Artykuł metodologiczny

Ekstrakcja histonów z próbek klinicznych do profilowania epigenetycznego za pomocą spektrometrii masowej

DOI:

10.3791/68584

⸱

21 listopada 2025

 ,  , 
1Department of Experimental Oncology, IEO, European Institute of Oncology IRCCS, 2Department of Oncology and Hematology-Oncology (DIPO), University of Milan

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten umożliwia efektywną ekstrakcję histonów z różnych próbek klinicznych do późniejszej analizy modyfikacji translacyjnej przez LC-MS/MS. Ułatwiając solidne wykrywanie kluczowych modyfikacji histonów, stanowi cenne narzędzie do kompleksowego profilowania epigenetycznego w dużych kohortach klinicznych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obszerne dowody eksperymentalne potwierdzają rolę mechanizmów epigenetycznych w początku, progresji i nawrotach nowotworów. Wśród nich warianty histonowe i ich modyfikacje posttranslacyjne (PTM) regulują organizację i dynamikę chromatyny oraz dostępność genomu, wpływając tym samym na kluczowe procesy DNA, takie jak transkrypcja, replikacja i naprawa uszkodzeń DNA za pomocą tzw. kodu histonowego. Zaburzenia układu histonów PTM są często obserwowane w nowotworach, a niektóre markery służą jako biomarkery diagnostyczne i prognostyczne. Dlatego nowe metody umożliwiające obiektywne i kompleksowe profilowanie histonowego PTM w próbkach klinicznych są niezwykle cenne dla charakteryzowania epigenetycznych krajobrazów guzów. Przedstawiamy tutaj protokół efektywnej ekstrakcji histonów z próbek klinicznych, w tym biopsje zamrożone na zachwiacie szybko, optymalnej temperatury cięcia (OCT) oraz biopsje z parafiną (FFPE) z formacją parafiny (FFPE). To podejście daje białka histonowe o odpowiedniej ilości i jakości do późniejszej analizy oddolnej za pomocą wysokowydajnej chromatografii cieczowej sprzężonej ze spektrometrią mas tandemową (LC-MS/MS). Ten sposób działania umożliwia solidne wykrywanie i ilościowe wykrywanie i ilościowe kluczowe modyfikacje histonów, szczególnie acetylacji i metylacji lizyny, w próbkach pierwotnych nowotworów, zapewniając dodatkową warstwę molekularną do charakteryzacji nowotworu.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W jądrze komórek eukariotycznych histony łączą się z DNA, tworząc nukleosomy, podstawowe jednostki strukturalne chromatyny. Każdy nukleosom składa się z około 146 bp DNA owiniętego wokół oktamera składającego się z dwóch kopii histonów rdzeniowych H2A i H2B, wraz z dwoma dimerami histonów H3 i H4. Ponadto obecny jest również histon łącznikowy H1, który ułatwia organizację chromatyny wyższego rzędu poprzez wiązanie zarówno nukleosomu, jak i rozciągnięcia DNA łączącego między nukleosomami1. Histone są ozdobione szeroką gamą modyfikacji posttranslacyjnych (PTM), które występują głównie na ich N-końcowych ogonach. Modyfikacje te obejmują metylację, różne typy acylacji (acetylacja, propionylacja, butyrylacja itp.), fosforylację, sumoylację, ubikwitylację, ADP-rybozylację oraz krotonylację, spośród którychnajbardziej wyróżniają się metylacja lizyny i argininy oraz acetylacja lizyny. Konkretne typy, lokalizacje i kombinacje modyfikacji histonów tworzą tzw. kod histonowy. Kod ten składa się z różnych modyfikacji posttranslacyjnych (PTM) na N-końcowych ogonach histonów, które są dodawane i usuwane przez specyficzne enzymy modyfikujące histony. Te modyfikacje są następnie rozpoznawane przez białka efektorowe, prowadząc do zmian w strukturze chromatyny, takich jak zagęszczenie czy dekondensacja, co ostatecznie wpływa na kilka procesów biologicznych, w tym naprawę uszkodzeń DNA, replikację, a szczególnie transkrypcję genów 3,4.

Metylacja DNA i histonowe PTM należą do najczęściej badanych cech epigenetycznych w raku3. Najnowsze dowody eksperymentalne wykazały zmiany w poziomach różnych histonowych PTM w kilku typach nowotworów. Warto zauważyć, że utrata H4K20me3 i H4K16ac została zgłoszona jako cechy charakterystyczne nowotworu, ponieważ ich poziom był obniżony praktycznie we wszystkich guzach w porównaniu do zdrowych tkanek4. Nasza grupa zidentyfikowała utratę H3K14ac jako potencjalną cechę rozpoznawczą raka, ilościowo określając jej zmniejszenie w kilku nowotworach w porównaniu do normalnych odpowiedników, stosując podejścia oparte na spektrometrii masowej (MS)5. Ponadto liczne badania podkreślają prognostyczną wartość PTM histonowych, pokazując, że zmiany w ich globalnych poziomach, głównie oceniane immunohistochemią w biopsjach pacjentów, korelują z postępem nowotworu, oceną histologiczną oraz odpowiedzią terapeutyczną 6,7,8. Dlatego analiza histonów PTM w próbkach nowotworów jest ważna dla identyfikacji nowych biomarkerów diagnostycznych i prognostycznych, a także potencjalnych celów tzw. epi-leków8.

Bardzo powszechne metody analizy PTM histonów w liniach komórkowych i próbkach klinicznych opierają się na technikach opartych na przeciwciałach, takich jak immunoblotowanie, immunohistochemia oraz enzymatyczny immunosorbentny test (ELISA)9. Jednak metody oparte na przeciwciałach mają różne ograniczenia, w tym reaktywność krzyżową lub odwrotnie, maskowanie epitopem10. Reaktywność krzyżowa występuje, gdy przeciwciała wiążą się z niezamierzonymi celami o podobnych epitopach, prowadząc do potencjalnych fałszywie pozytywnych wyników, natomiast maskowanie epitopów oznacza przeoczenie wykrycia konkretnego epitopu (histonowego PTM lub wariantu, w tym przypadku) z powodu obecności innych modyfikacji na sąsiednich resztach. Ponadto ilość tkanki potrzebna do analizy modyfikacji histonów za pomocą przeciwciał jest często wysoka, ponieważ jednocześnie można wykryć tylko ograniczoną liczbę PTM, więc do analiz multipleksowanych11 trzeba przetworzyć kilka przekrojów tkanki. Spektrometria mas (MS) stała się metodą wyboru do profilowania histonowych PTM i ich wariantów, przezwyciężając ograniczenia podejść opartych na przeciwciałach 5,8. MS opiera się na wykrywaniu różnicy masy (Δm, masa delta) pomiędzy teoretycznymi a eksperymentalnie mierzonymi masami peptydów i białek. Jest bezstronny, kompleksowy i ilościowy, ponieważ pozwala na identyfikację i ilościową identyfikację PTM oraz wariantów bez konieczności wcześniejszej znajomości ich lokalizacji. To czyni SM szczególnie cennym do czułej i dokładnej analizy zmian histonowych PTM w nowotworach i innych schorzeniach patologicznych8.

