Protokół ten opisuje system mocowania głowicy ultradźwiękowej specjalnie zaprojektowany do stymulacji ultradźwiękowej rdzenia kręgowego u obudzonych myszy. Metoda wykorzystuje system fiksacji, aby zapewnić dokładne ustawienie przetwornika ultradźwiękowego, jednocześnie umożliwiając uczestnikom eksperymentu swobodne poruszanie się bez uszczerbku dla precyzji stymulacji.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Mocowanie przetworników ultradźwiękowych do neuromodulacji rdzenia kręgowego u myszy
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Zogniskowane ultradźwięki (FUS) stały się innowacyjną nieinwazyjną technologią neuromodulacji, wykazującą znaczny potencjał w zakresie regulacji neuronalnej rdzenia kręgowego. Jednak osiągnięcie stabilnego mocowania przetwornika wzdłuż kręgosłupa stanowi poważne wyzwanie techniczne. Istniejące metody unieruchomienia często wymagają długotrwałego znieczulenia zwierząt lub wykazują niewystarczającą niezawodność adhezji. Te krytyczne ograniczenia podkreślają pilną potrzebę opracowania nowego paradygmatu fiksacji, który zapewni zarówno stabilność operacyjną, jak i kompatybilność fizjologiczną. Protokół ten wprowadza innowacyjny system mocowania przetwornika ultradźwiękowego do stymulacji rdzenia kręgowego u obudzonych, swobodnie poruszających się myszy. Opracowanie niezawodnej metody precyzyjnego umieszczania głowicy ultradźwiękowej w kręgosłupie ma kluczowe znaczenie dla eksperymentów neurostymulacyjnych. Metoda ta łączy w sobie trzy fazy: chirurgiczne odsłonięcie trzonu kręgu T13, precyzyjne szlifowanie wyrostka kolczystego w celu stworzenia płaskiego interfejsu kontaktowego oraz bezpieczne połączenie adhezyjne metalowej podstawy i kolimatora z kręgosłupem za pomocą materiału bazowego protezy i mieszanki klejowej. Umożliwia naturalne zachowania motoryczne poprzez nieograniczony ruch i zapewnia stabilną pozycję przy minimalnych różnicach przestrzennych między sesjami, ułatwiając badanie interwencji rdzenia kręgowego za pośrednictwem ultradźwięków w świadomych modelach zwierzęcych. Jest to szczególnie istotne w badaniach wymagających oceny behawioralnej w zakresie naprawy urazów kręgosłupa, modulacji bariery krew-rdzeń kręgowy i mechanizmów przewlekłego bólu. Rozwiązując krytyczne wyzwanie techniczne w badaniach nad neuromodulacją u zwierząt w stanie czuwania, protokół ten oferuje stabilny interfejs przetwornik-kręgosłup bez ograniczeń ruchów, torując drogę do dokładniejszych i bardziej wiarygodnych wyników eksperymentalnych.
Wprowadzenie
Rdzeń kręgowy jest kluczowym węzłem integracji informacji między ośrodkowym i obwodowym układem nerwowym, co czyni go cennym dla badań klinicznych w obszarach takich jak transdukcja sygnału bólu, rekonstrukcja ruchowych sieci neuronowych i regulacja neuroplastyczności. Skoncentrowane ultradźwięki (FUS), nowa nieinwazyjna technologia neuromodulacji, stała się ważnym sposobem regulacji neuronalnej rdzenia kręgowego. Dzięki fizycznym cechom głębokiej penetracji tkanek, rozdzielczości przestrzennej na poziomie milimetra i kontrolowanym parametrom wyjściowym energii, jego zastosowanie rozciąga się od podstawowych badań nad mechanizmami neurologicznymi po przedkliniczne badania translacyjne różnych modeli patologicznych rdzenia kręgowego.
