj roztwór wzdłuż boków probówki, a następnie mieszaj próbkę przez 15 sekund. Umieść próbki w zamrażarce o temperaturze -80 °C na co najmniej 5 minut.
    UWAGA: Próbki mogą pozostawać przechowywane na tym etapie w temperaturze -80 °C do następnego dnia.
  12. Wyjmuj próbki pojedynczo z zamrażarki o temperaturze -80 °C. Wirówka 1 300 × g przez 30 sekund.
  13. Wstrzyknij pełną próbkę do systemu HPLC 2, unikając materiału z pelletami.
  14. Gdy pik retinolu się wydziela, zbieraj rozpuszczalnik przechodzący przez detektor do małej szklanej fiolki (<1 mL) o stożkowym dnie, a następnie delikatnie wsuń fiolkę do probówki o wymiarach 12 x 75 mm.
  15. Włącz koncentrator próżniowy i pozwól skraplacowi ostygnąć przez 20 minut.
  16. Umieść próbki w zbalansowanej formacji na karuzeli, ustaw temperaturę na zera i próżnię na 05.1, zamknij pokrywę i naciśnij run.
    UWAGA: Próbki zazwyczaj schną w 10-20 minutach. Ważne jest, aby w chromatografie gazowym usunięto cały metanol z próbek.
  17. Po wyschnięciu przelej fiolkę HPLC do bursztynowej fiolki 4 mL z nakrętką i ponownie ją rekonfunduj za pomocą 4-7 μL heksanu.
    UWAGA: Zazwyczaj wynosi to 7 μL, ale jest zmniejszona, gdy podczas oczyszczania próbka ma niskie stężenie. Próbki wątroby mogą być znacznie bardziej skoncentrowane, więc rekonstytuuj je w większej objętości. Celuj w przedział od 75 ng/μL do 400 ng/μL.
  18. Wstrzyknąć 1-5 μL do GC-C-IRMS, aby uzyskać odpowiedni sygnał, oparty na stężeniu próbki potrzebnej do wstrzyknięcia około 75 ng retinolu.

3. Analiza próbek za pomocą GC-C-IRMS

  1. Przygotuj GC kolumną (100% dimetylopolisiloksan, niepolarny, 15 m, 0,25 mm ID, 0,25 μm film) i przepływem helu 1,2 mL/min.
  2. Przeprowadz kontrole systemowe, aby upewnić się, że nie ma wycieków, a źródło IRMS jest odpowiednio skoncentrowane na masach 44, 45 i 46.
    Codziennie jako pierwszy zastrzyk należy podawać 2 μL standardu retinolu wzbogaconego o stężeniu 75 ng/μL 13C, aby określić czas retencji i zweryfikować działanie systemu.
  3. W oprogramowaniu do akwizycji załaduj metodę instrumentu, wpisz nazwę próbki i naciśnij próbkę na start. System GC-C-IRMS wykona procedurę wstępnej konfiguracji systemu. Gdy na przedniej stronie GC zapali się zielona lampka Ready to Inject , wstrzyknij ustaloną objętość próbki do wtryskiwacza PTV z programowalną temperaturą i waporyzacją, wyjmij strzykawkę i naciśnij przycisk Start .
  4. Uruchamiaj wtryskiwacz PTV w trybie PTV Splitless, z kolumną ochronną umieszczoną na górze wkładki wtryskiwacza, co umożliwia symulowany wtrysk na kolumnie. Ustaw program wtryskiwacza, aby zaczynał od początkowej temperatury 50 °C, utrzymuj przez 1,05 minuty, zwiększ do 200 °C z częstotliwością 14,5 °C/s, utrzymuj na 200 °C przez 1 minutę, następnie przejdź do 300 °C przy 14,5 °C/s, a następnie utrzymuj do czyszczenia wtryskiwacza przez 4 minuty z przepływem helu rozdzielonym 50 mL/min przed powrotem do 50 °C dla Następny zastrzyk.
  5. Zaprogramuj temperaturę piekarnika GC na początkową temperaturę 50 °C, utrzymuj przez 1 minutę, stopniowo zwiększ z 30 °C/min do 150 °C, następnie z 15 °C/min na 265 °C, następnie do 295 °C przy 40 °C/min, a następnie utrzymuj przez 2,50 minut przed schłodzeniem do 50 °C przed kolejnym wstrzyknięciem.
  6. Upewnij się, że każdy chromatogram zaczyna się od trzech impulsów CO2 (czystość 99,999%), skalibrowanych względem sacharozy (IAEA-CH-6). Dostęp prowadzi do oprogramowania do pozyskiwania.
  7. Po każdym wstrzyknięciu należy sprawdzić każdy chromatogram, aby upewnić się, że szczyt retinolu jest obecny i czy całkowanie jest odpowiednie. Wykorzystaj oprogramowanie do automatycznego integrowania szczytów retinolu, tak jak to możliwe, aby zminimalizować potencjalne błędy wynikające z ręcznych wdrożeń. Wykorzystaj standardowe ustawienia detekcji nachylenia początkowego i końcowego na poziomie 20 mV/s.
    UWAGA: Maksymalna amplituda 200 mV lub mniejsza jest zbyt mała, aby zapewnić dokładny pomiar stosunku 13°C.
  8. Eksportuj dane chromatogramu do programu kalkulacyjnego. Uwzględnij następujące kluczowe kategorie danych: nazwę próbki, czas retencji szczytu, amplitudę szczytową przy masie 45 oraz AT%.
    UWAGA: Dane eksportowane można określić za pomocą zdefiniowanej metody eksportu. Wartość δ jest korzystna dla łatwiejszej interpretacji, ale nie jest wymagana do obliczeń.

