Artykuł metodologiczny

Znakowanie komórek macierzystych barwnikami fluorescencyjnymi do nieinwazyjnego wykrywania za pomocą obrazowania optycznego

DOI:

10.3791/686

⸱

2 kwietnia 2008

 ,  ,  , 
1Contrast Agent Research Group at the Center for Molecular and Functional Imaging, Department of Radiology, University of California San Francisco

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W niniejszym filmie przedstawiono techniki znakowania ludzkich embrionalnych komórek macierzystych oraz mezenchymalnych komórek macierzystych barwnikami fluorescencyjnymi. Technika ta może być wykorzystana do śledzenia in vivo przeszczepionych komórek macierzystych za pomocą obrazowania optycznego oraz do korelacji histopatologicznych z wykorzystaniem mikroskopii fluorescencyjnej.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Obrazowanie optyczne (OI) jest łatwym, szybkim i niedrogim narzędziem do monitorowania in vivo nowych terapii opartych na komórkach macierzystych. Technika ta opiera się na znakowaniu komórek macierzystych ex vivo barwnikiem fluorescencyjnym, a następnie dożylnym wstrzyknięciu znakowanych komórek i wizualizacji ich gromadzenia się w określonych organach docelowych lub obszarach patologicznych. Przedstawiona technika demonstruje sposób znakowania ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych (hMSC) poprzez prostą inkubację z lipofilnym barwnikiem fluorescencyjnym DiD (C67H103CIN2O3S) oraz sposób znakowania ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC) zatwierdzonym przez FDA barwnikiem fluorescencyjnym indocyjaniną zieloną (ICG). Mechanizm pobierania polega na adhezji i dyfuzji lipofilnego barwnika przez dwuwarstwę fosfolipidową błony komórkowej. Efektywność znakowania jest zazwyczaj wyższa, gdy komórki są inkubowane z barwnikiem w mediach bezsurowiczych, w przeciwieństwie do inkubacji w mediach zawierających surowicę. Ponadto dodatek czynnika transfekcyjnego, siarczanu protaminy, znacząco poprawia pobieranie środka kontrastowego.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Znakowanie mezenchymalnych komórek macierzystych fluorescencyjnym barwnikiem DiD

  1. Aby rozpocząć procedurę znakowania mezenchymalnych komórek macierzystych, poddaj komórki trypsynizacji i policz je, aby uzyskać zawiesinę o określonej liczbie komórek.
  2. Wyjmij komórki z inkubatora i odessij starą pożywkę z kolb zawierających komórki przeznaczone do znakowania.
  3. Przemyj komórki 10 ml PBS bez Mg/Ca. Odessij PBS. Mg i Ca hamowałyby działanie trypsyny, dlatego stosuje się PBS pozbawiony tych jonów.
  4. Dodaj uprzednio ogrzaną 0,05% trypsynę; w przypadku kolby T75 stosujemy 5 ml. Upewnij się, że cała powierzchnia kolby jest pokryta roztworem.
  5. Inkubuj w inkubatorze w temperaturze 37°C przez około 5 minut.
  6. Potwierdź odklejenie komórek pod mikroskopem. Jeśli komórki nadal przylegają do kolby, opukaj ją kilka razy i odczekaj nieco dłużej, aż trypsynizacja zakończy się pomyślnie.
  7. Następnie należy zneutralizować trypsynę, dodając pożywkę zawierającą 10% FCS. Stosujemy taką samą ilość pożywki, jaka została użyta dla trypsyny.
  8. Pipetuj roztwór kilka razy w górę i w dół, aby upewnić się, że wszystkie komórki zostały ponownie zawieszone w pożywce.
  9. Przenieś roztwór komórek do sterylnej, zakręcanej probówki polipropylenowej o pojemności 15 ml.
  10. Wiruj przy 400 rcf przez 5 minut.
  11. Odessij nadsącz, uważając, aby nie naruszyć osadu komórkowego.
  12. Resuspenduj komórki w DMEM i przeprowadź liczenie komórek.
  13. Zawieś komórki do znakowania w bezserwatkowej pożywce hodowlanej (DMEM) z gęstością 1x10^6 na ml.
  14. Tym kończy się przygotowanie zawiesiny komórkowej. Teraz można rozpocząć znakowanie.
  15. Najpierw dodaj 5 µL środka kontrastowego DiD na każdy ml zawiesiny komórek.
  16. Następnie wymieszaj roztwór poprzez delikatne pipetowanie.
  17. Inkubuj komórki z roztworem znakującym w temperaturze 37°C przez 20 minut w 6-dołkowej płytce o niskim stopniu adhezji (low-attachment).
  18. Po zakończeniu inkubacji należy przenieść roztwór komórek do zakręcanej probówki polipropylenowej o pojemności 15 ml.
  19. Odwiruj roztwór przy 400 rcf przez 5 minut.
  20. Odessij pożywkę do znakowania, uważając, aby nie naruszyć osadu komórkowego.
  21. Przemyj komórki PBS. Pipetuj komórki w górę i w dół, dbając o rozbicie osadu komórkowego.
  22. Powtórz dwa ostatnie kroki jeszcze dwukrotnie, tak aby łącznie przeprowadzić 3 etapy przemywania.
  23. Policz komórki i wykonaj test z błękitem trypanu w celu określenia żywotności komórek. Są to standardowe protokoły hodowli komórkowych, których tutaj nie będziemy wyjaśniać.
  24. Komórki są teraz gotowe do obrazowania w skanerze optycznym.

