Laktylom oparty na spektrometrii masowej i potwierdzenie białek mleczonych

Podsumowanie

Protokół ten opisuje metodę wykorzystującą linie komórkowe raka płaskonabłonkowego przełyku jako przykład do analizy laktylacji białek. Proces ten obejmuje analizę laktylacji białek od hodowli komórkowej do potwierdzenia kandydatów, w tym analizę spektrometrii mas opartą na lakttylacji oraz potwierdzenie immunoprecipitacją.

Streszczenie

Po raz pierwszy zidentyfikowana w 2019 roku, laktylacja, nowa modyfikacja posttranslacyjna (PTM) na resztach lizyny, wykazuje od tego czasu znaczenie w wielu patologiach i kontekstach fizjologicznych. Posiada dwa izomery (L- i D-laktylację) i wiadomo, że zmienia tworzenie kompleksów, lokalizację komórkową lub stabilność docelowych białek. Protokół ten opisuje metodę analizy laktylacji od hodowli komórkowej do potwierdzenia potencjalnych celów laktylacycznych, wykorzystując jako przykład linię komórek raka płaskonabłonkowego przełyku TE11. Poniższy protokół zawiera szczegóły dotyczące identyfikacji białek laktylowanych poprzez immunoprecipitację specyficzną dla L-laktylizyny (K_L-LA) (IP) peptydów do analizy spektrometrią mas (MS): (1) ekstrakcja białek, (2) redukcja białek, alkilacja i trawienie, (3) oczyszczanie białek i koncentracja peptydów, (4) IP z użyciem kulek_{K L-LA} oraz (5) stężenie K_L-LA peptydy. Po tych etapach zostaną przeprowadzone analizy surowych danych MS w celu identyfikacji miejsc laktylowanych oraz opisane zostanie potwierdzenie tych domniemanych białek laktylowanych przez IP. Za pomocą tej metody można zidentyfikować zakres od 100 do 500 peptydów oraz potwierdzić białka mlecylne interesujące. Podsumowując, badanie białek mlecących ma potencjał do pogłębienia naszej wiedzy o sygnalizacji komórkowej napędzanej PTM zarówno w warunkach normalnych, jak i chorobowych.

Wprowadzenie

Laktylacja to modyfikacja potranslacyjna (PTM) na pozostałościach lizyny z wykorzystością metabolitów pochodzących z glikolizy. L-laktylo-CoA i laktoiloglutation są substratami L-laktylacji (K_{, L-LA}) i D-lakttylacji (K_{, D-LA),} odpowiednio ^1,2. L-laktylacja to proces enzymatyczny obejmujący enzymy takie jak acetylotransferaza ^3,4. Przeciwnie, D-laktylacja jest procesem nieenzymatycznym poprzez nukleofilową podstawienie między laktoylglutationem a resztą lizynową⁵. Jako proces dynamiczny, deacetylazy takie jak HDAC1-3 są uznawane za usuwające mlekanie⁶. Od czasu odkrycia w 2019 roku wykazano^{, że} jest interesujący w wielu patologiach i kontekstach fizjologicznych². Ten PTM został po raz pierwszy zidentyfikowany na histonach poprzez obserwację przesunięcia masy o wartości 72,021 Da za pomocą wysokowydajnej chromatografii cieczowej (HPLC) i tandemowej spektrometrii mas (MS/MS)³. Od tego czasu laktylacja została wykryta także na innych białkach niż histony i wykazano, że wpływa na funkcjonalną różnorodność, lokalizację lub stabilność zmodyfikowanych białek w zależności od kontekstu 7,8,9,10.

Biorąc pod uwagę, że PTM często występują w niskiej ilości11 i są częścią dynamicznego oraz przejściowego procesu¹², konieczne jest wzbogacenie badanych PTM przez immunoprecipitację (IP). Następnie MS jest często używane do opisu proteomu sprzężonego z PTM na trawionych peptydach, takich jak fosfoproteom czy profilowanie ubikwitynacji¹¹. Podobnie jak w przypadku innych PTM, laktylomów lub wzbogaconych laktylacjonowanych peptydów, proteomika oparta na SM jest złotym standardem identyfikacji nowych miejsc laktylacji.

Protokół ten opisuje identyfikację peptydów wzbogaconych_{o K L-LA} za pomocą proteomiki opartej na SM, po czym następuje potwierdzenie białek mleczonych przez immunoprecipitację. Na przykładzie linii komórkowych raka płaskonabłonkowego przełyku (ESCC) opisujemy protokół służący do ściągnięcia białek mleczonych w celu identyfikacji celów laktylowanych w bazie SM oraz ich późniejszego potwierdzenia przez IP.

Protokół

Ponieważ PTM są procesem dynamicznym i przejściowym, ważne jest, aby ustalić z góry konfluencję, przy której całkowity poziom laktylacji jest optymalny, stosując cytometrię przepływową lub western blotting z przeciwciałem_{anty-K L-LA} . Na przykład konfluencja 70%-80% jest preferowana w liniach komórkowych ESCC dla eksperymentów laktylomowych i IP, ponieważ całkowity poziom laktylacji jest najwyższy. Odczynniki i używany sprzęt są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Hodowla komórkowa

1. Hodować komórki w szalkach Petriego o średnicy 100 mm aż do osiągnięcia wymaganego zbiórka, jak wspomniano wcześniej.
   UWAGA: Wyhodować wystarczającą liczbę komórek, aby uzyskać od 0,5 do 1 mg białek dla laktylomów lub więcej niż 2 mg dla IP.
2. Przepłucz komórki 5 ml schłodzonej soli fosforanowej 1x z buforem fosforanowym (PBS).
3. Dodaj 500 μL schłodzonego PBS i pobierz komórki za pomocą skrobaczka do komórek. Przenieś do mikrorurki o pojemności 1 ml o niskim wiązaniu.
4. Ogniwa wirówkowe w stężeniu 2000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej (RT) i wyrzucają przezroczysty supernatant. Granulki komórkowe można przechowywać w temperaturze -80 °C.

