Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

In Situ Wykrywanie metabolicznie aktywnych komórek w tkance raka wątrobowokomórkowego za pomocą kriosekcji opartej na MTT

323 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/68575

⸱

31 października 2025

 ,  ,  ,  , 
1Gastroenterology Department, First Hospital of Quanzhou Affiliated to Fujian Medical University, 2Medical School, Huaqiao University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawiamy tutaj prosty protokół wykrywania metabolicznie aktywnych komórek w tkance raka wątrobowokomórkowego za pomocą kriosekcji opartej na MTT. Metoda ta może być również stosowana do wykrywania aktywnych komórek in situ w innych tkankach lub narządach.

Streszczenie

Nowe dowody, w tym wcześniejsze badania, wskazują na subpopulację komórek w tkankach raka wątrobowokomórkowego (HCC), które wykazują wyższą aktywność metaboliczną i odporność na przemianę. Te komórki są kluczowymi czynnikami postępu guza i oporności na terapię. Jednak istniejące metody wykrywania żywotnych komórek in situ często naruszają integralność tkanek, zmieniają żywotność komórek lub są technicznie wymagające. Niniejsze badanie przedstawia nowatorskie, proste, niedestrukcyjne podejście do in situ wykrywania metabolicznie aktywnych komórek w tkankach HCC poprzez mitochondrialnie zależną redukcję bromku 3-(4,5-dimetytoltiazol-2-yl)-2,5-difenylotetrazolu do nierozpuszczalnych kryształów formazonu. Poprzez optymalizację rozmiaru fragmentów tkanki (1 × 1 × 0,2 cm3), warunków hodowli (20% FBS, 1 mg/mL MTT oraz 3-godzinna inkubacja z przerywanym wirowaniem) oraz parametrów kriosekcji (grubość 20 μm, utrwalanie PFA 4% oraz barwienie przeciwbarwne DAPI), uzyskano mapowanie przestrzenne żywotnych komórek HCC w ciągu 5 godzin. Ten opłacalny protokół nie wymaga specjalistycznego sprzętu i utrzymuje architekturę tkanek, umożliwiając przestrzenną identyfikację klastrów komórek o wysokiej żywotności i odporności na przeciążenie w regionach powierzchniowych. Ograniczenia obejmują stopniową utratę żywotności powyżej 6 godzin oraz przemieszczenie kryształów podczas sekcji, co można złagodzić poprzez suplementację FBS i kontrolowane zamrożenie. Metoda ta stanowi praktyczną platformę do izolacji pojedynczych komórek subpopulacji opornych na terapię, co przyczynia się do rozwoju badań nad mikrośrodowiskiem HCC.

Wprowadzenie

Rak wątrobowokomórkowy (HCC), trzecia najczęstsza przyczyna zgonów związanych z nowotworami na świecie, charakteryzuje się wysoką heterogenicznością i wskaźnikami nawrotów1. Ta przestrzenna i czasowa heterogeniczność sprawia, że niektóre populacje komórek w tkankach nowotworowych są bardziej aktywne niż inne pod względem metabolizmu, proliferacji, progresji, tolerancji na stres i oporności na leki. Wykrywanie in situ żywotnych komórek w tkankach HCC ma głębokie znaczenie kliniczne i biologiczne, ponieważ komórki te obejmują proliferujące się podklony, populacje oporne na terapię oraz komórki inicjujące przerzuty. Takie żywotne komórki mogą być kluczowymi czynnikami nawrotu guza, unikania układu odpornościowego i niepowodzenia terapeutycznego2.

Jednak obecne technologie profilowania przestrzennego (np. transkryptomika przestrzenna) wymagają specjalistycznego aparaturowania i wiążą się z wysokimi kosztami, podczas gdy tradycyjne analizy zbiorcze często pomijają przestrzenną heterogeniczność żywotnych komórek oraz ich dynamiczne interakcje z komponentami stromalnymi3. Na przykład pozostałe, żywotne komórki HCC po resekcji wykazują odrębne profile metaboliczne, których nie da się wiernie odtworzyć w rozłączonych układach komórkowych4. Dlatego rozwój technologii detekcji przestrzennej jest niezbędny, aby rozwikłać funkcjonalne powiązania między żywotnymi komórkami nowotworowymi a ich mikrośrodowiskiem, co ostatecznie opracuje precyzyjne strategie terapeutyczne. Chociaż konwencjonalne metody, takie jak cytometria przepływowa czy immunohistochemia (IHC), zostały przez naszą grupę wykorzystane do wykrywania żywotnych komórek w HCC, wymagają one dysocjacji lub fiksacji tkanek, co powoduje utratę kontekstu przestrzennego i utrudnia analizę interakcji między komórkami 5,6. Dlatego opracowanie nieniszczycielskich, wysokorozdzielczych technologii do wykrywania in situ żywotnych komórek jest kluczowe dla wyjaśnienia mechanizmów oporności na HCC i kierowania precyzyjnymi terapiami.

