Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Ustanowienie systemu hodowli wciornastków chili (Scirtothrips dorsalis hood) do badań przesiewowych zjadliwości grzybów entomopatogenicznych

1.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/68600

⸱

18 lipca 2025

 ,  ,  , 
1Master Program in Plant Medicine and Good Agricultural Practice, National Chung Hsing University, 2Department of Entomology, National Chung Hsing University, 3Applied Zoology Division, Taiwan Agricultural Research Institute, 4International Doctoral Program in Agriculture, National Chung Hsing University

W tym artykule

Podsumowanie

Protokół testu biologicznego z oderwanymi liśćmi został opracowany dla masowej hodowli wciornastków chili przy użyciu zmodyfikowanej metody oderwanych liści w szklanych pojemnikach zawierających agar, zapewniając wysoką przeżywalność i zsynchronizowany rozwój. System ten umożliwia skuteczne badania przesiewowe zjadliwości grzybów entomopatogenicznych przeciwko larwom w drugimstadium rozwojowym i zapewnia niezawodne dostarczanie wciornastków do ocen laboratoryjnych, szklarniowych i terenowych.

Streszczenie

Wciornastki chili (Scirtothrips dorsalis Hood) są znaczącym gospodarczo szkodnikiem upraw ozdobnych i spożywczych na Tajwanie. Grzyby entomopatogeniczne (EPF) działają jako przyjazny dla środowiska środek kontroli biologicznej do zwalczania wciornastków. Kluczowe znaczenie ma badanie przesiewowe zjadliwości izolatów EPF przeciwko wciornastkom chili w warunkach laboratoryjnych przed zastosowaniem w terenie. Jednak ograniczone dane na temat metody hodowli wciornastków chili stanowią wyzwanie dla badań laboratoryjnych na dużą skalę. Aby rozwiązać ten problem, opracowaliśmy zmodyfikowaną metodę hodowli laboratoryjnej do masowej produkcji S. dorsalis.

Metoda wykorzystuje system chowu z oderwanymi liśćmi przy użyciu szklanego pojemnika zawierającego agar, który jest odpowiedni do oceny EPF w stosunku do wciornastków chili. Ten zoptymalizowany system testów biologicznych z oderwanymi liśćmi jest odpowiedni do oceny skuteczności EPF przeciwko wciornastkom chili. System jest w stanie wyprodukować dużą liczbę wciornastków na tym samym etapie rozwoju w celu przeprowadzenia badań przesiewowych w kierunku wirulencji. Zgodnie z testem, wynik wykazał, że izolat Cordyceps cateniannulata (Cc-NCHU-213) wykazał najwyższą zjadliwość (53,6%) w stosunku do larw 2. stadium wciornastków chili po 7 dniach od inokulacji (d.p.i.). Co więcej, krążki liściowe osadzone w agarze pozostawały świeże przez ponad 7 dni, co pozwoliło wciornastkom przetrwać (90% wskaźnik przeżycia w przypadku leczenia kontrolnego) przez cały okres obserwacji, co wskazuje na stabilność systemu chowu. Protokół ten demonstruje stabilny system chowu do masowej produkcji i oceny zjadliwości izolatów EPF wobec wciornastków chili, co może być użyteczne dla innych wciornastków, umożliwiając badania przesiewowe potencjalnych izolatów EPF w celu zwalczania wciornastków w terenie.

Wprowadzenie

Wciornastki chili (Scirtothrips dorsalis Hood; Thysanoptera: Thripidae) jest polifagicznym szkodnikiem atakującym ponad 100 gatunków roślin w 40 różnych rodzinach roślin, w tym warzyw oraz roślin ozdobnych i owocowych1. Pochodzi z tropikalnej i subtropikalnej Azji - Azji Południowo-Wschodniej, Indii, Japonii i Tajwanu2. Według naszej wiedzy wciornastki chili są szkodnikami upraw rolnych i ozdobnych, w tym mango, herbaty, jagód i lotosu na Tajwanie. W ciągu ostatnich dwóch dekad wciornastki chili stały się znaczącym szkodnikiem gospodarczym w kilku krajach ze względu na rosnącą globalizację i otwarty handel produktami rolnymi. Dodatkowo wysoki potencjał rozrodczy i zdolności adaptacyjne do nowo zaatakowanych obszarów przyczyniły się do rozprzestrzeniania się tego szkodnika 1,3.

Wciornastki chili żywią się głównie młodymi liśćmi, pędami, płatkami kwiatów i niedojrzałymi owocami, co prowadzi do nekrozy i śmierci tkanek3. Ponadto służą jako wektor różnych chorób roślin, w tym wirusa nekrozy pąków orzeszków ziemnych (GBNV), wirusa chlorotycznej plamistości orzeszków ziemnych (GCFSV), wirusa żółtej plamistości orzeszków ziemnych (GYSV)4 i wirusa smug tytoniu (TSV)5. W rezultacie karmienie wciornastkami chili może znacznie zmniejszyć plony i wartość dotkniętych upraw. Skuteczne zarządzanie wciornastkami chili opiera się na zintegrowanym planie ochrony przed szkodnikami, który wykorzystuje strategie kontroli kulturowej, biologicznej i chemicznej1. Na Tajwanie rolnicy ekologiczni powszechnie stosują materiały niechemiczne, takie jak olej o wąskim zakresie i olej neem, lub metody kontroli biologicznej, w tym stosowanie drapieżnych roztoczy i drobnych robaków pirackich (na podstawie osobistej obserwacji). Jednak na podstawie informacji zwrotnych od rolników można stwierdzić, że stosowanie tych olejków w okresie kwitnienia i owocowania może zakłócać zapylanie i uszkadzać pyłek, prowadząc do zmniejszenia plonów i wartości ekonomicznej. W związku z tym opracowanie skutecznych alternatywnych środków zwalczania wciornastków chili ma kluczowe znaczenie dla rolników ekologicznych.