Tutaj opisujemy zoptymalizowany protokół ekstrakcji histonów z próbek klinicznych, połączony z profilowaniem histonów PTM opartym na SM, dalej określanym jako workflow epi-proteomics. Biopsje pacjentów są głównie przechowywane jako świeżo mrożone (FF), próbki mrożone w optymalnej temperaturze cięcia (OCT) oraz próbki z parafiną zakorzenioną w formalinie (FFPE)12. Podczas gdy świeże biopsje są zamrażane w ciekłym azocie lub wstępnie schłodzonym izopentanie bez dodania żadnego medium konserwującego13, biopsje zamrożone w OCT zawierają rozpuszczalne w wodzie medium krioprotekcyjne, głównie złożone z poliwinylalkoholu i glikolu polietylenowego, które ułatwia cięcie tkanek14. Próbki FFPE, z kolei utrwalone formaliną i osadzone w parafinie, stanowią najczęstszą metodę przechowywania próbek klinicznych, ponieważ mogą być przechowywane w temperaturze pokojowej przez kilka lat, unikając kosztownej konserwacji przy niskich lub ultra-niskich temperaturach15. Ponieważ biopsje zatrzymniane są wolne od dodatków konserwujących, mogą być bezpośrednio przetwarzane do ekstrakcji histonów, natomiast biopsje zamrożone OCT i FFPE wymagają początkowych kroków usunięcia medium lub utrwalającego. Próbki FFPE wymagają również rozległego odłączania białek i pozyskiwania antygenów.

Protokół ten szczegółowo opisuje metody ekstrakcji histonów z świeżo zamrożonych, osadzonych w OCT i próbek klinicznych FFPE, zapewniając odpowiednią ilość i jakość do dalszej analizy SM poprzez uwzględnienie specyficznych wyzwań związanych z każdym typem zachowania próbki (krok 1). Histony oczyszczone z próbek klinicznych są rozdzielane za pomocą elektroforezy żelu białkowego w warunkach denaturujących (SDS-PAGE), następnie następuje etap deriwacyjny, a następnie enzymatycznie trawione w celu uzyskania peptydów o odpowiedniej długości (4-15 aminokwasów) do analizy spektrometrii masowej oddolnie16 (krok 2). Dokładniej mówiąc, histony są trawione metodą podobną do ArgC, gdzie trypsyna, która zwykle przecina się na końcu C niezmodyfikowanych lizyn (K) i arginin (R), jest indukowana do cięcia tylko na końcu arginin w C, z powodu wcześniejszej chemicznej acylacji niezmodyfikowanych i monometylowanych lizyn bezwodnikiem propionowym (PRO). Następnie trawione peptydy histonowe podobne do Arg-C są acylowane na ogonach N-końcowych przez dodanie izocyjanianu fenylowego (). Ta dalsza deriwatyzacja zwiększa hydrofobiczność peptydów i umożliwia lepsze rozdzielanie peptydów krótkich histonów za pomocą odwrotnej fazy wysokowydajnej chromatografii cieczowej (RP-HPLC), poprawiając identyfikację i ilościową identyfikację izobarycznych peptydoform17,18 (krok 3). Ogólnie rzecz biorąc, opisane tutaj metody podkreślają siłę profilowania histonów opartego na SM w badaniach epigenetycznych nowotworów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Świeżo zamrożone i OCT-zamrożone biopsje tkanek pobierano za zgodą pacjentów poddawanych operacji w Europejskim Instytucie Onkologii (Mediolan), natomiast biopsje FFPE pobierano od pacjentów poddawanych operacji w Istituto Neurologico Carlo Besta (Mediolan). Badanie to zostało zatwierdzone przez Komitet Etyczny Europejskiego Instytutu Onkologii (badanie UID 2550) oraz przez Istituto Neurologico Carlo Besta (badanie CET 39/24).

1. Ekstrakcja histonów z tkanek pochodzących od pacjentów (rysunek 1A)

UWAGA: Aby analizować histony z reprezentatywnych populacji komórek nowotworowych i zmniejszyć zmienność między próbami, zaleca się stosowanie biopsji klinicznych o komórkowości guza co najmniej 50% i bez obszarów martwiczych i/lub rozległej infiltracji immunologicznej.

