Artykuł metodologiczny

Mikroskopia ekspansyjna: Obrazowanie fluorescencyjne o wysokiej rozdzielczości za pomocą konwencjonalnego mikroskopu

DOI:

10.3791/68595

⸱

19 grudnia 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1University of Bordeaux, CNRS, MFP, iMet UMR 5234, 2Université Claude Bernard Lyon 1, MeLiS-UCBL-CNRS UMR 5284-INSERM U1314, 3University of Bordeaux, CNRS, MFP, ProParaCyto UMR 5234

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiamy tutaj szczegółowy protokół łączący metody kriofiksacji i mikroskopii ekspansyjnej (Cryo-ExM), umożliwiający obrazowanie w wysokiej rozdzielczości z zachowaniem strukturalnym dostosowanym do różnych próbek biologicznych. Próbki biologiczne są zamrażane, osadzane w polimerze puchniącym, denaturowane, rozszerzane i znakowane immunosystemowo, co umożliwia obrazowanie o nadrozdzielczości za pomocą standardowych mikroskopów świetlnych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikroskopia ekspansyjna (ExM) to innowacyjna technika mikroskopii fluorescencyjnej o superrozdzielczości, która fizycznie powiększa próbki biologiczne, umożliwiając obrazowanie przekraczające limit dyfrakcji za pomocą konwencjonalnych systemów, takich jak mikroskopy konfokalne. Poprzez osadzenie próbek w napęcznialnej matrycy hydrożelowej, ExM umożliwia izotropowe rozszerzanie próbki, zwiększając rozdzielczość przestrzenną bez konieczności stosowania specjalistycznego sprzętu nanokopiowego. Zaawansowane warianty, takie jak mikroskopia rozszerzająca ultrastrukturę (Ultrastructure Expansion Microscopy, U-ExM), zachowują drobne detale komórkowe, w tym organelle i zespoły makrocząsteczkowe.

Obserwacja konkretnych struktur komórkowych, czyli organelli, w dużej mierze zależy od metody utrwalania próbki, zwłaszcza poprzez użycie chemicznych linkerów na bazie aldehydu oraz wytrącania białek za pomocą zimnego metanolu. Ostatnio integracja kriofiksacji — złotego standardu techniki fiksacji — z metodą U-ExM umożliwiła obserwacje na skalę nano-szeroką różnorodności próbek biologicznych, od hodowanych komórek ssaków po całe organizmy, w ich niemal naturalnym stanie. Mikroskopia ekspansji to potężne narzędzie do badania struktur biologicznych na różnych skalach, od izolowanych organelli po całe tkanki. W połączeniu z kriogenicjamią dostarcza bezprecedensowych informacji o architekturze komórkowej i procesach dynamicznych, minimalizując jednocześnie artefakty związane z tradycyjnymi metodami fiksacji. Te osiągnięcia pozycjonują ExM jako wszechstronne ramy do wysokorozdzielczego, niemal natywnego obrazowania biologicznego.

Niniejsze badanie przedstawia szczegółowy protokół kryogenifiksacji połączony z mikroskopią ekspansyjną próbek z różnych źródeł. Protokół ten podkreśla kluczowe kroki, w tym utrwalanie próbki, formowanie polimerów, rozszerzanie, barwienie immunologiczne oraz obrazowanie, dostarczając niezbędnych wskazówek do wdrożenia tej metody w dowolnym laboratorium.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikroskopia odgrywa kluczową rolę w badaniach biologicznych, umożliwiając wizualizację ultrastruktury i organizacji w systemach żywych na niespotykaną dotąd skalę, od całych organizmów po pojedyncze cząsteczki. Pole mikroskopii obejmuje dwa odrębne systemy: mikroskopię elektronową (EM), wysoce resolutującą, ale o ograniczonej zdolności do specyficznego oznaczania, oraz mikroskopię świetlną, umożliwiającą precyzyjną i szczegółową wizualizację struktury podkomórkowej, ale z ograniczoną rozdzielczością ze względu na ograniczenie dyfrakcyjne światła. Chociaż mikroskopia fluorescencyjna o nadrozdzielczości (SRM) rozwinęła się jako potężna metoda obrazowania fluorescencji komórek z podrozdzielczością, wizualizacja ultrastrukturalnych szczegółów zespołów makrocząsteczkowych, takich jak całe organizmy, pozostaje wyzwaniem1. Ponadto techniki SRM, osiągające rozdzielczość od 10 do 120 nm, opierają się na zaawansowanych mikroskopach i algorytmach rekonstrukcji obrazów oraz wymagają wiedzy specjalistycznej i specjalistycznych mikroskopów, co ogranicza ich dostęp do wielu laboratoriów biologicznych. Pojawiająca się metoda superrozdzielczości, mikroskopia ekspansyjna (ExM), przezwyciężyła te ograniczenia. Opracowana w laboratorium Edwarda S. Boydena dekadę temu, ExM to innowacyjna technika mikroskopii fotonicznej, obecnie uznawana za mikroskopię superrozdzielczą, umożliwiającą obrazowanie bez potrzeby stosowania specjalistycznych mikroskopów2. Zamiast polegać na zaawansowanych technologiach obrazowania, ExM polega na osadzaniu próbek biologicznych w polimerze puchającym, który rozszerza się izotropowo. To fizyczne rozszerzenie zwiększa rozmiar próbki czterokrotnie lub więcej, zwiększając rozdzielczość i umożliwiając obserwację za pomocą konwencjonalnych mikroskopów świetlnych. Początkowo opracowane w przecięciach mózgu, protokoły ExM ewoluowały, aby poprawić rozdzielczość i uprościć procedury. Technika ta została z powodzeniem zaadaptowana do różnych próbek biologicznych, w tym komórek eukariotycznych, organizmów jednokomórkowych, pasożytów, tkanek i całych organizmów, co potwierdza jej wszechstronność 3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14, 15.

Obecnie istnieją dwie główne klasy protokołów: przedrozszerzającesię 2,16 oraz porozszerzające17,18, które odnoszą się do momentu biologicznego barwienia próbki, albo przed, albo po zabiegu rozszerzania. Niniejszy artykuł skupi się szczególnie na protokole po ekspansji, w którym immunoznakowanie przeprowadza się po denaturacji i ekspansji próbki.

W tym protokole próbki biologiczne są kriogenicznie lub chemicznie utrwalane i inkubowane z użyciem środków chemicznych, co pozwala na zakotwicenie białka w przyszłym polimerze. Następnie próbki są osadzane w polimerze puchniącym się złożonym z akrylamidu/bisakrylamidu (powszechnie stosowanego w żelach elektroforezy) oraz akrylianu sodu (umożliwiającego ekspansję). Dodanie wody wywołuje rozszerzanie się żelu, zwiększając odległość między białkami proporcjonalnie do rozprężania żelu. Białka zainteresowania są następnie oznaczane bezpośrednio w żelu za pomocą specyficznych przeciwciał (Rysunek 1).

Wszystkie wymienione techniki obrazowania, w tym mikroskopia elektronowa, mikroskopia fotoniczna, mikroskopia superrozdzielcza oraz ExM, wymagają biologicznego utrwalenia próbki. Fiksacja na bazie aldehydu tworzy sieci międzybiałkowe, utrzymując organizację komórek podczas zabiegów wymaganych w mikroskopii fotonicznej lub elektronowej. Jednak fiksacja może również prowadzić do artefaktów i zmian morfologicznych w komórce, które mogą być subtelne w klasycznej mikroskopii świetlnej, ale stały się coraz bardziej widoczne wraz z rozwojem SRM, co skłania naukowców do ponownego rozważenia konsekwencji metod fiksacji19. Jednym ze sposobów na obejście artefaktów związanych z fiksacją jest użycie mikroskopii na żywo, która umożliwia dynamiczną wizualizację struktur komórkowych w ich niemal naturalnym stanie. Jednak mikroskopia na żywo ma kilka wad, zwłaszcza konieczność ekspresji transgenów, która może potencjalnie wpływać na fizjologię komórek i zmieniać zachowanie białek w porównaniu z endogennymi odpowiednikami. Dodatkowo, mikroskopia na żywo zazwyczaj oferuje niższą rozdzielczość niż mikroskopia stała i ma ograniczone opcje znakowania, ponieważ znaczniki fluorescencyjne muszą być nietoksyczne i stabilne w warunkach rzeczywistych, co ogranicza dostępne markery. Dziedzina mikroskopii elektronowej, dzięki wysokiej rozdzielczości, znacząco przyczyniła się do rozwoju optymalnych metod utrwalania struktur podkomórkowych lub makrocząsteczkowych przy zachowaniu ich pierwotnego stanu. Dekady temu laboratoria Dubocheta, Franka i Hendersona opracowały kriofiksację, polegającą na szybkim fiksowaniu komórki w wodzie szklistej i wykazaniu, że jest to jedyne podejście do zachowania rodzimej ultrastruktury20,21. Chociaż oczyszczone cząsteczki można obserwować bezpośrednio w lodzie szklistym za pomocą mikroskopii krioelektronowej, komórki muszą być osadzone w żywicy i przecięte przed obserwacją. Aby dodatkowo ustabilizować próbki w możliwie najbardziej naturalnym stanie, poddawane są metodzie podstawiania przez zamrażanie. W tym procesie, gdy cząsteczki lodu wracają do stanu ciekłego, natychmiast zastępuje je aceton, który ma wyższy współczynnik dyfuzji niż woda. Podczas usuwania wody cząsteczki mogą się agregować i zapadać, podobnie jak podczas chemicznego wiązania sieciowego. Aby ograniczyć tę agregację, podstawienie zamrożenia przeprowadza się w niskich temperaturach, zmniejszając agregację poprzez zwiększenie lepkości wewnątrzkomórkowej22. Takie kontrolowane podejście ogranicza tworzenie dużych agregatów i zachowuje ultrastrukturę komórkową bliżej jej stanu rodzimego.