Grzyby entomopatogeniczne (EPF) to grupa grzybów zabijających owady, które okazały się skuteczną i zrównoważoną techniką zwalczania szkodników 6,7,8. Kilka badań wykazało skuteczność EPF przeciwko wciornastkom chili. Komercyjne EPF, Beauveria bassiana GHA (BotaniGard_ES) i Metarhizium brunneum F52 (Met-52 EC), wykazały znaczną kontrolę wciornastków chili na roślinach róży 9,10. Populacje wciornastków chili na roślinach papryki mogą być również redukowane przez Cordyceps javanica (= Isaria fumosorosea)11. Inne EPF, takie jak Lecanicillium lecanii i Purpureocillium lilacinum, zostały przetestowane przeciwko wciornastkom chili w różnych uprawach, w tym w roślinach chili i herbacie, i były skuteczne w zwalczaniu tego szkodnika12,13.

Niektóre wcześniejsze badania oceniające skuteczność EPF w zwalczaniu wciornastków w szklarniach lub na polu zostały przeprowadzone bez uprzedniego badania przesiewowego pod kątem najskuteczniejszych gatunków/szczepów EPF, co ograniczyło ich skuteczność. Staranne badania przesiewowe EPF mogą znacznie poprawić ochronę przed szkodnikami. W wielu badaniach hodowano wciornastki do testów biologicznych na nienaruszonych roślinach w klatkach11,14. Chociaż nienaruszony system hodowli roślin zapewnia bardziej naturalne środowisko dla wciornastków, stanowią one wyzwanie w zarządzaniu różnymi etapami rozwoju, ponieważ wciornastki wykazują różne zachowania na każdym etapie. Zmienność ta może komplikować wybór docelowych etapów do określonych celów eksperymentalnych. Ponadto warunki glebowe w nienaruszonym systemie chowu roślin mogą wpływać na przepoczwarzanie i eklozację wciornastków chili, zmniejszając w ten sposób liczbę osobników dostępnych do kolejnych testów biologicznych15, ograniczając zasoby do dalszych testów biologicznych. Ponadto systemy hodowli całych roślin wymagają więcej miejsca i ciągłej pielęgnacji roślin, ponieważ rośliny zestresowane mogą zmieniać zachowanie wciornastków i mogą być bardziej czasochłonne i zasobożerne. Istnieje niewiele doniesień o systemach hodowli wciornastków opartych na nieożywionym materiale roślinnym (np. oderwanej tkance roślinnej lub sztucznej diecie) do laboratoryjnych testów biologicznych, ale szczegóły tych metod były często niejasne lub pomijane 12,16.

Badanie to miało na celu opracowanie prostego, opłacalnego i zrównoważonego systemu masowej hodowli wciornastków chili w warunkach laboratoryjnych. W protokole tym zmodyfikowano metodę hodowli krążkówliściowych 7 , aby zapewnić bardziej wydajne i kontrolowane podejście do masowej hodowli wciornastków, umożliwiając precyzyjny wybór etapów rozwojowych do testów biologicznych poprzez ścisłą kontrolę warunków środowiskowych. Ponadto opracowano stabilny i powtarzalny system testów biologicznych do oceny zjadliwości izolatów grzybów entomopatogenicznych (EPF) na podstawie 50% czasu letalnego (LT50) i 50% mediany stężenia śmiertelnego (LC50), które odnoszą się do szacowanego czasu przy określonej dawce oraz stężenia zawiesiny grzybów wymaganego do spowodowania 50% śmiertelności wciornastków chili. odpowiednio. Dzięki zastosowaniu tej metody można prawidłowo zidentyfikować wciornastki zebrane w terenie, a stabilne kolonie laboratoryjne wciornastków można utrzymać w celu przetestowania skuteczności różnych izolatów grzybów przy użyciu łatwiejszej i bardziej powtarzalnej metodologii.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

UWAGA: Pełny eksperymentalny schemat blokowy pokazano na rysunku 1.

