Wykorzystanie narzędzi optogenetycznych LEXY i LINuS oraz zautomatyzowanej analizy obrazu do ilościowego określenia dynamiki transportu nukleocytoplazmatycznego w żywych komórkach

Podsumowanie

Protokół ten opisuje, jak efektywnie konfigurować i wykonywać zautomatyzowane analizy danych obrazowania żywych komórek uzyskanych ze śledzenia transportu nukleocytoplazmatycznego za pomocą narzędzi optogenetycznych.

Streszczenie

Transport nukleocytoplazmatyczny (NCT) jest niezbędny do utrzymania homeostazy komórkowej, a jego zakłócenie jest związane z różnymi chorobami, w tym zaburzeniami neurodegeneracyjnymi i stwardnieniem zanikowym bocznym. Podkreśla to potrzebę opracowania narzędzi do monitorowania i ilościowego określania NCT. Wśród tych narzędzi znajdują się szybkie i odwracalne sondy optogenetyczne LEXY (Light-inducible nuclear export system) i LINuS (Light-inducible nuclear localization signal), które umożliwiają pomiar dynamiki NCT w żywych komórkach.

Oryginalne publikacje opisują manualną segmentację i kwantyfikację sygnału sondy fluorescencyjnej w jądrze i cytozolu po transfekcji konstruktów LEXY i LINuS w obrazowaniu żywych komórek. Jednak zarówno transfekcja, jak i ręczna segmentacja ograniczają liczbę komórek, które można analizować i są narażone na nieprecyzyjność z powodu potencjalnych błędów zależnych od użytkownika. Podczas gdy duża szybkość i odwracalność zapewniana przez optogenetykę powinna w zasadzie pozwolić na wysoką czułość w wykrywaniu zmian w dynamice NCT, zależy to od parametrów akwizycji i analizy wystarczającej liczby komórek.

W związku z tym ustaliliśmy wektory lentiwirusowe wykazujące ekspresję LEXY i LINuS w celu stworzenia stabilnych linii komórkowych, przetestowaliśmy markery obrazowania na żywo i warunki kontrolne oraz wdrożyliśmy półautomatyczny potok analizy obrazu, który pozwala na analizę setek komórek. Ta metoda analizy wykorzystuje ogólnodostępne oprogramowanie FIJI, jest dostępna dla początkujących bioinformatyków i nie wymaga zaawansowanej konfiguracji komputera. W tym miejscu przedstawiamy krok po kroku protokół konfiguracji LEXY jako przykład tych narzędzi optogenetycznych do monitorowania eksportu jądrowego, od przygotowania próbek po akwizycję obrazowania żywych komórek i automatyczną analizę, pokazując jednocześnie, jak dostosować protokół do innych warunków, kontroli lub modeli w dowolnym laboratorium. Wszystkie plazmidy i linie komórkowe wykorzystane w tym protokole zostaną udostępnione społeczności naukowej, co jeszcze bardziej zwiększy dostępność metody.

Wprowadzenie

Znaczenie transportu nukleocytoplazmatycznego (NCT) dla regulacji kluczowych szlaków komórkowych i utrzymania homeostazy komórkowej zostało dobrze zbadane w ciągu ostatnich lat¹. W związku z tym stworzono kilka narzędzi do badania dynamiki NCT ^2,3,4. Wśród tych narzędzi sondy optogenetyczne LINuS⁵ i LEXY⁶, opublikowane odpowiednio w 2014 i 2016 roku, zapewniają skuteczny sposób monitorowania NCT w żywych komórkach. Narzędzia te, zaprojektowane do śledzenia indukowanego eksportu (LEXY) lub importu (LINuS) reportera fluorescencyjnego, są indukowane przez ekspozycję na światło niebieskie i odwracalne.

Krótko mówiąc, te dwie małe sondy wykorzystują właściwości domeny LOV2 z białka fototropiny-1 rośliny Avena sativa⁷. W przypadku braku światła niebieskiego helisa Jα z domeny LOV2 jest fotoklatkowana i osadzana w rdzeniu białka. Ponieważ helisa Jα może reagować na bodziec świetlny, oświetlenie światłem niebieskim indukuje zmianę konformacyjną, a następnie odłączenie helisy Jα od domeny LOV2. Autorzy LEXY i LINuS wykorzystali tę czułość na światło do fuzji sygnału lokalizacji jądrowej (NLS) lub sygnału eksportu jądrowego (NES) z helisą Jα, odpowiednio dla LINuS i LEXY (ryc. 1). Powstałym narzędziem jest sonda, która przemieszcza się do jądra (LINuS) lub cytozolu (LEXY) po podświetleniu światłem niebieskim.

Aby śledzić sondy za pomocą obrazowania fluorescencyjnego, do konstrukcji dodano również reporter fluorescencyjny mCherry. Na koniec do systemu dodano słaby NES (dla LINuS) lub NLS (dla LEXY), aby upewnić się, że sondy nie znajdują się w swojej ostatecznej lokalizacji przed oświetleniem światłem niebieskim, co uniemożliwiłoby zaobserwowanie translokacji LEXY lub LINuS między jądrem a cytozolem.

Rysunek 1: Reprezentacja sond LEXY i LINuS. Obie sondy składają się z białka mCherry połączonego ze światłoczułą domeną LOV2. Różnica między tymi dwoma narzędziami polega na sekwencji sygnalizacyjnej ukrytej przez helisę Jα: NES dla LEXY i NLS dla LINuS. Obie sondy posiadają również słabą sekwencję sygnału, która kontroluje ich początkową lokalizację: słaby NLS dla LEXY i słaby NES dla LINuS. Aktywacja systemów za pomocą oświetlenia światłem niebieskim powoduje zatem albo ich eksport dla LEXY, albo ich import dla LINuS, umożliwiając użytkownikom monitorowanie eksportu lub importu energii jądrowej. Skróty: LEXY = indukowany światłem system eksportu jądrowego; LINuS = indukowany światłem sygnał lokalizacji jądrowej; NLS = sygnał lokalizacji jądrowej; NES = sygnał eksportu jądrowego. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Lokalizacja fluorescencji mCherry informuje o przenoszeniu sond LEXY i LINuS między jądrami a cytozolem, a zatem może być śledzona w obrazowaniu żywych komórek, co pozwala użytkownikom monitorować NCT. Oprócz tego, że LEXY i LINuS mogą być używane jako proste sondy, mogą być również modyfikowane do kontrolowania lokalizacji i badania białek będących przedmiotem zainteresowania, in vitro 5,6,8,9 lub in vivo^10,11.