W 2022 roku rosnące dowody na to, że chemiczna wiązania wprowadza artefakty, połączone z postępem w mikroskopii ekspansyjnej, skłoniły laboratorium Guichard/Hamel do opracowania metody integrującej kriofiksację z mikroskopią ekspansyjną, znanej jako 'Cryo-ExM'23. Podejście to wykorzystuje zalety obu technik, zachowując struktury biologiczne przy minimalnych zniekształceniach. Próbki są zamrażane kriogenicznie za pomocą zamrażania pod wysokim ciśnieniem lub ręcznego zanurzania, co wymaga specjalistycznego sprzętu powszechnie stosowanego w laboratoriach mikroskopii elektronowej lub zakładach rdzeniowych.

Niniejszy artykuł przedstawia krok po kroku protokół przeprowadzania kriofiksacji, po którym następuje mikroskopia ekspansja, oraz przedstawia reprezentatywne wyniki z dwóch modeli eksperymentalnych: ludzkich komórek hodowlanych oraz jednokomórkowego pasożyta Trypanosoma brucei, czynnika wywołującego śpiącość. Podkreślimy ulepszenia oferowane przez kriogenifiksację w porównaniu z konwencjonalnymi metodami fiksacji oraz podkreślimy najczęstsze pułapki i artefakty związane z tą techniką.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Odczynniki stosowane w tym protokole są wymienione w Tabeli Materiałów. Protokół ten jest dostosowany, z drobnymi modyfikacjami, do obserwacji różnych procesów komórkowych w różnych próbkach biologicznych (w tym drożdżach24,25, Toxoplasma gondii26, gatunkach zwierząt bliskich spokrewnionych27, zielonych algach28,29, eukariontach mikrobiologicznych30), a także próbkach myszy23 i ludzkich23,31,32,33). Modyfikacje dostosowujące protokół do tych różnych próbek nie są wymienione w niniejszym artykule, ponieważ można je pobrać z oryginalnych publikacji. Tutaj komórki RPE1 oraz Trypanosoma brucei są wykorzystywane jako zastępstwa komórek ssaków i pasożytów. Protokół ten kładzie nacisk na etapy utrwalania i rozszerzania próbek biologicznych; dlatego w tym artykule nie przedstawiono informacji dotyczących kultury próbki.

1. Przygotowanie roztworu bulionowego

  1. Roztwór polilizyny
    1. Ponownie zawiesij poli-L lub poli-D-lizynowy bromik (Tabela materiałów) w wodzie, aby uzyskać roztwór zapasowy poli-lizyny o stężeniu 1 mg/mL. Przechowuj ten roztwór w temperaturze -20 °C i dalej rozcieńczaj w wodzie o stężeniu 0,2 mg/mL w celu pokrycia pokrywek (Tabela 1, Tabela materiałów).
  2. Rozwiązanie kotwiczeniowe
    1. Przygotuj świeży roztwór akrylamidu/formaldehydu (pod pokrywą chemiczną), mieszając 38 μL formalnego dehydu (36,5%-38%; Tabela materiałów) oraz 50 μL akrylamidu (40%, Tabela materiałów) w 912 μL PBS, aby uzyskać 1 ml roztworu.
  3. Roztwór żelacy bez APS (inicjator)
    1. Przygotuj roztwór mieszanki, dodając 500 μL 38% akrylianu sodu (19% final), 250 μL 40% akrylamidu (10% final), 50 μL 2% bisakrylamidu (0,1% final), 50 μL TEMED (0,5% final) oraz 100 μL 10x PBS (1x final). Aliquot w objętości odpowiedniej maksymalnie na 2 żele (80-90 μL) i przechowywanie w -20 °C przez co najmniej 12 godzin przed używania (patrz Tabela 1 dla długoterminowej ochrony).
      UWAGA: Prosimy zauważyć, że objętość wskazana do przygotowania mieszanki roztworu żelacyjnego jest obliczana tak, aby uzyskać końcową objętość 1 mL, natomiast rzeczywista objętość roztworu wynosi 950 μL, ponieważ APS, które stanowi 1/20 całkowitej objętości z każdego roztworu, jest dodawane spontanicznie. Pierwotny czas przechowywania roztworużelacyjnego 17 został wydłużony po tym, jak zaobserwowaliśmy, że można go zachować do miesiąca w temperaturze -20 °C bez utraty stałości żelu ani efektywności rozszerzalności.
  4. TEMED i APS
    1. APS 10% w/v: Rozcieńcz proszek APS w wodzie, zachowuj i przechowuj w temperaturze -20 °C.
    2. TEMED 10% v/v: Rozcieńcz TEMED w wodzie, podaj i przechowuj w temperaturze -20 °C.
  5. Akrylian sodu (SA) 38%
    1. Przygotuj 38% SA z oczyszczonej SA (AK scientific lub Sigma; Tabela materiałów)
      1. Ponownie zawiesz 38 g akrylianu sodu w 100 mL wody przy stałym mieszaniu (ważne). Stopniowo wprowadzaj kwasy sainatyczny, aby uniknąć kruszyw, i mieszaj przez noc w temperaturze 4 °C, aby zapewnić całkowitą rezawiesję. Upewnij się, że roztwór jest przezroczysty i bezbarwny lub lekko żółty. Zachowaj w temperaturze 4 °C do roku.
    2. Przygotuj 38% kwasu tlenowego z kwasu akrylowego (Sigma; Tabela materiałów)
      1. Przygotuj 90 mL akrylanu sodu o stężeniu 38% przez neutralizację kwasu akrylowego NaOH pod chemiczną osłoną.
      2. Wymieszaj 29 ml wody z 25 ml kwasu akrylowego podczas mieszania.
        UWAGA: Od tego etapu reakcja musi być przeprowadzona na lodzie z stałą kontrolą pH i temperatury, ponieważ reakcja jest egzotermiczna.
      3. Dodawaj 10 N NaOH kropla po kropli za pomocą pipety Pasteura.
        UWAGA: Upewnij się, że temperatura nie przekracza 25 °C (jeśli tak jest, przestań dodawać NaOH i poczekaj, aż temperatura się ochłodzi).
      4. Kontynuuj neutralizację, aż pH osiągnie 7-8 i mieszaj przez godzinę na lodzie.
        UWAGA: Jeśli pH nagle przekroczy 10, dodaj kwas akrylowy, aż pH spadnie do 7-8.
      5. Przechowuj roztwór w zamkniętym pojemniku na noc. Jeśli roztwór się wypadł, wiruj w 1000 × g przez 10 minut. Zbieraj supernatant, aliquot, i przechowuj je w temperaturze -20 °C.
  6. Rozwiązanie denaturacji
    1. TrisBase 1 M: rozcieńcz 121,14 g TrisBase w 1 litrze wody, dostosuj pH HCl do 9 i przechowuj w RT.
    2. Bufor denaturacyjny: Wymieszać 200 mM Dodecylosiarczanu sodu (SDS), 200 mM NaCl, 50 mM TrisBase w wodzie. Dla roztworu 200 mL dodaj 10 mL Tris-BASE 1 M (pH 9) do 124,9 mL ddH2O, dodaj 57,1 mL SDS (20%/700 mM bulionu) i 8 mL NaCl (5 M bulionu) podczas mieszania. Przechowywać w RT (Tabela 1).