Aby szybko wykryć i wyświetlić żywotne komórki w tkankach HCC in situ bez destrukcyjnego leczenia, opracowano prostą metodę hodowli tkanek opartą na 3-(4,5-dimetylotiazol-2-yl)-2,5-difenylottetrazolowym bromku (MTT). Krótko mówiąc, świeże, cienkie tkanki HCC (około 1 × 1 × 0,2 cm3) były najpierw hodowane w podłożu DMEM przez 3 godziny, zawierające 20% surowicy płodowej bydła (FBS) oraz MTT (1 mg/mL). Następnie, po utrwaleniu 4% paraformaldehydu (PFA) i montażu zawierającym DAPI, zamrożone szkiełka tkankowe osadzone w OCT (grubość 20 μm) poddawano mikroskopowej obserwacji pod jasnym lub UV światłem. Żywotne komórki będą wykazywać fioletowe, fioletowo-czerwone lub fioletowo-czarne ubarwienie. Dzięki temu protokołowi z powodzeniem wykryliśmy żywotne komórki w tkankach HCC w ciągu 5 godzin. Jednocześnie ta metoda zachowuje mikroarchitekturę 3D, jest kompatybilna z analizą multiomiki w dalszej fazie i jest prosta, a także oszczędna w czasie i kosztach. Jednak ta metoda wykazuje pewne ograniczenia. Wieloetapowe procesy płukania, sekcjonowania i hodowli mogą wywoływać deformacje strukturalne i apoptozę w tkankach, zwłaszcza w próbkach o wysokim przemionie metabolicznym, takich jak tkanka HCC w tym badaniu. Dodatkowo, zwiększona grubość przekrojów kriosekcyjnych obniża przejrzystość i płaskość mikroskopowych obserwacji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie eksperymenty przeprowadzono zgodnie z Deklaracją Helsińską i zatwierdzono przez Komisję Etyczną Pierwszego Szpitala Afiliowanego w Quanzhou (nr FJMU IACUC2021257). Tkanki HCC zostały chirurgicznie usunięte i pobrane w Pierwszym Szpitalu Quanzhou, afiliowanym przy Uniwersytecie Medycznym w Fujian, za świadomą zgodą pacjentów. Ten eksperyment wymaga standardowych środków ochronnych, w tym noszenia fartucha laboratoryjnego, jednorazowej maski i rękawiczek.

1. Przygotowanie tkanek

  1. Umieść sterylną 9 cm szalkę Petriego na lodzie. Dodaj 30 ml lodowatej soli fosforanowej (PBS).
  2. Natychmiast przenieś chirurgicznie usuniętą ludzką tkankę HCC do PBS.
  3. Delikatnie mieszaj naczynie przez 5 sekund, aby usunąć zanieczyszczenia krwi. Aspiruj PBS za pomocą sterylnej pipety.
    UWAGA: Powtórz trzy razy.
  4. Przenieś tkankę na pokrywkę szalki Petriego.
    UWAGA: Chusteczki łatwo przylegają do niezwilżonej pokrywki z szalki Petriego, co pozwala na lepsze obsługiwanie.
  5. Przycinaj tkankę na około 1 × 1 ×0,2 cm 3 fragmenty za pomocą sterylnego ostrza chirurgicznego (nr 11).
    UWAGA: Długość i szerokość fragmentów mogły się zmieniać, ale głębokość powinna być mniejsza niż 0,2 cm.
  6. Zwróć fragmenty do świeżej misy o pojemności 9 cm wypełnionej 30 mL lodowatego PBS.
  7. Delikatnie mieszaj naczynie przez 5 sekund, aby usunąć zanieczyszczenia krwi. Aspiruj PBS za pomocą sterylnej pipety.
    UWAGA: Powtórz krok 1.7 trzy razy. Jeden fragment tkanki gotowany w PBS (95 °C, 10 min) został ustalony na kontrolę ujemną. Wszystkie etapy wykonuj w warunkach sterylnych.

2. Hodowla tkanek

  1. Do każdej studni płyty 6-dołowej dodaj 1,8 mL kompletnego medium hodowlanego DMEM (wstępnie podgrzanego do 37 °C) zawierającego glukozę (końcowe stężenie = 4,5 g/L) i L-glutaminę (końcowe stężenie = 2 mM). Następnie do każdego odwiertu płyty 6-dołowej należy dodać 0,6 mL FBS (końcowe stężenie = 20% v/v) oraz 0,6 mL zapasu MTT (końcowe stężenie = 1 mg/mL).
  2. Przenieś fragmenty tkanek do dołków za pomocą sterylnych kleszczy.
  3. Włóż płytkę z 6 dołkami do inkubatora. Inkubuj przez 3 godziny w 37 °C z 5%CO2.
    UWAGA: Delikatnie mieszaj talerz przez 3 sekundy co 30 minut. Inkubacja mogła zostać przerwana, gdy powierzchnia fragmentów tkanek przybierze fioletowy lub fioletowo-kolor.