Metoda kwantyfikacji zaproponowana w publikacjach LEXY i LINuS pokazuje względną intensywność jądrową sond. Sugerowana analiza jest wykonywana ręcznie i opiera się na pomiarze obszaru zainteresowania (ROI) w jądrze i cytozolu. Chociaż metoda ta daje dobre odwzorowanie sygnału sondy w czasie, jest bardzo długa i żmudna, zwłaszcza gdy eksperymenty i warunki są powtarzane. Co ważne, tej metodzie brakuje również dokładności, ponieważ reprezentowana jest tylko niewielka część zaprojektowanego przedziału.

W tym miejscu proponujemy nowy protokół do kwantyfikacji sygnałów fluorescencyjnych LEXY i LINuS. Wdrożyliśmy zautomatyzowane techniki, które ułatwiają analizy i zapewniają większą dokładność. Ułatwi to proces nowym użytkownikom tych narzędzi i pomoże zwiększyć przepustowość. Nasz protokół kwantyfikacji wykorzystuje tylko jeden interfejs, wtyczkę TrackMate¹² o otwartym kodzie źródłowym FIDŻI. W szczególności, aby poprawić wiarygodność kwantyfikacji, użyliśmy markera DNA dalekiej czerwieni kompatybilnego z obrazowaniem na żywo, aby przeprowadzić segmentację całego jądra za pomocą StarDist¹³, wytrenowanej konwolucyjnej sieci neuronowej, w połączeniu ze śledzeniem i pomiarem sygnału fluorescencyjnego sondy za pomocą TrackMate¹².

Uzyskane dane można następnie łatwo wyeksportować do dostarczonego i gotowego do użycia arkusza kalkulacyjnego (tabela uzupełniająca S1) w celu uzyskania względnej intensywności jądrowej każdego zidentyfikowanego jądra. Protokół ten wyjaśnia również, w jaki sposób połączyć uzyskane wartości na wykresie, dopasowując uzyskaną krzywą przebiegu w czasie do modelu monowykładniczego, jak w przypadku Yoo i Mitchisona¹⁴ oraz jak obliczyć szybkość transportu dla różnych badanych warunków. Dzięki temu protokołowi i dostarczonemu arkuszowi kalkulacyjnemu do analizy, użytkownicy będą mogli łatwo określić ilościowo dane obrazowania żywych komórek, nawet przy ograniczonych umiejętnościach bioinformatycznych.

Protokół

UWAGA: Poniżej opisano protokół monitorowania eksportu jądrowego za pomocą sondy LEXY. Szczegółowe informacje na temat ustawień, które należy dostosować dla LINuS, znajdują się w rozdziale 5.

1. Hodowla komórkowa

UWAGA: Procedura opisana w tej sekcji powinna być wykonywana w kapturze klasy do hodowli tkankowych. Kroki opisane poniżej zostały zoptymalizowane dla linii komórkowej NIH / 3T3 mysich fibroblastów¹⁵ , przy użyciu DMEM (lub DMEM wolnego od czerwieni fenolowej, jeśli jest to wskazane), uzupełnione 10% płodową surowicą bydlęcą i 1% penicyliną-streptomycyną jako pożywką (patrz tabela materiałów). Użytkownicy mogą jednak dostosować procedurę do innych typów komórek. Protokół jest odpowiedni dla transfekowanych komórek lub stabilnych linii komórkowych. Zalecamy jednak tworzenie stabilnych linii komórkowych, jak wspomniano w sekcji dyskusji.

1. Przygotować roztwór powlekający z 23 μg/ml kolagenu i 2 μg/ml fibronektyny w sterylnym 1x PBS. Dodać 800 μl roztworu powlekającego do każdej płytki do obrazowania na żywo (patrz tabela materiałów) i przechowywać w inkubatorze przez 90 minut.
2. Umyj mieszaninę powlekającą sterylnym 1x PBS i zasiej 60 000 komórek na szalkach do obrazowania na żywo w pożywce, w celu pobrania następnego dnia.
3. W razie potrzeby należy przetransfekować komórki plazmidem LEXY zgodnie z metodą transfekcji, która najlepiej odpowiada zastosowanemu typowi komórki. Aby postępować zgodnie z tym protokołem, należy wykonać kotransfekcję sondy z pustym wektorem w celu zwiększenia wydajności, w stosunku 1:5 dla LEXY:pusty wektor. Chroń komórki przed światłem w ciemnym pudełku lub folią aluminiową i pozwól im rosnąć przez jeden dzień.
4. Przed pobraniem wybarwić komórki markerem DNA dalekiej czerwieni zgodnym z obrazowaniem żywych komórek, w pożywce wolnej od czerwieni fenolowej i upewnić się, że są całkowicie chronione przed światłem aż do momentu pozyskania.
   UWAGA: W naszym przypadku używamy SiR-DNA¹⁶ w stężeniu 1 μM, inkubowanego przez co najmniej 1 godzinę przed akwizycją.
5. W celu kontroli eksportu należy użyć inhibitora eksportu jądrowego Leptomycyny B¹⁷ w stężeniu 0,5 nM (łagodne zahamowanie eksportu) i 1 nM (silne zahamowanie eksportu), nałożonego na komórki 1 godzinę przed nabyciem.