2. Procedura wiązania i ekspansji kriogenicznej

  1. Przygotowanie próbki i kriogenicja
    UWAGA: Protokół ten jest zoptymalizowany pod kątem próbek hodowanych lub ładowanych na pokrywkach o grubości 12 mm. Proszę zmienić objętość rozwiązania dla innych źródeł wsparcia.
    1. Przygotowanie próbki
      1. Hodować próbkę w warunkach dostosowanych do próbki biologicznej, albo bezpośrednio na 12 mm pokrywkach (komórkach ssaków przylegających), albo w zawiesie (T. brucei).
      2. Załaduj próbkę na pokrywkę (T. brucei) wstępnie położoną polilizyną w następujący sposób: krótko inkubuj pokrywki o średnicy 12 mm w polilizynie (0,2 mg/mL) przez 1 godzinę w 37 °C, szybko umyj i susz na powietrzu.
      3. Wiruj pasożyty w dawce 300 g przez 10 minut w temperaturze pokojowej (RT). Ponownie zawiesz w PBS uzupełnionym 10% podłoża hodowlanego i załaduj pokrywki 5-10 minut przed kriogenicznym fiksowaniem.
    2. Układ zanurzania (Rysunek 2A-C)
      UWAGA: Pracuj pod kapturem chemicznym w rękawiczkach i fartuchu laboratoryjnym podczas manipulacji acetonem. Używaj fartucha laboratoryjnego i gogli przy manipulacji z ciekłym azotem i ciekłym etanem.
      1. Pod chemicznym okapem napełnij probówki po 5 ml (1 pokrywkę/tubkę) 1 ml ekstra-suchego acetonu za pomocą strzykawki i igły, aby uniknąć zanieczyszczenia powietrza.
        UWAGA: Dla lepszego zachowania błony biologicznej konieczne jest dodanie paradehydu (PFA)/glutaraldehydu (GA) (0,1/0,02 %). Dostosuj rurkę do średnicy slipu (pokrywki > 12 mm nie zmieścią się w tubach 5 mL).
      2. Zamroź rurki w ciekłym azocie, używając plastikowego lub metalowego stojaka odpornego na niskie temperatury, aby utrzymać je w pionie.
      3. Wypełnij połowę pudełka z polistyrenu (30 cm x 30 cm / grube ściany) suchym lodem.
      4. Napełnij dewar typu Vitrobot ciekłym azotem, aż przestanie parować, i odczekaj 10-15 minut na stabilizację temperatury. Użycie pająka jest potrzebne, aby ułatwić chłodzenie systemu (Rysunek 2B, gwiazdka). Uzupełnij, jeśli trzeba.
      5. Usuń pająka i napełnij metalową komorę zanurzającą ciekłym etanem.
      6. Poczekaj 10 minut, aż etan się wyrówna.
        UWAGA: W razie potrzeby uzupełnić system zanurzania ciekłym etanem (na tym etapie nie używaj już pająka). Przejście z gazowego do ciekłego etanu jest trudne. Stosowanie odpowiedniego ciśnienia jest kluczowe dla powstawania ciekłego etanu. Wysokie ciśnienie zapobiega powstawaniu cieczy przez stały przelew gazu w komorze metalowej, natomiast niskie ciśnienie powoduje powstawanie stałego etanu w komorze metalowej i rurce napełniającej. Unikanie powstawania lodu jest kluczowe dla eksperymentu. Utrzymanie końcówki napełniającej na styku ciecz i powietrze pomaga zapobiegać powstawaniu etanu stałego.
    3. Zanurzenie (Rysunek 2A-C)
      UWAGA: Używaj fartucha laboratoryjnego i gogli podczas manipulacji z ciekłym azotem i etanem.
      1. Weź pokrywkę 12 mm z cienką pęsetą.
      2. Nadmierne ilości medium wchłonij bibułką.
      3. Trzymaj pokrywkę w połowie za pomocą pęsety z pierścieniem zaciskowym dostosowanym do krio-tłoka.
      4. Włóż pęsetę trzymającą pokrywkę do uchwytu krio-tłoka. Usuń wszelkie pozostałe materiały papierem Whatman.
      5. Aktywuj kriogeniczkę, aby zanurzyć pokrywę w roztworze etanu w metalowej komorze.
      6. Szybko przełóż pokrywkę do rurki zawierającej zamrożony aceton (1 pokrywka/tubka).
        UWAGA: Nie używaj tych samych pęset do pobierania próbek ani do zanurzania, aby uniknąć zanieczyszczenia podłożem hodowlanym. Bądź szczególnie ostrożny, jeśli używasz pokrywek > 12 mm (pokrywy o średnicy 15 lub 18 mm pasują do nośnika, ale mogą być trudniejsze do zanurzenia). W tym etapie można zanurzyć pokrywę w ciekłym azocie po zanurzeniu, aby ułatwić transfer do Eppendorfa, jednocześnie utrzymując próbkę zamrożoną. Ponieważ aceton zamarza w temperaturze -96 °C, konieczne jest umieszczenie pokrywek na zamarzniętym acetonie do zastąpienia zamrożenia.
    4. Zamienienie i nawodnienie zamrożenia
      UWAGA: Pracuj pod maską podczas manipulacji próbkami podczas zamrażania. Wzrost temperatury powoduje ciśnienie wewnątrz rury, co może wywołać eksplozję rury.
      1. Inkubuj rurki w suchym lodzie pod kątem nachylenia (około 45°).
      2. Mieszaj przez noc na wstrząszaczu orbitalnym. Zamknięte pudełko umieść na shakerze w temperaturze 4 °C lub RT, aby temperatura wzrosła z -180 °C do -80 °C.
      3. Wyjmij większość suchego lodu z pudełka (tylko kilka zostawij na dnie), szybko uwolnij ciśnienie w rurkach poprzez szybkie ich otwieranie i zamykanie, a następnie mieszaj przez 45 minut na wstrząsie orbitalnej, aby temperatura wzrosła z -80 °C do -20 °C.
      4. Przełóż pokrywki na płytkę z 12 dołkami (lub dowolny wygodny pojemnik) zawierającą wcześniej schłodzony czysty etanol (100%). Inkubuj przez 5 minut i konwertuj stopniowe nawadnianie w następujący sposób: EtOH 100% (5 min) - EtOH 95% (3 min) - EtOH 95% (3 min) - EtOH 70% (3 min) - EtOH 50% (3 min) - EtOH 25% (3 min) - H2O 100%.
      5. Przenieś pokrywki do PBS i ułóż je pod mikroskopem (drapiąc powierzchnię końcówką), aby wszystkie były skierowane do góry.
        UWAGA: EtOH 100% i 95% przechowywane są w -20 °C, EtOH 70% i EtOH 50% w 4 °C, a EtOH 25% i ddH20w RT, aby kontynuować wzrost temperatury aż do RT. Do znakowania błonowego konieczne jest dodanie PFA/GA (0,1%/0,02%) w roztworach acetonowych i nawodniających, z wyjątkiem ddH2O.
  2. Rozbudowa
    1. Kotwicenie białek
      1. Przygotuj świeży roztwór 1,4% formacji formaldehydu/2% akryloamidu (FA/AA) w PBS 1x.
      2. Umieść pokrywki w płytkach 4/12 wypełnionych 0,5/1 mL AA/FA.
      3. Inkubuj przez 3-5 godzin w 37 °C bez mieszania.
        UWAGA: Formaldehyd wiąże wolne grupy aminowe białek z akrylamidem. Nadmiar akryloamidu pomaga ograniczyć sieci krzyżowe białek normalnie indukowane przez formaldehyd i kotwiczy białka w przyszłym polimerze ekspansyjnym. Kroki wydłużenia białka do nocnego etapu może być potrzebne w zależności od próbki biologicznej. W każdym razie dłuższa inkubacja nie wpłynie na żaden z poniższych kroków. Napełnij wolne studnie wodą lub umieść je w wilgotnej komorze, aby zapobiec parowaniu.
    2. Żelacje
      1. Rozmraż, APS (10%) i roztwór żelacyjny (akrylan sodu 19%, akryloamid 10%, bisakrylamid 0,1%, TEMED 0,5% rozcieńczony w 10x PBS) na lodzie 10 minut przed żelem.
      2. Przygotuj wilgotną komorę z cienką warstwą mokrej tkanki i parafilmu, a następnie przechowuj ją w temperaturze 4 °C przez 10 minut.
      3. Umieść wilgotną komorę na lodzie.
      4. Wyjmij pokrywki z roztworu kotwicącego białko i usuń nadmiar roztworu bibułką (2 w rzędzie).
      5. Dodaj APS (końcowe stężenie 0,5%) do roztworu żelacyjnego, zachowuj wir przez 2-3 sekundy i załaduj 2 krople po 35 μL na parafilm wilgotnej komory.
      6. Przykryj każdą kroplę pokrywką, komórki skierowane w stronę roztworu żelu.
      7. Inkubuj na lodzie przez 5 minut, aby umożliwić penetrację żelu.
      8. Inkubuj w temperaturze 37 °C przez 30-60 minut.
    3. Denaturacja
      1. Żel wybij narzędziem do wyciskania biopsji (0,4 cm średnicy, rysunek 2D) i mieszaj przez 10/15 minut w płytkach z 6 dołkami wypełnioną 1 mL buforu denaturacyjnego, aż żele odłączą się od pokrywek.
      2. Przełóż żel do rurki mikrowirówki o pojemności 1,5 mL, wypełnionej świeżym buforem denaturacyjnym.
      3. Inkubować przez 1 godzinę i 30 minut w 95 °C.
      4. Przelej żel do ddH2O na 10 minut i powtórz 3 razy, aby prawidłowo wymyć bufor denaturacyjny.
      5. Zmierz żel papierem milimetrowym lub zaciskiem, aby ocenić współczynnik rozszerzalności żelu.
      6. Przenieś żel do PBS w celu immunodymastyki.
      7. Alternatywnie, żele można przechowywać w PBS-azydzie 0,02% w temperaturze 4 °C przez krótki czas (Tabela 1) lub w -20°C dla dłuższego przechowywania (Tabela 1). Do długotrwałego przechowywania żele muszą być inkubowane w kilku kąpielach w wodzie: roztwór glicerolu 50% przez 2-3 godziny w mieszaniu i umieszczany w temperaturze -20 °C w odpowiedniej objętości roztworu, która musi być dostosowana do rozmiaru żelu.
        UWAGA: Żel można przechowywać w całości, jeśli jest to preferowane (Rysunek 2D, E) (krok 2.2.3.1). Do 5 dziurków (równowartość całego żelu) można zebrać w jednej tubce (krok 2.2.3.2). Należy zachować temperaturę i czas denaturacji (krok 2.2.3.3). Wysokie temperatury mogą wywołać otwarcie rurki, prowadząc do parowania buforu denaturacyjnego i/lub wypróżnienia żelu. Pamiętaj, aby używać rurek zabezpieczających lub je zakryć. Płukanie żelu po denaturacji musi odbywać się w wodzie destylowanej, ponieważ PBS wywołuje opady SDS, co wpływa na efektywność płukania. Ten krok wywoła niewielkie rozszerzenie żelu, które nie ma wpływu na kolejne kroki protokołu (krok 2.2.3.4). Glicerol można rozcieńczyć w PBS, aby zaoszczędzić miejsce w przypadku dużych żeli. Do wypychania o rozmiarze 0,4 mm żele idealnie przechowywane są w 12-dołkowej płycie wypełnionej 3 mL wody: glicerolem.