Znakowanie ludzkich embrionalnych komórek macierzystych fluorescencyjnym barwnikiem ICG

  1. Aby rozpocząć procedurę znakowania ludzkich embrionalnych komórek macierzystych, należy przygotować środek kontrastowy z zieleni indocyjaninowej. Następnie należy zmieszać go z protaminą, pełniącą rolę czynnika transfekcyjnego.
  2. Odważ 1mg proszku z zieleni indocyjaninowej. Rozpuść proszek ICG w 100 µL dimetylosulfotlenku (DMSO).
  3. Do mieszaniny dodaj 400 µL pożywki DMEM + 10% płodowej surowicy cielęcej (Dulbecco's Modified Eagles Medium) i dokładnie wstrząśnij. Otrzymany roztwór będzie miał końcowe stężenie zieleni indocyjaninowej wynoszące 2mg/ml.
  4. Dodaj protaminę jako czynnik transfekcyjny. Protamina pełni funkcję nośnika dla środka kontrastowego, co pozwala na jego bardziej efektywne wniknięcie do wnętrza komórki.
  5. Zmieszaj 5 µL siarczanu protaminy o stężeniu 10mg/ml z 300 µL ICG oraz 300 µL bezzsurowiczej pożywki DMEM.
  6. Delikatnie wstrząsaj nowym roztworem do transfekcji przez 5 minut, aby umożliwić utworzenie się kompleksów.
  7. Roztwór do znakowania jest gotowy.
  8. Odsącz starą pożywkę z 10mm szalki Petriego z hESC.
  9. Dodaj 5ml uprzednio ogrzanej, bezzsurowiczej pożywki DMEM.
  10. Do komórek dodaj wcześniej przygotowany roztwór protaminy i ICG. Rozpocznij godzinną inkubację, umieszczając szalkę w inkubatorze w temperaturze 37°C.
  11. Po zakończeniu inkubacji wyjmij szalkę z inkubatora i odsącz roztwór do znakowania.
  12. Przepłucz komórki, płucząc szalkę 5 ml PBS.
  13. Odsącz PBS i zastąp go 5ml 0,25% trypsyny. Inkubuj szalkę w temperaturze 37°C przez 5 minut, aby umożliwić zajście trypsynizacji. Warto co jakiś czas lekko wstrząsnąć szalką.
  14. Delikatnie pipetuj roztwór w górę i w dół, aby rozbić pozostałe kolonie.
  15. Zneutralizuj trypsynę, dodając do szalki taką samą ilość KSR.
  16. Przenieś zawiesinę komórkową do probówki 15ml i odwiruj roztwór przy 400 rcf przez 5 minut.
  17. Resuspenduj komórki w pełnej pożywce.
  18. Jeśli na tym etapie wciąż występują agregaty, powtórz proces trypsynizacji i wirowania.
  19. Po uzyskaniu zawiesiny komórkowej wolnej od agregatów, odsącz starą pożywkę i resuspenduj osad w 10ml uprzednio ogrzanej pełnej pożywki dla ESC.
  20. Na tym etapie konieczne jest oddzielenie mysich komórek karmicielskich od hESC. Jest to niezbędne, aby w dalszej kolejności obrazować wyłącznie komórki macierzyste.
  21. W tym celu przenieś zawiesinę komórkową do 10 cm szalki pokrytej żelatyną.
  22. Umieść szalkę w inkubatorze w temperaturze 37°C na 45 minut. W tym czasie należy unikać poruszania szalką.  W ten sposób komórki karmicielskie przywrą do dna szalki, natomiast komórki macierzyste nie.
  23. Przenieś roztwór z szalki Petriego; w ten sposób otrzymujemy roztwór znakowanych pojedynczych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych.
  24. Komórki można teraz policzyć i poddać testowi z błękitem trypanu.
  25. Komórki są gotowe do obrazowania!