2. Obrazowanie

UWAGA: Akwizycji można dokonywać za pomocą mikroskopu konfokalnego kompatybilnego z obrazowaniem na żywo, który ma możliwość tworzenia wzoru wybranych akwizycji i pulsacyjnego oświetlenia laserowego 458 nm. Obrazowanie wykonaliśmy w ciemności w komorze o temperaturze 37 °C (z 5%_CO2) mikroskopu konfokalnego ze skanowaniem rezonansowym. Konfiguracja jest zoptymalizowana pod kątem obiektywu 20x, co umożliwia jednoczesne obrazowanie wielu komórek w tym samym polu widzenia. Sekwencja obrazowania składa się z trzech faz, jak na rysunku 2.

1. Stabilna faza
   1. Wykonaj jedną akwizycję sygnałów mCherry (LEXY, laser 561 nm) i dalekiej czerwieni (SiR-DNA, laser 633 nm) co 15 s i powtórz to 10 razy, przez łączny czas trwania 150 s. Upewnij się, że w tym momencie nie obserwuje się ani bielenia, ani translokacji produktu LEXY do cytozolu.
      UWAGA: Oświetlenie układu niebieskim światłem na tym etapie aktywowałoby LEXY, co natychmiast spowodowałoby jego eksport do cytozolu.
2. Faza oświetlenia
   UWAGA: Ta faza składa się z trzech kroków, powtarzanych 15x.
   1. Przeprowadź pulsacyjne oświetlenie światłem niebieskim (laser 458 nm), z impulsami 36 ms powtarzanymi 150x, przez łączny czas trwania ~5 s.
   2. Wykonaj jedną akwizycję sygnałów fluorescencyjnych mCherry (LEXY, laser 561 nm) i dalekiej czerwieni (SiR-DNA, laser 633 nm).
   3. Przerwa na 15 sekund.
3. Faza rekonwalescencji
   1. Wykonaj jedną akwizycję sygnałów mCherry (LEXY, laser 561 nm) i dalekiej czerwieni (SiR-DNA, laser 633 nm) co 15 s, powtórz 25x, przez łączny czas trwania 375 s.
      UWAGA: Ten krok jest opcjonalny i można go usunąć, jeśli użytkownicy chcą obserwować tylko eksport sondy, a nie odzyskiwanie.

Rysunek 2: Konfiguracja trzech faz LEXY. Aby monitorować eksport materiałów jądrowych za pomocą LEXY, w oprogramowaniu mikroskopu należy skonfigurować trzy fazy. Górna część wskazuje konfigurację, która ma być używana do akwizycji żywych komórek firmy LEXY. Ta konfiguracja składa się ze stabilnej fazy, aby zapewnić stabilność sygnału w jądrze, fazy oświetlenia, aby indukować translokację LEXY z jądra do cytozolu, oraz fazy odzyskiwania, aby zaobserwować powrót LEXY do jądra. Dolna część rysunku wskazuje oczekiwane wyniki obrazowania żywych komórek. Na czerwono mCherry wskazuje lokalizację LEXY. W kolorze szarym SiR-DNA barwi jądro komórek. Podziałka = 10 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

3. Analiza dla LEXY

UWAGA: Cała analiza segmentacji i śledzenia jest wykonywana przy użyciu FIJI, z TrackMate¹², wtyczką Fidżi o otwartym kodzie źródłowym (wymagana wersja szczegółowo opisana w Tabeli Materiałów).