3. Immunobarwienie i końcowa ekspansja

  1. Zmień kąpiel PBS na kolejne 15 minut inkubacji.
  2. Pokrój cały żel na 4 równe kawałki.
  3. Przenieś kawałki/dziurkarki żelowe do dostosowanego nośnika (rysunek 2D, E) i inkubuj z przeciwciałami pierwotnymi rozcieńczonymi w PBS-BSA 2% przez 3 godziny do nocy z mieszaniem (szczegółowe warunki patrz Tabela 2 i Tabela 3 ).
  4. Żel do mycia 3 razy z PBS+Tween 0,1% przez 10 minut RT z mieszanką.
  5. Inkubuj żel do przeciwciał wtórnych, a Hoechst w PBS-BSA 2% przez 3 godziny do nocy z mieszaniem (szczegółowe warunki patrz Tabela 2 i Tabela 3 ).
  6. Żel myjki 3 razy z PBS+Tween 0,1% przez 10 minut RT z mieszanką.
  7. Opcjonalnie: Wykonaj etykietowanie całego proteomu poprzez inkubację żelu NHS-esterem (szczegóły w Tabeli 2 ) w PBS przez 1h30 przy RT pod mieszaniem, a następnie przemyj 3 razy w PBS+Tween 0,1% przez 10 minut.
  8. Przełóż żel do przystosowanego nośnika i przejdź do rozprężania żelu przez inkubację w wodzie destylowanej (ddH2O).
    UWAGA: Stężenie i rodzaj detergentu (Tween, Triton-X100, Saponina) używanego do mycia przeciwciał można dostosować do próbek biologicznych. Wielokrotna wymiana wody jest kluczowa, aby wyeliminować ślady soli, które uniemożliwiają pełne rozprężanie.

4. Montaż i obrazowanie

  1. Pokrywki pokrywkowe pokrywają polilizyną (patrz sekcja 1.1) poprzez przykrycie pokrywek około 200 μL polilizyny, inkubują 1 godzinę w RT i myją 3x w ddH2O, aby usunąć nadmiar polilizyny. Pozwól wyschnąć pokrywki i przechowuj je w temperaturze 4°C do czasu użycia.
  2. Umieść żele rozprężone na niepowlekanych pokrywkach w komorze obrazującej, aby sprawdzić orientację próbek za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.
  3. Po ułożeniu susz żel na papierze bez kłaczków, aby usunąć nadmiar wody i zamontuj na pokrywkach pokrytych polilizyną (patrz krok 1.1 dla protokołu).
  4. Obserwuj próbki mikroskopem odwróconym.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niniejszy artykuł podkreśla wyniki łączenia kriofiksacji z mikroskopią ekspansyjną na dwóch różnych typach próbek: hodowanych komórkach ssaków i pasożytach T. brucei . Obie próbki były albo krio-utrwalone, albo chemicznie związane z 4% PFA przed rozszerzeniem i immunodymatycznym kolorowaniem. Należy zauważyć, że inne wiązania chemiczne mogą być bardziej odpowiednie dla konkretnych organelli (takich jak metanol czy glutaraldehyd) i że dla uproszczenia wybrano jedynie PFA, powszechną wiązającą substancję chemiczną, aby porównać ją z kriofiksacją.

Ludzkie komórki nabłonkowe RPE1 (nabłonkowe pigmenty siatkówki) zostały zabarwione na αβ-tubulinę, ATP5a oraz Hoechst, aby zobrazować mikrotubule, mitochondria i jądra odpowiednio. Dodatkowo żele były inkubowane fluorescencyjnym NHS-esterem przed ekspansją, barwnikiem reagującym z wolnymi grupami aminami, co barwi cały proteom komórkowy. Mogliśmy zaobserwować kilka zalet kriogeniczności w porównaniu do chemicznej, co jużwykazało 23. Najbardziej uderzającą cechą było to, że kriogenicja doskonale zachowała sieć mitochondrialną, widoczną zarówno przy użyciu esteru NHS, jak i specyficznymi przeciwciałami przeciwko podjednostce syntazy ATP alfa (ATP5a) (Rysunek 3A,B). Ponadto, ponieważ ATP5a jest zlokalizowany w wewnętrznej błonie mitochondrialnej, mogliśmy rozróżnić kryszty mitochondrialne za pomocą kriogenefiksacji (rysunek 3B"). Wręcz przeciwnie, fiksacja PFA nie pozwalała zachować sieci mitochondrialnej, a zatem kryszty mitochondrialne nie były widoczne w tym stanie (rysunek 3C"). Barwiliśmy także mikrotubule w obu warunkach i wykazaliśmy, że kriogenifiksacja zachowuje lepiej dynamiczne mikrotubule, takie jak mikrotubule cytoplazmatyczne lub astralne (rysunek 3B-E). Jednak stabilne mikrotubule, takie jak w centriole i rzęskach, niebłoniaste organelle złożone z 9-krotnych mikrotubul tripletów/dubletów, były równie zachowane, jeśli nie lepiej, w komórkach związanych z PFA w porównaniu do komórek krio-fiksowanych (rysunek 3B',C'). Ważne jest, aby zauważyć, że kriofiksacja, jako zachowanie integralności białek komórkowych, może być mniej przydatna do bardzo gęstych struktur, takich jak centriole i rzęski. Obserwacja ta została również dokonana na strukturach sztywnych, takich jak pory jądrowe, gdzie wiązanie chemiczne powoduje wypłukanie białek cytoplazmatycznych, co pozwala na lepszą obserwację struktur porów jądrowych23,32. Wreszcie mogliśmy wykazać, że kriogenicja omija także efekt sieci chemicznej, który negatywnie wpływa na zdolność ekspansji, co pokazano na wrzecionach mitotycznych, które w stanie krio-fiksowanym były prawie dwukrotnie bardziej rozszerzone niż PFA (Rysunek 3D,E).