  1. Wzbogacenie histonów ze świeżo zamrożonych tkanek (szacowany czas trwania: 60 min)
    UWAGA: Wszystkie kroki muszą być wykonywane na lodzie.
    1. Rozmroz tkankę na lodzie i wycij kawałek o ilości około 20-30 mg, zwykle odpowiadający około 2 mm3 tkanki.
    2. Przełóż próbkę do probówki o pojemności 1,5 mL i pokrój tkankę na małe kawałki nożyczkami (Tabela materiałów).
    3. Dodaj 1 mL buforu izolacyjnego jąder (Tabela 1), świeżo uzupełnionego inhibitorami proteaz wymienionymi w Tabeli Materiałów. Potem dobrze wymieszaj.
    4. Przenieś próbkę do homogenizatora Dounce (Tabela materiałów).
      UWAGA: W obecności dużych kawałków tkanki użyj końcówki p1000 (po przecięciu końcówki nożyczkami), aby lepiej zebrać próbkę.
    5. Ujednolicaj tkankę, najpierw używając LUŹNEGO, a potem CIASNEGO tłuczka (Tabela Materiałów), aż fragmenty tkanki staną się niewidoczne gołym okiem.
    6. Przefiltruj ujednoliconą próbkę przez sitko komórek o pojemności 100 μm (Tabela materiałów), aby usunąć zanieczyszczenia tkanki.
    7. Intensywnie pipetuj w górę i w dół za pomocą p200, aby rozpuścić błonę plazmatyczną i przenieść próbkę do nowej probówki 1,5 mL.
    8. Rozpylaj jądra komórek przez wirowanie w ilości 2 300 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C za pomocą wirówki stołowej (Tabela materiałów).
    9. Usuń supernatant i ponownie zawiesij granulki jądrowe w 50-100 μL buforu izolacyjnego jąder, uzupełnionym 0,1% SDS, aby rozpuścić membranę jądrową (Tabela materiałów).
    10. Dodaj 250 U nukleazy benzonazy, aby trawić kwasy nukleinowe, dobrze wymieszaj i inkubuj przez 2 minuty w temperaturze 37°C (Tabela materiałów).
      UWAGA: Jeśli próbka jest nadal lepka, sonikację można również przeprowadzić w kąpieli wodnej (ustawienie: 10 min 30s ON/30s OFF; moc: wysoka; temperatura: 4 °C). Po tym etapie próbki można przechowywać w temperaturze -20 °C.
  2. Wzbogacenie histonów z próbek OCT (szacowany czas trwania: 90 min)
    UWAGA: Protokół ten został zoptymalizowany dla czterech/pięciu przekrojów OCT o grubości 10 μm, odpowiadających 20-60 mg tkanki. Jednak liczba przekrojów tkanek zależy od rodzaju biopsji klinicznej oraz całkowitej powierzchni tkanek. Biorąc pod uwagę niedobór próbek klinicznych, można przeprowadzić ekstrakcję z mniejszej ilości tkanki początkowej, nawet jeśli może to skutkować mniejszym wykrywaniem modyfikacji histonów.
    1. Umieść cztery lub pięć przekrojów tkanek o grubości 10 μm, odpowiadających około 20-60 mg tkanki, w probówce o pojemności 1,5 mL.
    2. Przemyj sekcje 1 mL lodowatego 70% EtOH (Tabela 1) przez 2 minuty na obrotowym kole (Tabela materiałów) w temperaturze 4 °C.
    3. Wirówka w 16 000 x g przez 2 minuty w 4 °C w wirówce stołowej.
    4. Powtarzaj kroki 1.2.2 i 1.2.3 łącznie 3 razy.
    5. Próbki nawadniaj w 1 mL podwójnie destylowanej wody (ddH,2O) z rotacją (Tabela materiałów) przez 2 minuty w temperaturze 4 °C.
    6. Wirówka w 16 000 x g przez 2 minuty w 4 °C w wirówce stołowej (Tabela materiałów).
    7. Powtórz kroki 1.2.5 i 1.2.6 dwa razy z 1x PBS (Tabela materiałów).
    8. Przejdź do kroku 1.1.2 protokołu wzbogacania z świeżo zamrożonych próbek.
  3. Ekstrakcja histonów z próbek FFPE (szacowany czas trwania: 8 h)
    UWAGA: Opisany protokół został opracowany dla czterech przekrojów FFPE o grubości 10 μm, odpowiadających około 20-60 mg tkanki. W większości analiz MS modyfikacji histonów ilość ta jest nadmierna i stanowi bezpieczny punkt wyjścia, gdy materiał nie jest ograniczający. Jednak można również użyć mniej materiału wyjściowego, co jest szczególnie istotne, biorąc pod uwagę często niewielką ilość tkanki dostępnej podczas analizy próbek klinicznych. Użycie mniejszej ilości materiału wyjściowego, choć wykonalne, zazwyczaj zmniejsza odporność ilościowej dla modyfikacji histonów o niskiej obfitości (np. H3K27ac lub wielometylowane peptydy H3K27/K36), a efekt ten może się różnić w zależności od typu tkanki oraz próbki do próbki. Niemniej jednak nasze laboratorium wykazało, że profilowanie histonowe PTM oparte na SM można skutecznie przeprowadzić na obszarach tkanek z mikrosekcji laserowej próbek FFPE z raka piersi, które mają zaledwie 1 000 komórek18.
    1. Umieść cztery przekroje FFPE o grubości 10 μm, odpowiadające około 20-60 mg tkanki, w probówce o pojemności 1,5 mL.
    2. Dodaj 1 mL środka rozpuszczającego parafinę do próbki i wiru (Tabela materiałów) z maksymalną prędkością przez 30 sekund, aż parafina całkowicie się rozpuści.
      UWAGA: Odczynniki rozpuszczające parafinę są mutagenne, rakotwórcze i łatwopalne, dlatego muszą być stosowane pod chemiczną okrycią.
      UWAGA: Rozpuszczanie parafiny następuje, gdy kawałki parafiny nie są już widoczne gołym okiem, a środek rozpuszczający parafinę ma białawy, jednorodny kolor.
    3. Wirówka 16 000 x g przez 3 minuty w wirówce stołowej i wyrzuć supernatant. Aby uniknąć niepożądanej aspiracji próbki podczas usuwania supernatantu, pompy próżniowe/pipety można zakręcić mniejszym końcówką (np. końcówki p200, p10).
    4. Powtórz krok 1.3.2 i 1.3.3 jeszcze trzy razy (łącznie 4 razy), aby zapewnić całkowite usunięcie parafiny. Alternatywnie, zważ całkowicie odparafinizowaną próbkę, aby uzyskać wskaźnik ilości przetworzonej tkanki.
    5. Dodaj 1 ml roztworu 95% EtOH (Tabela 1) i zacznij wirować z maksymalną prędkością przez 30 sekund, aby zapewnić całkowite ponowne zawiesienie tkanek.
    6. Wirówka 16 000 x g przez 3 minuty w wirówce stołowej i wyrzuć supernatant. Alternatywnie, zważ odwodnioną próbkę, aby mieć wskaźnik ilości przetworzonej suchej tkanki.
    7. Powtórz kroki 1.3.5 i 1.3.6 z 70%, 50% i 20% EtOH (Tabela 1) oraz ddH2O, aby nawodnić próbkę.
    8. Dodaj 200 μL buforu ekstrakcyjnego (Tabela 1).
      UWAGA: Jeśli obecne są większe kawałki tkanki, pokrój je nożyczkami na mniejsze kawałki. W zależności od ilości tkanki można dodać mniejsze/większe ilości buforu ekstrakcyjnego, aby zapewnić prawidłową lizę próbki. Dla szczególnie małych granulek zawieszonych w objętości buforu ekstrakcyjnego poniżej 100 μL, sonikację można przeprowadzić za pomocą urządzenia sonikacyjnego (Tabela materiałów) (30 s ON/30 s OFF: wysokie, 10 cykli).
    9. Homogenizuj tkankę w buforze ekstrakcyjnym przez sonikację za pomocą cyfrowego sonifikatora (Tabela materiałów) z mikrokońcówką 3 mm (>15 cykli, 5 sekund ON/2 min OFF, moc: 15-30%).
      UWAGA: Próbki można uznać za prawidłowo ujednolicone, gdy w roztworze nie są widoczne cząstki tkanki, a bufor ekstrakcyjny wykazuje jednolity, niemętny kolor. Trzymaj próbki w RT podczas cykli sonifikacji. Lód może powodować wydzielanie SDS w buforze ekstrakcyjnym, co upośledza homogenizację tkanek. Prawidłowa sonikacja jest kluczowa, aby osiągnąć pełną lizę tkanek i ekstrakcję białka. Umieść mikrokońcówkę na właściwej wysokości w probówce (nie może dotykać dna probówki, uwalniając plastikowe cząstki, i nie może znajdować się na styku bufora z wyciągiem powietrza, tworząc pianę i pęcherzyki).
    10. Po homogenizacji inkubuj próbki w temperaturze 95 °C przez 45 minut w termomieszaczu. Co 15 minut otwieraj pokrywkę tub, aby pozwolić formaldehydu odparować.
    11. Inkubuj próbki w temperaturze 65 °C przez 4 godziny w termomieszaczu. Otwieraj pokrywkę co 20-60 minut, aby formaldehyd mógł odparować.
    12. Wirówka 16 000 x g przez 1 minutę w RT w wirówce stołowej i przelewa supernatant do nowej rurki.
      UWAGA: Próbki można przechowywać w temperaturze -20 °C.