 

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

OI jest stosunkowo nową techniką obrazowania, opartą na detekcji fluorescencji. OI jest tak samo czuła jak techniki obrazowania oparte na radiotracerach, ale nie wiąże się z ekspozycją na promieniowanie. OI zapewnia skuteczny sposób nieinwazyjnego i powtarzalnego śledzenia komórek, dostarczając tym samym wiedzy na temat migracji komórek do miejsca docelowego. Jednym z głównych ograniczeń tej techniki jest ograniczona penetracja tkanek przez sondy fluorescencyjne in vivo. W związku z tym akumulacja znacznika w głębokich t...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Projekt ten został wsparty grantem Leon J. Thal SEED z California Institute for Regenerative Medicine. Tobias Henning otrzymał finansowanie w ramach stypendium badawczego z Niemieckiej Społeczności Badawczej (DFG, HE 4578/1-2). Pragniemy z wdzięcznością podziękować Juanito Menesesowi za jego rady dotyczące hodowli ludzkich embrionalnych komórek macierzystych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Zieleń indocyjaninowa (IR-125)OdczynnikFisher ScientificAC41254-1000
DMSOOdczynnikSigma-AldrichD-2650
D-MEM High Glucose OdczynnikSigma-AldrichD5648
ŻelatynaOdczynnikSigma-AldrichG1890Rozcieńczyć do stężenia końcowego 0.1% w PBS
PBS, bez Mg i CaOdczynnikGIBCO, by Life Technologies14190-144
Trypsyna-EDTA 0.05% OdczynnikInvitrogen25300-120
Trypsyna-EDTA 0.25% OdczynnikInvitrogen25200-114
FCS, charakteryzowanaOdczynnikHycloneSH30071.03
Sito do komórek (40 μm Nylon)OdczynnikBD Biosciences352340
DiDOdczynnikMolecular Probes, Life TechnologiesV-22887
Knockout DMEMOdczynnikGIBCO, by Life Technologies10829018
Knockout Serum ReplacerOdczynnikGIBCO, by Life Technologies10828028
b-Merkapto–etanol OdczynnikSigma-Aldrich7522
Niezbędne aminokwasy OdczynnikGIBCO, by Life Technologies11140050
FGF-2OdczynnikR&D Systems233-FB-025
Glutamina 200mM OdczynnikGIBCO, by Life Technologies25030081
Penicylina/StreptomycynaOdczynnikGIBCO, by Life Technologies15140-122
Siarczan protaminyOdczynnikAmerican Pharmaceutical Partners

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Daldrup-Link, H. E., Rudelius, M., Metz, S., Piontek, G., Settles, M., Pichler, B., Heinzmann, U., Weinmann, H. J., Schlegel, J., Link, T. M., Rummeny, E. J., Oostendorp, R. A. J. Stem cell tracking with Gadophrin-2 -- a bifunctional contrast agent for MR imaging, optical imaging and fluorescence microscopy. Eur J Nucl Med Mol Imaging. 31, 1312-1321 (2004).
  2. Simon, G. H., Daldrup-Link, H. E., Kau, J., Metz, S., Schlegel, J., Piontek, G., Saborowski, O., Demos, S., Duyster, J., Pichler, B. J. Optical imaging of experimental arthritis using allogeneic leukocytes labeled with a near-infrared fluorescent probe. Eur J Nucl Med & Mol Imaging. 33, 998-1006 (2006).
  3. Sutton, E., Henning, T., Pichler, B., Bremer, C., Daldrup-Link, H. E. Cell Tracking with Optical imaging. Eur Radiol. 2, 350-357 (2003).
  4. Funovics, M. A., Alencar, H., Su, H. S., Khazaie, K., Weissleder, R., Mahmood, U. Miniaturized multichannel near infrared endoscope for mouse imaging. Mol Imaging. 2, 350-357 (2003).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Znakowanie barwnikiem fluorescencyjnymznakowanie kom rek macierzystychbarwnik DiDziele indocyjaninowasiarczan protaminytest ywotno ci kom rekp ukanie przez wirowaniepo ywka bezsurowiczasito do kom rek

Powiązane artykuły