2. Laktylom

UWAGA: Zawsze należy używać rękawiczek, aby zapobiec zanieczyszczeniu próbek. Zawsze używaj filtrowanych końcówek, mikrorurek o niskim wiążeniu oraz wody klasy MS.
UWAGA: Biologiczne replikacje (3-5 według naszego doświadczenia) zawsze powinny być wykonywane, aby upewnić się, że zidentyfikowane modyfikacje są powtarzalne.

1. Ekstrakcja białek
   UWAGA: Pracuj na lodzie.
   1. Przygotuj bufor lizy laktylomu (Tabela 1) i przechowuj go w temperaturze 4 °C przed użyciem. Dodaj inhibitory proteazy tuż przed użyciem.
   2. Ekstraktuj białka przy użyciu odpowiedniej objętości buforu lizy.
   3. Sonikat na lodzie, 12 cykli po 5 sekund impulsu + 5 sekund wyłączony, przy intensywności 20%-25%.
   4. Wirować w 16 000 x g przez 10 minut w 4 °C. Przenieść przezroczysty supernatant zawierający białka do nowej mikrorurki o niskim wiążeniu.
   5. Ilościowo określ białka za pomocą zestawu kwasu bicynchoninowego (BCA) zgodnie z zaleceniami producenta.
      UWAGA: Zestaw BCA jest kompatybilny z maksymalną ilością mocznika do 3 M. Dlatego próbki muszą być odpowiednio rozcieńczone.
   6. Przenieś 500 μg do 1 mg białek do nowych, niskowiążących mikrorurek. Używaj tej samej ilości białka na każdą próbkę. Uzupełnij objętość wszystkich próbek buforem lizy laktylomu do tej samej końcowej objętości.
2. Redukcja, alkilacja i trawienie enzymatyczne
   1. Dodaj ditiotrytol do końcowego stężenia 5 mM. Inkubuj w 95 °C przez 2 minuty.
   2. Inkubuj przez 30 minut w RT.
   3. Dodaj chloroacetamid do końcowego stężenia 7,5 mM. Inkubuj w RT przez 20 minut w ciemności.
   4. Dodaj 3-krotność objętości próbki (od kroku 2.1.6) 1 M (NH₄)₂CO₃ , aby zmniejszyć ilość mocznika z 8 M do 2 M.
      UWAGA: Jeśli całkowita objętość przekracza pojemność mikrorurek, podziel ją na dwie mikrorurki.
   5. Dodaj 1 μg trypsyny klasy MS na każde 100 μg białek. Inkubuj przez noc w temperaturze 30 °C. Przejdź do oczyszczania próbki.
3. Oczyszczanie i stężenie peptydów
   UWAGA: Pracuj w RT.
   1. Zakwasz próbkę, dodając kwas trifluorocetowy (TFA) do końcowego stężenia 0,2%.
   2. Przygotuj następujące roztwory w wodzie klasy MS na świeżo: 0,1% TFA, 1% kwasu mrówkowego (FA) oraz 1% FA/50% acetonitrylu.
   3. Do kontynuowania oczyszczania używaj kolumn C18 po 100 mg.
      UWAGA: Aby użyć tej kolumny, użyj dwóch końcówek pipety: załaduj kolumnę jedną i tnij końcówkę drugiej, aby wyrzucić płyn z kolumny. Upewnij się, że kolumna pozostaje stale mokra. Używaj jednej kolumny na próbkę.
   4. Naładuj kolumnę 1 ml 100% acetonitrylu, czyli roztworu zwilżającego, i wyrzuć go. Powtórz dwa razy.
   5. Wyrównaj kolumnę, ładując 1 mL 0,1% TFA i wyrzucaj. Powtórz dwa razy.
   6. Naładuj kolumnę 1 mL zakwaszonej próbki. Kontynuuj 10 cykli ładowania/wyrzucania próbki. Powtórz, jeśli zostanie jakaś próbka.
   7. Przemyj kolumnę, ładując 1 mL 0,1% TFA i wyrzucaj. Powtórz dwa razy.
   8. Do elucii przejdź przez 10 cykli ładowania/wyrzucenia, używając 750 μL 1% FA/50% acetonitrylu. Zbierz w nowej, niskowiążącej mikrorurce. Powtórz z dodatkowymi 750 μL 1%/50% acetonitrylu, co daje łącznie 1,5 mL oczyszczonych peptydów.
      UWAGA: Rozpoznaj mikrorurkę po boku, a nie na nakrętce, aby uniknąć zanieczyszczenia próbek podczas przebijania dziur w nakrętce.
   9. Przebij 1 do 3 otworów w nakrętce mikrorurek igłą do odparowania.
   10. Używając koncentratora próżniowego, koncentruj próbki w temperaturze 60 °C tak długo, jak jest potrzebne (dla próbek o objętości końcowej 1,5 mL może to zająć co najmniej 4 godziny). Następnie przechodzi się immunoprecipitacja peptydów.
4. Immunoprecipitacja z użyciem koralików_{K L-LA}
   1. Przygotuj bufor płukania i bufor IP z laktylomom (Tabela 2).
   2. Na lodzie dodaj 200 μL buforu IP do skoncentrowanych peptydów, dokładnie mieszając w górę i w dół, aż do rozpuszczenia. Niektóre osady nadal mogą być widoczne.
   3. Wirówka w 12 000 x g przez 10 minut w 4 °C, aby usunąć wszelkie osady.
      UWAGA: Po wirowaniu próbkę można dozować jako krok kontrolny, na przykład za pomocą spektrofotometru do ilościowego określenia stężenia peptydu na 205 nm.