Tabela 1: Skład bufora. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.

2. Rozdzielczość histonów poprzez SDS-PAGE oraz trawienie w żelu

  1. SDS-PAGE (Rysunek 1B; szacowany czas trwania: 2 godziny)
    1. Aby ocenić czystość histonów i oszacować ich ilość, należy załadować 1/10 ekstraktów histonowych na żel poliakrylamidowy o wartości 17% (SDS-PAGE; Tabela 1) obok znanych ilości rekombinowanych histonów, jak pokazano na Rysunku 1B.
      UWAGA: Zamiast ładować 1/10 ekstraktów histonowych, można załadować 15-50 μg białek, mierzonych testami tolerującymi wysokie stężenia detergentów, takich jak test białka kwasu bicynchoninowego (BCA)19 . Należy jednak pamiętać, że wzbogacenie histonów na całkowite białka może się znacząco różnić między świeżo zamrożonymi, zamrożonymi OCT i próbkami FFPE, a ilościowe określenie ilości histonów może być oparte wyłącznie na SDS-PAGE. 1, 0,5 i 0,25 μg rekombinowanego histonu H3.1 (Tabela materiałów) można załadować jako odniesienie do dokładniejszego ilościowego określenia ilości histonów.
    2. Próbki mieszają z buforem ładowania dodecylosiarczanu litu (LDS) lub z równoważnymi ładunkowymi dla SDS-PAGE (np. bufor Laemmli) z dodatkiem ditiotreitolu (DTT; Tabela materiałów) przy końcowym stężeniu 10 mM.
    3. Denaturuj próbki w temperaturze 95°C przez 5 minut w termomikserze.
    4. Po separacji białek na SDS-PAGE należy zabarwić żel barwieniem Coomassie (Tabela materiałów).
    5. Oszacuj wydajność histonów za pomocą wizualnej lub programowej ilościowej ilościowej20 pasm histonowych w próbkach klinicznych w porównaniu do rekombinowanego histonu H3 załadowanego w znanych ilościach.
  2. Trawienie histonów w żelu (Rysunek 2; szacowany czas trwania: 2 dni)
    UWAGA: Trawienie podobne do ArgC jest stosowane do analizy MS histonowych PTM, ponieważ standardowe trawienie trypsyny generuje zbyt krótkie peptydy, ze względu na wysoką częstotliwość występowania aminokwasów lizyny i argininy w ich sekwencji, co utrudnia wykrywanie peptydów LC-MS oraz identyfikację PTM. Poprzez chemiczną modyfikację lizyn zapobiega się rozszczepieniu tryptycznego w tych miejscach, co skutkuje rozszczepieniem wyłącznie arginin na końcu C, tworząc dłuższe peptydy (4-15 aminokwasów) zawierające zmodyfikowane lizyny w sekwencji; Ogólnie rzecz biorąc, protokół ten ułatwia wykrywanie i pomiar SM zmodyfikowanych peptydów histonowych i został szczegółowo opisany w licznych publikacjach8, 17, 21.
    OPCJONALNIE: Wewnętrzny standard (np. silnie oznakowany spike-in, syntetycznie znakowane peptydy22) może być mieszany z próbkami histonów w proporcji 1:1, aby uzyskać dokładniejszą ilościowość peptydów w MS (rysunek 2B).
    1. Załaduj 3-5 μg próbki histonów na żel poliakrylamidowy o wartości 17%, na podstawie szacowanej ilościowej ilości histonów wykonanej w kroku 2.1.5 (Rysunek 2B).
    2. Po SDS-PAGE wizualizuj białka, barwiąc żel barwieniem Coomasie.
      UWAGA: Aby zapobiec zanieczyszczeniu mogącemu zakłócić analizę LC-MS/MS, zaleca się wykonanie następujących kroków w środowisku wolnym od keratyny, takim jak dedykowany okap, ponieważ keratyna jest silnym zanieczyszczeniem MS.
    3. Taśmy żelowe odpowiadające masie cząsteczkowej białek histonowych rdzenia (taśma żelowa między 10 a 18 kDa, uwzględniając następującą masę cząsteczkową każdego histonu rdzeniowego: H3 około 17 kDa, H2A-H2B około 14 kDa, H4 około 11 kDa) za pomocą skalpela (Tabela materiałów) i przecinały pasy na kawałki o grubości około 1 mm3 każda.
    4. Za pomocą skalpela przenieś kawałki żelu do probówki o pojemności 1,5 mL.
      UWAGA: Aby całkowicie pokryć kawałki żelu, objętości podane poniżej można zwiększyć, zachowując stechiometrię odczynników.
    5. Rozbarw kawałki żelu, dodając roztwór 50% acetonitrylu (ACN) w ddH2O (Tabela 1). Włóż do termomieszacza ustawionego na 1400 obr./min na 10 minut RT, a następnie wyrzuć supernatant.
    6. Powtarzaj krok 2.2.5, aż kawałki żelu całkowicie się odbarwią.
    7. Odsusz kawałki żelu, dodając 100% ACN (Tabela materiałów). Inkubuj mieszanką z prędkością 1400 obr./min przez 10 minut RT, a następnie wyrzuć supernatant.
    8. Powtarzaj krok 2.2.7, aż kawałki żelu będą białe i twarde, a więc całkowicie odwodnione.
    9. Susz kawałki żelu przez 5 minut w RT w wirówce próżniowej (Tabela materiałów).
      UWAGA: Histony są ubogie w cysteiny (tylko dwie cysteiny występują w histonach H3 na pozycjach 96 i 110 (UniprotKB ID P68431), a tylko jedna cysteina występuje w histonie H2B na pozycji 154 (UniprotKB ID B4DR52)). Dodatkowo te cysteiny występują w peptydach, których nie można wykryć przy trawieniu podobnym do ArgC w rozsianym rozsianym od dołu do góry, więc chemiczne addukty gruptiolowych 23 nie są artefaktem w analizie histonów MS, a w opisanym protokole nie przeprowadza się redukcji cysteiny ani alkilacji.