Komórki Trypanosoma brucei zostały zabarwione na TDH34 (rysunek 4A-D), aby zobrazować unikalny mitochondrium, oraz dla BiP35 (rysunek 4E,F), aby podkreślić siatkówkę endoplazmatyczną. Dodatkowo żele były barwione fluorescencyjnym NHS-esterem. Jak zaobserwowano w komórkach ludzkich, kriogenicjania w połączeniu z ekspansją lepiej zachowuje ogólną architekturę komórkową (Rysunek 4B,E), szczególnie te dwie struktury błoniaste, w porównaniu do fiksacji PFA (Rysunek 4C,D,F). Mikrotubulowy cytoszkielet T. brucei jest bardziej sztywny i stabilny niż u komórek ludzkich; w związku z tym nie zaobserwowano istotnej różnicy między PFA a kriogenifiksacją. Ponadto limit rozdzielczości techniki U-ExM uniemożliwia nam rozróżnienie pojedynczych mikrotubul (nie pokazano).

Ogólnie rzecz biorąc, kriofiksacja rozwiązuje ograniczenia klasycznej fiksacji chemicznej, takie jak zachowanie organelli błoniastych (mitochondriów, siatkówki endoplazmatycznej) oraz dynamicznych elementów cytoszkieletu (mikrotubule cytoplazmatyczne lub astralne). Dodatkowo, ponieważ kriofiksacja nie tworzy żadnego połączenia krzyżowego między białkami, w pełni zachowuje zdolność ekspansji, zwłaszcza na sztywnych i gęstych strukturach.

Kontrola jakości kriogenifiksacji i ekspansji jest niezbędna do zachowania ultrastruktury komórkowej próbek biologicznych. Kilka błędów może skutkować słabym utrwaleniem i powstaniem artefaktów w próbkach biologicznych. Tutaj podkreślamy najczęstsze wady i wyniki związane z kriogenifiksacją oraz skutki słabej fiksacji. Najbardziej oczywistym artefaktem powstałym podczas kriofiksacji jest pojawienie się pęknięć wewnątrz próbki biologicznej (rysunek 5A), również powszechne w mikroskopii krioelektronowej. Chociaż te pęknięcia nie zmieniają wewnętrznej ultrastruktury organelli, jak pokazano na Rysunku 5A (wstawka) mitochondriów i mikrotubul, mogą prowadzić do błędnej interpretacji biologicznego znaczenia tych pęknięć i należy je rozważyć ostrożnie. Nie ma konkretnej korelacji między problemami manipulacji a pojawieniem się/licznością tych pęknięć.

Jedną z cech wskazujących na słabą fiksację jest pojawienie się "struktur przypominających pęcherzyki" wewnątrz cytoplazmy komórkowej, co wskazuje na obecność kryształów lodu. Struktury te są szczególnie widoczne przy barwieniu esterów NHS (rysunek 5B). Zazwyczaj towarzyszy im ograniczona konserwacja elementów cytoszkieletu, takich jak mikrotubule o falistej formie (rysunek 5B), oraz bardzo słaba zachowaność organelli błonianych (mitochondria na rysunku 5B). Te cechy świadczą o istotnych problemach związanych z wiązaniem, które mogą być spowodowane (i) nieodpowiednią objętością i/lub temperaturą etanu (kroki 2.2.4-2.2.6 z protokołu), (ii) niestopniowym nagrzewaniem próbki biologicznej (kroki 2.3 i 2.4 z protokołu) oraz (iii) obecnością zanieczyszczeń w roztworze podstawiania zamrożenia (krok 2.2.1 z protokołu). Reprezentatywne obrazy roztworów akrylanu sodu podkreślające oczekiwany aspekt 38% akrylianu sodu użytecznego (bezbarwnego i przezroczystego [1]) lub lekko żółtego i przezroczystego [2]), lub nienadającego się do ekspansji (żółty/pomarańczowy i mętny [3]), pokazano na Rysunku 5C.

figure-results-1
Rysunek 1: Przepływ pracy Cryo-ExM. (A) Żywe komórki (komórki ludzkie, czyli T. brucei) są kriofiksowane przez zanurzenie się w ciekłym etanie w temperaturze -180 °C i inkubację w zamrożonym acetonie na suchym lodzie. Zastępowanie zamrożeniem polega na stałym i powolnym podnoszeniu temperatury z -180 °C do -80 °C poprzez inkubację na suchym lodzie, co wywołuje upłynnienie acetonu (-96 °C), a następnie z -80 °C do -20 °C przez inkubację bez suchego lodu. Rehydratacja odbywa się poprzez kolejne kąpiele etanolu zmieszane z półksiężycowym stężeniem wody destylowanej oraz stałym podnoszeniem temperatury z -20 °C do temperatury pokojowej. (B) Następnie poddawane są ponownie nawodnione próbki do ekspansji w następujący sposób: Próbki są inkubowane w mieszance akrylamidu: formalnego dehydu (AA/FA) w temperaturze 37 °C, co pozwala na zakotwicenie białek w polimerze puchniącym z akrylamidu, bisakrylamidu i akrylianu sodu (AA/BIS/SA), przy czym ten ostatni nadaje żelowi właściwości rozszerzalności. Próbki są inkubowane w NaCl/SDS w temperaturze 95 °C, aby przeprowadzić destabilizację interakcji białek i delikatną denaturację. Ten etap jest niezbędny dla ekspansji izotropowej. Następnie próbki są immunobarwiane za pomocą regularnych przeciwciał pierwotnych i wtórnych, a następnie rozszerzane w wodzie destylowanej. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

figure-results-2
Rysunek 2. Konfiguracja zanurzania i rozszerzania kriogenicznym . (A) Kriogeniczna przepychacza w pozycji uzbrojonej (górny panel) i w pozycji opuszczonej (dolny panel). Strzałka wskazuje przycisk PUSH do aktywacji zanurzenia. (B) Zestaw kriogeniczny gotowy do zanurzenia, pokazując poziom ciekłego azotu (N2) odpowiedniego do kriogenicznego fiksacji, wskazywaną przez wysokość pianki otaczającej dewar (czerwony grot strzałki). Usuwalny pająk jest oznaczony gwiazdkami. (C) Ilustracja kluczowych kroków kriogenicznego zanurzenia z trzymania pokrywki (lewy górny górny róg), pozycja pokrywek w ciekłym etanowym dewarze (lewy dolny róg) oraz probówki zbiorczej do zamrożenia (po prawej). (D) Ilustracja metody "żelowego dziurkania" do immunobarwienia w próbkach ludzkich. Polimeryzowany żel na pokrywkach (1) jest cięty za pomocą specjalnego dziurkacza biopsyjnego (P), tworząc wybicie żelowe o średnicy 0,4 cm (2), które można barwić na silikonowej płycie (prawe panele), aby zmniejszyć ilość przeciwciał. (E) Ilustracja metody 'żelowego cięcia' immunobarwienia w próbkach ludzi i T. brucei . Żele polimeryzowane i denaturowane (1) są cięte na 4 równe części (2), co pozwala na ich inkubację w 12-dołkowej płycie z przeciwciałami. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