   4. Przemyj K_L-LA kulki sprzężone z agarozą 3 razy 200 μL lodowato zimnego 1x PBS, wirując w 2000 x g przez 1 minutę w 4 °C i usuwając przezroczysty supernatant po każdym myciu.
      UWAGA: Na 1 mg białka na początku tego protokołu należy użyć 20 μL koralików K_L-LA sprzężonych z agarozą, wcześniej alicytatowanych w rurkach o pojemności 0,5 mL o niskim wiążeniu, co ułatwia użycie.
   5. Przenieś przezroczysty supernatant zawierający ponownie zawieszone peptydy do mikrorurki 0,5 mL zawierającej wcześniej umyte koraliki. Uszczelnij rurki filmem parafinowym, aby zapobiec wyciekom.
   6. Inkubuj przez noc z delikatnym rotowaniem od końca do końca w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Kroki 2.4.7-2.4.12 wykonuje się w temperaturze 4 °C.
   7. Granuluj kulki przez wirowanie w dawce 2000 x g przez 1 minutę. Usuń przezroczysty supernatant.
   8. Dodaj 200 μL bufora IP z laktylomom i płucz przez 15 sekund, odwracając tubę. Wirówka w 2000 x g przez 30 sekund i wyrzuć przezroczysty supernatant.
   9. Powtórz krok 2.4.8 raz.
   10. Dodaj 200 μL bufora do płukania i płucz przez 15 sekund, odwracając rurkę. Wirówka w 2000 x g przez 30 sekund i wyrzuć przezroczysty supernatant.
   11. Powtórz krok 2.4.10 dwa razy.
   12. Dodaj 200 μL wody klasy MS i płucz przez 30 sekund, odwracając rurkę. Wiruj w 2000 x g przez 1 minutę i wyrzuć przezroczysty supernatant.
       UWAGA: Pozostałe etapy protokołu laktylomatowego wykonuje się w RT.
   13. Elutuj związane peptydy 100 μL buforu elucijnego (0,1% TFA świeżo przygotowanych) przez 1 minutę, delikatnie obracając się od końca do końca w RT. Wirówka w 2000 x g przez 2 minuty.
   14. Powtórz krok 2.4.13 dwa razy i połącz eluty. Przejdź do oczyszczania próbek.
5. Stężenie i oczyszczanie peptydów_{K L-LA}
   1. Przygotuj następujące roztwory w wodzie słodkiej klasy MS: 0,1% TFA, 1% FA i 1% FA/50% acetonitrylu.
      UWAGA: Tuż przed rozpoczęciem oczyszczania przygotuj odpowiednią ilość roztworu w mikrorurkach po 1,5 mL (krok 2.5.3: 300 μL 100% acetonitrylu, krok 2.5.4: 300 μL 0,1% TFA, krok 2.5.6: 300 μL 0,1% TFA oraz krok 2.5.7: 300 μL 1% FA/50%).
   2. Do kontynuowania oczyszczania używaj końcówek C18 o pojemności 100 μL.
      UWAGA: Końcówki C18 o pojemności 100 μL są używane w ten sam sposób co tradycyjne końcówki pipety. Trzymaj kciuk w ruch i nigdy nie puszczaj tłoka między krokami, aby utrzymać kolumnę mokrą i zapobiec napływowi powietrza.
   3. Aspiruj 100 μL 100% acetonitrylu, czyli roztworu zwilżającego, i delikatnie podawaj, nie wyrzucając całego płynu. Powtórz dwa razy.
   4. Wyrównuj kolumnę, zasysając 100 μL 0,1% TFA i delikatnie podawaj. Powtórz dwa razy.
   5. Naładuj kolumnę 100 μL próbki peptydów_{K L-LA} . Przekonuj 10 cykli ładowania/wyrzucania w nowej, niskowiążącej mikrorurce. Powtórz, jeśli zostanie jakaś próbka.
   6. Kolumnę myj przez zasysanie 100 μL 0,1% TFA i wydaj. Powtórz dwa razy.
   7. Przeprowadzić 10 cykli ładowania/wyrzutu do elucii, używając 100 μL 1% FA/50% acetonitrylu w nowej mikrorurce o niskim wiązaniu. Powtórz dwa razy i połącz eluaty.
      UWAGA: Peptydy wiążące się z czubkiem C18 mogą uniemożliwić zasysanie końcówki 100 μL naraz. Powtarzaj ten krok, aż w mikrorurce nie będzie już cieczy (300 μL) w kroku 2.5.7.
   8. Przebij 1 do 3 otworów w nakrętce mikrorurek igłą do odparowania.
      UWAGA: Zidentyfikuj mikrorurki po boku rurki, a nie na korekcie, aby uniknąć skażenia próbek podczas przebijania otworów.
   9. Za pomocą koncentratora próżniowego koncentruj próbki w temperaturze 60 °C tak długo, jak potrzeba do odparowania cieczy (dla całkowitej objętości 300 μL, może to zająć co najmniej 2 godziny).
   10. Ponownie zawiesz skoncentrowane peptydy w 30 μL 1% FA.
   11. Zgodnie z wytycznymi platformy spektrometrii mas, ilościowo określ peptydy spektrofotometrem na 205 nm, aby określić ich stężenie.
   12. Przelej do szklanej fiolki i utrzymuj w temperaturze 4 °C aż do analizy SM.

