Artykuł metodologiczny

Wykorzystanie narzędzi optogenetycznych LEXY i LINuS oraz zautomatyzowanej analizy obrazu do ilościowego określenia dynamiki transportu nukleocytoplazmatycznego w żywych komórkach

1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/68585

⸱

22 lipca 2025

 , 
1Institut de Génétique Humaine (IGH), Université de Montpellier, CNRS, UMR9002

W tym artykule

Podsumowanie

Protokół ten opisuje, jak efektywnie konfigurować i wykonywać zautomatyzowane analizy danych obrazowania żywych komórek uzyskanych ze śledzenia transportu nukleocytoplazmatycznego za pomocą narzędzi optogenetycznych.

Streszczenie

Transport nukleocytoplazmatyczny (NCT) jest niezbędny do utrzymania homeostazy komórkowej, a jego zakłócenie jest związane z różnymi chorobami, w tym zaburzeniami neurodegeneracyjnymi i stwardnieniem zanikowym bocznym. Podkreśla to potrzebę opracowania narzędzi do monitorowania i ilościowego określania NCT. Wśród tych narzędzi znajdują się szybkie i odwracalne sondy optogenetyczne LEXY (Light-inducible nuclear export system) i LINuS (Light-inducible nuclear localization signal), które umożliwiają pomiar dynamiki NCT w żywych komórkach.

Oryginalne publikacje opisują manualną segmentację i kwantyfikację sygnału sondy fluorescencyjnej w jądrze i cytozolu po transfekcji konstruktów LEXY i LINuS w obrazowaniu żywych komórek. Jednak zarówno transfekcja, jak i ręczna segmentacja ograniczają liczbę komórek, które można analizować i są narażone na nieprecyzyjność z powodu potencjalnych błędów zależnych od użytkownika. Podczas gdy duża szybkość i odwracalność zapewniana przez optogenetykę powinna w zasadzie pozwolić na wysoką czułość w wykrywaniu zmian w dynamice NCT, zależy to od parametrów akwizycji i analizy wystarczającej liczby komórek.

W związku z tym ustaliliśmy wektory lentiwirusowe wykazujące ekspresję LEXY i LINuS w celu stworzenia stabilnych linii komórkowych, przetestowaliśmy markery obrazowania na żywo i warunki kontrolne oraz wdrożyliśmy półautomatyczny potok analizy obrazu, który pozwala na analizę setek komórek. Ta metoda analizy wykorzystuje ogólnodostępne oprogramowanie FIJI, jest dostępna dla początkujących bioinformatyków i nie wymaga zaawansowanej konfiguracji komputera. W tym miejscu przedstawiamy krok po kroku protokół konfiguracji LEXY jako przykład tych narzędzi optogenetycznych do monitorowania eksportu jądrowego, od przygotowania próbek po akwizycję obrazowania żywych komórek i automatyczną analizę, pokazując jednocześnie, jak dostosować protokół do innych warunków, kontroli lub modeli w dowolnym laboratorium. Wszystkie plazmidy i linie komórkowe wykorzystane w tym protokole zostaną udostępnione społeczności naukowej, co jeszcze bardziej zwiększy dostępność metody.

Wprowadzenie

Znaczenie transportu nukleocytoplazmatycznego (NCT) w regulacji kluczowych szlaków komórkowych i utrzymaniu homeostazy komórkowej było przedmiotem intensywnych badań w ostatnich latach1. W konsekwencji opracowano szereg narzędzi do badania dynamiki NCT2,3,4. Wśród tych narzędzi sondy optogenetyczne LINuS5 oraz LEXY6, opisane odpowiednio w 2014 i 2016 roku, stanowią potężną metodę monitorowania NCT w żywych komórkach. Narzędzia te, zaprojektowane do śledzenia indukowalnego eksportu (LEXY) lub importu (LINuS) fluorescencyjnego reportera, są odwracalne i aktywowane pod wpływem światła niebieskiego.

Krótko mówiąc, te dwie małe sondy wykorzystują właściwości domeny LOV2 białka fototropiny-1 rośliny Avena sativa7. W absence niebieskiego światła helisa Jα z domeny LOV2 jest fotoklatkowana i osadzona w rdzeniu białka. Ponieważ helisa Jα może reagować na bodziec świetlny, naświetlanie światłem niebieskim indukuje zmianę konformacyjną i następcze odłączenie helisy Jα od domeny LOV2. Autorzy LEXY i LINuS wykorzystali tę światłoczułość do połączenia sygnału lokalizacji jądrowej (NLS) lub sygnału eksportu jądrowego (NES) z helisą Jα, odpowiednio dla LINuS i LEXY (Rysunek 1). Powstałym narzędziem jest sonda, która po naświetleniu światłem niebieskim translokuje do jądra (LINuS) lub cytozolu (LEXY).

Aby śledzić sondy za pomocą obrazowania fluorescencyjnego, do konstruktów dodano również reporter fluorescencyjny mCherry. Na koniec do układu dodano słaby sygnał NES (dla LINuS) lub NLS (dla LEXY), aby upewnić się, że sondy nie znajdowały się w swojej końcowej lokalizacji przed naświetleniem niebieskim światłem, co zapobiegłoby obserwacji translokacji LEXY lub LINuS między jądrem a cytosolem.

figure-introduction-1
Rycina 1: Przedstawienie sond LEXY i LINuS. Obie sondy składają się z białka mCherry połączonego z światłoczułą domeną LOV2. Różnica między tymi dwoma narzędziami polega na sekwencji sygnałowej ukrytej przez helisę Jα: NES w przypadku LEXY oraz NLS w przypadku LINuS. Obie sondy posiadają również słaby sygnał sekwencyjny w celu kontroli ich początkowej lokalizacji: słaby NLS dla LEXY i słaby NES dla LINuS. Aktywacja systemów poprzez naświetlanie światłem niebieskim indukuje zatem ich eksport w przypadku LEXY lub import w przypadku LINuS, co pozwala użytkownikom na monitorowanie eksportu lub importu jądrowego. Skróty: LEXY = system indukowanego światłem eksportu jądrowego; LINuS = indukowany światłem sygnał lokalizacji jądrowej; NLS = sygnał lokalizacji jądrowej; NES = sygnał eksportu jądrowego. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Lokalizacja fluorescencji mCherry informuje o przemieszczaniu się sond LEXY i LINuS pomiędzy jądrami a cytozolem, co pozwala na ich śledzenie w obrazowaniu żywych komórek, umożliwiając użytkownikom monitorowanie NCT. Poza zastosowaniem w charakterze prostych sond, LEXY i LINuS mogą być również modyfikowane w celu kontrolowania lokalizacji i badania białek docelowych in vitro5,6,8,9 lub in vivo10,11.