1. Zbieranie polowe wciornastków chili i utrzymanie kolonii

  1. Kolekcja wciornastków chili
    1. Zbadaj wzrokowo obie strony liści i wewnątrz kwiatów pod kątem poczęstunku wciornastków chili na roślinach borówki na dotkniętej farmie borówek.
    2. Należy zapisać szczegółowe informacje o każdej próbce (np. część rośliny i stopień porażenia) i potwierdzić praktyki produkcyjne z rolnikami, takie jak rolnictwo konwencjonalne lub rolnictwo ekologiczne, w tym stosowanie oleju mineralnego i wrogów naturalnych.
    3. Pokrój liście i kwiaty zaatakowane przez wciornastki chili i przenieś je do plastikowej torby z zamkiem błyskawicznym (tabela materiałów), a następnie zamknij worek z zamkiem błyskawicznym z odrobiną powietrza w środku, aby utrzymać wciornastki przy życiu. Przynieś próbkę do laboratorium w ciągu 3 godzin.
      UWAGA: Próbkę należy umieścić w chłodziarce, gdy czas pobrania w terenie jest dłuższy niż 3 godziny.
    4. Przygotuj szklany pojemnik do hodowli (35 mm wysokości, 45 mm średnicy wewnętrznej), umieść trzy warstwy okrągłego ręcznika papierowego (o średnicy 40 mm) na dnie szklanego pojemnika do hodowli, a następnie dodaj 8-10 kropli (400-500 μl) przefiltrowanej wody (rysunek 1 i tabela materiałów).
    5. Zbierz młody, czerwony liść mango z pól mango (ryc. 1). Umyj liść i sprawdź pod mikroskopem optycznym (tabela materiałów) pod kątem jaj owadów lub innego zanieczyszczenia owadami przed przygotowaniem szklanego pojemnika do hodowli. Pokrój liść mango nożem do skóry (Tabela materiałów) w okrągły krążek (40 mm) i połóż go na mokrym ręczniku papierowym.
      UWAGA: Liście mango są bardziej stabilnymi zasobami do karmienia wciornastków niż młode liście borówki, które rosną tylko sezonowo.
    6. Obserwuj wciornastki chili pod mikroskopem optycznym w 10-krotnym powiększeniu i przenieś 10 dorosłych wciornastków (pięć samców i pięć samic) za pomocą cienkiego pędzla malarskiego (Tabela materiałów) do szklanego pojemnika do hodowli.
    7. Uszczelnij każdy szklany pojemnik do hodowli dwiema warstwami parafilmu (Tabela materiałów) i wykonaj około 40 małych otworów za pomocą szpilki przeciw owadom #00 do wentylacji (Tabela materiałów).
    8. Przechowywać szklany pojemnik do hodowli w inkubatorze w temperaturze 25 ± 1 °C, ~ 70% wilgotności względnej z fotoperiodem światło: ciemny (L: D) = 12 godzin: 12 godzin (tabela materiałów).
    9. Dorosłe osobniki usunąć za pomocą pędzla po 48 godzinach.
      UWAGA: Z naszych obserwacji wynika, że samice wciornastków składają jaja ~2 dni po przeniesieniu do szklanego pojemnika do hodowli.
    10. Obserwuj tkanki liści z jajami pod mikroskopem stereoskopowym, aby dodatkowo potwierdzić złożenie jaj (ryc. 1 i tabela materiałów). Umieść świeży krążek z liści mango na liściu z jajkami i dodaj 8-10 kropli przefiltrowanej wody na ręcznik papierowy, aby utrzymać wilgotność.
  2. Utrzymanie populacji wciornastków chili
    UWAGA: Z jaj wykluwają się 1 larwyw wieku dojrzałym po ~5-7 dniach.
    1. Bezpośrednio przenieść liść zawierający 1 larwyw stadium rozwojowym do nowego szklanego pojemnika do hodowli.
      UWAGA: Za pomocą pędzla delikatnie przenieś 1 larwyw stadium rozwojowym do nowego szklanego pojemnika do hodowli, unikając zanieczyszczenia zgniłym i nieoczekiwanym wzrostem grzybów na liściach mango. Z naszych obserwacji wynika, że dorosła samica składa średnio 6 jaj dziennie.
    2. Codziennie obserwuj wciornastki chili. Dodawaj 8-10 kropli przefiltrowanej wody co 4 dni do ręcznika papierowego. Dodawaj świeży krążek z liści mango do pojemnika co 4 dni, zanim stary liść wyschnie.
      UWAGA: 1 larwyw stadium rozwojowym pojawiają się w postaci dorosłej w ciągu ~ 7-10 dni, w zależności od czynników środowiskowych, takich jak temperatura i wilgotność.
    3. Obserwuj populację wciornastków chili codziennie, aż wciornastki rozwiną się w dorosłe osobniki, i powtórz kroki z kroku 1.1.4 w celu długoterminowego utrzymania populacji.
  3. Masowy chów wciornastków chili
    1. Zbierz dorosłe samice z utrzymywanej populacji i przygotuj szklany pojemnik do hodowli w oparciu o powyższe kroki.
    2. Przenieś 10 dorosłych samic do pojemnika i postępuj zgodnie z krokami od 1.1.4 do 1.1.10, aby uzyskać liść z jajami.
      UWAGA: Dorosła samica składa średnio 6 jaj dziennie.
    3. Delikatnie przenieś ~120 larw 1st instar do nowego szklanego pojemnika do hodowli za pomocą pędzla.
    4. Codziennie obserwuj wciornastki chili. Dodawaj 8-10 kropli przefiltrowanej wody na ręcznik papierowy co 4 dni. Dodawaj świeży krążek z liści mango do pojemnika co 4 dni, zanim stary liść wyschnie.
    5. Zbierz 1 larwyw stadium rozwojowym po 5-7 dniach od złożenia jaj; zebrać 2 larwyw stadium rozwojowym po 7-10 dniach; zebrać dorosłe osoby po ~ 14 dniach do testu biologicznego (ryc. 2).
      UWAGA: Obserwuj morfologię, aby rozróżnić różne stadia wciornastków chili do dalszych eksperymentów (ryc. 2).