3. Analiza magisterska i bioinformatyka

UWAGA: Próbki zostały przeanalizowane w Zakładzie Podstawowym Proteomiki Uniwersytetu Sherbrooke przy użyciu spektrometru masowego (MS) (działającego w trybie Data-Dependent Acquisition z trybem równoległej akumulacji i fragmentacji szeregowej (DDA-PASEF).

1. Spektrometria mas
   1. Dla każdej próbki należy wstrzyknąć 375 ng peptydów do wysokowydajnego systemu chromatografii cieczowej (HPLC).
   2. Załaduj peptydy na kolumnę pułapkową ze stałym przepływem 4 μL/min.
   3. Rozdziel peptydy w kolumnie analitycznej C18 przy użyciu 2-godzinnego gradientu 5%-37% acetonitrylu w 0,1% FA przy przepływie 400 nL/min.
   4. Wykonaj jonizację elektrospray przy następujących ustawieniach: napięcie kapilarne: 1500 V, gaz suchy: 3,0 L/min, temperatura sucha: 180 °C, ciśnienie TIMS-in: 2,6 mBar.
   5. Pobieranie widm mas w zakresie 100-1700 m/z w trybie DDA auto-MS/MS.
      UWAGA: Instrument jest ustawiony tak, aby wykrywać stany ładunku od 0 do 5+. Stosuje się konfigurację podwójnej spektrometrii mobilności jonów (TIMS) z czasem rampy wynoszącym 100 ms oraz 10 skanów równoległego akumulacji i fragmentacji szeregowej (PASEF) na cykl akwizycji, co daje cykl pracy 1,17 s. Wykluczenie dynamiczne jest ustawione na 0,4 min.
   6. Przeprowadz fragmentację przy użyciu energii indukowanej przez zderzenie (CID) liniowo zwiększonej od 20 do 59 eV w zakresie mobilności jonów 0,6-1,6 Vs/cm².
      UWAGA: Docelowa intensywność jest ustawiona na 20 000, z progiem intensywności 2 500. Standardowy wielokąt filtrujący stosuje się do priorytetyzacji prekursorów wzdłuż linii ukośnej skanowania dla peptydów naładowanych +2, +3 i +4 w płaszczyźnie mobilności m/z-ionów.
2. Wstępne przetwarzanie danych: analiza MaxQuant
   UWAGA: Kolejne kroki wykonuje się przy użyciu oprogramowania MaxQuant v.2.6.7¹³ , aby zidentyfikować peptydy laktylowane.
   1. W prawym górnym rogu kliknij zakładkę Konfiguracja i sprawdź, czy laktylacja została dodana jako modyfikacja.
   2. Jeśli nie, użyj bazy danych Unimod.org¹⁴. Zaloguj się jako gość i wyszukaj lactylation (dodatek #2114).
   3. Kliknij przycisk Dodaj . W nazwie napisz Lactylation (K), wpisz skład tak, jak napisany w Unimodzie, klikając przycisk Zmiana .
   4. Zweryfikować uzyskaną masę monoizotopową. Kliknij OK.
   5. W lewym górnym rogu ekranu, na niebiesko, kliknij przycisk Zapisz zmiany .
   6. W lewym górnym rogu kliknij na Surowe dane. Ładuj surowe pliki danych i nazywaj je automatycznie, używając przycisku No fractions .
   7. Ustaw liczbę wątków w lewym dolnym rogu, w zależności od liczby rdzeni dostępnych na komputerze.
   8. W zakładce specyficznej dla grupy kliknij na Modyfikacje na niebiesko.
   9. Dodaj Lactylation to Variable Modifications, klikając przycisk strzałki, aby dodać do kwadratu po prawej stronie.
   10. Kliknij na Ilościfikacja bez etykiet. Wprowadź LFQ i zmień typ normalizacji na zero.
   11. Kliknij na Trawienie. Upewnij się, że do kwadratu po prawej stronie dodano trypsinę/P.
   12. Zwiększ maksymalną liczbę pominiętych rozszczepień do 4 , ponieważ laktylacja może wpływać na trawienie trypsyny.
   13. Kliknij na Instrument. Zmień tolerancję peptydów Main Search na 20, biorąc pod uwagę, że laktylacja nie jest powszechnym PTM.
   14. W lewym górnym rogu kliknij na parametry globalne. Dodaj plik Fasta, wcześniej pobrany z Uniprot lub Ensembl, dla odpowiadającego mu gatunku.
   15. Kliknij na Identyfikator rule and Test , aby upewnić się, że plik Fasta można poprawnie odczytać.
   16. Kliknij na Ilościfikacja białek na niebiesko. Dodaj Lactylation do kwadratu po prawej.
   17. Kliknij na Identyfikację na niebiesko. Zmień FDR na 0,05. Upewnij się, że Second peptides i Match między przebiegami są zaznaczone.
   18. Kliknij na Ilościfikację bez etykiet na niebiesko. Zaznacz pola iBAQ i Top3.
   19. W prawym górnym rogu kliknij na Performance.
   20. W dolnej sekcji kliknij Start na niebiesko.
3. Identyfikacja białek mleconych
   UWAGA: Na końcu uruchomienia MaxQuant zostanie uzyskanych wiele plików wyjściowych, takich jak:
   • Miejsca lakttylacji (K)Miejsca: główny plik zainteresowania – zawiera informacje specyficzne dla konkretnych miejsc o laktylowanych resztach lizyny w precyzyjnej sekwencji peptydowej (zidentyfikowane białko, lokalizacja laktylacji w sekwencji, intensywności, poziom ufności).
   • Parametry laktylacji: zawierają wszystkie informacje o ustawieniach i progach stosowanych podczas analizy MaxQuant.
   • Peptydy laktylacyjne: zidentyfikowane peptydy zmodyfikowane i niezmodyfikowane.
   • Grupy białek laktylacyjnej: zidentyfikowane grupy białkowe i ich związek z wykrytą lakttylacją.
   Wykorzystanie tych plików zależy od pytania badawczego. Kolejny krok opisuje, jak zidentyfikować miejsce mleczące się laktylacją.
   1. Otwórz plik Lactylation (K)Sites w Excelu.
   2. Zduplikuj zakładkę na dole Lactylation (K)Sites , aby zachować oryginalne dane.
   3. Sortuj od A do Z kolumny odwrotne i potencjalne zanieczyszczenia . Jeśli w niektórych wierszach jest wartość, usuń te wiersze.
   4. W tej nowej karcie zachowaj tylko niezbędne kolumny, takie jak: (1) Białko: UniProt¹⁴ Numer pierwotny, (2) Pozycje w białkach: Przewidywana pozycja laktylacji, ważna do potwierdzenia jak opisano później, (3) Nazwy białek, (4) Nazwy genów, (5) Liczba mleczeń (K wykrytych na odpowiadającym peptydzie), (6) Laktylacja (K) Prawdopodobieństwa (Prawdopodobieństwo 1 w położeniu laktylacji), (7) Intensywność (suma wszystkich indywidualnych intensywności należących do odpowiadającego peptydu).
   5. Uzupełnij wszelkie brakujące wartości, takie jak nazwy białek lub genów.
   6. Zachowaj tylko pierwszy numer przystąpienia w kolumnie "Białka". Uzyskana tabela przedstawia wszystkie wykryte peptydy laktylowane wraz z najbardziej prawdopodobnym białkiem, w którym można go znaleźć.
      UWAGA: Ponieważ laktylacja nie jest obficie występującym PTM, oczekuje się, że od 100 do 500 peptydów zostanie zidentyfikowanych jako laktylowane. Ponieważ wykryte peptydy różnią się w zależności od replikacji, możliwe jest ustawienie progu co najmniej wykrytego w dwóch biologicznych replikacjach.
   7. Aby potwierdzić pozycję zmodyfikowanego resztka, użyj narzędzia internetowego do wyrównania, takiego jak BLAST z NIH¹⁵ lub Align z UniProt¹⁶ , z sekwencją peptydów w kolumnie "Lactylation (K) Probabilities" (usuń dowolne prawdopodobieństwo) oraz sekwencją białek z bazy UniProt¹⁷.
      UWAGA: Ponieważ w jednej sekwencji białkowej można zidentyfikować wiele miejsc laktylacji, możliwe jest jednoczesne ustawienie tych miejsc. To również pomoże zidentyfikować zduplikowane miejsca, które mogą znajdować się na różnych peptydach, ale w tym samym miejscu w sekwencji białkowej.
   8. Analiza danych będzie zależeć od pytania badawczego, ale przed rozpoczęciem analizy danych statystycznych należy rozważyć kroki normalizacji, centrowania, skalowania i transformacji logaritmów¹⁸.
   9. Aby potwierdzić białka mleczne zidentyfikowane analizą SM, należy przejść do protokołu immunoprecipitacji.