Metoda ilościowa zaproponowana w publikacjach LEXY i LINuS wykazuje względną intensywność sond w jądrach komórkowych. Sugerowana analiza jest wykonywana ręcznie i opiera się na pomiarze obszaru zainteresowania (ROI) w jądrze oraz w cytozolu. Chociaż metoda ta daje dobre odwzorowanie sygnału sondy w czasie, jest ona bardzo czasochłonna i żmudna, szczególnie w przypadku powtarzania eksperymentów i warunków. Co istotne, metoda ta cechuje się również niską dokładnością, ponieważ reprezentowany jest jedynie niewielki fragment wyznaczonego przedziału komórkowego.

W niniejszej pracy proponujemy nowy protokół ilościowego oznaczania sygnału fluorescencyjnego dla LEXY i LINuS. Wdrożyliśmy techniki zautomatyzowane, które ułatwiają analizy i zapewniają większą dokładność. Uprości to proces dla nowych użytkowników tych narzędzi i pomoże zwiększyć przepustowość. Nasz protokół ilościowy wykorzystuje tylko jeden interfejs – wtyczkę TrackMate12 programu FIJI o otwartym kodzie źródłowym. W celu zwiększenia niezawodności pomiarów zastosowaliśmy kompatybilny z obrazowaniem na żywo dalekoczerwony marker DNA do segmentacji całych jąder komórkowych za pomocą StarDist13, wyszkolonej splotowej sieci neuronowej, w połączeniu ze śledzeniem i pomiarem sygnału fluorescencyjnego sondy za pomocą TrackMate12.

Uzyskane dane można następnie łatwo wyeksportować do dołączonego, gotowego do użycia arkusza kalkulacyjnego (Tabela uzupełniająca S1), aby obliczyć względną intensywność jądrową każdego zidentyfikowanego jądra. Protokół ten wyjaśnia również, jak zestawić uzyskane wartości na wykresie poprzez dopasowanie otrzymanej krzywej przebiegu czasowego do modelu monoeksponencjalnego, zgodnie z metodą Yoo i Mitchison14, a także jak obliczyć szybkość transportu dla różnych testowanych warunków. Dzięki temu protokołowi oraz dostarczonemu arkuszowi analitycznemu użytkownicy będą mogli łatwo kwantyfikować dane z obrazowania żywych komórek, nawet przy ograniczonych umiejętnościach bioinformatycznych.

Protokół

UWAGA: Poniższy protokół opisuje monitorowanie eksportu jądrowego przy użyciu sondy LEXY. Szczegóły dotyczące ustawień do dostosowania dla LINuS przedstawiono w sekcji 5.

1. Hodowla komórkowa

UWAGA: Procedurę opisaną w tej sekcji należy przeprowadzić w komorze z laminarnym przepływem powietrza klasy do hodowli tkankowych. Kroki opisane poniżej zostały zoptymalizowane dla linii komórkowej fibroblastów mysich NIH/3T315, z wykorzystaniem pożywki DMEM (lub DMEM bez czerwieni fenolowej, gdy wskazano), uzupełnionej o 10% płodowej surowicy bydlęcej oraz 1% penicyliny-streptomycyny (patrz Tabela materiałów). Użytkownicy mogą jednak dostosować tę procedurę do innych typów komórek. Protokół nadaje się do komórek transfekowanych lub stabilnych linii komórkowych. Zalecamy jednak tworzenie stabilnych linii komórkowych, co zostało omówione w sekcji dyskusji.

  1. Przygotować roztwór do powlekania zawierający 23 µg/mL kolagenu i 2 µg/mL fibronektyny w sterylnym 1x PBS. Do każdej szalki do obrazowania na żywo (patrz Tabela Materiałów) dodać 800 µL roztworu do powlekania i inkubować w inkubatorze przez 90 min.
  2. Przepłukać mieszaninę do powlekania sterylnym 1x PBS, a następnie wysiać 60 000 komórek na szalki do obrazowania na żywo w pożywce, w celu przeprowadzenia akwizycji następnego dnia.
  3. W razie potrzeby przetransfekować komórki plazmidem LEXY zgodnie z metodą transfekcji najlepiej dopasowaną do użytego typu komórek. Aby postępować zgodnie z niniejszym protokołem, należy przeprowadzić kotransfekcję sondy z pustym wektorem w celu zwiększenia wydajności, w stosunku 1:5 dla LEXY:pusty wektor. Chronić komórki przed światłem w ciemnej skrzynce lub za pomocą folii aluminiowej i pozostawić do wzrostu na dobę.
  4. Przed akwizycją zabarwić komórki markerem DNA w dalekiej czerwieni kompatybilnym z obrazowaniem żywych komórek, w pożywce wolnej od czerwieni fenolowej, i upewnić się, że są one całkowicie chronione przed światłem aż do momentu akwizycji.
    UWAGA: W naszym przypadku stosujemy SiR-DNA16 w stężeniu 1 µM, inkubowany przez co najmniej 1 h przed akwizycjami.
  5. W celu kontroli eksportu zastosować inhibitor eksportu jądrowego Leptomycin B17 w stężeniu 0,5 nM (łagodne hamowanie eksportu) i 1 nM (silne hamowanie eksportu), podając go komórkom 1 h przed akwizycjami.

2. Obrazowanie

UWAGA: Akwizycję można przeprowadzić przy użyciu mikroskopu konfokalnego kompatybilnego z obrazowaniem żywych komórek, który posiada funkcję tworzenia wzorców wybranych akwizycji oraz pulsacyjne oświetlenie laserem 458 nm. Obrazowanie wykonano w ciemności w komorze o temperaturze 37 °C (z 5% CO2) mikroskopu konfokalnego ze skanowaniem rezonansowym. Układ został zoptymalizowany pod kątem obiektywu 20x, co pozwala na jednoczesne obrazowanie wielu komórek w tym samym polu widzenia. Sekwencja obrazowania składa się z trzech faz, zgodnie z Rysunkiem 2.