4. Obliczanie całkowitych zapasów witaminy A w organizmie oraz stężenia w wątrobie

  1. Równania rozcieńczania izotopów retinolu.
    UWAGA: Preferowane równanie równowagi izotopów oraz odpowiednia notacja stosowane przez niektórych badaczy opierają się na zaleceniach Międzynarodowej Unii Chemii Czystej i Stosowanej16. Zauważamy, że niektóre grupy badawcze stosują notację, która stara się zachować historyczne wykorzystanie czynników stosowanych w równaniach RID. Zauważamy również, że czynniki i literatura wspierająca mogą się różnić w tym, czy mają bardziej bezpośrednie zastosowanie do obliczeń TBS czy stężenia w wątrobie, w zależności od projektu badania, modelu eksperymentalnego i wyników analitycznych.
    1. Określ zawartość retinolu w surowicy TTR na podstawie izotopowej zawartości 13°CCO2 po spalaniu według następującego równania:
       figure-protocol-1    
      Gdzie F to ilość izotopowa (znana również jako frakcja izotopowa, w skrócie 'x') dawki śledźnika (Fa), retinolu w surowicy na poziomie wyjściowym (Fb) oraz retinolu surowicy po dawkowaniu i mieszaniu z pulą ciała (Fc). Okresy mieszania stosowane u ludzi to zazwyczaj około 14-21 dni, ale mogą być krótsze lub dłuższe, w zależności od konkretnego projektu badania.
    2. Użyj równań RID do obliczenia VA TBS zgodnie z następującym równaniem bazowym.
      figure-protocol-2
      Gdzie
      figure-protocol-3
      UWAGA: Czynniki wykorzystywane do absorpcji i magazynowania obejmują i) przechowywanie dawki w momencie wyrównania (absorpcja dawki), zwykle szacowane na poziomie od 75% do 90% u zdrowych osób. Szacunkowa temperatura może zostać zmniejszona, jeśli występuje stan zapalny. ii) Utrzymywanie dawki; Stałe: e-kt; k = ln(2)/okres półtrwania retinolu; 32 do 136 dni dla dzieci; 140 dni dla dorosłych); t = dni od podania (zwykle 14-21 dni); Podział na surowicę/wątrobębową traser: TTRserum / TTRliver; 0,65-0,9 przy poborze VA podczas okresu mieszania; 0,9-0,1 przy niskiej dawce tracera, kontrolowanym spożyciu VA i próbkowaniu na czczo.
      figure-protocol-4
    3. Oblicz stężenia VA wątroby z dodatkowymi założeniami dotyczącymi masy wątroby oraz udziału TBS VA w wątrobie.
      figure-protocol-5
      Gdzie
      figure-protocol-6
      Stosunek wątroby do masy ciała jest zwykle szacowany jako stała wiekowa: niemowlęta: 4-4,2%; dzieci: 3%; dorośli: 2,4%; Frakcja TBS w wątrobie zmienia się w zależności od poziomu witaminy A. Wcześniej używane szacunki to marginalny lub niski status VA: 0,5; Odpowiedni status VA: 0,8-0,9.