2. Identyfikacja molekularna wciornastków chili

UWAGA: Wciornastki zebrane z pola muszą być zidentyfikowane na poziomie gatunku poprzez identyfikację molekularną przy użyciu fragmentu genu mitochondrialnej oksydazy cytochromowej I (COI), powszechnie stosowanego markera dla wciornastków chili 17,18.

  1. Ekstrakcja genomowego DNA wciornastków chili
    1. Zbierz jeden dorosły wciornastek chili w probówce wirówkowej o pojemności 1,5 ml (tabela materiałów).
    2. Homogenizuj wciornastki chili za pomocą tłuczka do granulek, a następnie wyizoluj genomowe DNA za pomocą zestawu handlowego zgodnie z protokołem producenta (tabela materiałów).
  2. Amplifikacja PCR i sekwencjonowanie DNA
    1. Amplifikuj oczekiwany fragment DNA wciornastków chili za pomocą PCR Master Mix (2x) z parą starterów COI, starterem do przodu LCO 1490 i starterem odwrotnym HCO 2198, który amplifikuje częściowy mitochondrialny gen COI (tabela materiałów).
      1. Przygotować mieszaninę 20 μl PCR zawierającą 2 μl matrycy genomowego DNA wciornastka, po 1 μl starterów do przodu i do tyłu, 10 μl 2x PCR Master Mix i 6 μl ddH2O (tabela materiałów).
      2. Przeprowadzić PCR za pomocą termocyklera w następujących warunkach cyklicznych: początkowa denaturacja w temperaturze 94 °C przez 2 minuty, 35 cykli w temperaturze 94 °C przez 30 s, 52 °C przez 1 minutę, 72 °C przez 1 minutę, a następnie końcowe przedłużenie temperatury 72 °C przez 10 minut (tabela materiałów).
    2. Sprawdź amplikon PCR za pomocą elektroforezy w 1% żelu agarozowym, aby zweryfikować wynik amplifikacji (ryc. 3).
    3. Wyciąć pasmo docelowe (oczekiwany rozmiar amplikonu wynosił 658 pz) i oczyścić amplikon COI PCR wciornastków chili za pomocą zestawu do oczyszczania Gel/PCR zgodnie z protokołem producenta. Wyślij oczyszczony produkt do sekwencjonowania za pośrednictwem komercyjnej usługi sekwencjonowania. (Tabela materiałów).
  3. Analiza sekwencji
    1. Oceń jakość sekwencji za pomocą przywołanego oprogramowania (Tabela materiałów).
    2. Otwarcie pliku FASTA lub TXT i ręczne przycięcie podstaw niskiej jakości zarówno na końcach 5′, jak i 3′ poprzez usunięcie niepożądanych sekwencji.
    3. Przeprowadź wyszukiwanie BLAST w bazie danych NCBI (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) przy użyciu parametrów domyślnych, aby potwierdzić tożsamość gatunku.

3. Przygotowanie grzybów entomopatogenicznych

UWAGA: Izolaty EPF użyte w tym badaniu są wymienione w Tabeli 1.

  1. Odzyskiwanie izolatów grzybów z biblioteki zasobów grzybów
    1. Rozmrozić zakonserwowany wywar z konidiów grzybowych (konidia zawieszone w 30% glicerynie) w zamrażarce o temperaturze -80 °C.
    2. Przenieść około 10 μl zawiesiny konidiów i równomiernie rozprowadzić na 5,5 cm płytce z agarem dekstrozowym Sabouraud (SDA) o średnicy 1/4 za pomocą rozsiewacza komórek w okapie z przepływem laminarnym. Pożywkę przygotowuje się przez zmieszanie 0,75 g bulionu dekstrozowego Sabouraud i 1,5 g agaru w 100 ml podwójnie destylowanej wody (ddH2O) (tabela materiałów).
    3. Uszczelnić szalkę Petriego parafilmem (tabela materiałów) i przenieść płytkę do inkubatora ciemności w temperaturze 25 °C na 10-14 dni.
    4. Subkulturuj aktywnie rosnącą grzybnię grzybów, rozsiewając smugi na świeżej płytce z 1/4 agaru z dekstrozy Sabouraud (SDA). Inkubować grzyby w ciemności w temperaturze 25 °C przez 10-14 dni, aby umożliwić rozwój konidiów przed zbiorem.
      UWAGA: Do kolejnych testów biologicznych należy używać kultur grzybów, które mają około 10 dni. Kultury starsze niż 14 dni nie są zalecane do badania wirulencji ze względu na potencjalne zmniejszenie żywotności konidiów.
  2. Przygotowanie zawiesiny konidiów
    1. Dodaj 2-3 ml 0,03% Tween 80 na powierzchnię 10-14-dniowej kultury grzybów na 1/4 SDA. Delikatnie zeskrob konidia za pomocą sterylnej pętli (Tabela materiałów).
    2. Przenieść zawiesinę grzybów do czystej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml.
    3. Homogenizuj zawiesinę przez wirowanie z maksymalną prędkością i przefiltruj ją przez bibułę filtracyjną, aby usunąć resztki strzępek i uzyskać czystą zawiesinę konidiów.
    4. Za pomocą hemocytometru (tabela materiałów) sprawdzić liczbę konidiów pod mikroskopem świetlnym i rozcieńczyć zawiesinę do 108 konidiów/ml.
    5. Przenieś zawiesinę konidialną do mikroopryskiwacza wysterylizowanego światłem UV w celu późniejszego zastosowania testu biologicznego.
      UWAGA: Upewnij się, że zawiesina konidialna jest dokładnie zawirowana przed każdym transferem, aby uniknąć osiadania. Przed użyciem wysterylizuj mikroopryskiwacz, wystawiając go na działanie promieniowania ultrafioletowego przez 30 minut w okapie z przepływem laminarnym.