1. Zainstaluj FIJI, a następnie pobierz wtyczki StarDist¹³ i TrackMate. Aby zainstalować wtyczki, przejdź do punktu menu Pomoc | Aktualizacja ... | Zarządzaj witrynami aktualizacji i zaznacz CSBDeep, StarDist i Trackmate-StarDist, a następnie kliknij Zastosuj zmiany. Uruchom ponownie Fidżi.
2. Podczas gdy niektóre mikroskopy mogą wykonywać każdą fazę akwizycji (stabilne oświetlenie-odzyskiwanie) razem, inne (np. referencyjny mikroskop konfokalny) zapisują je osobno. Dlatego dodatkowym krokiem, jeśli używasz tej konfiguracji, jest połączenie faz razem: otwórz obrazy trzech sekwencji, uruchom funkcję concatenate , aby skompilować trzy fazy poklatkowe w jednym pliku: kliknij na Obraz | Stosy | Narzędzia | Łączenie....
3. Wybierz fazę stabilną jako Image1, fazę oświetlenia jako Image2 i fazę odzyskiwania jako Image3. Uzyskany obraz jest pojedynczym obrazem dla upływu czasu trzech faz, z połączonymi kanałami mCherry (kanał 1) i SiR-DNA (kanał 2).
4. Zachowaj uzyskany obraz do późniejszego kroku segmentacji i zapisz go: przejdź do punktu menu Plik | Zapisz jako | Niechyb....
5. Podziel sam kanał mCherry dla następujących analiz: przejdź do punktu menu Obraz | Kolor | Podziel kanały i zapisz je: przejdź do Plik | Zapisz jako | Niechyb....
6. Aby sprawdzić, czy podczas akwizycji nie doszło do ewentualnego wybielenia, uruchom polecenie Kreśl profil osi Z na kanale mCherry: przejdź do punktu menu Obraz | Stosy | Wykres Profil osi Z. W wygenerowanej tabeli kliknij Dane | Skopiuj 1. zestaw danych i wklej go do gotowego do użycia arkusza kalkulacyjnego dostarczonego z tym protokołem (tabela uzupełniająca S1), poniżej komórki profilu osi Z.
7. Narysuj okrągły obszar zainteresowania (ROI) o średniej wielkości jądra i zapisz go: przejdź do Analizuj | Narzędzia | Menedżer zwrotu z inwestycji.... Dodaj ROI i zapisz go: przejdź do Więcej | Zapisać...
   UWAGA: Ten sam zwrot z inwestycji powinien być używany do pomiaru tła dla wszystkich analizowanych warunków.
8. Umieść zapisany ROI w regionie bez komórek przez cały czas poklatkowy i zmierz średnią intensywność w ramach tego ROI za pomocą funkcji interfejsu ROI. Najpierw upewnij się, że średnia wartość szarości jest zaznaczona, klikając Analizuj | Ustaw wymiary. Następnie kliknij Więcej | Wiele miar. Zaznacz opcję Zmierz wszystkie 50 plasterków i jeden surowy na plasterek i kliknij OK.
9. Skopiuj i wklej wszystkie wartości wyświetlane w dostarczonym arkuszu kalkulacyjnym (tabela uzupełniająca S1) poniżej komórki "Tło ROI".
10. Na Fidżi zamknij obraz tylko z kanałem mCherry i wybierz wcześniej zapisany obraz ze scalonymi kanałami mCherry i SiR-DNA.
11. Otwórz wtyczkę TrackMate: przejdź do Wtyczki | Śledzenie | Kolega z toru.
12. Sprawdź, czy liczba punktów czasowych jest prawidłowa (od 0 do 49 , jeśli zastosowano się do proponowanych faz) i kliknij Dalej.
13. Wybierz detektor StarDist i kliknij Dalej.
14. Wybierz kanał 2 (SiR-DNA), aby podzielić jądra na segmenty i kliknij Dalej. Poczekaj kilka sekund na zakończenie procesu segmentacji. Sprawdź wzrokowo, czy uzyskana segmentacja odpowiada granicy jąder i kliknij Dalej (Rysunek 3). W przypadku niedokładnej segmentacji należy zwrócić uwagę na odpowiedni identyfikator jądra (SpotID), aby wykluczyć go z dalszej analizy w kroku 3.26.
15. Pozostaw parametry domyślne i kliknij Dalej w oknie początkowego ustawienia progowania . To okno podaje liczbę segmentowanych plamek (jąder) wśród 50 punktów czasowych.
16. Ustaw filtry w miejscach: utwórz i ustaw filtry:
    1. Utwórz dwa filtry ze średnią intensywnością ch1 jako parametrem, aby usunąć jądra o zbyt intensywnym lub zbyt słabym sygnale, które mogłyby zniekształcić analizy: jeden filtr do wyboru wartości powyżej zdefiniowanego progu, a drugi do wyboru wartości poniżej progu. Zdefiniuj wartość, aby usunąć tylko bardzo niski lub nasycony sygnał.
       UWAGA: Te filtry mogą nie być potrzebne, jeśli używane są stabilne linie komórkowe. Zanotuj te wartości, ponieważ należy je ponownie zastosować do wszystkich warunków.
    2. Utwórz dwa filtry Obszar do usuwania niepożądanych obiektów (gruzu, umierających lub dzielących się komórek) z analiz: jeden filtr do wyboru wartości powyżej zdefiniowanego progu, a drugi do wyboru wartości poniżej progu. Kliknij Dalej.
       UWAGA: Ponownie zastosuj te wartości dla wszystkich warunków.
17. Wybierz tracker: wybierz Prosty tracker LAP i kliknij Dalej.
18. Wybierz parametry śledzenia. Dostosuj maksymalną odległość łączenia (w tym przypadku 30 μm) — maksymalną odległość, na jaką będzie można połączyć się z obiektami między klatkami. Użyj opcji Maksymalna odległość zamykania przerwy (w tym przypadku 15 μm) i Maksymalna odległość zamykania przerwy (w tym przypadku 3), aby określić, ile miejsc na pojedynczej ścieżce można pominąć bez wykluczania tej samej ścieżki. Kliknij Dalej (Rysunek 3).
    UWAGA: Te proponowane parametry zostały zoptymalizowane dla naszej konfiguracji i modelu komórkowego przy użyciu podejścia prób i błędów i mogą wymagać eksperymentalnego dostosowania.
    Maksymalna odległość łączenia musi być dostosowana, aby zapobiec błędnemu śledzeniu od jednego jądra do drugiego, zwłaszcza jeśli komórki dużo się poruszają.
19. Po obliczeniach kliknij Dalej i ustaw filtry na ścieżkach. Aby wybrać tylko te jądra, które były śledzone w całym przebiegu czasu (50 punktów czasowych z proponowaną sekwencją), należy wybrać największą liczbę punktów na ścieżce (umieść kursor na ponad 49 dla proponowanej sekwencji). Kliknij Dalej.
    UWAGA: Ułatwi to analizę, ale jest możliwe tylko wtedy, gdy wystarczająca liczba jąder była śledzona przez cały przebieg czasu, jeśli nie: patrz dyskusja.
20. Opcje wyświetlania: zaznacz opcję Wyświetl nazwy miejsc, aby móc prześledzić każde jądro w dalszych analizach. Dostosuj wyświetlane funkcje zgodnie z preferencjami użytkownika.
21. U dołu strony kliknij Utwory | Eksportuj do pliku CSV , aby zapisać tabelę ze wszystkimi pomiarami. Zamknij tabelę i kliknij Dalej.
22. Opcjonalnie należy wykreślić cechy toru z T (czasem) jako osią X i średnią intensywnością ch1 dla osi Y. Kliknij Cechy działki. Zamknij wykres i kliknij Dalej.
    UWAGA: Da to użytkownikom wyobrażenie o ogólnej tendencji eksportu. W tym momencie nie jest znormalizowany do tła i początkowej intensywności.
23. Kliknij Przechwyć nakładkę jako akcję i Wykonaj | Dobrze. Wygenerowany obraz zostanie wykorzystany do identyfikacji jąder oznaczonych ilościowo. Zapisz: przejdź do punktu menu Plik | Zapisz jako | Niechyb....
24. W pliku arkusza kalkulacyjnego zaimportuj plik CSV uzyskany za pomocą funkcji TrackMate: Na karcie Dane w grupie Pobieranie i przekształcanie danych kliknij opcję Z tekstu/CSV i importuj.
25. Zaznacz wszystkie cztery poniższe kolumny, klikając odpowiadającą im literę, a następnie skopiuj i wklej je u góry dostarczonego arkusza kalkulacyjnego (tabela uzupełniająca S1), kolumny od A do D, z tłem: Identyfikator punktu (B), Identyfikator ścieżki (C), Ramka (I), Średnia intensywność ch1 (M).
    UWAGA: Upewnij się, że początek wklejonych miar zaczyna się w wierszu 6 tabeli uzupełniającej S1. Jeśli tak nie jest, pomiary mogą zostać przesunięte z jednej lub więcej komórek, a zatem być nieprawidłowe. Zapoznaj się z arkuszem kalkulacyjnym w tabeli uzupełniającej S2 , aby uzyskać przykład oczekiwanej dyspozycji.
26. Posortuj wyniki alfabetycznie najpierw według TrackID (pojedyncze jądro), klikając strzałkę w komórce B5 i Klatka (punkt czasowy), klikając strzałkę w komórce C5.
27. Aby usunąć szum tła, odejmij wartości uzyskane w kroku 3.8 od każdej wartości uzyskanej w polu Średnia intensywność ch1 (wstępnie obliczona w dostarczonym arkuszu kalkulacyjnym, patrz tabela uzupełniająca S1).
28. Aby znormalizować sygnał LEXY, należy obliczyć średnie natężenie sygnału fluorescencyjnego mCherry w fazie stabilnej (klatki od 0 do 9). Następnie podziel wszystkie wyniki uzyskane w Średnia intensywność ch1 przez średnią intensywność fazy stabilnej (wstępnie obliczoną w dostarczonym arkuszu kalkulacyjnym, patrz Tabela uzupełniająca S1).
    UWAGA: Otrzymana liczba jest średnią intensywnością fluorescencji jądrowej LEXY. Wszystkie miary są już wyświetlane według jąder z kolumny L i mogą być wykreślone na wykresie.