    10. Dodaj do każdej probówki 15 μL roztworu bezwodorku propionowego (PRO) o zawartości 7,7 M (Tabela materiałów) oraz 26 μL 1 M wodorowęglanu amonu (AmBic) (Tabela materiałów) i inkubuj próbki w termomieszaku ustawionym na 350 obr./min przez 10 minut w 37 °C.
      UWAGA: Ponieważ bezwodniki rozpuszczone w buforze reaktywnym mają tendencję do odparowywania, nie przygotowuj mieszanki PRO i AmBic, lecz dodaj je osobno do każdej próbki, aby utrzymać stałe właściwe stężenie PRO w każdej probówce.
    11. Całkowicie pokryj kawałki żelu, dodając 1 M AmBic (zalecana objętość: 80 μL) i inkubuj próbki mieszanką z prędkością 1400 obr./min przez 4 godziny w temperaturze 37°C w termomieszaczu. Usuń cały płyn później.
      UWAGA: Dodaje się 1 M AmBic w celu utrzymania zasadowego pH, co jest idealne do katalizowania propionylacji niemodyfikowanych i monometylowanych lizyn przez PRO.
    12. Przemyj trzy razy ddH2O, inkubując próbki pomiędzy nimi na RT przez 10 minut, mieszając w termomikserze przy 1400 obr./min. Po każdym myciu wyrzucaj płyn.
    13. Dodaj 50% ACN i inkubuj w termomikserze przy 1400 obr./min przez 15 minut w RT. Następnie wyrzuć płyn.
    14. Całkowicie odsusz kawałki żelu, dodając 100% ACN i inkubuj przy 1400 obr./min przez 15 minut w termomikserze w RT. Potem wyrzuć płyn.
    15. Powtarzaj krok 2.2.14, aż kawałki żelu będą wyglądać na białe i suche.
    16. Suche kawałki żelowe 5 minut w RT w wirówce próżniowej.
    17. Do każdej próbki dodaj 4 μL roztworu trypsyny (Tabela 1) oraz 20 μL buforu trawiennego (Tabela 1) i inkubuj przez 10 minut na lodzie, aby umożliwić wchłanianie trypsyny w kawałki żelu.
      UWAGA: Ta inkubacja – przeprowadzana z koncentrowanym roztworem trypsyny i buforem trawienia (50 mM AmBic w ddH2O, tworząc zasadowe pH idealne dla rozszczepienia trypsyny) – pozwala na wchłonięcie enzymu przez kawałki żelu przed jego aktywacją w temperaturze 37 °C.
    18. Gdy skoncentrowana trypsyna zostanie całkowicie wchłonięta, dokładnie pokryj kawałki żelu dodatkowym buforem trawienia (objętość orientacyjna: 80 μL) i inkubuj w temperaturze 37 °C przez noc w termomieszaczu.
    19. Aby wyodrębnić strawione peptydy z kawałków żelu, należy dodać 100 μL 100% ACN i inkubować w 1400 obr./min przez 20 minut w termomiksie w termomikserze.
    20. Zbierz supernatant i przelej go do nowej probówki 1,5 mL.
    21. Dodaj 80 μL 100% ACN do żelowych kawałków i inkubuj przy 1400 obr./min przez 10 minut RT w termomieszaczu.
    22. Zbierz supernatant i zgrupuj go z tym zebranym w kroku 2.2.20, a następnie skoncentruj peptydy w wirówce próżniowej do objętości od 1 do 5 μL.
      UWAGA: Zastosowanie wirówki próżniowej umożliwia odparowanie rozpuszczalnika organicznego (ACN). Zaleca się jednak, aby próbka nie wysychać całkowicie na tym etapie, ponieważ może to negatywnie wpłynąć na kolejny etap derytacji. Jeśli próbka wyschnie, ponownie zawiesij ją w wodzie ddH2Oi sonikuj w kąpieli wodnej przez 5 minut.
    23. Dodaj ddH2O do każdej próbki, do końcowej objętości 15 μL, następnie dodaj 2 μL 1 M wodorowęglanu trietyloammonu (Tabela materiałów) i 3 μL roztworu izocyjanianu fenylowego () (Tabela 1) i inkubuj w 350 obr./min przez 90 minut w termomieszaczu.
      UWAGA: jest mutagenny i rakotwórczy, dlatego zaleca się obchodzenie się z nim pod chemiczną maską. Ponieważ jest wysoce reaktywny i lotny, zaleca się unikanie przygotowywania mieszanki głównej z wodorowęglanu trietyloammonu i, ale zaleca się dodawanie każdego odczynnika osobno, aby zapewnić dokładną obecność stężenia.
    24. Do każdej probówki dodaj 8 μL 1% kwasu trifluoroctowego (TFA; Tabela materiałów) aby zatrzymać derywację za pomocą.
    25. Rozcieńcz każdą próbkę 100 μL Buforu A (Tabela 1) i załaduj je na końcówki C18 (przygotowane zgodnie z opisem w24 lub zakupione od różnych dostawców).
    26. Próbki obracaj w ilości 2 100 x g przez 10 minut w 4 °C w wirówce wirującej z wirnikami obrotowymi, aby umożliwić peptydom histonowym wiązanie się z żywicą C18.
      UWAGA: Próbki można przechowywać na końcówkach Stage w temperaturze 4 °C przez kilka miesięcy.
    27. Dodaj 30 μL bufora elucijnego (Tabela 1) do C18 Stage Tips i umieść końcówki w nowej probówce 1,5 mL. Próbki rotuj w 1000 x g przez 10 minut w wirówce stołowej w temperaturze 4 °C, aby wyluczyć peptydy histonowe.
    28. Skoncentruj próbki do objętości od 1 do 3 μL za pomocą wirówki próżniowej, a następnie dodaj 1% TFA, aby uzyskać końcową objętość 6 μL.
    29. Załaduj 5 μL roztworu peptydu do mikropłytki z 96 dołkami do analizy MS (Tabela materiałów) i zabezpiecz ją matą uszczelniającą (Tabela materiałów).

3. HPLC-MS/MS i analiza danych (Rysunek 3)

UWAGA: Opisane parametry są odpowiednie dla systemu chromatografii cieczowej ESAY-nLC 1200 połączonego przez kolumnę EASY Spray ze spektrometrem mas Q Exactive Plus Orbitrap (Tabela materiałów), ale można także stosować podobne lub równoważne instrumenty z parametrami ad hoc.