4. Badania przesiewowe pod kątem wirulencji przeciwko wciornastkom chili

  1. Przygotowanie 2larw w stadium rozwojowym
    1. Zebrać 2. larwyw stadium rozwojowym, wykonując kroki 1.3.1-1.3.5 dla następnego eksperymentu.
      UWAGA: Rozróżnij larwy w drugimstadium rozwojowym po żółtym kolorze ciała i szerokim odwłoku w porównaniu z larwami w pierwszym stadium rozwojowym (ryc. 2).
  2. Przygotowanie pojemnika do zaszczepiania
    UWAGA: Wybierz gatunki liści na podstawie docelowej uprawy wciornastków chili. W niniejszej pracy wciornastki chili zebrano z pola porażonych liści borówki 'Biloxi' (V. corymbosum L. × V. darrowii Camp). W związku z tym test biologiczny EPF przeciwko wciornastkom chili zostanie przeprowadzony na liściach borówki.
    1. Zbierz młode liście borówki z farmy borówek i umyj liście borówki, aby usunąć kurz powierzchniowy i wszelkie inne stawonogi, jeśli są obecne.
    2. Wysuszyć liście na powietrzu lub użyć ręczników papierowych, aby wytrzeć wodę; Następnie sprawdź powierzchnię liści borówki pod kątem innych stawonogów lub jaj pod mikroskopem stereoskopowym. Usuń wszystkie stawonogi, jeśli są obecne.
    3. Wytnij krążek liściowy o średnicy 2,8 cm za pomocą noża do skór (Tabela materiałów), zdezynfekuj liść za pomocą 1% wybielacza (roztwór podchlorynu sodu) i spłucz 2x wysterylizowaną wodą, aby usunąć wszelkie pozostałości wybielacza z liści.
      UWAGA: Przygotuj krążek liściowy przed zestaleniem się agaru, aby upewnić się, że krążek liściowy może być prawidłowo osadzony w agarze wodnym.
    4. Autoklawuj 2,5% wodny roztwór agaru (2,5 g agaru na 100 ml ddH2O) do sterylizacji.
    5. Wlej 3 ml 2,5% agaru wodnego do małych szklanych pojemników (35 mm wysokości, 30 mm średnicy wewnętrznej) do okapu z przepływem laminarnym, zanim agar zastygnie. Pozostawić agar do ostygnięcia do temperatury około 40 °C, aż osiągnie stan półstały.
    6. Delikatnie umieść krążek liściowy (adaksjalną stroną do góry) na agarze , lekko go osadzając z minimalną ekspozycją powyżej powierzchni agaru. Gdy agar wodny całkowicie zastygnie, szklane pojemniki są gotowe do testu biologicznego.
  3. Inokulacja i obserwacja EPF
    1. Przed aplikacją dokładnie zmieszać zawiesinę konidialną. Za pomocą mikrorozpylacza równomiernie nanieść 0,1 ml zawiesiny (przygotowanej w kroku 3.2.4) na powierzchnię każdej krążki liściowej z odległości około 10 cm wewnątrz szklanego pojemnika.
      UWAGA: Przetestuj obszary natryskiwania przed eksperymentem. Upewnij się, że oprysk równomiernie pokrywa całą tarczę liściową cienką warstwą. Jeśli kropelki gromadzą się w stojącej wodzie na liściu, zmniejsz objętość inokulacji, aby uniknąć nadmiernego zwilżenia.
    2. Zawiesinę konidiów suszyć na powietrzu na liściu przez 30 minut w sterylnych warunkach (np. w kapturze z przepływem laminarnym).
    3. Przenieść 10 z 2 larww drugim stadium rozwojowym do każdego pojemnika za pomocą cienkiego pędzla i zamknąć każdy szklany pojemnik do hodowli dwiema warstwami parafilmu.
    4. Wykonaj ~ 30 małych otworów za pomocą szpilki do owadów #00 (tabela materiałów) do wentylacji.
    5. Zaszczepić pojemnik w inkubatorze o temperaturze 25 ± °C wilgotnością względną ~70% i fotoperiodem L:D = 12 h: 12 h.
    6. Obserwuj i rejestruj śmiertelność wciornastków chili pod mikroskopem stereoskopowym przy 10-krotnym powiększeniu dziennie przez 7 dni.
    7. Martwe larwy należy przechowywać w szklanym pojemniku w celu obserwacji grzybicy w celu potwierdzenia zakażenia EPF.