Rysunek 3: Analiza TrackMate przy użyciu FIDŻI. Na górze schematyczne przedstawienie analiz TrackMate, na dole obrazy uzyskane z analiz FIJI. Pierwsza reprezentacja po lewej stronie pokazuje niesegmentowane barwienie SiR-DNA, markera jądra, w kolorze szarym. Drugi panel reprezentuje automatyczną segmentację przeprowadzoną za pomocą kanału SiR-DNA przez Stardist. Jądra są pokolorowane zgodnie z intensywnością kanału mCherry, aby ułatwić wizualizację i ostatni krok. Trzeci panel pokazuje ślady uzyskane przez śledzenie barwienia SiR-DNA w punktach czasowych całej sekwencji obrazowania żywych komórek. Ostatni panel po prawej stronie pokazuje sygnał fluorescencyjny LEXY, w kolorze czerwonym, w obszarze zdefiniowanym przez segmentację, który będzie mierzony dla każdego punktu czasowego. Podziałka = 50 μm Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

4. Stawki transportowe, statystyki i dane liczbowe

1. Wykreśl wykres względnej intensywności jądrowej.
   1. Otwórz GraphPadPrism i utwórz arkusz: kliknij Wprowadź lub zaimportuj dane do nowej tabeli, a w opcjach wybierz czasy, które upłynęły dla X i maksymalną liczbę segmentowanych jąder dla wartości replik w podkolumnach obok siebie dla Y. Kliknij Create i wklej uzyskane dane w tabeli.
   2. Dla wartości X (czas), jeśli parametry przejęć zostały zachowane zgodnie z sugestią, skopiuj i wklej kolumnę pod "czasem" w dostarczonym arkuszu kalkulacyjnym. W przeciwnym razie dostosuj wartości zgodnie z używanymi parametrami.
   3. Aby utworzyć wykres względnej intensywności jądra, przejdź do sekcji Wykresy. Wybierz XY jako rodzinę wykresów, a Punkty i linia łącząca ze słupkami błędów jako typ wykresu.
   4. W sekcji Wykres wybierz Średnia, Błąd i SEM, a następnie kliknij OK , aby wyświetlić wykresy. Zmieniaj skale i wizualizacje zgodnie z wybranymi parametrami.
2. Dopasuj względną intensywność jądrową do modelu monowykładniczego.
   1. W sekcji Tabela danych kliknij pozycję Nowa tabela danych.
      1. Wybierz Wprowadź wartości X jako X i Enter i wykreśl pojedynczą wartość Y dla każdego punktu jako Y, a następnie kliknij Utwórz.
      2. W kolumnie X podaj czasy w ułamkach dziesiętnych tylko dla fazy stabilnej i oświetlenia; jeśli sugerowane parametry przejęć zostały zachowane, skopiuj i wklej kolumnę "czas dziesiętny" w dostarczonym arkuszu kalkulacyjnym, Tabela uzupełniająca S1.
      3. Wkleić wartości uzyskane jako względna intensywność jądrowa w tabeli, tylko dla fazy stabilnej i oświetlenia.
      4. W sekcji Wyniki wybierz następującą analizę: Analizy XY | Wykładniczy | Regresja nieliniowa (dopasowanie krzywej) i kliknij przycisk OK.
      5. W parametrach wybierz Plateau, po którym następuje jeden rozpad fazy jako Model, a w parametrach ograniczających wybierz stałą równą 2,25 jako X0 (czas rozpoczęcia oświetlenia), stałą równą 1 jako Y0 (względna intensywność jądra na początku oświetlenia), stałą równą 0 dla plateau (wartości, do których powinna skłaniać się względna intensywność jądrowa) i wskazują, że K (wskaźnik wywozu) powinien być większy niż 0. Pozostaw inne parametry domyślne. Kliknij OK.
      6. W sekcji Wyniki , wiersz K wskazuje wszystkie szybkości eksportu dla jąder badanego stanu.
      7. W razie potrzeby powtórz kroki od 4.2.1 do 4.2.1.5 dla pozostałych warunków.
3. Utwórz wykres szybkości eksportu.
   1. Utwórz nową tabelę: wybierz Wprowadź wartości X jako X i Enter, a następnie wykreśl pojedynczą wartość Y dla każdego punktu jako Y, a następnie kliknij przycisk Utwórz.
   2. Dla każdego warunku (w kolumnach) wklej i przetransponuj wartości K uzyskane w poprzednim kroku.
   3. Aby utworzyć wykres szybkości eksportu, przejdź do sekcji Wykresy , wybierz kolumnę jako rodzinę wykresów, a następnie w sekcji Pudełko i skrzypce wybierz Wykres skrzypcowy jako typ wykresu, z Wykres skrzypcowy. Pokaż wszystkie punkty jako wykres. Kliknij OK , aby zobaczyć wykres. W razie potrzeby dostosuj sposób reprezentacji danych.
   4. Aby uruchomić test statystyczny dla szybkości eksportu, wykonaj dwustronny test t Welcha, zgodnie z opisem w Yoo i Mitchison¹⁴, wykonując następujące kroki:
      1. W tabeli zawierającej stawki eksportu wszystkich warunków kliknij Analizuj | Porównanie grup | Test T (i testy nieparametryczne), wybierz warunki, które mają być testowane, i kliknij OK. Zaznacz opcję Niesparowany, Tak użyj testu parametrycznego i Niesparowany test t z poprawką Welcha. Nie zakładaj równych kart SD i kliknij OK.
   5. Obserwuj wyniki analizy w tabeli w sekcji Wyniki i w razie potrzeby zgłaszaj wykres szybkości eksportu.