3. Zakończenie i fiksacja

  1. Aspiruj medium MTT. Fragmenty tkanek myj lodowatą solą fizjologiczną.
    UWAGA: Powtórz pięć razy.
  2. Do każdej studni płyty 6-dołowej dodaj 2 mL 4% neutralno-buforowanej formaliny (NBF).
  3. Umieść talerz w lodówce w 4 °C na godzinę.

4. Kriosekcja

  1. Delikatnie przetrzyj fragmenty na czystym, chłonnym papierze.
  2. Umieść tkankę w kryomoldzie wypełnionym związkiem OCT.
    UWAGA: Upewnij się, że tkanka jest całkowicie pokryta związkiem OCT.
  3. Zamroź tkankę w lodówce o niskiej temperaturze w temperaturze -80 °C przez 20 minut.
  4. Zamontuj zamrożony blok na zacisku kriostatu w temperaturze -20 °C.
  5. Przecinaj przekroje o długości 100 μm w temperaturze -20 °C, aż powierzchnia tkanki zostanie odsłonięta.
    UWAGA: Powierzchnia tkanki ma fioletowe zabarwienie.
  6. Zbieraj plastry o średnicy 20 μm za pomocą szkiełek powlekanych klejąco.
    UWAGA: Plasterki tkanki powinny mieć odcień fioletowy, fioletowo-czerwony lub fioletowo-.
  7. Utrwal plasterki w 4% paraformaldehydu (PFA) w temperaturze pokojowej przez 2 minuty.
  8. Delikatnie płucz preparaty PBS przez 1 minutę.
    UWAGA: Powtórz trzy razy.

5. Montaż

  1. Nałóż 1 kroplę medium mocującego zawierającego DAPI (końcowe stężenie: 1 μg/mL).
  2. Przykryj się folią na przykrycie.
  3. Zabezpiecz krawędzie lakierem do paznokci.
    UWAGA: Preparaty z uszczelnionymi krawędziami można przechowywać w temperaturze 4 °C w ciemności, jeśli mikroskopia nie zostanie wykonana natychmiast.

6. Mikroskopia

  1. Wizualizuj fioletowe, fioletowo-czerwone lub fioletowo-ciemne osady formazonu (żywotne komórki) przy powiększeniu 20× pod jasnym polem za pomocą mikroskopii jasnej.
  2. Wykrywanie niebieskich DAPI (jąder) pod oświetleniem UV za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.
  3. Połącz kanały brightfield i fluorescencyjne dla korelacji przestrzennej.
    UWAGA: Używane tutaj oprogramowanie to NIS Element F (wersja 4.00.06).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Badanie to z powodzeniem wykryło komórki metabolicznie aktywne w tkance HCC bez zakłócania architektury tkanek. Po pierwsze, zdjęcia w jasnym polu (Rysunek 1A) pokazały, że powierzchnia tkanki wykazuje gęste pokrycie komórkowe i wielowarstwowe układanie się komórek na warstwie, co potwierdza zachowaną integralność architektoniczną tkanki HCC podczas hodowli i przetwarzania. Warto zauważyć, że skupiska komórek w obszarach powierzchniowych wykazywały wyraźne fioletowo-czerwone osady formazonow...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Obecne metody wykrywania żywotnych komórek in situ nadal napotykają na wieloaspektowe ograniczenia. IHC i immunofluorescencja (IF), szeroko stosowane do identyfikacji markerów proliferacji lub białek związanych z apoptozą, cierpią na zaburzenia integralności błony wywołane przez fiksację formaldehydu7. Ponadto penetracja przeciwciał w grubych przekrojach tkanek jest suboptymalna8. Sondy żywotności fluorescencyjnej, takie jak Calcein-AM, choć skuteczne w znakowaniu ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają żadnych konfliktów interesów do ujawnienia.