4. Immunoprecipitacja (IP)

1. Ekstrakcja białek
   UWAGA: Pracuj na lodzie.
   1. Przygotuj lizę/bufor do mycia IP (Tabela 3) i przechowuj go w 4 °C przed użyciem. Dodaj inhibitory proteazy tuż przed użyciem.
      UWAGA: Do przygotowania próbki można użyć granulki komórkowej zachowanej w temperaturze -80 °C. Jeśli pracujesz ze świeżymi komórkami, postępuj zgodnie z krokami 4.1.2 i 4.1.3. W przeciwnym razie ponownie zawiesij osadę komórki w tej samej objętości lizy/buforu do płukania, jak podano w kroku 4.1.2 i kontynuuj krok 4.1.4.
   2. Dodaj 1 ml lizy/buforu do płukania IP i inkubuj komórki w 4 °C przez 10 minut.
   3. Pobieraj komórki za pomocą skrobaka do komórek i przenosi lizę do mikrorurki o pojemności 1,5 mL.
   4. Inkubuj delikatnym obrotem od końca do końca przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
   5. Wirówka w 16 000 x g przez 10 minut w 4 °C.
   6. Przelej przezroczysty supernatant do nowej mikrorurki o pojemności 1,5 mL.
   7. Ilościowo określ białko za pomocą zestawu BCA zgodnie z protokołem producenta.
2. Wstępne oczyszczanie kulek i inkubacja przeciwciał_{K L-LA}
   UWAGA: Pracuj na lodzie. Dla każdego warunku eksperymentalnego przygotuj kontrolną probówkę IP (IgG tego samego gatunku co przeciwciało K_L-LA ) oraz probówkę dla K_L-LA IP.
   1. Przenieś 1 mg białek do nowej mikrorurki o pojemności 1,5 mL. Uzupełnij wszystkie próbki do tego samego końcowego woluminu, używając lizy/bufora płukania IP.
      UWAGA: Protokół ten można wykonać przy użyciu kulek magnetycznych lub agarozowych. Do kolejnych kroków używano kulek magnetycznych.
   2. Przenieś wymaganą objętość kulek do nowej mikrorurki o pojemności 1,5 mL.
   3. Aby przemyć koraliki przed praniem, namagnesuj je przez 30 sekund lub do momentu, aż roztwór będzie przezroczysty. Usuń przezroczysty supernatant. Płucz kulki 3 razy z 500 μL lizy/bufora do mycia. Po każdym myciu wyrzucaj przezroczysty supernatant. Dodaj taką samą objętość bufora IP jak objętość początkowo pobranych koralików.
   4. Inkubuj próbki białka z 10-15 μL wcześniej wymytych koralików, delikatnie obracając od końca do końca przez 20 minut w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Do 1 mg białka użyj 10-15 μL magnetycznych kulek. Ten krok minimalizuje niespecyficzne wiązanie białek z kulkami podczas protokołu immunoprecipitacji.
   5. Magnesuj kulki na 30 sekund lub do momentu, aż roztwór będzie przezroczysty. Przelej przezroczysty supernatant do nowej mikrorurki o pojemności 1,5 mL.
   6. Dodaj 1,5 μL przeciwciała_{anty-K L-LA}do jednej probówki i odpowiednią ilość IgG do innej.
      UWAGA: Na początku tego protokołu na 1 mg białka należy użyć 1,5 μg przeciwciał.
   7. Inkubuj próbki delikatnym obrotem od końca do końca przez noc w temperaturze 4 °C.
3. Immunoprecipitacja_K-L-LA
   UWAGA: Pracuj na lodzie.
   1. Przygotuj lizę/bufor do mycia IP (Tabela 3) i przechowuj go w 4 °C przed użyciem. Dodaj inhibitory proteazy tuż przed użyciem.
   2. Wstępnie umyj kulki zgodnie z krokiem 4.2.3.
      UWAGA: Na początku tego protokołu do 1 mg białka należy użyć 40 μL kulek magnetycznych.
   3. Inkubuj próbki z 40 μL wcześniej umytych kulek magnetycznych z delikatnym obrotem od końca do końca przez 4 godziny w temperaturze 4 °C.
   4. Magnesuj kulki na 30 sekund lub do momentu, aż roztwór będzie przezroczysty. Zbierz pierwszy przezroczysty supernatant. Płucz kulki 3 razy z 500 μL lizy/bufora do mycia. Po każdym myciu usuwaj przezroczysty supernatant.
      UWAGA: Pierwszy supernatant można zmierzyć i stosować w western blottingu (WB). Warto ocenić skuteczność immunoprecypitacji.
   5. Ponownie zawiesij kulki z 20 μL 2x Laemmli i 5% buforem β-merkaptoetanolu.
   6. Inkubuj w 95 °C przez 5 minut przed załadowaniem na żel SDS-PAGE. Alternatywnie, próbki denaturowane można przechowywać w temperaturze -20 °C przez kilka tygodni.
4. Wykrywanie WB
   1. Umieść lampy IP na stojaku magnetycznym na 30 sekund, zanim pobierze próbkę i załaduje ją na żel SDS-PAGE.
   2. Wykonaj WB z użyciem przeciwciała przeciwko interesującemu białku i/lub przeciwciału_{przeciw K L-La} , aby potwierdzić obniżenie efektu białek mlekowych w 5% albuminie surowicy bydłej (BSA). Przeciwciała wtórne rozcieńczono w skali 1:5000 w stężeniu 5% BSA.
   3. Wykrywaj pasma za pomocą detekcji chemiluminescencji opartej na HRP.