Wyniki

Przykładowy chromatogram próbki surowicy monitorowany przy 325 nm jest dostępny dla sekcji protokołu 2 (Rysunek 1). W zależności od konkretnego systemu i używanej kolumny, typowy czas retencji dla retinolu wynosi 4-6 minut, a standard wewnętrzny 6-8 minut. Zielony zacieniany obszar pokazuje docelowy zakres zbierania frakcji retinolu, aby zminimalizować zanieczyszczenia. Efektywność ekstrakcji retinolu z surowicy wynosi zazwyczaj ≥ 85%, podczas gdy saponizowane próbki mleka matki i tkanek mają zwykle niższą skuteczność, średnio ~70-80%. Niewielkie ilości cisizomerów retinolu mogą być obserwowane tuż przed lub po głównym piku all-trans podczas oczyszczania HPLC. W próbie przedstawionej na Rysunku 1 nie zaobserwowano znaczącego cisizomeru, ale można go zobaczyć na Rysunku Uzupełniającym 1 w odniesieniu17. Często dodatkowy izomer zostaje rozdzielony podczas drugiego oczyszczania HPLC (nie pokazano) lub podczas rozdzielenia GC (Rysunek 2).

Przykładowe chromatogramy GC-C-IRMS dla standardu, próbki surowicy i pustego pola są pokazane dla sekcji protokołu 3 (Rysunek 2)9. Każda próbka zawiera referencyjne pikiCO2 z wzbogaceniem 13C, skalibrowanym według standardu sacharozy MAEA (MAEA-CH-6).

Eksperymentalna precyzja IRMS (CV%) dla obfitości izotopowej 13°C/całkowity C dla: 1) referencyjnego CO2 wynosiła 0,012 dla stabilności i 0,031 dla liniowości (n = 10 każda); 2) standard retinolu wynosił 0,036 dla stabilności międzydniowej i 0,022 dla liniowości wewnątrzdniowej (n = 4 każdy); oraz 3) eksperymentalna wynosiła 0,073 ± 0,061 w całym okresie początkowym oraz osiem grup dietetycznych u myszoskoczków (n = 46 w 9 grupach)9.

Poniżej znajduje się przykład, jak dane GC-C-IRMS w surowicy są wykorzystywane do obliczania stężeń TBS i wątroby VA określonych 14 dni po podaniu dawki za pomocą równania RID dla metody 4:

Cechy uczestników badania:

Wiek:4 lata
Masa ciała:16,0 kg
Fa (2 węgle oznaczone plus naturalna obfitość):0.11
Fb:0.010757
Fc:0.011057
Zastosowana dawka znacznika:1,0 μmol
Czas od podania:14 dni
Okres półtrwania VA:32 dni
Absorpcja:0.8
Stosunek TTR w surowicy do wątroby (dieta niekontrolowana):0.9
Ułamek TBS w wątrobie:0.8

Kalkulacja:

TTR = (Fc-F b)/(Fa-F c)
TTR = (0,0110568 - 0,010757) / (0,11 - 0,0110568) = 0,0030300213
1/TTR = 1 / 0,0030300213 = 330,03

Utrzymanie dawki = e-kt z okresem półtrwania 32 dni i czasem pobierania próbek 14 dni
k= ln(2)/36 = 0,693147181 / 36 = 0,021660849
t = 14
e-kt = e-0,02166 x 14= 0,738413073

figure-results-1

TBS = 1 × 330,03 x 0,8 x 0,738413073 × 0,9 = 175 μmol

Do obliczania stężeń VA w wątrobie:
Masa wątroby (g) = 1 000 × masa ciała (kg) × 3% (szacunkowo dla dzieci)
Masa wątroby = 1 000 x 16,0 x 0,03 = 480 g
figure-results-2
Stężenie VA w wątrobie = (175 / 480) x 0,8 = 0,29 μmol/g

figure-results-3
Rysunek 1: Chromatogram HPLC próbki surowicy ludzkiej. System HPLC 1 z izokratyczną fazą mobilną 90:10 MeOH:H,2O i detekcją na 325 nm. Pik retinolu jest zbierany dla wartości absorpcji powyżej ~0,1 (obszar zielony zacieniony). Wewnętrzny standard C-23 β-apo karotenolu służy do ilościowego określenia stężenia retinolu w surowicy (jeśli jest to pożądane) podczas tego etapu. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