  1. HPLC-MS/MS (szacowany czas trwania: 90 min na próbkę)
    1. Wstrzyknąć 3 μL z 5 μL peptydów histonowych z etapu 2.2.29 (odpowiadającego około 0,25-0,8 μg, na podstawie ilościfikacji histonów za pomocą SDS-PAGE) do nanokolumny C18 (Tabela materiałów) przy stałym przepływie 500 nl/min w Buforze A.
    2. Zastosować 55-minutowy gradient liniowy 10%-45% Buforu B z przepływem 250 nL/min do oddzielenia peptydów.
    3. Pobieranie danych MS/MS w trybie zależnym od danych (DDA), aby automatycznie przełączać się między MS1 a MS2 za pomocą dedykowanych pakietów oprogramowania (Tabela materiałów).
      UWAGA: W przypadku pozyskiwania i ogólnych warunków zobacz Tabelę 2.
  2. Analiza danych RAW MS
    UWAGA: W tym protokole ilościowa identyfikacja PTM histonów odbywa się za pomocą EpiProfile, otwartego skryptu (https://github.com/zfyuan/EpiProfile2.0_Family), przyjaznego dla użytkownika i odpowiedniego do standardowych analiz, takich jak te opisane dla metylacji i acetylacji lizyny H3 i H4. Jednak EpiProfile można dostosować do przeprowadzania analiz mniej standardowych modyfikacji oraz na podstawie różnych protokołów przygotowania próbek przez bardziej doświadczonych użytkowników. Prosimy pamiętać, że EpiProfile wymaga licencji MATLAB, aby działać25 lat.
    1. Przeanalizuj pozyskane dane RAW za pomocą oprogramowania EpiProfile 2.0 (wersja PRO-)25 (Tabela materiałów) i ilościowo określ peptydy histonowe, wybierając opcje histone_normal, gdy analiza jest wykonywana bez etykiet, oraz histone_SILAC, gdy używa SUPER-SILAC spike-in. Ustaw ndebug = 0.
    2. Dla każdego peptydu histonowego (np. H3_3-8) oblicz względną ilością (%RA) każdej zmodyfikowanej peptydoformy (np. H3_3-8 unmod, me1, me2, me3) dzieląc jego chromatogram jonów (XIC) obliczony przez EpiProfile przez sumę wszystkich XIC obliczonych dla tego peptydu.
      UWAGA: Opcjonalnie XICs obliczane przez EpiProfile można zweryfikować poprzez inspekcję widm MS oraz ręczne kwantyfikowanie peptydów histonowych przy użyciu dedykowanego układu widm, opisanego w18,26.
    3. Dla każdej peptydoformy oblicz stosunek lekkich do ciężkich (L/H), dzieląc %RA każdego natywnego, lekkiego peptydu przez %RA odpowiadającego mu ciężkiego peptydu pochodzącego z mieszanki SUPER-SILAC, dodanego do każdej próbki.
    4. Przekształc stosunki L/H w skalę logarytmiczną. Aby podkreślić istotne różnice w obfitości peptydoform między próbkami, można przeprowadzić analizę statystyczną, a stosunki L/H we wszystkich próbkach można wizualnie przedstawić jako mapy ciepła i wykresy rozrzutowe, jak na Rysunku 4.

Tabela 2: Lista ustawień akwizycji oraz ogólnych ustawień stosowanych dla LC-MS/MS w systemie używanym w tym protokole. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przeprowadziliśmy ekstrakcję histonów z świeżo zamrożonych i OCT próbek raka piersi oraz z próbek opon FFPE, stosując powyższy protokół. Jak pokazano na rysunku 1A, dla mrożonych próbek usuwaliśmy OCT, gdy był obecny, i homogenizowaliśmy próbki w buforze izolacyjnym jąder zawierającym łagodny detergent (0,1% Triton step 1.1), co umożliwiło izolację jąder. Następnie wyekstrahowaliśmy histony z dodatkiem 0,1% SDS; zamiast tego, w przypadku próbek FFPE, odparafinizowaliśmy, rehydratowaliśmy i o...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisana tutaj metoda zapewnia prosty i solidny sposób pracy umożliwiający efektywną izolację histonów z próbek klinicznych przechowywanych jako świeżo zamrożone, zamrożone OCT oraz biopsji FFPE do profilowania ich krajobrazów modyfikowanych za pomocą analizy MS. Następujący protokół przygotowania próbki poprzez separację SDS-PAGE oraz trawienie PRO-w żelu z trypsyną zapewnia skuteczne usuwanie detergentów, soli i innych zanieczyszczeń MS33 oraz zapewnia dokładną i solidną ilościową ilościową liczb...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy chirurgom i klinicystom z Europejskiego Instytutu Onkologii oraz Istituto Neurologico Carlo Besta za przeprowadzenie biopsji tkanek FF, OCT mrożonych oraz FFPE. Dziękujemy Robertie Noberini za naukową i metodologiczną dyskusję podczas przygotowywania rękopisu oraz za nasze finansowanie: PRIN2022 (CUPG53D23001530006), AIRC (numer grantu IG-2023-28767) oraz Fondazione IEO-Monzino (FIEORDT-2023-BONALDI).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
chemikalia
Histolemon RS dla histologiiCarlo Erba4549122,5 L
Acetonitryl (ACN)Carlo Erba4123411L
Wodorowęglan amonu (AmBic)Sigma AldrichA6141500 g
Nadsiarczan amonu (APS)WDR1.012.010.500500 g
Inhibitor proteazy aprotyninySigma Aldrich  A11535 mg
Nukleaza benzonazowaMerkE101425 KU
Bisakrylamid 30% 37,5 MAppliChemAPA362610001 L
Bufor A 0,1 % kwasu mrówkowego w ddH2OThermo Fisher Scientific10229884500 mL 
Bufor B 0,1 % kwasu mrówkowego / 80% acetonitrylu w ddH2OThermo Fisher Scientific15431423500 mL
Żywica C18Merck66883-UŚrednica 47 mm
Coomassie Instant BlueAbcamab1192111 L
Ditiotreitol (DTT)  WDR441496P25 g
EtanolCarlo Erba4146082,5 L
Leupeptin  Inhibitor proteazySigma-Aldrich L85115 mg
N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine (TEMED)Sigma Aldrich1.107.320100100 mL
Bufor próbek LDS NuPAGEInvitrogenNP00074x
PBS - Fosforanem buforowana sól fizjologiczna MicroGemTL1006500 mL
Izocyjanian fenylu ()Sigma Aldrich185353100 g
Inhibitor proteazy fenylommetylosulfonylowofluorku (PMSF)Sigma Aldrich  P76261 g
Bezwodnik propionowy (PRO)Sigma Aldrich24031150 g
Rekombinowany histon H3.1 CzłowiekNew England BiolabsM25031 & mikro; g/µ L
Trypsyna o stopniu sekwencjonowaniaPromegaV5113100 ug
Inhibitor deacetlazy histonowej deacetlazy z maślani sodu (NaBut)MerckB58875 g
Dodecylosiarczan sodu (SDS)Sigma AldrichL3771100 g
Trietyloammonowy wodorowęglanSigma AldrichT7408100 mL
Kwas trifluorooctowy (TFA)Thermo Fisher Scientific289041x10mL
Tris-HClSigma AldrichT3253100 g
Detergent Triton X-100Sigma-Aldrich X100RS5 g
Kits/ Sprzęt/Oprogramowanie
Mikropłytka 96-dołkowaCorningPCR-96-FS-CNiepirogeniczny, wolny od Rnazy/Dnazy
SaldoKern19024
Wirówka stołowaLaboratorium Biofuge HareusPico, 23396
Urządzenie sonakacyjne BioruptorDiagenoda
Branson Digital Sonifier 250Emerson
Sitnik komórkowy 100 & mikro; mSokół352360
Koncentrator plusEppendorf5305000509
Homogenizator Dounce (np. nbsp; Dounce, Wheaton...)Dounce, Wheaton1 mL młynka do tkanek
EASY-nLC 1200 Chromatografia cieczowaThermo Fisher Scientific
Kolumna EASY-Spray HPLC C18Thermo Fisher ScientificES9022 & mikro; m, 100  Å, 75 & mikro; m x 25 cm
Skrypt EpiProfile2.0https://github.com/zfyuan/EpiProfile2.0_Family
Oprogramowanie Fijihttps://imagej.net/software/fiji/downloads
MATLABhttps://www.mathworks.com
Wyszukiwarka MaxQuanthttps://maxquant.net/maxquant/
Pestel A (luźny)Dounce, Wheaton
Pestel B (ciasno)Dounce, Wheaton
System LC-MS/MS Q Exactive Plus OrbitrapThermo Fisher Scientific
Koło obrotoweThermo Fisher Scientific11496548
SkalpelKiato13010
NożyczkiThermo Fisher Scientific15207266
Mata uszczelniającaCorningAM-96-PCR-RDKompatybilność z automatyzacją
Wirówka wirowa z wychyleniemBeckman coulterAllegra X-15R
Termomikser kompaktowyEppendorf5350
WirPBIVibromix
Oprogramowanie XcaliburThermo Fisher ScientificOPTON-30965