Wyniki

Na przykład linia komórek raka płaskonabłonkowego przełyku TE11 była hodowana do osiągnięcia 80% współbycia. Zgodnie z procesem pracy przedstawionym na Rysunku 1 oraz analizie MaxQuant, opisanej w tym protokole, określono laktylom. W tych komórkach zidentyfikowano 137 peptydów potencjalnie mleczących, reprezentujących 82 unikalne białka, ponieważ na tym samym białku zidentyfikowano wiele miejsc (rysunek 2A). Należy zauważyć, że nie uwzględnia to unikalnych peptydów. W tych eksperymentach w liniach raka płaskonabłonkowego przełyku spodziewana jest liczba od 100 do 500 zidentyfikowanych peptydów.

Zidentyfikowane białka laktylowe są powiązane z kilkoma procesami biologicznymi, takimi jak przebudowywanie chromatyny lub montaż chromatyny, które już wcześniej opisano w literaturze jako wzbogacone w białka laktylowe (Rysunek 2B). Jednymi z pierwszych zidentyfikowanych białek laktylowanych były histony, które również można znaleźć w tych danych, takie jak histon H1.2 (Tabela 4). Mlecenie można było zidentyfikować na kilku różnych resztach lizyny z tego samego białka. Na przykład na histonie H1.2 zidentyfikowano dwa miejsca laktylacji: lizyny (K) 168 (prawdopodobnie) i 191. Na pierwszym peptydzie (Tabela 4, linia 2) zaobserwowano, że reszta K168 ma większe prawdopodobieństwo laktylacji przy 0,733 na 1, podczas gdy K169 ma prawdopodobieństwo tylko 0,267. HNRNPA1 jest dobrym przykładem peptydu, który wymaga wyrównania, aby określić odpowiednią zmodyfikowaną resztę.

Aby potwierdzić laktylację HNRNPA1 na podstawie wyników laktylomu (Tabela 4), wykonano test IP ukierunkowany na tę modyfikację po translacji. Po pierwsze, aby określić, który typ kulki wykazuje optymalne interakcje z przeciwciałem_{anty-K L-LA}, porównano koraliki G i A/G. Po przeprowadzeniu IP z użyciem przeciwciała_{K L-LA} oraz następnie WB przeciwko K_L-LA, zaobserwowano widoczne wzbogacenie białek_{K L-LA} w porównaniu z oczekiwanym wejściem dla obu typów kulek (Rysunek 3). Wyniki te pokazują skuteczność i odporność protokołu w wzbogacaniu białek mlecznych. Nie zaobserwowano wyraźnych różnic między obiema typami koralików testowanymi. Aby zweryfikować cele zidentyfikowane przez MS, można następnie potwierdzić konkretne adresy IP. Na przykład laktylacja HNRNPA1, którą zidentyfikował MS (Tabela 4), została skalibrowana. Po K_L-LA IP i HNRNPA1 WB wykryto konkretny pas odpowiadający HNRNPA1, co wskazuje, że HNRNPA1 jest modyfikowany przez laktylację (rysunek 4). Podczas gdy zarówno kulki G, jak i A/G skutecznie immunoprecipitowały docelowe białko, bardziej intensywny sygnał HNRNPA1 obserwuje się u koralików A/G, co sugeruje zwiększoną afinitet lub regenerację.

Rysunek 1: Przegląd przepływu pracy przy analizie laktylomu. Skróty: IP = Immunoprecipitation; K_L-LA = L-laktylizyna; LC-MS/MS = chromatografia cieczowa – spektrometria mas tandemowy. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 2: Reprezentatywne wyniki dla niektórych białek uzyskanych dla laktylomu komórek TE11. (A) Całkowita liczba zidentyfikowanych białek i peptydów. Na tym samym białku można zidentyfikować wiele miejsc laktylacji. (B) Top 5 procesów biologicznych wzbogaconych o białka mleczone w komórkach TE11 uzyskanych za pomocą bazy danych STRING. Wartość p została skorygowana dla wielokrotnych testów za pomocą Benjamini-Hochberga. Liczba w każdym słupku oznacza liczbę białek w sieci, które zostały zidentyfikowane jako laktylowane, spośród całkowitej liczby białek w tej ontologii genowej (GO). Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 3: Immunoprecipitacja K_L-LA przy użyciu kulek G lub A/G oraz wykrywanie białej warstwy Pan-K_L-LA w komórkach TE11. Wykrywanie Pan-K_L-LA stanowi kluczową kontrolę potwierdzającą skuteczność i specyficzność immunoprecipitacji tego PTM. Ten eksperyment zapewnia, że IP skutecznie wzbogaca białka zawierające modyfikację K_L-LA . (*) oznacza ciężkie i lekkie łańcuchy przeciwciała, co wyraźnie zaobserwowano w IP: IgG ścieżki (kontrolne IP) (N = 3). Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 4: Immunoprecipitacja K_L-LA przy użyciu kulek G lub A/G oraz wykrywanie HNRNPA1 przez WB. Wykrywanie HNRNPA1 przez WB w immunoprecypitacjach specyficznych_{dla K L-LA} przy użyciu kulek G lub A/G potwierdza jego laktylację w komórkach TE11 (N = 3). Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rozwiązanie	Ostateczna koncentracja
Mocznik	8 M
Wodorowęglan amonu	1 M
HEPES	20 mM

Tabela 1: Bufor lizy laktylomu. Przygotowanie w wodzie klasy MS i regulacja pH do 8.