  1. Faza stabilna
    1. Wykonaj jedną akwizycję sygnałów mCherry (LEXY, laser 561 nm) i dalekiej czerwieni (SiR-DNA, laser 633 nm) co 15 s i powtórz tę czynność 10x, przez łączny czas 150 s. Upewnij się, że na tym etapie nie obserwuje się ani blaknięcia, ani translokacji LEXY do cytozolu.
      UWAGA: Naświetlenie układu światłem niebieskim na tym etapie aktywowałoby LEXY, co natychmiast wywołałoby jego eksport do cytozolu.
  2. Faza naświetlania
    UWAGA: Faza ta składa się z trzech kroków, powtórzonych 15x.
    1. Przeprowadź pulsacyjne naświetlanie światłem niebieskim (laser 458 nm), stosując impulsy o czasie trwania 36 ms powtórzone 150x, przez łączny czas ~5 s.
    2. Wykonaj jedną akwizycję sygnałów fluorescencyjnych mCherry (LEXY, laser 561 nm) i dalekiej czerwieni (SiR-DNA, laser 633 nm).
    3. Odczekaj 15 s.
  3. Faza regeneracji
    1. Wykonaj jedną akwizycję sygnałów mCherry (LEXY, laser 561 nm) i dalekiej czerwieni (SiR-DNA, laser 633 nm) co 15 s, powtórz 25x, przez łączny czas 375 s.
      UWAGA: Krok ten jest opcjonalny i może zostać pominięty, jeśli użytkownicy chcą obserwować jedynie eksport sondy, a nie regenerację.

figure-protocol-1
Rycina 2: Konfiguracja trzech faz LEXY. Aby monitorować eksport jądrowy za pomocą LEXY, w oprogramowaniu mikroskopu należy ustawić trzy fazy. Górna część schematu przedstawia konfigurację stosowaną podczas akwizycji obrazowania żywych komórek LEXY. Konfiguracja ta składa się z fazy stabilnej, zapewniającej stabilność sygnału w jądrze, fazy oświetlania, mającej na celu indukcję translokacji LEXY z jądra do cytozolu, oraz fazy regeneracji, aby zaobserwować powrót LEXY do jądra. Dolna część ryciny przedstawia oczekiwane wyniki obrazowania żywych komórek. Kolor czerwony (mCherry) wskazuje lokalizację LEXY. Kolor szary (SiR-DNA) barwi jądra komórkowe. Paski skali = 10 µm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

3. Analiza dla LEXY

UWAGA: Cała analiza segmentacji i śledzenia została przeprowadzona przy użyciu FIJI z wtyczką TrackMate12, będącą otwartym oprogramowaniem do Fiji (wymagana wersja została wyszczególniona w Tabeli materiałów).