figure-results-3
Rysunek 3. Porównanie kriogenifiksacji i fiksacji PFA w komórkach ludzkich. (A) Obraz wirującego dysku komórek RPE1 zafiksowanych i rozszerzonych na poziomie krio-stałych i rozszerzonych, barwionych na αβ-tubuliny (cyjan), mitochondrialną podjednostkę syntazy ATP 5a (ATP5a, żółty) oraz NHS-ester (czerwono-szary), wykazujący doskonałą zachowalność zarówno organelli błonowych, jak i elementów cytoszkieletu, w tym centriolów i rzęsek (grot strzały). Pasek skalowy: 10 μm (B, C) Obracający się obraz dysku komórki RPE1 zafiksowanej krio-fiksowanej (B) i PFA-fiksowanej (C), barwionej na αβ-tubuliny (cyjan), mitochondrialne ATP5a (żółte) oraz Hoechst (magenta), z naciskiem na pierwotne rzęski (strzałki, B', C') oraz mitochondria (B", C). Jeśli wiązanie krio- i PFA równie dobrze zachowuje centriole i rzęski pierwotne, to kryogenicutracja znacznie przewyższa PFA pod względem zachowania struktury mitochondrialnej (B", C"- czerwone strzałki wskazują na kryształy mitochondrialne widoczne tylko w warunkach krio-fiksowanych). Paski skalowe: odpowiednio 1, 1 i 2,5 μm. (D,E) Obraz wirującego dysku kryo-fiksowanego (D) i PFA-fiksowanego (E) mitotycznego komórki RPE1 barwionej na αβ-tubuliny na żółto/szary, mitochondrialny ATP5a (magenta) i Hoechst (BOP niebieski), pokazujący, że kriogenicja pozwala na lepsze rozszerzanie wrzeciona mitotycznego (czerwone groty strzałek) oraz zachowanie lepszych mikrotubul mitotycznych wrzeciona (czerwone strzałki). Pomiary długości wrzeciona mitotycznego: odpowiednio 12 μm i 7 μm dla kriogeniczności i fiksacji PFA. Skala: 10 μm. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego wykresu.

figure-results-4
Rysunek 4. Porównanie kriofiksacji i fiksacji PFA u Trypanosoma brucei. (A, B) Konfokalne obrazy komórek procyklicznych T. brucei zafiksowanych i rozszerzonych na poziomie krio-fiksowanych i rozszerzonych barwionych na mitochondrialną dehydrogenazę treoninową (TDH, żółty) oraz NHS-ester (czerwono-szary), pokazujące doskonałą zachowanie unikalnego mitochondriu oraz ogólną architekturę komórki. Paski skalowe: 5 μm. (C, D) obraz konfokalny komórek procyklicznych PFA zafiksowanych i rozszerzonych T. brucei , barwiony na TDH (żółty) i NHS-ester (czerwony/szary). Porównując zachowanie struktury mitochondrialnej i sieci, kriogenicjania przewyższa fiksację PFA. Paski skalowe: 5 μm. (E, F) obrazy konfokalne komórek procyklicznych kriogenicznych (E) i PFA-fiksowanych (F) oraz rozszerzonych komórek T. brucei barwionych pod marker siatkówki endoplazmatycznej BiP i NHS-ester (szary), co pokazuje, że kriogenicja pozwala na lepszą ekspansję i zachowanie siatkówki endoplazmatycznej. Paski skalowe: 5 μm. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figury.

figure-results-5
Rysunek 5. Problemy z kriogenifiksacją. (A,B) Obrazy wirujących dysków kriogenicznie zafiksowanych i rozszerzonych RPE1 barwionych na αβ-tubuliny (cyjan), mitochondrialną podjednostkę syntazy ATP 5a (ATP5a, żółty) oraz NHS-ester (czerwony) pokazujące klasyczne efekty kriofiksacji: pęknięcia (A, strzałki) i bąbelki (B, strzałka). Chociaż pęknięcia nie wpływają na ultrastruktury organelli (A), obecność pęcherzyków w cytoplazmie (B) wskazuje na złe fiksowanie i znacząco zmienia zachowanie organelli podkomórkowych (mitochondriów i mikrotubul, wstawek). Paski skalowe: 5 μm i 2 μm (wstawki). (C) Zdjęcie przedstawiające różne roztwory akrylianu sodu, podkreślające oczekiwany aspekt 38% akrylanu sodu nadających się do użytku (bezbarwnych i przezroczystych (1) lub lekko żółtych i przezroczystych (2), albo nieprzydatnych do ekspansji (żółto/pomarańczowe i mętne (3)). Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Tabela 1: Warunki przechowywania rozwiązań Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 2: Lista przeciwciał Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 3: Warunki immunodawistyki Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W niniejszym artykule przedstawiamy szczegółowy protokół integrujący kriofiksację z mikroskopią ekspansyjną (Cryo-ExM), oferując solidne podejście do wizualizacji przedziałów subkomórkowych, jednocześnie unikając artefaktów często kojarzonych z wiązaniem chemicznym, takich jak zniekształcenia strukturalne i utrata antygenów. Zachowując architekturę komórkową w stanie niemal naturalnym, Cryo-ExM eliminuje potrzebę rozległej optymalizacji fiksacji, umożliwiając dokładniejszą lokalizację białek.

Chociaż protokół jest zazwyczaj prosty, kilka kluczowych kroków wymaga szczególnej uwagi, aby zapewnić skuteczne rezultaty. Etap kriogenicznego zanurzania jest szczególnie czuły, ponieważ wymaga zarówno specyficznych materiałów (patrz Tabela materiałów), jak i pewnej zręczności, szczególnie podczas obsługi ciekłego wypełnienia etanowego, co stanowi potencjalną pułapkę. Wcześniejsza znajomość technik kriofiksacji jest korzystna; zalecamy konsultację ze specjalistą od kriogenii lub kierownikiem obiektu mikroskopii elektronowej przy pierwszym wdrażaniu tej metody. W fazie rozbudowy niezbędne jest ścisłe przestrzeganie warunków denaturacji, ponieważ odchylenia mogą zagrozić zarówno zachowaniu próbek, jak i efektywności ekspansji. Wreszcie, utrzymanie odpowiednich warunków przechowywania wszystkich odczynników (patrz Tabela 1) jest kluczowe dla zapewnienia powtarzalności i spójnej jakości obrazowania w czasie.

Niniejszy artykuł podkreśla kilka kluczowych zalet protokołu Cryo-ExM. Co istotne, kriogenicutracja minimalizuje utratę białek rozpuszczalnych, co jest częstym ograniczeniem konwencjonalnych metod fiksacji, i lepiej zachowuje integralność błony, co zwiększa wierność obrazowania komórkowego. Główną zaletą tej techniki jest kompatybilność ze standardowymi mikroskopami szerokokątnymi i konfokalnymi. W przeciwieństwie do wielu innych metod superrozdzielczości, które wymagają specjalistycznego i często kosztownego sprzętu, ExM można zaimplementować za pomocą konwencjonalnych mikroskopów fluorescencyjnych. Kolejną istotną zaletą ExM jest jego wszechstronność. Technika ta została z powodzeniem zastosowana na szerokim zakresie próbek biologicznych – od pojedynczych komórek po złożone tkanki – co wykazuje jej szerokie zastosowanie w różnych dziedzinach badań. Artykuł ten szczególnie podkreśla kompatybilność tego protokołu z dwoma bardzo różnymi systemami modelowymi: T. brucei i komórkami ludzkimi, ale należy zauważyć, że większa lub bardziej złożona próbka wymagałaby utrwalenia pod wysokim ciśnieniem i zamrożeniem, ponieważ ręczne zanurzanie nie wystarcza do zachowania całej próbki 24,25,30. Mikroskopia ekspansyjna zrewolucjonizowała zdolność wizualizacji nanoskalowych struktur komórkowych, które wcześniej były trudne lub niemożliwe do rozwiązania, umożliwiając przełomy w takich dziedzinach jak biologia komórki, biologia rozwojowa i neurobiologia36. W szczególności metoda ta okazała się przełomowa w parazytologii, dziedzinie, w której konwencjonalna mikroskopia świetlna często zawodzi. Dla wielu pasożytów mikroskopia ekspansji ultrastruktury (U-ExM) okazała się przełomem, umożliwiając obrazowanie w wysokiej rozdzielczości złożonych organelli, takich jak apikoplast, konoid i elementy cytoszkieletowe, z niespotykaną dotąd klarownością 6,37,38. Te postępy pokazują siłę U-ExM w odkrywaniu wcześniej niedostępnych szczegółów strukturalnych, otwierając nowe możliwości w biologii komórki, neurobiologii i biologii pasożytów oraz wspierając poszukiwania potencjalnych celów terapeutycznych. Ponadto ExM pozostaje kompatybilny z powszechnie stosowanymi przeciwciałami immunofluorescencji, co ułatwia jego integrację z istniejącymi procesami pracy. W większości przypadków przeciwciała rutynowo stosowane w mikroskopii fluorescencyjnej lub western blottingu skutecznie działają na rozszerzonych próbkach, eliminując potrzebę stosowania specjalistycznych odczynników. Ta dostępność sprawia, że Cryo-ExM jest atrakcyjną opcją dla wielu laboratoriów badań biologicznych, oferując obrazowanie o wysokiej rozdzielczości bez kosztów i złożoności typowej dla zaawansowanych systemów obrazowania.