Podziękowania

Badania te zostały sfinansowane przez Biuro Nauki i Technologii miasta Xiamen (nr 3502Z20227197), Fundusz Startupowy Uniwersytetu Medycznego Fujian na rzecz badań naukowych (2021QH1240). Dziękujemy Xianying Zhang, Jingjing Zhou oraz Shaocong Weng (Uniwersytet Huaqiao) za ich pomoc techniczną.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
-80 &°; Zamrażarka C (pionowa)Thermo Fisher ScientificTSX60086V
Czysty stół (pionowy przepływ laminarny)AIRTECHSW-CJ-1FD
Inkubator CO2 (165 L)Thermo Fisher ScientificHeracell VIOS 160i (np. 51030400 / 51033559)
Slip (24& razy; 50 mm, #1.5)CITOGLAS (Citotest)0341-3610
Kultura szalki Petriego (90 mm)GNIAZDO752001 (przykład)
Medium montażowe zawierające DAPI.BeyotimeP0131 (5 mL/25 mL)
DMEM (wysoka glukoza, z pirotrosianem)Invitrogen (Gibco)11995-065
FBS (kwalifikowany, pochodzenie amerykańskie)Invitrogen (Gibco)A3160501
Mikroskop fluorescencyjnyNikonSeria ECLIPSE Ti2
Mikrotom zamrażający (kriostat)LeicaCM1950
Szkiełka mikroskopowe (gładkie, 25&; 75 mm)CITOGLAS (Citotest)0317-0001
Odczynnik MTT (proszek)BeyotimeST316
Lakier do paznokci (przezroczysty)Beyotime—
NBF (Neutralna Formalina Buforowana)Beyotime—
Złożenie OCTSAKURA (Sakura Finetek)4583
Mikroskop optyczny (pionowy)NikonSeria ECLIPSE Ci (np. Ci-L)
PBS (500 mL)BeyotimeC0221A
PFA, 4% w PBS (utrwalającym)BeyotimeP0099
Końcówka pipety (1 mL, niskowiązająca)KIRGENKG1313-L
Końcówka pipety (200 & micro; L)Axygen (Corning)T-200-Y (masowy) / T-200-Y-R-S (rackowany, sterylny)
Pipettor (jednokanałowy)Thermo Fisher ScientificFinnpipette F2 (gatunek specyficzny dla zakresu#)
SkalpelHYSTICModel różni się (np. źródło dostawcy 100022208326)
PęsetaHYSTICModel się różni

Bibliografia

  1. Forner, A., Reig, M., Bruix, J. Hepatocellular carcinoma. Lancet. 391 (10127), 1301-1314 (2018).
  2. Sun, Y. F., et al. Dissecting spatial heterogeneity and the immune-evasion mechanism of CTCs by single-cell RNA-seq in hepatocellular carcinoma. Nat Commun. 12 (1), 4091(2021).
  3. Calderaro, J., Couchy, G., Imbeaud, S. Histological subtypes of hepatocellular carcinoma are related to gene mutations and molecular tumour classification. J Hepatol. 67 (4), 727-738 (2017).
  4. Finn, R. S., Qin, S., Ikeda, M. Atezolizumab plus Bevacizumab in unresectable hepatocellular carcinoma. N Engl J Med. 384 (20), 1894-1905 (2020).
  5. Lin, C. C., Zhou, J. P., Liu, Y. P. The silencing of Pokemon attenuates the proliferation of hepatocellular carcinoma cells in vitro and in vivo by inhibiting the PI3K/Akt pathway. PLoS One. 7 (12), e51916(2012).
  6. He, J. The lactate receptor HCAR1 drives the recruitment of immunosuppressive PMN-MDSCs in colorectal cancer. Nat Immunol. 26 (3), 391-403 (2025).
  7. Zhou, H. G., Guo, M. Y., Li, J. Y. Hypoxia-triggered self-assembly of ultrasmall iron oxide nanoparticles to amplify the imaging signal of a tumor. J Am Chem Soc. 143 (4), 1846-1853 (2021).
  8. Baker, A. M., Huang, W. N., Wang, X. M. Robust RNA-based in situ mutation detection delineates colorectal cancer subclonal evolution. Nat Commun. 8 (1), 1998(2017).
  9. Morrison, J. K. Single-cell transcriptomics reveals conserved cell identities and fibrogenic phenotypes in zebrafish and human liver. Hepatol Commun. 6 (7), 1711-1724 (2022).
  10. Qi, L., Liang, J. Y., Li, Z. W. Deep learning-derived spatial organization features on histology images predicts prognosis in colorectal liver metastasis patients after hepatectomy. iScience. 26 (10), 107702(2023).
  11. Aizarani, N., Saviano, A. A human liver cell atlas reveals heterogeneity and epithelial progenitors. Nature. 572 (7768), 199-204 (2019).
  12. Tasdogan, A., Faubert, B., Ramesh, V. Metabolic heterogeneity confers differences in melanoma metastatic potential. Nature. 577 (7788), 115-120 (2020).
  13. Guo, D. Z. Single-cell tumor heterogeneity landscape of hepatocellular carcinoma: Unraveling the pro-metastatic subtype and its interaction loop with fibroblasts. Mol Cancer. 23 (1), 157(2024).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

obrazowanie MTTmapowanie ywych kom rekmikro rodowisko guzaoporno na terapikryszta y formazanuizolacja pojedynczych kom rek
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.