figure-results-4
Rysunek 2: Chromatogramy GC-C-IRMS wykazujące determinację retinolu 13 C/12 C. Chromatogram GC-C-IRMS standardu (A) retinolu, (B) retinolu oczyszczonego z surowicy oraz (C) iniekcji pustej zaadaptowanej według Gannona i in.9. Trzy ślady dotyczą masy 44 (odpowiadającej 12C16O2), 45 (odpowiadającej 13C16O2 lub 12C16O17O) oraz 46 (odpowiadającej głównie 12C16O18O, co służy do korekty masy 45 dla wkładu 17O). Trzy szerokie piki przed 200 sekundami to piki referencyjneCO2 skalibrowane do materiału referencyjnego Sucrose 13C. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Dyskusja

Opisane metody pomiaru wzbogacenia retinolu o 13C przy użyciu GC-C-IRMS mogą dostarczyć cennych danych do oceny interwencji dietetycznych, 18 modelowania kinetyki witaminy A, 19,20,21 badań klinicznych lub badań populacyjnych z uwzględnieniem RID dla lepszych szacunków statusu VA22.

W tym teście retinol oczyszczony z próbki biologicznej jest przeprowadzany przez kolumnę GC za pomocą helu o jakości badawczej (>99,99999% czystości) z gradientem temperaturowym, oddzielającym go od pozostałych zanieczyszczeń w próbce. Retinol jest spalany, tworząc CO2 i wodę, a woda jest usuwana. CO2 jest przenoszony do IRMS, gdzie mierzy się masy 44, 45 i 46, a δ i AT% określa się względem odniesienia gazuCO2 , które dodatkowo kalibruje się według standardu sacharozy (MAEA-CH-6).

Podczas przygotowania retinolu do wstrzykiwania ekstrahowany retinol musi być najwyższej czystości, aby uzyskać powtarzalne proporcje izotopowe i maksymalizować żywotność platformy analitycznej pomiędzy dokładnymi czyszczeniami. Rozpuszczalniki używane do ekstrakcji powinny mieć najwyższą dostępną stopień czystości, czyli zazwyczaj MS. Wszystkie naczynia szklane, takie jak probówki ekstrakcyjne, pipety Pasteura i fiolki do wtrysków HPLC, powinny być nowe, ponieważ trudno je odpowiednio wyczyścić do analizy MS. Ważne jest, aby używać szklanych rurek i pipet zamiast plastiku, aby zminimalizować plastyfikatory w ekstraktach, które gromadzą się na GC i kolumnach spalania.

Modyfikacje w tym procesie analizy próbek można było wprowadzać w zależności od konkretnego projektu badania i źródła próbkowania. Na przykład jeden system HPLC prawdopodobnie może być zoptymalizowany do oczyszczania retinolu. Z naszego doświadczenia wynika, że wymagałoby to wody w fazie ruchomej i wymagałoby albo ruchomego gradientu fazowego, albo wydłużonego czasu schnięcia próbki przed wtryskiem na GC-C-IRMS. Stwierdziliśmy, że stosowanie dwóch systemów HPLC z krótkimi metodami izokratycznymi równoważy wymagania analityczne z uzyskaniem jasnych sygnałów na GC-C-IRMS (rysunek 2). Zastosowanie LC-MS/MS mogłoby zapewnić bardziej uprościony proces analityczny dla próbek RID7. Jednak czułość GC-C-IRMS ma wyraźne zalety w postaci możliwości stosowania niższych dawek i ilości znakowania izotopów, ilościowego określania znaczników w dłuższych punktach czasowych oraz analizy próbek z niskim wzbogaceniem próbki.

Ograniczenia tej metody obejmują konieczność wielu instrumentów, fachową obsługę techniczną oraz ograniczenia przepustowości próbek wynikające z dłuższego czasu przygotowania próbki. Czas potrzebny na przygotowanie każdej próbki można poprawić poprzez wdrożenie HPLC z automatycznymi możliwościami zbierania frakcji, ponieważ etapy oczyszczania HPLC wykorzystują metody izokratyczne, co skutkuje spójnym czasem retencji analizy. Metoda ta mogła być optymalizowana tak, aby używać tylko jednego oczyszczania HPLC. Stosujemy dwa systemy równolegle, aby zwiększyć przepustowość i ułatwić suszenie próbki przed rekonstytucją w heksanie i wstrzykiwaniem na GC-C-IRMS.