  1. Zainstaluj program FIJI, a następnie pobierz wtyczki StarDist13 oraz TrackMate. Aby zainstalować wtyczki, przejdź do Help | Update … | Manage Update Sites i zaznacz CSBDeep, StarDist oraz Trackmate-StarDist, a następnie kliknij Apply changes. Zrestartuj program Fiji.
  2. Podczas gdy niektóre mikroskopy mogą rejestrować każdą fazę akwizycji (Stable-Illumination-Recovery) razem, inne (np. wspomniany mikroskop konfokalny) zapisują je oddzielnie. W związku z tym, w przypadku korzystania z tej konfiguracji, dodatkowym krokiem jest połączenie faz: otwórz obrazy trzech sekwencji, uruchom funkcję concatenate , aby skompilować trzy fazy time-lapse w jednym pliku: kliknij Image | Stacks | Tools | Concatenate….
  3. Wybierz fazę stabilną jako Image1, fazę oświetlenia jako Image2 oraz fazę regeneracji jako Image3. Wynikiem jest pojedynczy obraz time-lapse trzech faz z połączonymi kanałami mCherry (kanał 1) i SiR-DNA (kanał 2).
  4. Zachowaj otrzymany obraz do późniejszego etapu segmentacji i zapisz go: przejdź do File | Save As | Tiff….
  5. Wyodrębnij sam kanał mCherry do dalszych analiz: przejdź do Image | Color | Split Channels i zapisz go: przejdź do File | Save As | Tiff….
  6. Aby sprawdzić ewentualny bleaching podczas akwizycji, uruchom polecenie Plot Z-axis Profile dla kanału mCherry: przejdź do Image | Stacks | Plot Z-axis Profile. W wygenerowanej tabeli kliknij Data | Copy 1 st Data Set i wklej dane do gotowego arkusza dołączonego do protokołu (Supplemental Table S1), poniżej komórki profilu osi Z.
  7. Narysuj kołowy obszar zainteresowania (ROI) o średniej wielkości jądra komórkowego i zapisz go: przejdź do Analyze | Tools | ROI Manager…. Dodaj ROI i zapisz go: przejdź do More | Save…
    UWAGA: Ten sam ROI należy wykorzystać do pomiaru tła dla wszystkich analizowanych warunków.
  8. Umieść zapisany ROI w obszarze bez komórek przez cały czas trwania time-lapse i zmierz średnią intensywność w obrębie tego ROI za pomocą funkcji interfejsu ROI. Najpierw upewnij się, że zaznaczona jest opcja mean grey value, klikając Analyze | Set Measurements. Następnie kliknij More | Multi Measure. Zaznacz Measure all 50 slices oraz one raw per slice i kliknij ok.
  9. Skopiuj i wklej wszystkie wyświetlone wartości do dołączonego arkusza (Supplemental Table S1), poniżej komórki „ROI Background”.
  10. W programie Fiji zamknij obraz zawierający tylko kanał mCherry i wybierz wcześniej zapisany obraz z połączonymi kanałami mCherry i SiR-DNA.
  11. Otwórz wtyczkę TrackMate: przejdź do Plugins | Tracking | TrackMate.
  12. Sprawdź, czy liczba punktów czasowych jest poprawna (0 do 49 , jeśli zastosowano proponowane fazy) i kliknij Next.
  13. Wybierz detektor StarDist detector i kliknij Next.
  14. Wybierz kanał 2 (SiR-DNA) , aby przeprowadzić segmentację jąder, i kliknij Next. Odczekaj kilka sekund, aż proces segmentacji zostanie zakończony. Sprawdź wizualnie, czy uzyskana segmentacja odpowiada obrysom jąder, i kliknij Next (Rycina 3). W przypadku niedokładnej segmentacji zanotuj odpowiedni identyfikator jądra (SpotID), aby wykluczyć go z dalszej analizy w kroku 3.26.
  15. Pozostaw domyślne parametry i kliknij Next w oknie initial thresholding setting . Okno to wyświetla liczbę segmentowanych punktów (jąder) spośród 50 punktów czasowych.
  16. Ustaw filtry dla punktów: utwórz i skonfiguruj filtry:
    1. Utwórz dwa filtry z parametrem Mean intensity ch1 , aby usunąć jądra o zbyt silnym lub zbyt słabym sygnale, co mogłoby zafałszować analizy: jeden filtr do wyboru wartości powyżej określonego progu i drugi do wyboru wartości poniżej progu. Zdefiniuj wartość tak, aby usunąć jedynie sygnały bardzo niskie lub nasycone.
      UWAGA: Filtry te mogą być zbędne w przypadku użycia stabilnych linii komórkowych. Zanotuj te wartości, ponieważ muszą one zostać ponownie zastosowane dla wszystkich warunków.
    2. Utwórz dwa filtry Area , aby usunąć z analiz niepożądane obiekty (debris, komórki obumierające lub dzielące się): jeden filtr do wyboru wartości powyżej określonego progu i drugi do wyboru wartości poniżej progu. Kliknij Next.
      UWAGA: Ponownie zastosuj te wartości dla wszystkich warunków.
  17. Wybierz tracker: wybierz Simple LAP tracker i kliknij Next.
  18. Wybierz parametry śledzenia. Dostosuj Linking max distance (tutaj 30 µm) – maksymalną odległość, która będzie dopuszczalna przy łączeniu obiektów między klatkami. Użyj Gap-closing max distance (tutaj 15 µm) oraz Gap closing max frame gap (tutaj 3), aby określić, ile punktów pojedynczego toru może zostać pominiętych bez wykluczenia całego toru. Kliknij Next (Rycina 3).
    UWAGA: Zaproponowane parametry zostały zoptymalizowane dla naszej konfiguracji i modelu komórkowego metodą prób i błędów i mogą wymagać eksperymentalnego dostosowania.
    Parametr Linking max distance musi zostać dostosowany, aby zapobiec błędnemu śledzeniu (mistracking) z jednego jądra do drugiego, zwłaszcza jeśli komórki wykazują dużą ruchliwość.
  19. Po zakończeniu obliczeń kliknij Next i ustaw filtry dla torów (tracks). Aby wybrać tylko jądra, które były śledzone przez cały przebieg czasowy (50 punktów czasowych przy proponowanej sekwencji), wybierz najwyższą liczbę punktów w torze (ustaw kursor na over 49 dla proponowanej sekwencji). Kliknij Next.
    UWAGA: Ułatwi to analizę, ale jest możliwe tylko wtedy, gdy wystarczająca liczba jąder była śledzona przez cały przebieg czasowy; w przeciwnym razie zapoznaj się z dyskusją.
  20. Opcje wyświetlania: zaznacz Display spot names, aby móc odtworzyć ścieżkę każdego jądra w dalszych analizach. Dostosuj wyświetlane cechy zgodnie z preferencjami użytkownika.
  21. Na dole strony kliknij Tracks | Export to CSV, aby zapisać tabelę ze wszystkimi pomiarami. Zamknij tabelę i kliknij Next.
  22. Opcjonalnie wykreśl cechy toru, przyjmując T (czas) jako oś X oraz Mean intensity of the ch1 jako oś Y. Kliknij Plot features. Zamknij wykres i kliknij Next.
    UWAGA: Pozwoli to użytkownikom uzyskać ogólny obraz trendów z eksportu. Na tym etapie dane nie są znormalizowane względem tła i intensywności początkowej.
  23. Jako akcję wybierz Capture overlay i kliknij Execute | OK. Wygenerowany obraz posłuży do identyfikacji kwantyfikowanych jąder. Zapisz go: przejdź do File | Save As | Tiff….
  24. W pliku arkusza kalkulacyjnego zaimportuj plik CSV uzyskany z programu TrackMate: na karcie Data , w grupie Get & Transform Data , kliknij From Text/CSV , a następnie Import.
  25. Zaznacz cztery następujące kolumny, klikając odpowiednie litery, a następnie skopiuj i wklej je na górze dołączonego arkusza (Supplemental Table S1), w kolumnach od A do D, wraz z tłem: Spot ID (B), Track ID (C), Frame (I), Mean intensity ch1 (M).
    UWAGA: Upewnij się, że początek wklejonych pomiarów zaczyna się w wierszu 6 arkusza Supplemental Table S1. W przeciwnym razie pomiary mogą zostać przesunięte o jedną lub więcej komórek, co spowoduje ich błędność. Przykładowy układ można znaleźć w arkuszu Supplemental Table S2.
  26. Posortuj wyniki alfabetycznie najpierw według TrackID (pojedyncze jądro) , klikając strzałkę w komórce B5 , a następnie według Frame (punkt czasowy) , klikając strzałkę w komórce C5.
  27. Aby usunąć szum tła, odejmij wartości uzyskane w kroku 3.8 od każdej wartości uzyskanej w Mean intensity ch1 (obliczone wcześniej w dołączonym arkuszu, patrz Supplemental Table S1).
  28. Aby znormalizować sygnał LEXY, oblicz średnią intensywność sygnału fluorescencji mCherry w fazie stabilnej (klatki od 0 do 9). Następnie podziel wszystkie wyniki uzyskane w Mean intensity ch1 przez średnią intensywność fazy stabilnej (obliczone wcześniej w dołączonym arkuszu, patrz Supplemental Table S1).
    ​UWAGA: Otrzymana liczba jest średnią jądrową intensywności fluorescencji LEXY. Wszystkie pomiary są już wyświetlane per jądro od kolumny L i mogą zostać przedstawione na wykresie.

figure-protocol-2
Rysunek 3: Analiza TrackMate z użyciem programu FIJI. Na górze schematyczne przedstawienie analiz TrackMate, na dole obrazy uzyskane z analiz w programie FIJI. Pierwsze przedstawienie po lewej stronie pokazuje niesegmentowane barwienie SiR-DNA, marker jądra komórkowego, w kolorze szarym. Drugi panel przedstawia automatyczną segmentację wykonaną w kanale SiR-DNA za pomocą Stardist. Jądra są zabarwione zgodnie z intensywnością kanału mCherry, aby ułatwić wizualizację i końcowy etap. Trzeci panel pokazuje ścieżki uzyskane poprzez śledzenie barwienia SiR-DNA w punktach czasowych całej sekwencji obrazowania żywych komórek. Ostatni panel po prawej stronie pokazuje sygnał fluorescencyjny LEXY, w kolorze czerwonym, w obszarze zdefiniowanym przez segmentację, który będzie mierzony dla każdego punktu czasowego. Pasek skali = 50 µm Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