5. Adaptacje dla LINuS

UWAGA: Opisany powyżej protokół można łatwo dostosować do monitorowania importu jądrowego za pomocą LINuS, stosując następujące zmiany.

1. Hodowla komórkowa
   1. Zamiast leptomycyny B w kroku 1.5 należy użyć importazolu¹⁸ jako inhibitora jądrowego, w stężeniu 10 μM przez 1 godzinę przed akwizycją.
2. Obrazowania
   1. Aby uzyskać optymalny import systemu, zastąp 150 powtórzeń impulsów oświetlenia o długości 36 ms przez laser 458 nm w kroku 2.2.1 przez 250 powtórzeń przez łączny czas trwania ~9 s.
      UWAGA: taktowanie sekwencji może być zależne od typu komórki, a parametry obu sond mogą wymagać regulacji, aby były optymalne, ponieważ systemy zależą od rozpoznawania NLS i NES, które są specyficzne dla typu komórki^19,20.
3. Stawki transportowe, statystyki i liczby
   1. Zamiast dopasowywać krzywą do plateau, po którym następuje rozpad jednej fazy w kroku 4.2.1.5, wybierz plateau, a następnie analizę asocjacji jednej fazy .
   2. Ogranicz X0 do 2,25, Y0 jako 1, a K (szybkość importu w przypadku LINuS) jest większa niż 0.
      UWAGA: Analizy LINuS z TrackMate są identyczne jak w LEXY. Względna intensywność jądrowa jest nadal wartością zmierzoną i przeanalizowaną, ale zamiast obserwować spadek spowodowany eksportem sondy, należy zaobserwować wzbogacenie sygnału fluorescencyjnego w jądrze po podświetleniu światłem niebieskim.

Wyniki

Wyżej wymieniony protokół powinien pozwolić użytkownikom na wizualizację lokalizacji i translokacji sondy podczas akwizycji w obrazowaniu żywych komórek. Przykład oczekiwanych obrazów uzyskanych w celu wizualizacji eksportu jądrowego za pomocą LEXY przedstawiono na rysunku 4. Szybki spadek sygnału z jądra i wzbogacenie cytozolu należy zaobserwować po kilku rundach oświetlenia światłem niebieskim. Stopniowe odzyskiwanie sygnału sondy może być widoczne po zatrzymaniu cykli oświetlenia. Leptomycyna B, inhibitor eksportu, zaświadcza, że za pomocą analiz można zobrazować zmianę w eksporcie, ponieważ zapobiega ona eksportowi LEXY przy oświetleniu światłem niebieskim (ryc. 4).

Rysunek 4: Wizualizacja sygnału LEXY w czasie. Uchwycenie reprezentatywnych punktów czasowych faz stabilnych, oświetlenia i regeneracji, uzyskanych za pomocą obrazowania żywych komórek. Warunek metanolu reprezentuje warunek kontrolny. Po pulsacyjnym podświetleniu światłem niebieskim, w kolorze czerwonym, sygnał fluorescencyjny mCherry, reporter lokalizacji LEXY, jest przemieszczany z jądra do cytozolu. Po zatrzymaniu oświetlenia sygnał jest odzyskiwany w jądrze. Leczenie inhibitorem eksportu leptomycyną B w dawce 1 nM lub 0,5 nM wskazuje na brak lub zmniejszenie eksportu produktu LEXY, gdy eksport jest zablokowany. Podziałka = 30 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Jeśli chodzi o analizy, o ile wartości względnej krzywej intensywności jądrowej w fazie stabilnej powinny wynosić około 1, o tyle po aktywacji światła niebieskiego powinny wykazywać powolny spadek, aż do osiągnięcia plateau pod koniec fazy oświetlenia (rysunek 5A). Jeśli spadek jest zbyt szybki lub zbyt wolny, parametry akwizycji można zoptymalizować (patrz dyskusja). Leczenie leptomycyną B w wystarczających stężeniach może również potwierdzić, że analizy i technika są wystarczająco czułe, aby wykazać, że eksport jądrowy jest całkowicie zablokowany, a względne wartości intensywności jądrowej są stabilne na poziomie około 1 dla całego eksperymentu. Pośrednie stężenia leptomycyny B powinny jednak wykazywać łagodny eksport jądrowy (ryc. 5A). Te obserwacje wizualne powinny zostać potwierdzone ilościowo wraz z ustaleniem wskaźnika wywozu (rys. 5B).