5. Test biologiczny wybranych izolatów EPF

UWAGA: Do zależnego od dawki testu biologicznego przeciwko wciornastkom chili można wybrać najbardziej zjadliwy izolat EPF lub kilka izolatów o wysokiej zjadliwości. Do oceny zależności między dawką a chorobotwórczością wykorzystano trzy różne stężenia konidiów, w zakresie od 106 do 108 konidiów/ml.

  1. Przygotowanie zawiesiny konidiów
    1. Odzyskaj wybrany izolat EPF, wykonując krok 3.1.
    2. Przygotować trzy stężenia zawiesin konidiów (106, 107 i 108 konidiów/ml) zgodnie z opisem w kroku 3.2.
  2. Przygotowanie 2larw w stadium rozwojowym
    1. Zbierz larwy w drugim stadium rozwojowym, wykonując krok 4.1, aby uzyskać nowo pojawiające się dorosłe osobniki.
  3. Przygotowanie pojemnika do zaszczepiania
    1. Wykonaj krok 4.2. Przygotowanie pojemnika do zaszczepiania zawierającego krążki z liści borówki amerykańskiej zanurzone w agarze wodnym.
  4. Inokulacja i obserwacja EPF
    1. Przeprowadzić inokulację EPF trzema stężeniami zawiesiny konidiów, jak opisano w kroku 4.3.

6. Analiza statystyczna

  1. Obliczanie śmiertelności
    1. Przekształć dane dotyczące śmiertelności każdego szczepu grzyba za pomocą transformacji Arcsin przed przeprowadzeniem jednokierunkowej analizy wariancji (ANOVA) w celu oceny różnic między leczeniem grzybami (poziom istotności ustalony jako p < 0,05).
    2. Wykonaj porównania post hoc średnich leczenia za pomocą testu Tukey's Honest Significant Difference (HSD).
  2. Obliczanie mediany czasu letalnego (LT50) i mediany stężenia śmiertelnego (LC50)
    1. Oblicz medianę czasu letalnego (LT50) i medianę stężenia śmiertelnego (LC50) za pomocą analizy regresji Probit.
    2. Utwórz i wypełnij zmienne o nazwach "całkowita", "odpowiedź" i "czas trwania" (dla LT50) lub "stężenie" (dla LC50) obserwowanymi danymi w interfejsie oprogramowania.
      UWAGA: Jeśli skumulowana śmiertelność nie przekroczy 50% w okresie obserwacji, nie można wiarygodnie oszacować wartości LT50 i/lub LC50.
    3. Wykonaj analizę Probit, przechodząc do opcji Analizuj | Regresja | Probit. Ustaw "całkowitą" jako całkowitą liczbę badanych owadów, "odpowiedź" jako liczbę martwych owadów, a "czas trwania" lub "stężenie" jako współzmienną. Ustaw poziom istotności współczynnika heterogeniczności na 0,05, naciskając przycisk Opcje i ustawiając Poziom istotności dla użycia współczynnika heterogeniczności na 0,05.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Schemat doświadczalny przedstawiony w niniejszym badaniu wykazał, że możliwe jest ustanowienie stabilnego systemu hodowli tripsów paprykowych, począwszy od zbioru w terenie, aż po badanie zjadliwości izolatów EPF (Rycina 1). Choć obserwacje morfologiczne pozwalają odróżnić tripsy paprykowe od innych tripsów kwiatowych, zastosowanie częściowej sekwencji COI jako markera molekularnego, w tym analiza wielkości amplikonu PCR oraz sekwencjonowanie COI, pozwala na ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Wciornastki chili to szkodnik o znaczeniu globalnym, atakujący wiele ważnych gospodarczo upraw, takich jak kukurydza, orzeszki ziemne, papryka, soja, truskawki, słodkie ziemniaki i pomidory 1,11,19. Obecne strategie kontroli opierają się na zintegrowanych podejściach obejmujących praktyki kulturowe, środki kontroli biologicznej i zabiegi chemiczne, w tym wykorzystanie naturalnych wrogów, nicieni i EPF 11,14,20,21.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują, że w tej pracy nie występuje konflikt interesów.