4. Szybkość transportu, statystyka i ryciny

  1. Narysuj wykres względnej intensywności jądrowej.
    1. Otwórz program GraphPad Prism i utwórz arkusz: kliknij w Wprowadzanie lub importowanie danych do nowej tabelii w opcjach wybierz czas trwania dla X i the maksymalna liczba posegmentowanych jąder dla wartości powtórzeń w sąsiadujących podkolumnach dla YKliknij w Utwórz i wklej uzyskane dane do tabeli.
    2. Dla Wartości X (czas)jeśli parametry akwizycji pozostały zgodne z sugestiami, należy skopiować i wkleić kolumnę znajdującą się pod nagłówkiem „time” w dostarczonym arkuszu kalkulacyjnym. W przeciwnym razie należy dostosować wartości do parametrów, które zostały zastosowane.
    3. Aby utworzyć wykres względnej intensywności jądra, przejdź do sekcji Graphs (Wykresy). Wybierz XY jako rodzina grafówi Punkty & linia łącząca z słupkami błędów jako typ wykresu.
    4. W Wykres sekcja, wybierz Średnia, błąd i SEM i kliknij w Proszę o dostarczenie tekstu źródłowego do tłumaczenia. aby wyświetlić wykresy. Zmień skale i elementy wizualne zgodnie z wybranymi parametrami.
  2. Dopasuj względną intensywność jądrową do modelu monoeksponencjalnego.
    1. W Tabela danych sekcja, kliknij w Nowa tabela danych.
      1. Wybierz Wprowadź wartości X jako X i Wprowadź i wykreśl pojedynczą wartość Y dla każdego punktu jako Yi kliknij w Utwórz.
      2. W X kolumna, podaj czasy w zapisie dziesiętnym wyłącznie dla fazy stabilizacji i fazy naświetlania; jeśli zachowano sugerowane parametry akwizycji, skopiuj i wklej kolumnę „decimal time” z dostarczonego arkusza kalkulacyjnego, Tabela uzupełniająca S1.
      3. Wklej otrzymane wartości jako względna intensywność jądrowa w tabeli, wyłącznie dla fazy stabilizacji i fazy naświetlania.
      4. W Wyniki sekcja, wybierz następującą analizę: Analizy XY | Wykładnicza | Regresja nieliniowa (dopasowanie krzywej) i kliknij w Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia..
      5. W parametrywybierz Model z plateau, po którym następuje jednofazowy rozpad, oraz w ograniczyć parametry, wybierz a stała równa 2,25 jako X0 (początkowy czas naświetlania), a stała równa 1 jako Y0 (względna intensywność jądra na początku naświetlania), a stała równa 0 dla plateau (wartości, do których powinna dążyć względna intensywność jądrowa), i wskazać, że K (wskaźnik eksportu) powinien zostać większe od 0Pozostałe parametry pozostaw w ustawieniach domyślnych. Kliknij Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia..
      6. W Wyniki w sekcji wiersz K wskazuje wszystkie szybkości eksportu dla jąder w badanym warunku.
      7. Powtórz kroki od 4.2.1 do 4.2.1.5 dla pozostałych warunków, jeśli będzie to konieczne.
  3. Utwórz wykres szybkości eksportu.
    1. Utwórz nową tabelę: wybierz Wprowadź wartości X Jako X i Wprowadź i nanieś na wykres pojedynczą wartość Y dla każdego punktu jako Yi kliknij w utwórz.
    2. Dla każdego warunku (w kolumnach) wklej i transponuj wartości K otrzymane w poprzednim kroku.
    3. Aby stworzyć wykres szybkości eksportu, należy przejść do Wykresy sekcja, wybierz kolumna jako rodzina grafów, a w Wykres pudełkowy i skrzypcowy sekcja, wybierz Wykres skrzypcowy Jako typ wykresuz Wykres skrzypcowy. Pokaż wszystkie punkty jako wykresKliknij w Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia. aby wyświetlić wykres. W razie potrzeby dostosuj sposób reprezentacji danych.
    4. Aby przeprowadzić test statystyczny dla tempa eksportu, należy wykonać dwustronny test Welcha t test, zgodnie z opisem Yoo i Mitchisona14poprzez wykonanie następujących kroków:
      1. W tabeli zawierającej szybkości eksportu dla wszystkich warunków kliknij na Analiza | Porównanie grup | Test t (oraz testy nieparametryczne), wybierz warunki do przetestowania i kliknij Proszę o dostarczenie tekstu źródłowego do tłumaczenia.Kleszcz Nieparowane, tak, należy użyć testu parametrycznegoi Nieparzysty test t z poprawką Welcha. Nie przyjmuj równości odchyleń standardowych.i kliknij w Proszę podać tekst źródłowy do tłumaczenia..
    5. Zapoznaj się z wynikami analizy w tabeli w obrębie Wyniki wyodrębnić i opisać wykres tempa eksportu, jeżeli jest to wymagane.

5. Adaptacje dla LINuS

UWAGA: Powyższy protokół można łatwo dostosować do monitorowania importu jądrowego z użyciem LINuS, wprowadzając następujące zmiany.

  1. Hodowla komórek
    1. Zamiast leptomycyny B w kroku 1.5, należy zastosować importazol18 jako inhibitor transportu jądrowego w stężeniu 10 µM przez 1 h przed akwizycją.
  2. Obrazowanie
    1. Aby uzyskać optymalny import w układzie, należy zastąpić 150 powtórzeń impulsów oświetlenia laserem 458 nm o czasie trwania 36 ms w kroku 2.2.1 przez 250 powtórzeń, co daje całkowity czas trwania ~9 s.
      UWAGA: czas trwania sekwencji może być zależny od typu komórek, a parametry dla obu sond mogą wymagać dostrojenia w celu optymalizacji, ponieważ układy te zależą od rozpoznawania NLS i NES, które są specyficzne dla typu komórek19,20.
  3. Szybkość transportu, statystyka i wykresy
    1. Zamiast dopasowywania krzywej do plateau, po którym następuje jednofazowy spadek w kroku 4.2.1.5, należy wybrać analizę Plateau followed by one phase association (plateau, po którym następuje jednofazowe asocjowanie).
    2. Należy ograniczyć wartość X0 do 2.25, Y0 do 1, a wartość K (szybkość importu w przypadku LINuS) do wartości większej niż 0.
      UWAGA: analizy LINuS z użyciem TrackMate są identyczne z analizami LEXY. Relatywna intensywność jądrowa jest nadal mierzoną i analizowaną wartością, jednak zamiast spadku wynikającego z eksportu sondy, powinno być obserwowane wzbogacenie sygnału fluorescencyjnego w jądrze po oświetleniu światłem niebieskim.