Rysunek 5: Oczekiwana względna intensywność jądrowa LEXY i szybkość transportu. (A) Wykres przedstawia względną intensywność jądrową sygnału fluorescencyjnego LEXY w czasie, znormalizowaną do średniej intensywności mCherry w fazie stabilnej. Względna intensywność jądrowa stanu metanolu (kontrolnego, czerwonego) zmniejsza się o połowę po oświetleniu, w przeciwieństwie do komórek traktowanych inhibitorem eksportu leptomycyną B, przy stężeniu 0,5 nM (jasnoniebieski) lub 1 nM (ciemnoniebieski). Słupki błędów: SEM. (B) Szybkość eksportu warunków kontrolnych i leptomycyny B, uzyskana przez dopasowanie krzywej do modelu monowykładniczego. Wartości uzyskane, gdy eksport jest zablokowany przez leptomycynę B, są znacznie niższe niż warunek kontrolny. N = 18 komórek dla metanolu (czerwony), 19 komórek dla leptomycyny B 0,5 nM (jasnoniebieski) i 15 komórek dla leptomycyny B 1 nM (ciemnoniebieski). Wartości P obliczono za pomocą dwustronnego testu t Welcha. : P < 1×10⁻⁴, ****: P < 1×10⁻⁵. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela uzupełniająca S1: Arkusz kalkulacyjny z predefiniowanymi obliczeniami. Ten arkusz kalkulacyjny jest dostarczany w celu ułatwienia analizy. Wartości intensywności uzyskane za pomocą TrackMate można bezpośrednio skopiować i wkleić do arkusza kalkulacyjnego w celu uzyskania znormalizowanych względnych wartości intensywności jądrowej. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Tabela uzupełniająca S2: Przykład oczekiwanych wyników dla warunku kontrolnego analizy LEXY. Arkusz kalkulacyjny przedstawia przykład uzyskanych wartości dla warunków kontrolnych stabilnej linii komórkowej LEXY. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Jak wspomniano w protokole, stworzenie stabilnych linii komórkowych znacznie poprawia jakość analiz. Po pierwsze, posiadanie 100% komórek wykazujących ekspresję sond zwiększa liczbę śledzonych i analizowanych jąder, co wzmacnia solidność analiz. Po drugie, zmniejsza śmierć komórek wywołaną nadekspresją sond i toksycznością zastosowanych odczynników do transfekcji. I wreszcie, zmniejsza silną niejednorodność sygnałów fluorescencyjnych między komórkami. Ten parametr jest istotny, ponieważ nasycony sygnał nie pozwoli na prawidłowe wykrycie zmiany intensywności po naświetleniu. Ten sam wniosek dotyczy słabych sygnałów, które mogą wybielić lub nie pozwolić na ilościowe określenie różnic. Dlatego zalecamy najpierw przetestowanie sond przez transfekcję, aby upewnić się, że działają prawidłowo, ustawienie parametrów akwizycji, a następnie szybkie utworzenie stabilnych linii komórkowych. Stworzyliśmy wektory lentiwirusowe zarówno dla sond LEXY, jak i LINuS, które są dostępne do udostępnienia na żądanie, a także stabilne linie NIH/3T3 LEXY lub LINuS utworzone za pomocą tych lentiwirusów.

Jeśli sondy są transfekowane lub jeśli komórki są rzadkie, sugerowane parametry prawdopodobnie zmniejszą liczbę wykrywanych ścieżek, a analizy będą mniej wiarygodne. W takim przypadku użytkownicy mogą być bardziej pobłażliwi w stosunku do miejsc pominiętych w śledzeniu, zmniejszając filtr Liczba miejsc w utworach (sugerujemy pozostawienie co najmniej 45 z 50 miejsc). Uwaga: jeśli ten filtr zostanie zmniejszony, dostarczony plik Excel (tabela uzupełniająca S1) powinien zostać ręcznie dostosowany: w rzeczywistości wartości wklejone z zaimportowanego pliku CSV nie będą uwzględniać luk. Użytkownik musi znaleźć brakujące miejsca z numerem TrackID i skorelować je z numerem jądra, co zwykle zajmuje kilka rund kopiowania i wklejania.

Krytycznym parametrem gwarantującym powodzenie eksperymentu jest utrzymywanie komórek w ciemności. Ponieważ sondy reagują na niebieskie światło, użytkownicy muszą zapewnić transport komórek w ciemności przez co najmniej 30 minut przed akwizycją. Wystarczy małe zamknięte pudełko lub użycie aluminium do przykrycia naczynia. Podobnie, należy być bardzo ostrożnym, aby używać światła mCherry tylko do wyszukiwania komórek pod mikroskopem, ponieważ oświetlenie niebieskim światłem aktywuje komórki. Jeśli ewentualne oświetlenie nastąpi pod mikroskopem, poszukaj innego odległego pola do akwizycji. Wykreślenie profilu osi Z w kroku 3.6 pomoże dowiedzieć się, czy na komórki wpłynęło oświetlenie, czy krzywa maleje, a nie jest płaskowyżem.

Sekwencja obrazowania składa się z trzech faz. Po pierwsze, faza stabilna, mająca na celu ocenę potencjalnego bielenia, ale także upewnienie się, że lokalizacja LEXY jest stała bez aktywacji (1). Po drugie, faza aktywacji, składająca się z rund pulsacyjnego oświetlenia światłem niebieskim, w celu wywołania translokacji LEXY z jądra do cytozolu (2). Wreszcie opcjonalna faza odzyskiwania, w której sygnał stopniowo wraca do swojego początkowego położenia w jądrze (3).