Chociaż GC-C-IRMS jest niezwykle czuły do określania stosunków izotopów, wymaga większej całkowitej masy retinolu próbki, aby uzyskać odpowiedni sygnał retinolowy. Wymagania dotyczące próbki zależą zarówno od ilości próbki, jak i stężenia VA w próbce. Zazwyczaj celuje się w 75 ng retinolu, aby uzyskać silny szczyt, co pozwala na zmienność w transferze GC i wydajności spalania. W praktyce, przy optymalnych warunkach pracy, uzyskaliśmy wystarczający sygnał z próbkami, co skutkowało iniekcjami GC-C-IRMS nawet od 25 ng. Odpowiada to próbce surowicy o niższej objętości (~0,4 mL), niskim stężeniu retinolu (~0,5 μmol/L) oraz niewielkich stratach podczas procesu ekstrakcji i oczyszczania. W analitycznym rozwoju metody RID znaczącą poprawą było przejście na wtryskiwacz PTV. Niska temperatura początkowa zapobiega zbyt szybkiemu rozszerzaniu się heksanu niosącego próbkę, co pozwala na symulowane iniekcje próbek w kolumnie. Bezpośrednie wstrzykiwanie do kolumny maksymalizuje sygnał retinolu, z wadą nieco gorszego kształtu piku i bardziej stałej konserwacji.

Mleko matki zostało zaproponowane jako zamiennik próbek surowicy w teście RID. Zostało to potwierdzone u kobiet karmiących piersią w Zambii, które miały głównie niskie zapasy VA11. Nie została jeszcze zatwierdzona u kobiet z wyższym spożyciem preformowanej VA, jak w krajach o wysokich dochodach, lub w populacjach konsumujących wiele źródeł VA, w tym diety, wzbogacania i suplementacji.

Ocena VA w mleku matki ma kilka zalet w porównaniu z innymi biochemicznymi wskaźnikami statusu VA. Pobieranie mleka matki jest często łatwiejsze niż z krwi, ponieważ nie są potrzebni flebotomiści, a pobieranie mleka matki jest zwykle uważane za mniej inwazyjne dla osób23. Użycie przypadkowych próbek mleka matki jest wygodne i wymaga jedynie 5 ml mleka. Ponadto próbki nie muszą być przetwarzane natychmiast, co skraca czas obsługi próbek, szczególnie w warunkach terenowych. Jednak standaryzacja pobierania próbek dla pełnych próbek mleka matki jest kluczowa, ponieważ stężenia tłuszczu i retinolu są wyższe w mleku ostatnim niż w mleku przednim, a stężenia tłuszczu mlecznego i retinolu zwykle zmieniają się w zależności od pory dnia i odstępu od ostatniego karmienia 1,24. W przypadku próbek przypadkowych najlepiej wyrazić stężenie retinolu na g tłuszczu mlecznego. Tłuszcz mleczny powinien być najlepiej określony po zebraniu metodą krematokrytu25. Próbki powinny być chronione przed światłem. Alikwoty (zazwyczaj 1 do 5 mL) do analizy HPLC muszą być przygotowane w momencie pobierania, ponieważ mleko nie jest jednorodne po zamrożeniu i rozmrożeniu.

Istnieją dwie główne okoliczności, w których pomiar wzbogacenia VA o 13C w wątrobie może być możliwy i interesujący. Najczęstsza sytuacja dotyczy stosowania 13retinolu oznaczonego C-w badaniach na zwierzętach podczas pobierania wątroby. Obliczone TBS VA będą porównywane z stężeniem VA w wątrobie określonym przez HPLC/UPLC, ale wzbogacenie zapasów wątrobowych o 13C jest również przydatne do określenia, jak znacznik jest rozmieszczony w krążeniu w porównaniu do magazynów długoterminowych. Dodatkowo, w niektórych wyjątkowych przypadkach, możliwe jest pobranie próbek biopsji wątroby od ludzi, którzy wyrazili zgodę i przyjęli deklarowaną dawkę witaminyA 26,27. Próbki te są również przydatne do walidacji i testowania mieszania 13C-retinolu. Przetwarzanie próbki wątroby rozpoczyna się od zmielenia odmierzonej próbki bezwodnego siarczanu sodu, aby zatrzymać wodę i rozłożyć tkankę. Następnie jest on ekstrahowany za pomocą 50 mL chlorku metylenu przez papier filtracyjny. Część jest suszona pod azotem i rekonstytuowana w etanolu z 0,1% butylowanym hydroksy-toluenem jako konserwantem. Próbka jest saponizowana i pobierana tą samą procedurą, co w przypadku mleka matki.