Roztwór - Bufor płukania z laktylomatem	Ostateczna koncentracja
NaCl	100 mM
EDTA	1 mM
Tris-HCl	20 mM
Dodaj do bufora IP Lactylome	Ostateczna koncentracja
NP-40	0.5%

Tabela 2: Bufor płukania laktylomu i bufor IP. Przygotowanie w wodzie klasy MS i regulacja pH do 8 dla obu roztworów.

Rozwiązanie	Ostateczna koncentracja
Chlorek sodu	100 mM
Fluorek sodu	50 mM
Tris-HCl (pH 7,5)	50 mM
β-glicerofosforan	40 mM
EDTA (pH 8)	5 mM
Glicerol	5%
Triton X-100	1%
Dodaj świeże:
Koktajl inhibitorów proteazy 100X	1X
PMSF	1 mM
Orthovanadate	0,2 mM

Tabela 3: Liza/bufor do mycia IP. Musi być wolna od denaturantów, ponieważ mogą one destabilizować obecność PTM na białkach.

Pozycje w białkach		Białko	Nazwy białek	Nazwy genów	Liczba mleczeń (K)	Prawdopodobieństwa mlecenia (K)		Intensywność
168		P16403	Histone H1.2	HIST1H1C	1	KPAAATVTK(0.733)K(0.267)		1.98E+04
191		P16403	Histone H1.2	HIST1H1C	1	SAAK(1)AVKPK		6.91E+04
51		A8K2U0	Białko podobne do alfa-2-makroglobuliny 1	A2ML1	1	VCLDLSPGYSDVK(1)		3.18E+04
5; 5; 5		C9JMM0	Homolog białka chromoboksa 3	CBX3	1	ASNK(1)TTLQK		1.21E+05
10; 10; 10		C9JMM0	Homolog białka chromoboksa 3	CBX3	1	TTLQK(0.828)MGK(0.172)		2.49E+05
112; 141		O76095-2	Białko JTB	JTB	2	K(0.858)ALEK(0.18)VRK(0.962)		1.47E+04
350; 298; 298; 297; 285; 245; 253; 169; 48; 100; 95; 93; 79; 23; 93; 92; 79; 28; 74; 50; 73; 51; 57; 56; 48; 61; 66; 66; 73		P09651	Heterogeniczna jądrowa rybonukleoproteina A1	HNRNPA1	1	SSGPYGGGGQYFAK(1)PR		6.13E+04

Tabela 4: Reprezentatywne wyniki dla peptydów laktylacowanych uzyskane dla linii komórek raka płaskonabłonkowego przełyku TE11. Ta tabela została uzyskana po analizie MaxQuant.

Dyskusja

Protokół ten opisuje, jak immunoprecipitacja białek zmodyfikowanych_K-L-LA może być wykorzystana w SM do odkrywania nowych białek mleczonych i ich miejsc laktylacji. Protokół laktylomatowy wykonywany jest przy użyciu sprzężonych kulek, ale według pytania badawczego można go osiągnąć przy użyciu przeciwciał_{K L-LA} lub nawet przeciwciał_{K D-LA} . Jeśli zamiast sprzężonych kulek używa się przeciwciała, wybór przeciwciała poliklonalnego ułatwia tworzenie bardziej zwartych kompleksów, ponieważ może wiązać się z wieloma epitopami; jednak takie podejście może wprowadzać zmienność. Jedną z zalet stosowania sprzężonych kulek jest to, że zapobiegają one wypłukiwaniu przeciwciał – uwalnianiu się z twardego podłoża – co mogłoby zanieczyścić próbki SM. Jest to także bardziej czasoszczędne niż stosowanie przeciwciał niesprzężonych.

Ponadto ważne jest, aby zauważyć, że ilość zidentyfikowanych peptydów w tego typu analizie może być zależna od wielu czynników:¹. Po pierwsze, swoistość przeciwciał odgrywa kluczową rolę w zapewnieniu, że właściwe białko zostanie wychwycone. Dodanie kroku wstępnego oczyszczania z koralikami agarozowymi może być sposobem na usunięcie niespecyficznych interakcji. Z drugiej strony nie wiadomo, czy laktylacja może wpływać na trawienie trypsyny, ponieważ rozszczepia peptydy po stronie c-końcowej reszty argininy, a przede wszystkim na resztę lizyny. Jeśli tak się stanie, może to potencjalnie prowadzić do zmniejszenia pokrycia peptydami. Dlatego można rozważyć inne opcje proteaz. W tym protokole parametr "Max. missed cleavages" jest zwiększany, aby uwzględnić to ograniczenie. Na koniec należy również rozważyć przygotowanie i obsługę próbek, takie jak stosowanie rękawic zapobiegających zanieczyszczeniu próbek keratyną ze skóry, na przykład lub stabilność modyfikacji, ponieważ wymiana PTM jest dynamicznym i czasem szybkim procesem⁶.

W przeciwieństwie do szerszego podejścia MS, które doprowadziło do niskiej wykrywalności PTM o niskiej ilości, takiego jak laktylacja, identyfikacja wzbogaconych peptydów_{K L-LA} za pomocą proteomiki opartej na MS pozwala na szczegółową analizę miejsc PTM, taką jak identyfikacja nowo scharakteryzowanych miejsc laktylacji i białek laktylacowanych¹⁹. Western blot może dostarczyć informacji o ogólnym wzorcu laktylacji obecnej w komórkach, ale nie może wskazać na laktylację specyficzną dla białka. Dlatego IP jest powszechnie stosowanym podejściem do potwierdzania PTM²⁰ wykrytego przez MS. Testy ligacji bliskości (PLA) to kolejna technika, którą można wykorzystać do potwierdzenia laktylacji potencjalnych celów zidentyfikowanych przez proteomikę²¹. Technika ta może również wskazywać na lokalizację zmodyfikowanych białek, ale ma niższą swoistość. Zastosowanie podejścia IP specyficznego dla laktylacji jest odpowiednie dla szerokiego przesiewu PTM, ale może być interesujące przeprowadzenie IP specyficznego dla białka, w zależności od pytań badawczych.