Sekwencja opisana dla akwizycji może być specyficzna dla typu komórki^19,20. W pierwszym eksperymencie użytkownik powinien przetestować i zmodyfikować moc lasera i czasy, aby zobaczyć, jak system stopniowo przemieszcza się między jądrem a cytozolem. Co ważne, zbyt silna moc lasera, jako zbyt krótka przerwa, może uniemożliwić zobaczenie postępującej translokacji, ale zamiast tego brutalnego spadku/wzbogacenia (w zależności od użytej sondy) intensywności mCherry po oświetleniu.

Jeśli optymalizacja sekwencji nie rozwiąże problemu, prawdopodobnie NES i/lub NLS nie są odpowiednie dla używanego typu komórki. Użytkownicy mogą zapoznać się z artykułem⁸ metody LINuS, aby zaprojektować i zmodyfikować sondy. Użytkownicy mogą również zapoznać się z tym artykułem, aby uzyskać informacje na temat obrazowania LINuS za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego.

Segmentacja jąder jest krytycznym etapem analizy. Do obrazowania żywych komórek sond należy użyć solidnego i niezawodnego markera jądrowego. Ponieważ oświetlenie niebieskim światłem aktywuje translokację sondy, a sondy są monitorowane za pomocą białka fluorescencyjnego mCherry, marker ten musi być widoczny w widmie dalekiej czerwieni lub blisko. W naszym przypadku używamy SiR-DNA, które barwi komórki podczas 1 do ~24 h inkubacji, ale użycie SPY-DNA 650 jest również opcją (patrz Tabela materiałów w celu uzyskania referencji).

Wreszcie, jeśli segmentacja za pomocą StarDist w połączeniu z filtrowanym śledzeniem TrackMate udowodni swoją skuteczność, ważne jest, aby pamiętać, że użytkownik powinien zawsze wizualnie sprawdzić wyniki segmentacji i kwantyfikacji. Dzieląca się lub umierająca komórka może być uwzględniona w ocenie ilościowej, podczas gdy nie powinna. Aby zmniejszyć ryzyko analizy takich zdarzeń, dostarczony arkusz Excela przypisuje kod kolorystyczny względnej intensywności jądrowej (niebieski = niskie wartości, czerwony = wysokie wartości). Sprawdzając kolory przed wykreśleniem wartości w GraphPad Prism, użytkownik powinien być w stanie zauważyć wszelkie nietypowe wartości. Na przykład, względne intensywności jądrowe LEXY powinny wahać się od wysokich (czerwony, duże ilości sondy w jądrach) w fazie stabilnej do niskiej (niebieski, zmniejszona ilość sondy w jądrach) pod koniec fazy oświetlenia, zanim powrócą do wysokich wartości (czerwony), w fazie regeneracji (jak pokazano w tabeli uzupełniającej S2).

Protokół ten ma wiele zalet w porównaniu z poprzednio proponowanymi metodami ^5,6. Półautomatyczny potok ułatwia analizę transportu nukleocytoplazmatycznego LEXY i LINuS i zapewnia większą dokładność niż wcześniej proponowana ręczna kwantyfikacja ^5,6. Korzystanie z naszego protokołu umożliwi początkującym w tej dziedzinie wykonywanie wydajnych analiz, ale także zapewni nowe narzędzie dla doświadczonych użytkowników, którzy będą potrzebować tylko jednego otwartego interfejsu do wykonywania półautomatycznych analiz transportu nukleocytoplazmatycznego.

Metoda ta może być wykorzystana do dalszych zastosowań niż badanie globalnego tempa transportu nukleocytoplazmatycznego w liniach komórkowych NIH3T3. Rzeczywiście, dzięki kilku krokom optymalizacji można go dostosować do badania szybkości transportu sondy w różnych typach komórek lub żywych zwierzętach⁸. Co więcej, poprzez fuzję białka będącego przedmiotem zainteresowania LEXY lub LINuS, możliwe jest również zbadanie jego szybkości transportu lub dalszych skutków jego indukowanej światłem translokacji do jądra lub z niego. Na przykład możliwe jest sekwestrowanie białka w cytoplazmie za pomocą LEXY lub wymuszenie jego lokalizacji w jądrze za pomocą LINuS 5,6,21,22,23. Wreszcie, opisane analizy można również rozszerzyć na więcej zastosowań niż LEXY i LINuS, aby śledzić dowolny sygnał, który przemieszcza się między przedziałami subkomórkowymi, które można podzielić.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Kolagen	Sigma-Aldrich	08-115
Mikroskop konfokalny	LEICA (Dziennik LEICA	Dodatek SP8
DMEM (DMEM)	Gibco (firma Gibco)	31966021
Programu excel	Firmy Microsoft
FBS (Sieć Usługowa	Sigma-Aldrich	F7524 powiedział:
Fibronektyna	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał F1141 powiedział:
Oprogramowanie FIDŻI	FIDŻI		ImageJ 2.16.0/1,54p; Java1.8.0_322
Fluorodiaki	Holender	FD3510-100	Alternatywa: Komora Attofluorowa (Invitrogen #A7816)
Pryzmat GraphPad 10.4.1	Oprogramowanie GraphPad, Inc.
Importazol	Sigma-Aldrich	SML0341
Leptomycyna B	Sigma-Aldrich	L2913
Plazmid LEXY	Addgene powiedział:	72655	pDN122 powiedział:
Plazmid LINuS	Addgene powiedział:	61347	pDN77 powiedział:
Ołówek-Streptomycyna	Gibco (firma Gibco)	15140-122
DMEM bez czerwieni fenolowej	Gibco (firma Gibco)	21063-029
SiR-DNA (Gwiezdne DNA)	Spirochrom	Zobacz materiał SC007	Alternatywa: SPY-DNA650 (Spirochrom #SC501)
Wtyczka Stardist 2D	StarDist (Rozkład gwiazdy)		StarDist_0.3.0
Wtyczka TrackMate	Kolega z toru		TrackMate-7.14.0