Pomimo zalet, ExM ma pewne ograniczenia. Główną wadą jest znaczne zużycie przeciwciał, co może być kosztowne lub problematyczne, zwłaszcza jeśli przeciwciała domowej produkcji są dostępne w ograniczonych ilościach. Oto dlaczego proponujemy tę strategię protokołu, aby zmniejszyć objętość przeciwciał używanych do immunodbarwienia (Rysunek 2D,E). Proces rozszerzania zwiększa również grubość próbki, co może wpłynąć na możliwość wizualizacji głębszych struktur ze względu na ograniczenia odległości roboczej standardowych obiektywów mikroskopowych. To ograniczenie może być szczególnie trudne przy badaniu większych, grubszych próbek, gdzie głębsze obszary mogą nie być skutecznie obrazowane za pomocą konwencjonalnych mikroskopów. Dodatkowo, rozszerzanie tkanek może czasem powodować mechaniczne zniekształcenia, co wymaga starannej weryfikacji i korekty, aby zapewnić dokładne reprezentacje przestrzenne. Wreszcie, klasyczny ExM jest ściśle zależny od utrwalania próbki, które może się różnić w zależności od próbek biologicznych lub struktury podkomórkowej do obserwowania. Podczas gdy centriole i rzęski są na tyle stabilne, że można je rozszerzyć bez wcześniejszego fiksacji, organelli komórkowe wymagają różnych rodzajów wiązania chemicznego (PFA, metanol, glutaraldehyd), które mogą tworzyć artefakty i uniemożliwiać obserwację kilku struktur komórkowych razem. Wreszcie, ponieważ ExM jest kompatybilny z różnymi metodami obrazowania o wysokiej rozdzielczości, takimi jak Strukturalna Mikroskopia Iluminacji (SIM)39, Mikroskopia Emisyjnego Stymulowanego Redukcji Emisji (STED)40, bezpośrednia Stochastyczna Optyczna Rekonstrukcja Mikroskopia (dSTORM)41 oraz ostatnio mikroskopia świetlna42, podejście opisane w tym badaniu stanowi wszechstronne narzędzie do badania struktur komórkowych z wysoką precyzją. Niedawne badanie połączyło kriogenofiksację z iteracyjnym mikroskopem ekspansyjnym32, co dodatkowo przesuwa granice rozdzielczości, jednocześnie zachowując naturalny stan komórki tak bardzo, jak to możliwe dzięki kriofiksacji.

Dzięki umożliwieniu tym zaawansowanym technikom obrazowania uchwycenia komórek w ich pierwotnym stanie, Cryo-ExM toruje drogę przyszłym badaniom złożonych procesów komórkowych z niespotykaną dotąd klarownością. To podejście otwiera również nowe możliwości dla korelacyjnej mikroskopii światła i elektronów (CLEM), dodatkowo zwiększając jej potencjał w obrazowaniu multimodalnym.

Podsumowując, ExM stanowi potężne narzędzie do obrazowania superrozdzielczego, o szerokim zastosowaniu w różnych próbkach biologicznych. Jego kompatybilność ze standardowymi mikroskopami, wszechstronność typów próbek oraz stosunkowo prosta implementacja sprawiają, że jest atrakcyjnym wyborem dla wielu laboratoriów. Wraz z dalszym postępem w tej technice spodziewamy się dalszych ulepszeń w rozdzielczości, wykorzystaniu przeciwciał i obsłudze próbek, co zwiększy jej możliwości i uczyni ją jeszcze bardziej dostępną dla szerokiego zakresu zastosowań biologicznych. Cryo-ExM, w szczególności, stanowi obiecujące osiągnięcie, oferując możliwość badania struktur komórkowych z wyjątkową dokładnością, zachowując ich naturalną integralność, co ostatecznie przesuwa granice nowoczesnej mikroskopii.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Jennifer Vieillard za krytyczne rady i lekturę rękopisu. Dostrzegamy wkład SFR Santé Lyon-Est (UAR3453 CNRS, US7 Inserm, UCBL): CIQLE (członek LyMIC) w pozyskiwanie obrazów komórek RPE1. Dziękujemy Mónice Fernández Monreal z BIC za udostępnienie nam tłoka i etanu oraz Bordeaux Imaging Centre, jednostki usługowej CNRS-INSERM oraz Uniwersytetu w Bordeaux, członka krajowej infrastruktury France BioImaging, za pozyskanie obrazów T. brucei . Prace te były wspierane przez CNRS (T.brucei) i INSERM (komórki ludzkie) oraz finansowane przez następujące instytucje: Agence National de la Recherche (ANR-20-CE91-0003, ANR-19-CE17-0014 do M.B), LabEx ParaFrap (ANR-11-LABX-0024) oraz Fondation pour la Recherche sur le Cerveau (FRC-AP2024, M.L). P.H był wspierany przez finansowanie ANR-OIL (ANR24-CE15-2171-01 dla L.R), L.K wspierany przez ANR-BBDIV (ANR-22-CE13-0014 dla B.D.)

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Metalowy uchwyt na rurkę 5 mlDominique DutscherQB-E5Krok podstawienia zamrożonego
620 Ręczny kriogenicznikDUCHhttps://rhost-em.com/Krok kriofiksacji
Aceton 99,8% AcroSealAcros OrganicsKot. nr 67-64-1 Krok podstawienia zamrożonego
Akrylamid 40% (AA)Sigma-AldrichA4058Procedura rozbudowy  (kotwiczenie)
Kwasy akrylowe i bez śladu;Sigma-Aldrich8.00181 Procedura rozszerzania (polimer)
Persiarczan amonu (APS)Thermo Fisher17874Procedura rozszerzania (polimer)
Cios biopsjiDominique DutscherPUK-40Potrzebne do cięcia żelu przed denaturacją 
BSASigma-AldrichP1379Immunostaining 
Attofluor w komorze komórkowejInvitrogenA7816Komora obrazowania dostosowana do pokrywek 24mm do obrazowania
Komora celiSłużba Imagning Life10900Komora obrazowania dostosowana do pokrywek 18mm do obrazowania
Pokrywki 12 mm Dominique Dutscher100040Wzrost komórek / przyczepianie T. brucei
Pokrywki 24 mm Dominique Dutscher900547Obrazowanie 
Pokrywki 18mmVWR631-0153Obrazowanie 
Ethane gaz Linde Gaz88888DEPotrzebne do kriogenizacji
Formaldehyd 36,5 i dash; 38% (FA)Sigma-Aldrich  F8775Procedura rozbudowy  (kotwiczenie)
Glutaraldhehyd 25% (GA)Sigma-Aldrich  G5882Krok podstawienia zamrożonego
Glicerol & nbsp;Euromedex EU3550Długoterminowe przechowywanie żelu 
Ciekły azot & nbsp;Linde Gaz2200975Potrzebne do kriogenifiksacji (chłodzenia systemu)
Mikrorurki przezroczyste 5 ml & nbsp;Dominique Dutscher390932APotrzebne do podstawienia zamrażania
Igła 18GDominique Dutscher050123BPotrzebne do pobrania acetonu
N,N-metylobisakrylamid 2% (BIS)Sigma-AldrichM1533, SIGMAProcedura rozszerzania (polimer)
Paraformaldehyd 16% (PFA)EMSKot. Nr 15710Krok podstawienia zamrożonego
Poli-D-LizynaSigma-AldrichP1024Pokrywki pokrywające powłoki do próbek / obrazowania i obrazowania;
Poli-L-LizynaSigma-AldrichP1274Pokrywki pokrywające powłoki do próbek / obrazowania i obrazowania;
Reduktor ciśnienia Linde GazCPLH0SJ-LIN224Reduktor ciśnienia umożliwiający dystrybucję etanu (kriogenicję)
Seringe Terumo 10 mlDominique Dutscher50132Potrzebne do pobrania acetonu
Zestaw silikonowego elastomeruDow4001834Zestaw do przygotowania płytek z dołkami silikonowymi (barwienie immunobarwne)  
Akrylan sodu 97-99% (SA)Sigma-Aldrich408220Procedura rozszerzania (polimer)
AK ScientificR624Procedura rozszerzania (polimer)
Siarczan sodu dodecylowyEuromedexEU0660Procedura ekspansji (denaturacja)
Tetrametyloendiamina (TEMED)Thermo Fisher17919Procedura rozszerzania (polimer)
Rurki Thermo Scientific8060-0060Rurki do dystrybucji etanowej (kriogenicja)
Tween-20Euromedex1005-7Immunostaining 
Pęseta Dumont n&de; 5 FineScienceTools11255-20Manipulacja slipami na okładce 