Wyniki

Powyższy protokół powinien umożliwić użytkownikom wizualizację lokalizacji i translokacji sondy podczas obrazowania żywych komórek. Przykład oczekiwanych obrazów uzyskanych w celu wizualizacji eksportu jądrowego z użyciem LEXY przedstawiono na Rysunku 4. Po kilku cyklach naświetlania światłem niebieskim powinien być obserwowany szybki spadek sygnału z jądra oraz jego wzbogacenie w cytosolu. Po przerwaniu cykli naświetlania może być widoczna stopniowa regeneracja sygnału sondy. W celu kontroli systemu zastosowano Leptomycynę B, inhibitor eksportu, która potwierdza, że zmiany w eksporcie można wizualizować za pomocą przeprowadzonych analiz, ponieważ zapobiega ona eksportowi LEXY po naświetlaniu światłem niebieskim (Rysunek 4).

figure-results-1
Rycina 4: Wizualizacja sygnału LEXY w czasie. Obrazy reprezentatywnych punktów czasowych fazy stabilnej, naświetlania i regeneracji, uzyskane za pomocą obrazowania żywych komórek. Warunki z metanolem reprezentują grupę kontrolną. Po pulsacyjnym naświetlaniu światłem niebieskim, sygnał fluorescencyjny mCherry (zaznaczony na czerwono), będący reporterem lokalizacji LEXY, ulega translokacji z jądra do cytozolu. Po zaprzestaniu naświetlania sygnał powraca do jądra. Leczenie inhibitorem eksportu Leptomycyną B w stężeniu 1 nM lub 0,5 nM wykazuje brak lub zmniejszenie eksportu LEXY w przypadku zablokowania tego procesu. Pasek skali = 30 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

W odniesieniu do analiz, podczas gdy wartości krzywej względnej intensywności jądrowej w fazie stabilnej powinny wynosić około 1, po aktywacji światłem niebieskim powinny one wykazywać powolny spadek aż do osiągnięcia plateau pod koniec fazy naświetlania (Rysunek 5A). Jeśli spadek jest zbyt szybki lub zbyt wolny, można zoptymalizować parametry akwizycji (patrz dyskusja). Leczenie Leptomycyną B w wystarczających stężeniach może również potwierdzić, że analizy i technika są wystarczająco czułe, aby wykazać całkowite zablokowanie eksportu jądrowego, przy czym wartości względnej intensywności jądrowej pozostają stabilne na poziomie około 1 przez cały eksperyment. Natomiast pośrednie stężenia Leptomycyny B powinny wykazywać łagodny eksport jądrowy (Rysunek 5A). Obserwacje wizualne te powinny zostać potwierdzone ilościowo poprzez wyznaczenie szybkości eksportu (Rysunek 5B).

figure-results-2
Rycina 5: Oczekiwana względna intensywność jądrowa LEXY oraz szybkość transportu. (A) Wykres przedstawia względną intensywność jądrową sygnału fluorescencyjnego LEXY w czasie, znormalizowaną do średniej intensywności mCherry w fazie stabilnej. Względna intensywność jądrowa w warunkach z metanolem (kontrola, czerwony) spada o połowę po naświetleniu, w przeciwieństwie do komórek traktowanych inhibitorem eksportu Leptomycin B w stężeniu 0,5 nM (jasnoniebieski) lub 1 nM (ciemnoniebieski). Słupki błędu: SEM. (B) Szybkość eksportu w warunkach kontrolnych oraz z Leptomycin B, uzyskana poprzez dopasowanie krzywej do modelu monoeksponencjalnego. Wartości uzyskane przy zablokowaniu eksportu przez Leptomycin B są znacznie niższe niż w warunkach kontrolnych. N = 18 komórek dla metanolu (czerwony), 19 komórek dla Leptomycin B 0,5 nM (jasnoniebieski) i 15 komórek dla Leptomycin B 1 nM (ciemnoniebieski). Wartości P obliczono za pomocą dwustronnego testu t Welcha. ***: P < 1×10−4, ****: P < 1×10−5. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Tabela uzupełniająca S1: Arkusz kalkulacyjny z predefiniowanymi obliczeniami. Arkusz ten został udostępniony w celu ułatwienia analizy. Wartości intensywności uzyskane za pomocą TrackMate można bezpośrednio skopiować i wkleić do arkusza, aby otrzymać znormalizowane wartości względnej intensywności jądrowej. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Tabela uzupełniająca S2: Przykład oczekiwanych wyników dla warunku kontrolnego w analizie LEXY. Arkusz kalkulacyjny przedstawia przykład uzyskanych wartości dla warunku kontrolnego stabilnej linii komórkowej LEXY. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Jak wspomniano w protokole, stworzenie stabilnych linii komórkowych znacznie poprawia jakość analiz. Po pierwsze, posiadanie 100% komórek wykazujących ekspresję sond zwiększa liczbę śledzonych i analizowanych jąder, co wzmacnia solidność analiz. Po drugie, zmniejsza śmierć komórek wywołaną nadekspresją sond i toksycznością zastosowanych odczynników do transfekcji. I wreszcie, zmniejsza silną niejednorodność sygnałów fluorescencyjnych między komórkami. Ten parametr jest istotny, ponieważ nasycony sygnał nie pozwoli na prawidłowe wykrycie zmiany intensywności po naświetleniu. Ten sam wniosek dotyczy słabych sygnałów, które mogą wybielić lub nie pozwolić na ilościowe określenie różnic. Dlatego zalecamy najpierw przetestowanie sond przez transfekcję, aby upewnić się, że działają prawidłowo, ustawienie parametrów akwizycji, a następnie szybkie utworzenie stabilnych linii komórkowych. Stworzyliśmy wektory lentiwirusowe zarówno dla sond LEXY, jak i LINuS, które są dostępne do udostępnienia na żądanie, a także stabilne linie NIH/3T3 LEXY lub LINuS utworzone za pomocą tych lentiwirusów.

Jeśli sondy są transfekowane lub jeśli komórki są rzadkie, sugerowane parametry prawdopodobnie zmniejszą liczbę wykrywanych ścieżek, a analizy będą mniej wiarygodne. W takim przypadku użytkownicy mogą być bardziej pobłażliwi w stosunku do miejsc pominiętych w śledzeniu, zmniejszając filtr Liczba miejsc w utworach (sugerujemy pozostawienie co najmniej 45 z 50 miejsc). Uwaga: jeśli ten filtr zostanie zmniejszony, dostarczony plik Excel (tabela uzupełniająca S1) powinien zostać ręcznie dostosowany: w rzeczywistości wartości wklejone z zaimportowanego pliku CSV nie będą uwzględniać luk. Użytkownik musi znaleźć brakujące miejsca z numerem TrackID i skorelować je z numerem jądra, co zwykle zajmuje kilka rund kopiowania i wklejania.