Podziękowania

Szczególne podziękowania kierujemy do Pana Lin, Huanf-Jen z farmy borówki Humi (Wufeng Dist., Taichung City), który dostarczył sadzonki borówki. Badania te były wspierane przez 113-2313-B-005 -024 -MY3 z Narodowej Rady Nauki i Technologii (NSTC).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
#00 Przypinka do owadówEntosphinx DMM0220Wyprodukowano w Wielkiej Brytanii
Probówka wirówkowa 1,5 mlKorporacja CorningMCT-175-CWyprodukowano w USA
10 μ L Pętla zaszczepiającaNEST Naukowy718201Wyprodukowano w USA
100 pz Drabina DNA IIIGeneaid (Pomoc genowa)Zobacz materiał DL007Wyprodukowano na Tajwanie.
2x SuperRed PCR Master MixNarzędzia biologiczneTE-SR01Wyprodukowano na Tajwanie
Szalka Petriego 6 cmAlpha Plus Naukowy16021Wyprodukowano na Tajwanie
agarBioman NaukowyAGR001.1Klasa mikrobiologiczna
AgarozyBioman NaukowyZobacz materiał PB1200Wyprodukowano na Tajwanie
BioGreen Bezpieczny bufor żelowy DNABioman NaukowySDB001TWyprodukowano na Tajwanie
Łatwy zestaw do szybkiej ekstrakcji tkanek DNAFisher BiotecET-100https://www.fisherbiotec.com.au/wp-content/uploads/2021/11/FB-EDNA-DNA-Kits-flyer-11Nov21.pdf (wyprodukowano w Australii)
Podkład do przodu: LCO 1490Genomika PO-PR220919G6Sekwencja: 5'-GGT CAA CAA ATC ATA AAG ATA TTG G-3'
GenepHlow Żel/zestaw PCRGeneaid (Pomoc genowa)Zobacz materiał DFH300http://www.protech-bio.com/UserFiles/file/Gene-Spin%20Genomic%20DNA%20Kit.pdf
szklany pojemnik do hodowli Firma Sunshine Lab EquipmentRozmiar: 35 mm wysokości, 45 mm średnicy wewnętrznej. Może być repalowany przez dowolny podobny rozmiar plastikowego lub szklanego kubka.
hemocytometrPaweł Marienfeld640030Wyprodukowano w Niemczech
inkubatorCześćZobacz materiał F740Wyprodukowano na Tajwanie
nóż do skóryPrawdziwy warsztat rękodziełahttps://shopee.tw/jj891004? categoryId=100636& entryPoint=ShopByPDP& itemId=16023929406
Cykler termiczny MiniAmpThermo Fisher NaukowyA37834 (wersja angielska)Wyprodukowano w USA
mikroskop optyczny Nikon  Ci-LWyprodukowano w Japonii
pędzel do malowaniaFirma szczotkowa Tian Cheng4716608400352Można go zastąpić pędzlem akwarelowym z cienką końcówką, odpowiadającym okrągłemu pędzlowi o rozmiarze 0 lub 1.
ręcznik papierowymoże kwitnąćBLS007-8Wyprodukowano na Tajwanie
Parafilm MBemisPM-996 (wersja angielska)Wyprodukowano w USA
Tłuczek na peletyBioman NaukowyGT100RWyprodukowano na Tajwanie
Podkład odwrotny: HCO 2198Genomika PO-PR220919G6Sekwencja: 5'-TAA ACT TCA GGG TGA CCA AAA AAT CA-3'
Rosół z dekstrozy SabouraudHiMediaZobacz materiał MH033-500GWyprodukowano w Indiach
mikroskop stereoskopowySoptop (Na górę)SZN71 powiedział:Wyprodukowano na Tajwanie
Bufor TAE 50XBioman NaukowyTAE501000Wyprodukowano na Tajwanie
Animacja 80PanReac AppliChem142050.1661Wyprodukowano na Tajwanie
torba na zamek błyskawicznyFirma z tworzyw sztucznych Wenchen1809000061Rozmiar: 12 cm szerokości i 17 centymetrów długości. (Wyprodukowano na Tajwanie)