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jacquemet, G., et al. The cell biologist's guide to super-resolution microscopy. J Cell Sci. 133 (11), jcs240713(2020).
  2. Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. Optical imaging: expansion microscopy. Science. 347 (6221), 543-548 (2015).
  3. Laporte, M. H., et al. Time-series reconstruction of the molecular architecture of human centriole assembly. Cell. 187 (9), 2158-2174 (2024).
  4. Steib, E., et al. WDR90 is a centriolar microtubule wall protein important for centriole architecture integrity. Elife. 9, e57205(2020).
  5. Le Borgne, P., et al. The evolutionary conserved proteins CEP90, FOPNL, and OFD1 recruit centriolar distal appendage proteins to initiate their assembly. PLoS Biol. 20 (9), e3001782(2022).
  6. Bertiaux, E., et al. Expansion microscopy provides new insights into the cytoskeleton of malaria parasites including the conservation of a conoid. PLoS Biol. 19 (3), e3001020(2021).
  7. Liffner, B., et al. Atlas of Plasmodium falciparum intraerythrocytic development using expansion microscopy. Elife. 12, RP88088(2023).
  8. Amodeo, S., et al. Characterization of the novel mitochondrial genome segregation factor TAP110 in Trypanosoma brucei. J Cell Sci. 134 (5), jcs254300(2021).
  9. Corrales, R. M., et al. Tubulin detyrosination shapes Leishmania cytoskeletal architecture and virulence. Proc Natl Acad Sci U S A. 122 (3), e2415296122(2025).
  10. Brunet, M., et al. Drosophila Alms1 proteins regulate centriolar cartwheel assembly by enabling Plk4-Ana2 amplification loop. EMBO J. 44 (8), 2396(2025).
  11. Langner, E., et al. Ultrastructure expansion microscopy (U-ExM) of mouse and human kidneys for analysis of subcellular structures. Cytoskeleton (Hoboken). 81 (11), 618-638 (2024).
  12. Mercey, O., et al. The connecting cilium inner scaffold provides a structural foundation that protects against retinal degeneration. PLoS Biol. 20 (6), e3001649(2022).
  13. Steib, E., et al. TissUExM enables quantitative ultrastructural analysis in whole vertebrate embryos by expansion microscopy. Cell Rep Methods. 2 (10), 100311(2022).
  14. Freifeld, L., et al. Expansion microscopy of zebrafish for neuroscience and developmental biology studies. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (50), E10799-E10808 (2017).
  15. Yu, C. J., Orozco Cosio, D. M., Boyden, E. S. ExCel: super-resolution imaging of C. elegans with expansion microscopy. Methods Mol Biol. 2468, 141-203 (2022).
  16. Tillberg, P. W., et al. Protein-retention expansion microscopy of cells and tissues labeled using standard fluorescent proteins and antibodies. Nat Biotechnol. 34 (9), 987-992 (2016).
  17. Gambarotto, D., et al. Imaging cellular ultrastructures using expansion microscopy (U-ExM). Nat Methods. 16 (1), 71-74 (2019).
  18. Ku, T., et al. Multiplexed and scalable super-resolution imaging of three-dimensional protein localization in size-adjustable tissues. Nat Biotechnol. 34 (9), 973-981 (2016).
  19. Schnell, U., et al. Immunolabeling artifacts and the need for live-cell imaging. Nat Methods. 9 (2), 152-158 (2012).
  20. Dubochet, J. Cryo-EM-the first thirty years. J Microsc. 245 (3), 221-224 (2012).
  21. Neuhaus, E. M., et al. Ethane-freezing/methanol-fixation of cell monolayers: a procedure for improved preservation of structure and antigenicity for light and electron microscopies. J Struct Biol. 121 (3), 326-342 (1998).
  22. Kellenberger, E. The potential of cryofixation and freeze substitution: observations and theoretical considerations. J Microsc. 161 (Pt 2), 183-203 (1991).
  23. Laporte, M. H., et al. Visualizing the native cellular organization by coupling cryofixation with expansion microscopy (Cryo-ExM). Nat Methods. 19 (2), 216-222 (2022).
  24. Hinterndorfer, K., et al. Ultrastructure expansion microscopy reveals the cellular architecture of budding and fission yeast. J Cell Sci. 135 (24), jcs260240(2022).
  25. Mikus, F., Dey, G. Ultrastructure expansion microscopy (U-ExM) of the fission yeast Schizosaccharomyces pombe. Methods Mol Biol. 2862, 47-59 (2025).
  26. Ben Chaabene, R., et al. Toxoplasma gondii rhoptry discharge factor 3 is essential for invasion and microtubule-associated vesicle biogenesis. PLoS Biol. 22 (8), e3002745(2024).
  27. Shah, H., et al. Life-cycle-coupled evolution of mitosis in close relatives of animals. Nature. 630 (8015), 116-122 (2024).
  28. Klena, N., et al. An in-depth guide to the ultrastructural expansion microscopy (U-ExM) of Chlamydomonas reinhardtii. Bio Protoc. 13 (17), e4792(2023).
  29. van den Hoek, H., et al. In situ architecture of the ciliary base reveals the stepwise assembly of intraflagellar transport trains. Science. 377 (6605), 543-548 (2022).
  30. Mikus, F., et al. Charting the landscape of cytoskeletal diversity in microbial eukaryotes. bioRxiv. , (2024).
  31. Petrich, A., et al. Expanding insights: harnessing expansion microscopy for super-resolution analysis of HIV-1-cell interactions. Viruses. 16 (10), 1610(2024).
  32. Louvel, V., et al. iU-ExM: nanoscopy of organelles and tissues with iterative ultrastructure expansion microscopy. Nat Commun. 14 (1), 7893(2023).
  33. Lemaître, F., et al. Unveiling the molecular architecture of T cells and immune synapses with cryo-expansion microscopy. bioRxiv. , (2025).
  34. Millierioux, Y., et al. De novo biosynthesis of sterols and fatty acids in the Trypanosoma brucei procyclic form: carbon source preferences and metabolic flux redistributions. PLoS Pathog. 14 (5), e1007116(2018).
  35. Bangs, J. D., et al. Molecular cloning and cellular localization of a BiP homologue in Trypanosoma brucei: divergent ER retention signals in a lower eukaryote. J Cell Sci. 105 (Pt 4), 1101-1113 (1993).
  36. Dolgin, E. 'Expansion microscopy' turns ten: how a tissue-swelling method brought super-resolution imaging to the masses. Nature. 637 (8046), 752-754 (2025).
  37. Tosetti, N., et al. Essential function of the alveolin network in the subpellicular microtubules and conoid assembly in Toxoplasma gondii. Elife. 9, e56635(2020).
  38. Gorilak, P., et al. Expansion microscopy facilitates quantitative super-resolution studies of cytoskeletal structures in kinetoplastid parasites. Open Biol. 11 (9), 210131(2021).
  39. Halpern, A. R., et al. Hybrid structured illumination expansion microscopy reveals microbial cytoskeleton organization. ACS Nano. 11 (12), 12677-12686 (2017).
  40. Gao, M., et al. Expansion stimulated emission depletion microscopy (ExSTED). ACS Nano. 12 (5), 4178-4185 (2018).
  41. Zwettler, F. U., et al. Molecular resolution imaging by post-labeling expansion single-molecule localization microscopy (Ex-SMLM). Nat Commun. 11 (1), 3388(2020).
  42. Daetwyler, S., Fiolka, R. P. Light-sheets and smart microscopy, an exciting future is dawning. Commun Biol. 6 (1), 502(2023).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Expansion MicroscopySuper Resolution ImagingCryo FixationFluorescence MicroscopyHydrogel EmbeddingConfocal MicroscopyUltrastructure Expansion MicroscopySample FixationImmunostaining ProtocolCellular Architecture

Powiązane artykuły