Oświadczenia

Autorzy nie mają żadnych konfliktów interesów do zgłoszenia.

Podziękowania

Prace te zostały sfinansowane przez NIH-R01 DC019357 oraz Koordynowany Projekt Badawczy MAEA E43035.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Materiał referencyjny 13C możliwy do skali VPDB-LSVEC (Sucrose)Międzynarodowa Agencja Energii AtomowejIAEA-CH-6 Nazwa Narodowego Instytutu Standaryzacji i Technologii: RM 8542
Acetonitryl (klasa HPLC)Fischer ScientificUN1648
Etanol (czysty 200 proof, bezwodny ≥ 99.5%)Sigma459836
Szklane pipety pasteuraJakikolwiek
Szklane probówkiJakikolwiek
Hel (research grace, (>99,9995% czystości)Jakikolwiek
HeksanySigma178918
Metanol (klasa MS)VWRMSPP-A-456
Moździerz i tłuczek, ceramikaJakikolwiek
Pipeta o dodatnim wyporze 3-25 & micro; LGilsonFD10002
Pipeta o dodatnim przeporze 10-100 & micro; LGilsonFD10004
Pipeta o dodatnim przeporze 50-250 &; LGilsonFD10005
Pipeta o dodatnim przeporze 100-1000 i mikro; LGilsonFD10006
Wodorotlenek potasuFisher ScientificUN1813
Jakościowy papier filtrujący #1 150 mmWhatman1001-150
Lejki rozdzielająceJakikolwiek
Siarczan sodu, bezwodnyFischer ScientificS415-212
Kolby objętościowe (50 mL)Jakikolwiek