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cutter, A. R., Hayes, J. J. A brief review of nucleosome structure. FEBS Lett. 589 (20 Pt A), 2914-2922 (2015).
  2. Millan-Zambrano, G., Burton, A., Bannister, A. J., Schneider, R. Histone post-translational modifications - cause and consequence of genome function. Nat Rev Genet. 23 (9), 563-580 (2022).
  3. Yu, X., et al. Cancer epigenetics: From laboratory studies and clinical trials to precision medicine. Cell Death Discov. 10 (1), 28(2024).
  4. Fraga, M. F., et al. Loss of acetylation at lys16 and trimethylation at lys20 of histone h4 is a common hallmark of human cancer. Nat Genet. 37 (4), 391-400 (2005).
  5. Noberini, R., et al. Profiling of epigenetic features in clinical samples reveals novel widespread changes in cancer. Cancers (Basel). 11 (5), 723(2019).
  6. Khan, S. A., Reddy, D., Gupta, S. Global histone post-translational modifications and cancer: Biomarkers for diagnosis, prognosis and treatment. World J Biol Chem. 6 (4), 333-345 (2015).
  7. Liu, R., et al. Post-translational modifications of histones: Mechanisms, biological functions, and therapeutic targets. MedComm (2020). 4 (3), e292(2023).
  8. Noberini, R., Robusti, G., Bonaldi, T. Mass spectrometry-based characterization of histones in clinical samples: Applications, progress, and challenges. FEBS J. 289 (5), 1191-1213 (2022).
  9. Fuchs, S. M., Strahl, B. D. Antibody recognition of histone post-translational modifications: Emerging issues and future prospects. Epigenomics. 3 (3), 247-249 (2011).
  10. Voskuil, J. L. The challenges with the validation of research antibodies. F1000Res. 6, 161(2017).
  11. Rothbart, S. B., et al. An interactive database for the assessment of histone antibody specificity. Mol Cell. 59 (3), 502-511 (2015).
  12. Gastman, B., et al. Defining best practices for tissue procurement in immuno-oncology clinical trials: Consensus statement from the society for immunotherapy of cancer surgery committee. J Immunother Cancer. 8 (2), e001583(2020).
  13. Steu, S., et al. A procedure for tissue freezing and processing applicable to both intra-operative frozen section diagnosis and tissue banking in surgical pathology. Virchows Arch. 452 (3), 305-312 (2008).
  14. Snijders, M. L. H., et al. Cryo-gel embedding compound for renal biopsy biobanking. Scientific Reports. 9, 15250(2019).
  15. Sadeghipour, A., Babaheidarian, P. Making formalin-fixed, paraffin embedded blocks. Methods Mol Biol. 1897, 253-268 (2019).
  16. Dupree, E. J., et al. A critical review of bottom-up proteomics: The good, the bad, and the future of this field. Proteomes. 8 (3), 14(2020).
  17. Restellini, C., et al. Alternative digestion approaches improve histone modification mapping by mass spectrometry in clinical samples. Proteomics Clin Appl. 13 (1), e1700166(2019).
  18. Noberini, R., et al. Spatial epi-proteomics enabled by histone post-translational modification analysis from low-abundance clinical samples. Clin Epigenetics. 13 (1), 145(2021).
  19. Olson, B. Assays for determination of protein concentration. Curr Protoc Pharmacol. 73, A 3A 1-A 3A 32 (2016).
  20. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  21. Daled, S., et al. Histone sample preparation for bottom-up mass spectrometry: A roadmap to informed decisions. Proteomes. 9 (2), 17(2021).
  22. Kim, H. J., Ha, S., Lee, H. Y., Lee, K. J. Rosics: Chemistry and proteomics of cysteine modifications in redox biology. Mass Spectrom Rev. 34 (2), 184-208 (2015).
  23. Lindemann, C., et al. Strategies in relative and absolute quantitative mass spectrometry based proteomics. Biol Chem. 398 (5-6), 687-699 (2017).
  24. Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using stagetips. Nat Protoc. 2 (8), 1896-1906 (2007).
  25. Yuan, Z. F., et al. Epiprofile 2.0: A computational platform for processing epi-proteomics mass spectrometry data. J Proteome Res. 17 (7), 2533-2541 (2018).
  26. Noberini, R., Bonaldi, T. A super-silac strategy for the accurate and multiplexed profiling of histone posttranslational modifications. Meth Enzymol. 586, 311-332 (2017).
  27. Valikangas, T., Suomi, T., Elo, L. L. A systematic evaluation of normalization methods in quantitative label-free proteomics. Brief Bioinform. 19 (1), 1-11 (2018).
  28. Noberini, R., Longhi, E., Bonaldi, T. A super-silac approach for profiling histone posttranslational modifications. Methods Mol Biol. 2603, 87-102 (2023).
  29. Garcia, B. A., et al. Chemical derivatization of histones for facilitated analysis by mass spectrometry. Nat Protoc. 2 (4), 933-938 (2007).
  30. Manea, M., Mezo, G., Hudecz, F., Przybylski, M. Mass spectrometric identification of the trypsin cleavage pathway in lysyl-proline containing oligotuftsin peptides. J Pept Sci. 13 (4), 227-236 (2007).
  31. Davies, V., et al. Rapid development of improved data-dependent acquisition strategies. Anal Chem. 93 (14), 5676-5683 (2021).
  32. Herwig-Carl, M. C., et al. Mass spectrometry-based profiling of histone post-translational modifications in uveal melanoma tissues, human melanocytes, and uveal melanoma cell lines - a pilot study. Invest Ophthalmol Vis Sci. 65 (2), 27(2024).