Krytycznym parametrem gwarantującym powodzenie eksperymentu jest utrzymywanie komórek w ciemności. Ponieważ sondy reagują na niebieskie światło, użytkownicy muszą zapewnić transport komórek w ciemności przez co najmniej 30 minut przed akwizycją. Wystarczy małe zamknięte pudełko lub użycie aluminium do przykrycia naczynia. Podobnie, należy być bardzo ostrożnym, aby używać światła mCherry tylko do wyszukiwania komórek pod mikroskopem, ponieważ oświetlenie niebieskim światłem aktywuje komórki. Jeśli ewentualne oświetlenie nastąpi pod mikroskopem, poszukaj innego odległego pola do akwizycji. Wykreślenie profilu osi Z w kroku 3.6 pomoże dowiedzieć się, czy na komórki wpłynęło oświetlenie, czy krzywa maleje, a nie jest płaskowyżem.

Sekwencja obrazowania składa się z trzech faz. Po pierwsze, faza stabilna, mająca na celu ocenę potencjalnego bielenia, ale także upewnienie się, że lokalizacja LEXY jest stała bez aktywacji (1). Po drugie, faza aktywacji, składająca się z rund pulsacyjnego oświetlenia światłem niebieskim, w celu wywołania translokacji LEXY z jądra do cytozolu (2). Wreszcie opcjonalna faza odzyskiwania, w której sygnał stopniowo wraca do swojego początkowego położenia w jądrze (3).

Sekwencja opisana dla akwizycji może być specyficzna dla typu komórki19,20. W pierwszym eksperymencie użytkownik powinien przetestować i zmodyfikować moc lasera i czasy, aby zobaczyć, jak system stopniowo przemieszcza się między jądrem a cytozolem. Co ważne, zbyt silna moc lasera, jako zbyt krótka przerwa, może uniemożliwić zobaczenie postępującej translokacji, ale zamiast tego brutalnego spadku/wzbogacenia (w zależności od użytej sondy) intensywności mCherry po oświetleniu.

Jeśli optymalizacja sekwencji nie rozwiąże problemu, prawdopodobnie NES i/lub NLS nie są odpowiednie dla używanego typu komórki. Użytkownicy mogą zapoznać się z artykułem8 metody LINuS, aby zaprojektować i zmodyfikować sondy. Użytkownicy mogą również zapoznać się z tym artykułem, aby uzyskać informacje na temat obrazowania LINuS za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego.

Segmentacja jąder jest krytycznym etapem analizy. Do obrazowania żywych komórek sond należy użyć solidnego i niezawodnego markera jądrowego. Ponieważ oświetlenie niebieskim światłem aktywuje translokację sondy, a sondy są monitorowane za pomocą białka fluorescencyjnego mCherry, marker ten musi być widoczny w widmie dalekiej czerwieni lub blisko. W naszym przypadku używamy SiR-DNA, które barwi komórki podczas 1 do ~24 h inkubacji, ale użycie SPY-DNA 650 jest również opcją (patrz Tabela materiałów w celu uzyskania referencji).

Wreszcie, jeśli segmentacja za pomocą StarDist w połączeniu z filtrowanym śledzeniem TrackMate udowodni swoją skuteczność, ważne jest, aby pamiętać, że użytkownik powinien zawsze wizualnie sprawdzić wyniki segmentacji i kwantyfikacji. Dzieląca się lub umierająca komórka może być uwzględniona w ocenie ilościowej, podczas gdy nie powinna. Aby zmniejszyć ryzyko analizy takich zdarzeń, dostarczony arkusz Excela przypisuje kod kolorystyczny względnej intensywności jądrowej (niebieski = niskie wartości, czerwony = wysokie wartości). Sprawdzając kolory przed wykreśleniem wartości w GraphPad Prism, użytkownik powinien być w stanie zauważyć wszelkie nietypowe wartości. Na przykład, względne intensywności jądrowe LEXY powinny wahać się od wysokich (czerwony, duże ilości sondy w jądrach) w fazie stabilnej do niskiej (niebieski, zmniejszona ilość sondy w jądrach) pod koniec fazy oświetlenia, zanim powrócą do wysokich wartości (czerwony), w fazie regeneracji (jak pokazano w tabeli uzupełniającej S2).

Protokół ten ma wiele zalet w porównaniu z poprzednio proponowanymi metodami 5,6. Półautomatyczny potok ułatwia analizę transportu nukleocytoplazmatycznego LEXY i LINuS i zapewnia większą dokładność niż wcześniej proponowana ręczna kwantyfikacja 5,6. Korzystanie z naszego protokołu umożliwi początkującym w tej dziedzinie wykonywanie wydajnych analiz, ale także zapewni nowe narzędzie dla doświadczonych użytkowników, którzy będą potrzebować tylko jednego otwartego interfejsu do wykonywania półautomatycznych analiz transportu nukleocytoplazmatycznego.

Metoda ta może być wykorzystana do dalszych zastosowań niż badanie globalnego tempa transportu nukleocytoplazmatycznego w liniach komórkowych NIH3T3. Rzeczywiście, dzięki kilku krokom optymalizacji można go dostosować do badania szybkości transportu sondy w różnych typach komórek lub żywych zwierzętach8. Co więcej, poprzez fuzję białka będącego przedmiotem zainteresowania LEXY lub LINuS, możliwe jest również zbadanie jego szybkości transportu lub dalszych skutków jego indukowanej światłem translokacji do jądra lub z niego. Na przykład możliwe jest sekwestrowanie białka w cytoplazmie za pomocą LEXY lub wymuszenie jego lokalizacji w jądrze za pomocą LINuS 5,6,21,22,23. Wreszcie, opisane analizy można również rozszerzyć na więcej zastosowań niż LEXY i LINuS, aby śledzić dowolny sygnał, który przemieszcza się między przedziałami subkomórkowymi, które można podzielić.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

Dziękujemy ośrodku obrazowania MRI, należącemu do krajowej infrastruktury France-BioImaging (https://ror.org/01y7vt929), wspieranemu przez francuską Narodową Agencję Badawczą (ANR-24-INBS-0005 FBI BIOGEN), a w szczególności Marie-Pierre Blanchard, Julio Mateos-Langerak i Baptiste Monterroso za ich pomoc w ustawieniach mikroskopu i analizach FIDŻI. Jesteśmy wdzięczni wszystkim członkom laboratorium Boumendil za ich rady i owocne dyskusje, a w szczególności Parisie Nobari za pomoc w rozpoczęciu projektu. Dziękujemy Joeyowi Dufourdowi za korektę manuskryptu.