Bibliografia

  1. Kumar, V., Kakkar, G., McKenzie, C. L., Seal, D. R., Osborne, L. S. Weed and pest control-conventional and new challenges. , 53-77 (2013).
  2. Hoddle, M. Scirtothrips dorsalis (chilli thrips). CABI Compendium. , Wallingford, CT, USA. (2022).
  3. Liburd, O. E., Panthi, B. R., Phillips, D. A. Chilli thrips on blueberries in Florida: ENY2053/IN1298. EDIS. 2020 (6), (2020).
  4. Gopal, K., Krishna Reddy, M., Reddy, M., Muniyappa, V. Transmission of peanut yellow spot virus (PYSV) by thrips, Scirtothrips dorsalis Hood in groundnut. Arch Phytopathol Plant Prot. 43 (5), 421-429 (2010).
  5. Prasada Rao, R., et al. The host range of tobacco streak virus in India and transmission by thrips. Ann Appl Biol. 142 (3), 365-368 (2003).
  6. Chang, J. C., et al. Construction and selection of an entomopathogenic fungal library from soil samples for controlling Spodoptera litura. Front Sustain Food Syst. 5, 596316(2021).
  7. Yang, C. J., Nai, Y. S. Assessment of aphidicidal effect of entomopathogenic fungi against mustard aphid, Lipaphis erysimi (Kalt.). J Vis Exp. (197), e65312(2023).
  8. Liu, Y. C., et al. Isolation and selection of entomopathogenic fungi from soil samples and evaluation of fungal virulence against insect pests. J Vis Exp. (175), e62882(2021).
  9. Aristizábal, L., Chen, Y., Cherry, R., Cave, R., Arthurs, S. Efficacy of biorational insecticides against chilli thrips, Scirtothrips dorsalis (Thysanoptera: Thripidae), infesting roses under nursery conditions. J Appl Entomol. 141 (4), 274-284 (2017).
  10. Francis, J. R., Manchegowda, H. K. Molecular phylogenetic identification of Metarhizium and Beauveria and their bio-efficacy against chilli thrips, Scirtothrips dorsalis. Int J Trop Insect Sci. 43 (3), 909-918 (2023).
  11. Arthurs, S. P., Aristizábal, L. F., Avery, P. B. Evaluation of entomopathogenic fungi against chilli thrips, Scirtothrips dorsalis. J Insect Sci. 13 (1), 31(2013).
  12. Subramaniam, M. S. R., Babu, A., Deka, B. Lecanicillium lecanii (Zimmermann) Zare & Gams as an efficient biocontrol agent of tea thrips, Scirtothrips bispinosus Bagnall (Thysanoptera: Thripidae). Egypt J Biol Pest Control. 31, 1-14 (2021).
  13. Panyasiri, C., et al. Control efficacy of Purpureocillium lilacinum against chilli thrips (Scirtothrips dorsalis) on chili plant. Insects. 13 (8), 684(2022).
  14. Perera, M., Senanayake, N., Dissanayake, D. Evaluation of Amblyseius swirskii (predatory mite) and Orius laevigatus as biological control agents of chilli thrips (Scirtothrips dorsalis). Ceylon J Sci. 50 (4), 541(2021).
  15. Han, D., et al. Effect of pupation environment on pupal development and eclosion of chilli thrips (Thysanoptera: Thripidae). Environ Entomol. 54 (1), 223-230 (2025).
  16. Tatara, A. Effect of temperature and host plant on the development, fertility and longevity of Scirtothrips dorsalis Hood (Thysanoptera: Thripidae). Appl Entomol Zool. 29 (1), 31-37 (1994).
  17. Kumar, V., Seal, D. R., Osborne, L. S., McKenzie, C. L. Coupling scanning electron microscopy with DNA barcoding: a novel approach for thrips identification. Appl Entomol Zool. 49, 403-409 (2014).
  18. Silva, R., et al. Seasonal abundance of cotton thrips (Thysanoptera: Thripidae) across crop and non-crop vegetation in an Australian cotton-producing region. Agric Ecosyst Environ. 256, 226-238 (2018).
  19. Venette, R., Davis, E. Chilli thrips/yellow thrips, Scirtothrips dorsalis Hood (Thysanoptera: Thripidae) mini pest risk assessment. , Univ Minnesota Tech Bull. (2004).
  20. Mandi, N., Senapati, A. Integration of chemical, botanical and microbial insecticides for control of thrips, Scirtothrips dorsalis Hood infesting chilli. J Plant Prot Sci. 1 (1), 92-95 (2009).
  21. Samota, R., Jat, B., Choudhary, M. D. Efficacy of newer insecticides and biopesticides against thrips, Scirtothrips dorsalis Hood in chilli. J Pharmacogn Phytochem. 6 (4), 1458-1462 (2017).
  22. Panthi, B. R., Renkema, J. M., Lahiri, S., Liburd, O. E. The short-range movement of Scirtothrips dorsalis (Thysanoptera: Thripidae) and rate of spread of feeding injury among strawberry plants. Environ Entomol. 50 (1), 12-18 (2021).
  23. Priyanka, T., et al. Biology and morphometrics of Thrips parvispinus (Karny) (Thysanoptera: Thripidae) on chilli, Capsicum annuum L. Pest Manag Hortic Ecosyst. 30 (1), 85-92 (2024).
  24. Hemalatha, S., Ramaraju, K., Jeyarani, S. Evaluation of entomopathogenic fungi and delivery methods for management of thrips in chillies. Int J Veg Sci. 23 (3), 246-259 (2017).
  25. Xu, X. M., Guerin, L., Robinson, J. Effects of temperature and relative humidity on conidial germination and viability, colonization and sporulation of Monilinia fructigena. Plant Pathol. 50 (5), 561-568 (2001).
  26. Lee, S. J., et al. Transcriptional response of bean bug (Riptortus pedestris) upon infection with entomopathogenic fungus, Beauveria bassiana JEF-007. Pest Manag Sci. 75 (2), 333-345 (2019).
  27. Yang, Y. -T., et al. Up-regulation of carbon metabolism-related glyoxylate cycle and toxin production in Beauveria bassiana JEF-007 during infection of bean bug, Riptortus pedestris (Hemiptera: Alydidae). Fungal Biol. 120 (10), 1236-1248 (2016).
  28. Qayyum, M. A., et al. Entomopathogenic fungi: prospects and challenges. Entomopathogenic Fungi: Prospects and Challenges. , 57-79 (2024).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Bioassay na odci tych li ciachmasowa produkcjakontrola biologicznahodowla laboratoryjnaizolaty grzyb w
Ustanowienie systemu hodowli wciornastków chili (Scirtothrips dorsalis hood) do badań przesiewowych zjadliwości grzybów entomopatogenicznych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.