  33. Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nat Protoc. 1 (6), 2856-2860 (2006).
  34. Vai, A., et al. Improved mass spectrometry-based methods reveal abundant propionylation and tissue-specific histone propionylation profiles. Mol Cell Proteomics. 23 (7), 100799(2024).
  35. Chen, J., et al. In-gel nhs-propionate derivatization for histone post-translational modifications analysis in arabidopsis thaliana. Anal Chim Acta. 886, 107-113 (2015).
  36. Nshanian, M., et al. Short-chain fatty acid metabolites propionate and butyrate are unique epigenetic regulatory elements linking diet, metabolism and gene expression. Nat Metab. 7 (1), 196-211 (2025).
  37. Joseph, F. M., Young, N. L. Histone variant-specific post-translational modifications. Semin Cell Dev Biol. 135, 73-84 (2023).
  38. Amatori, S., Tavolaro, S., Gambardella, S., Fanelli, M. The dark side of histones: Genomic organization and role of oncohistones in cancer. Clin Epigenetics. 13 (1), 71(2021).
  39. Mohammad, F., Helin, K. Oncohistones: Drivers of pediatric cancers. Genes Dev. 31 (23-24), 2313-2324 (2017).
  40. Louis, D. N., et al. The 2021 who classification of tumors of the central nervous system: A summary. Neuro Oncol. 23 (8), 1231-1251 (2021).
  41. Deshmukh, S., Ptack, A., Krug, B., Jabado, N. Oncohistones: A roadmap to stalled development. FEBS J. 289 (5), 1315-1328 (2022).
  42. Lopes, M., Lund, P. J., Garcia, B. A. Optimized and robust workflow for quantifying the canonical histone ubiquitination marks h2ak119ub and h2bk120ub by lc-ms/ms. J Proteome Res. 23 (12), 5405-5420 (2024).
  43. Turriziani, B., et al. On-beads digestion in conjunction with data-dependent mass spectrometry: A shortcut to quantitative and dynamic interaction proteomics. Biology (Basel). 3 (2), 320-332 (2014).
  44. Hamza, G. M., et al. Affi-bams: A robust targeted proteomics microarray platform to measure histone post-translational modifications. Int J Mol Sci. 24 (12), 10060(2023).
  45. Nel, A. J., Garnett, S., Blackburn, J. M., Soares, N. C. Comparative reevaluation of fasp and enhanced fasp methods by lc-ms/ms. J Proteome Res. 14 (3), 1637-1642 (2015).
  46. Ledvinova, D., et al. Filter-aided sample preparation procedure for mass spectrometric analysis of plant histones. Front Plant Sci. 9, 1373(2018).
  47. Picard, G., et al. Psaq standards for accurate ms-based quantification of proteins: From the concept to biomedical applications. J Mass Spectrom. 47 (10), 1353-1363 (2012).
  48. Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. The maxquant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics. Nat Protoc. 11 (12), 2301-2319 (2016).
  49. Zhang, C., Liu, Y. Retrieving quantitative information of histone ptms by mass spectrometry. Methods Enzymol. 586, 165-191 (2017).
  50. Thomas, S. P., Haws, S. A., Borth, L. E., Denu, J. M. A practical guide for analysis of histone post-translational modifications by mass spectrometry: Best practices and pitfalls. Methods. 184, 53-60 (2020).
  51. Bauden, M., Kristl, T., Andersson, R., Marko-Varga, G., Ansari, D. Characterization of histone-related chemical modifications in formalin-fixed paraffin-embedded and fresh-frozen human pancreatic cancer xenografts using lc-ms/ms. Lab Invest. 97 (3), 279-288 (2017).
  52. Noberini, R., Uggetti, A., Pruneri, G., Minucci, S., Bonaldi, T. Pathology tissue-quantitative mass spectrometry analysis to profile histone post-translational modification patterns in patient samples. Mol Cell Proteomics. 15 (3), 866-877 (2016).
  53. Sugii, N., Matsuda, M., Tsurubuchi, T., Ishikawa, E. Hemorrhagic complications after brain tumor biopsy: Risk-reduction strategies based on safer biopsy targets and techniques. World Neurosurg. 176, e254-e264 (2023).
  54. Govaert, E., et al. Extracting histones for the specific purpose of label-free ms. Proteomics. 16 (23), 2937-2944 (2016).
  55. An, Y. A., Scherer, P. E. Mouse adipose tissue protein extraction. Bio Protoc. 10 (11), e3631(2020).
  56. Vantaggiato, L., et al. Protein extraction methods suitable for muscle tissue proteomic analysis. Proteomes. 12 (4), 27(2024).
  57. Noberini, R., et al. Extensive and systematic rewiring of histone post-translational modifications in cancer model systems. Nucl Acids Res. 46 (8), 3817-3832 (2018).
  58. Chatzikyriakou, P., et al. A comprehensive characterisation of phaeochromocytoma and paraganglioma tumours through histone protein profiling, DNA methylation and transcriptomic analysis genome wide. Clin Epigenetics. 15 (1), 196(2023).
  59. Noberini, R., et al. Pat-h-ms coupled with laser microdissection to study histone post-translational modifications in selected cell populations from pathology samples. Clin Epigenetics. 9, 69(2017).
  60. Henikoff, S., et al. RNA polymerase II at histone genes predicts outcome in human cancer. Science. 387 (6735), 737-743 (2025).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Ekstrakcja histon wmodyfikacje histon wmodyfikacje potranslacyjneorganizacja chromatynyodkrywanie biomarker wchromatografia cieczowatkanka FFPE

Powiązane artykuły