Przy ilościowym określaniu proporcji konkretnego białka laktylacyjnego w całkowitym ekstrakcie białkowym, samo wykonanie IP nie wystarcza. Podczas gdy IP z użyciem kulek_{K L-LA} pozwala na wychwytywanie białek mleczeniowych, nie określa dokładnie proporcji laktylacji, ponieważ ogranicza się do wzbogacania białek docelowych. Dlatego wymagana jest spektrometria mas, która zapewnia bardziej szczegółową analizę pozwalającą na precyzyjne ilościowe pomiary laktylacji. Dlatego wykonanie IP potencjalnie laktylowanego białka z użyciem przeciwciała przeciwko temu białku, a następnie analiza spektrometrii mas, może określić procent białek laktylowanych w całkowitej próbce białka, podczas gdy wykonanie IP jest efektywnym podejściem do potwierdzenia laktylacji białek zidentyfikowanych jako laktylowane przez SM.

W IP z wykorzystaniem przeciwciał niesprzężonych optymalizacja stosunku kulki do przeciwciał jest niezbędna, aby zapewnić optymalne wychwytywanie białek mlecznych. Rzeczywiście, równowaga między tymi dwoma komponentami bezpośrednio wpływa na specyfikę i efektywność IP. Nadmiar przeciwciał może prowadzić do wiązania niespecyficznego, co zwiększa szum tła i obniża ogólną dokładność wykrywania. Natomiast przeciwnie może prowadzić do nieefektywnego wzbogacenia białek docelowych, co skutkuje słabszymi sygnałami i obniżoną czułością. Te techniczne kwestie są kluczowe dla uzyskania wiarygodnych i precyzyjnych wyników w badaniu białek mlekowych.

Podsumowując, protokół ten może być wykorzystywany do monitorowania zmian w profilach laktylacji po deregulacji homeostazy, takich jak rak ^8,10, które mogą wpływać na odpowiedź związaną z lekami. Identyfikacja markerów biologicznych mogła być nawet osiągnięta tą metodą. Stosowana do wielu linii komórkowych, typów tkanek, a nawet biopsji pacjentów, technika ta ma potencjał pogłębić zrozumienie sygnalizacji komórkowej napędzanej PTM w chorobach lub w normalnych warunkach.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
100 uL Zip Tip C18	Pierce	87784
Acclaim PepMap100 C18	Dionex Corporation	164946	0,3 mm średnicy średnicy x 5 mm
Acetonitryl (klasa MS)	Fisher	A955-4
Wodorowęglan amonu	Sigma-Aldrich	A6141-500
Przeciwciało monoklonalne przeciw HNRNPA1	Novus Biologicals	NB100-672
Przeciwciało monoklonalne przeciwciało przeciw L-Laktylizynie (KL-La)	PTM-Bio	PTM1401RM
Przeciwciało IgG przeciw myszym, powiązane z HRP	CST	7076S
Przeciwciało IgG przeciw królikom i HRP	CST	7074S
Azure 280	Biosystemy	AZI280-01
Zestaw BCA	Thermo Fisher Scientific	P123227
Bovin Serum Albumin (BSA)	Wisent	800-095-EG
Captive Spray nanoESI źródło	Bruker Daltonics
Chloroacetamid	Sigma-Aldrich	C0267
Podłoże ECL Clarity Max Western	Bio-Rad	1705062
Dithiothreitol (DTT)	Thermo Fisher Scientific	R0861
Koraliki Dynabeads Protein G do immunoprecipitacji	Thermo Fisher Scientific	10004D
EDTA	Sigma-Aldrich	E9884
Kwas mrówkowy (FA; Stopień magisterski)	Thermo Fisher Scientific	A117-50
Glicerol	Fisher Scientific	BP229-1
HEPES (1M)	Wisent	330-050-EL
Hypersep C18 kolumna 100mg	Fisher	60108-302
Koraliki sprzężone z agarozą KL-LA	PTM-Bio	PTM-1404
Laemmli 2X (SDS, bromofenol)	Wisent, J.T. Baker	800-100-CG, D293-01
Mikrorurka o niskim wiązaniu 0,5 mL	Sarstedt	72.704.600
Mikrorurka o niskim wiązaniu 1,5 mL	Thermo Fisher Scientific	P190410
Mikrorurka 1,7 mL	Axygen	MCT-175-C
System HPLC NanoElute	Bruker Daltonics		Rozmiar cząstki 1,9 m, 75 μm średnicy średnicy x 25 cm
Prawidłowe przeciwciało poliklonalne IgG dla królików	Millipore Sigma	12-370
PepSep	Bruker Daltonics	1811112
Sól fizjologiczna z buforem fosforanowym (PBS)	Wisent	311-425-CL
PMSF	Thermo Fisher Scientific	36978
Koktajl inhibitorów proteazy (PIC)	Sigma-Aldrich	P8340-5
Sera-Mag SpeedBeads Białko A/G Magnetyczne Cząstki	Thermo Fisher Scientific	09-981-920
Chlorek sodu	Sigma-Aldrich	S9888-500
Fluorek sodu	Sigma-Aldrich	S1504
Ortowanadat sodu	Sigma-Aldrich	S6508
TimsTOF pro spektrometr mas	Bruker Daltonics
Kwas trifluorooctowy (TFA)	Thermo Fisher Scientific	A116-50
Tris-HCl	Wisent	600-125-IK
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100
Trypsyna (stopień MS)	Pierce	90058
Mocznik	Thermo Fisher Scientific	U15-500
Vaccufuge plus	Eppendorf	22820168
Woda (stopień MS)	VWR	10803-890A
β-glicerofosforan	Sigma-Aldrich	G5422
β-merkaptoetanol	Sigma-Aldrich	M3148