Prace w grupie CB są wspierane przez Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS), Institut National du Cancer (Francuski Narodowy Instytut Raka) / Canceropole Grand Sud-Ouest (Grant Emergence 2023 E07), Agence Nationale pour la recherche (ANR-23-TERC-0015-01 i ANR-21-CE12-0039), Institut National du Cancer (Grant INCa PLBIO23-207-2023-180) oraz Uniwersytet w Montpellier (program I-SITE, Francja 2030, projekt NAChO, projekt ChOICe).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
KolagenSigma-Aldrich08-115
Mikroskop konfokalnyLEICA (Dziennik LEICADodatek SP8
DMEM (DMEM)Gibco (firma Gibco)31966021
Programu excelFirmy Microsoft
FBS (Sieć UsługowaSigma-AldrichF7524 powiedział:
FibronektynaSigma-AldrichZobacz materiał F1141 powiedział:
Oprogramowanie FIDŻIFIDŻIImageJ 2.16.0/1,54p; Java1.8.0_322
FluorodiakiHolenderFD3510-100Alternatywa: Komora Attofluorowa (Invitrogen #A7816)
Pryzmat GraphPad 10.4.1Oprogramowanie GraphPad, Inc.
ImportazolSigma-AldrichSML0341
Leptomycyna BSigma-AldrichL2913
Plazmid LEXYAddgene powiedział:72655pDN122 powiedział:
Plazmid LINuSAddgene powiedział:61347pDN77 powiedział:
Ołówek-StreptomycynaGibco (firma Gibco)15140-122
DMEM bez czerwieni fenolowejGibco (firma Gibco)21063-029
SiR-DNA (Gwiezdne DNA)SpirochromZobacz materiał SC007Alternatywa: SPY-DNA650 (Spirochrom #SC501)
Wtyczka Stardist 2DStarDist (Rozkład gwiazdy)StarDist_0.3.0
Wtyczka TrackMateKolega z toruTrackMate-7.14.0

Bibliografia

  1. Wing, C. E., Fung, H. Y. J., Chook, Y. M. Karyopherin-mediated nucleocytoplasmic transport. Nat Rev Mol Cell Biol. 23, 307-328 (2022).
  2. Kelley, J. B., Paschal, B. M. Fluorescence-based quantification of nucleocytoplasmic transport. Methods. 157, 106-114 (2019).
  3. Crefcoeur, R. P., Yin, R., Ulm, R., Halazonetis, T. D. Ultraviolet-B-mediated induction of protein-protein interactions in mammalian cells. Nat Commun. 4 (2), 1779(2013).
  4. Beyer, H. M., et al. Red light-regulated reversible nuclear localization of proteins in mammalian cells and zebrafish. ACS Synth Biol. 4 (9), 951-958 (2015).
  5. Niopek, D., et al. Engineering light-inducible nuclear localization signals for precise spatiotemporal control of protein dynamics in living cells. Nat Commun. 5, 4404(2014).
  6. Niopek, D., Wehler, P., Roensch, J., Eils, R., Di Ventura, B. Optogenetic control of nuclear protein export. Nat Commun. 7, 10624(2016).
  7. Zayner, J. P., Antoniou, C., Sosnick, T. R. The amino terminal helix modulates light activated conformational changes in AsLOV2. J Mol Biol. 419 (1-2), 61-74 (2012).
  8. Wehler, P., Niopek, D., Eils, R., Di Ventura, B. Optogenetic control of nuclear protein import in living cells using light-inducible nuclear localization signals (LINuS). Curr Protoc Chem Biol. 8 (2), 131-145 (2016).
  9. Lataster, L., et al. Cell cycle control by optogenetically regulated cell cycle inhibitor protein p21. Biology. 12 (9), 1194(2023).
  10. Forlani, G., et al. Analysis of slow-cycling variants of the light-inducible nuclear protein export system LEXY in mammalian cells. ACS Synth Biol. 11 (10), 3529-3533 (2022).
  11. Inutsuka, A., Kimizuka, N., Takanohashi, N., Yakabu, H., Onaka, T. Visualization of a blue light transmission area in living animals using light-induced nuclear translocation of fluorescent proteins. Biochem Biophys Res Commun. 522 (1), 138-143 (2020).
  12. Tinevez, J. -Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
  13. Schmidt, U., Weigert, M., Broaddus, C., Myers, G. Cell detection with star-convex polygons. Medical Image Computing and Computer Assisted Intervention - MICCAI 2018. Frangi, A. F., Schnabel, J. A., Davatzikos, A. F., Alberola-López, C., Fichtinger, G. , Springer International Publishing. Cham. 265-273 (2018).
  14. Yoo, T. Y., Mitchison, T. J. O-GlcNAc modification of nuclear pore complexes accelerates bidirectional transport. J Cell Biol. 220 (7), e202010141(2021).
  15. Jainchill, J. L., Aaronson, S. A., Todaro, G. J. Murine sarcoma and leukemia viruses: assay using clonal lines of contact-inhibited mouse cells. J Virol. 4 (5), 549-553 (1969).
  16. Lukinavičius, G., et al. SiR-Hoechst is a far-red DNA stain for live-cell nanoscopy. Nat Commun. 6, 8497(2015).
  17. Kudo, N., et al. Leptomycin B inactivates CRM1/exportin 1 by covalent modification at a cysteine residue in the central conserved region. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (16), 9112-9117 (1999).
  18. Soderholm, J. F., et al. Importazole, a small molecule inhibitor of the transport receptor importin-β. ACS Chem Biol. 6 (7), 700-708 (2011).
  19. Henderson, B. R., Eleftheriou, A. A comparison of the activity, sequence specificity, and CRM1-dependence of different nuclear export signals. Exp Cell Res. 256 (1), 213-224 (2000).
  20. Lu, J., et al. Types of nuclear localization signals and mechanisms of protein import into the nucleus. Cell Commun Signaling. 19 (1), 60(2021).
  21. Krueger, D., et al. Principles and applications of optogenetics in developmental biology. Development. 146 (20), dev175067(2019).
  22. Kögler, A. C., et al. Extremely rapid and reversible optogenetic perturbation of nuclear proteins in living embryos. Dev Cell. 56 (16), 2348-2363 (2021).
  23. Zhang, W., et al. Hitchhiking of Cas9 with nucleus-localized proteins impairs its controllability and leads to efficient genome editing of NLS-free Cas9. Mol Ther. 32 (4), 920-934 (2024).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Obrazowanie ywych kom reksonda LEXYsonda LINuSeksport j drowylokalizacja j drowawektory lentiwirusoweoprogramowanie FIJI
Wykorzystanie narzędzi optogenetycznych LEXY i LINuS oraz zautomatyzowanej analizy obrazu do ilościowego określenia dynamiki transportu nukleocytoplazmatycznego w żywych komórkach
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.