Bibliografia

  1. Tanumihardjo, S. A., et al. Biomarkers of nutrition for development (BOND)-vitamin A review. J Nutr. 146 (9), 1816S-1848S (2016).
  2. Gannon, B. M., et al. Selected laboratory-based biomarkers for assessing vitamin A deficiency in at-risk individuals. Cochrane Database Syst Rev. 5 (5), CD013742(2025).
  3. Furr, H. C., et al. Stable isotope dilution techniques for assessing vitamin A status and bioefficacy of provitamin A carotenoids in humans. Public Health Nutr. 8 (6), 596-607 (2005).
  4. Lietz, G., et al. Current capabilities and limitations of stable isotope techniques and applied mathematical equations in determining whole-body vitamin A status. Food Nutr Bull. 37 (2 Suppl), S87-S103 (2016).
  5. Gannon, B. M., Tanumihardjo, S. A. Comparisons among equations used for retinol isotope dilution in the assessment of total body stores and total liver reserves. J Nutr. 145 (5), 847-854 (2015).
  6. Bausch, J., Rietz, P. Method for the assessment of vitamin A liver stores. Acta Vitaminol Enzymol. 31 (1-5), 99-112 (1977).
  7. Oxley, A., et al. An LC/MS/MS method for stable isotope dilution studies of β-carotene bioavailability, bioconversion, and vitamin A status in humans. J Lipid Res. 55 (2), 319-328 (2014).
  8. Preston, T. Existing and emerging technologies for measuring stable isotope labelled retinol in biological samples: isotope dilution analysis of body retinol stores. Int J Vitam Nutr Res. 84 (Suppl 1), 30-39 (2014).
  9. Gannon, B. M., et al. 13C natural abundance of serum retinol is a novel biomarker for evaluating provitamin A carotenoid-biofortified maize consumption in male Mongolian gerbils. J Nutr. 146 (7), 1290-1297 (2016).
  10. Green, M. H., Green, J. B. Use of the paired retinol isotope dilution test, but with a single isotope dose, to assess the impact of a vitamin A intervention on vitamin A stores in theoretical children with low stores. J Nutr. 154 (10), 3151-3156 (2024).
  11. Kaliwile, C., et al. Breast milk-derived retinol is a potential surrogate for serum in the 13C-retinol isotope dilution test in Zambian lactating women with vitamin A deficient and adequate status. J Nutr. 151 (1), 255-263 (2021).
  12. Howe, J. A., Valentine, A. R., Hull, A. K., Tanumihardjo, S. A. 13C natural abundance in serum retinol acts as a biomarker for increases in dietary provitamin A. Exp Biol Med (Maywood). 234 (2), 140-147 (2009).
  13. Sheftel, J., Gannon, B. M., Davis, C. R., Tanumihardjo, S. A. Provitamin A-biofortified maize consumption increases serum xanthophylls and 13C-natural abundance of retinol in Zambian children. Exp Biol Med (Maywood). 242 (15), 1508-1514 (2017).
  14. Gannon, B. M., et al. Comparison of total body vitamin A stores using individual versus population 13C-natural abundance of serum retinol in preschool children and women residing in six diverse African countries. J Nutr. 153 (4), 949-957 (2023).
  15. Tanumihardjo, S. A., Howe, J. A. Twice the amount of α-carotene isolated from carrots is as effective as β-carotene in maintaining the vitamin A status of Mongolian gerbils. J Nutr. 135 (11), 2622-2626 (2005).
  16. Coplen, T. B. Guidelines and recommended terms for expression of stable-isotope-ratio and gas-ratio measurement results. Rapid Commun Mass Spectrom. 25 (17), 2538-2560 (2011).
  17. Tanumihardjo, S. A., et al. Synthesis of 13C2-retinyl acetate and dose preparation for retinol isotope dilution tests. J Vis Exp. (222), e68535(2025).
  18. Gannon, B., et al. Biofortified orange maize is as efficacious as a vitamin A supplement in Zambian children even in the presence of high liver reserves of vitamin A: a community-based, randomized placebo-controlled trial. Am J Clin Nutr. 100 (6), 1541-1550 (2014).
  19. Gannon, B. M., Valentine, A. R., Davis, C. R., Howe, J. A., Tanumihardjo, S. A. Duration of retinol isotope dilution studies with compartmental modeling affects model complexity, kinetic parameters, and calculated vitamin A stores in US women. J Nutr. 148 (8), 1387-1396 (2018).
  20. Lopez-Teros, V., et al. The "super-child" approach is applied to estimate retinol kinetics and vitamin A total body stores in Mexican preschoolers. J Nutr. 150 (6), 1644-1651 (2020).
  21. Green, M. H., et al. Use of population-based compartmental modeling and retinol isotope dilution to study vitamin A kinetics and total body stores among Ghanaian women of reproductive age. Curr Dev Nutr. 8 (11), 104484(2024).
  22. Engle-Stone, R., et al. Filipino children with high usual vitamin A intakes and exposure to multiple sources of vitamin A have elevated total body stores of vitamin A but do not show clear evidence of vitamin A toxicity. Curr Dev Nutr. 6 (8), nzac115(2022).
  23. Stoltzfus, R. J., Underwood, B. A. Breast-milk vitamin A as an indicator of the vitamin A status of women and infants. Bull World Health Organ. 73 (5), 703-711 (1995).
  24. Ruel, M. T., Dewey, K. G., Martinez, C., Flores, R., Brown, K. H. Validation of single daytime samples of human milk to estimate the 24-hour concentration of lipids in urban Guatemalan mothers. Am J Clin Nutr. 65 (2), 439-444 (1997).
  25. Lucas, A., Gibbs, J. A., Lyster, R. L., Baum, J. D. Creamatocrit: simple clinical technique for estimating fat concentration and energy value of human milk. Br Med J. 1 (6119), 1018-1020 (1978).
  26. Furr, H. C., Clifford, A. J., Bergen, H. R. 3rd, Jones, A. D., Anderson, D. P., Olson, J. A. Vitamin A concentrations in liver determined by isotope dilution assay with tetradeuterated vitamin A and by biopsy in generally healthy adult humans. Am J Clin Nutr. 49 (4), 713-716 (1989).
  27. Haskell, M. J., et al. Assessment of vitamin A status by the deuterated-retinol-dilution technique and comparison with hepatic vitamin A concentration in Bangladeshi surgical patients. Am J Clin Nutr. 66 (1), 67-74 (1997).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Wzbogacanie witamin Awitamina A znakowana 13Cekstrakcja retinoid wanaliza surowicyanaliza mleka kobiecegooczyszczanie metod HPLCanalizator elementarnyekstrakcja do fazy sta ej
Film wkrótce dostępny
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.