Badania pokazują, że FUS może regulować obwody nerwowe rdzenia kręgowego na dwa sposoby: poprzez hamowanie lub aktywację ich poprzez efekty termiczne i mechaniczne. Charakteryzuje się również odwracalnością czasową i bezpieczeństwem dla tkanek 1,2,3. W badaniu modeli urazów rdzenia kręgowego, FUS poprawił zdolności motoryczne szczurów poprzez modulowanie reakcji zapalnych i promowanie naprawy neuronów 4,5,6. Ponadto wykazano, że FUS otwiera barierę krew-rdzeń kręgowy i zwiększa skuteczność miejscowego dostarczania leków poprzez efekt kawitacji za pośrednictwem mikropęcherzyków 7,8. W dziedzinie bólu neuropatycznego Liao i wsp. potwierdzili, że FUS skutecznie łagodzi objawy bólu neuropatycznego u szczurów poprzez regulację ekspresji KCC2 i hamowanie szlaku CaMKIV KCC29. Song i wsp. wykazali, że tsFUS o niskiej intensywności stosowany w lędźwiowym rdzeniu kręgowym znacznie zmniejszał allodynię mechaniczną i hamował aktywację mikrogleju w modelu przewlekłego zwężenia u szczura10. Osiągnięcie precyzyjnej modulacji rdzenia kręgowego za pomocą FUS zależy od stabilności przestrzennej systemu dostarczania energii ultradźwiękowej. Obecne strategie fiksacji dzielą się głównie na dwie kategorie: 1) Metoda fiksacji sztywnej: Osiąga precyzyjne pozycjonowanie za pomocą ramy stereotaktycznej, ale wymaga ciągłego znieczulenia, które tłumi aktywność neuronalną badanych eksperymentalnych i wpływa na trafność ocen behawioralnych 1,2,3,4,10 ; 2) Elastyczna metoda mocowania: Pozwala na prowadzenie badań na osobach przytomnych za pomocą urządzenia z paskiem elastycznym, ale ze względu na dużą ruchomość kręgosłupa występują błędy przemieszczenia i odklejenia przetwornika 6,8,9. Ponadto niejednorodność geometryczna blaszki kręgosłupa prowadzi do znacznego tłumienia energii ultradźwięków, zmniejszając skuteczność modulacji neuronalnej 7,8.
W badaniu tym w innowacyjny sposób zaproponowano wszczepialny schemat mocowania zogniskowanej głowicy ultradźwiękowej do badań nad modulacją neuronalną rdzenia kręgowego u świadomych, swobodnie poruszających się myszy. Protokół ten wykorzystuje minimalnie inwazyjne podejście chirurgiczne w celu zintegrowania metalowej podstawy, kolimatora i kręgosłupa, wspiera wielokrotne noszenie przetwornika ultradźwiękowego, zapewnia spójność celu ultradźwiękowego i utrzymuje tłumienie energii ultradźwiękowej przez blaszkę w akceptowalnym zakresie. Opracowana metodologia rozwiązuje krytyczne ograniczenia istniejących podejść, umożliwiając w ten sposób bardziej wiarygodne i powtarzalne eksperymenty z neuromodulacją rdzenia kręgowego u przytomnych, zachowujących się zwierząt. Kluczowe parametry to nacięcie w linii środkowej o długości 2,5 cm w T13, mocowanie metalowej podstawy ze stali nierdzewnej oraz stosunek objętości materiału bazowego protezy do kleju cyjanoakrylowego 3:1. Ograniczenia obejmują umiarkowaną inwazyjność chirurgiczną i precyzję w przygotowaniu powierzchni kostnej zależną od operatora.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie procedury na zwierzętach opisane w niniejszym badaniu zostały zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję Etyczną ds. Eksperymentów na Zwierzętach Instytutu Zaawansowanej Technologii w Shenzhen (numer certyfikatu: SIAT-IACUC-200721-YGS-NLL-A1313). We wszystkich eksperymentach wykorzystano samce myszy C57BL/6J (w wieku 8 tygodni). Myszy ważyły 18-22 g w momencie operacji.
1. Indukcja i podtrzymanie znieczulenia (5 ± 1 min)
- Wstępnie naładuj obwód znieczulenia przez 5 minut.
- Ustawić komorę indukcyjną tak, aby dostarczała 4% izofluranu do powietrza medycznego przy natężeniu przepływu 2 l/min. Karprofen (5 mg/kg mc., podskórnie) należy podawać jako przedoperacyjne działanie przeciwbólowe.
- Przełącz się na wentylację maski twarzowej po utracie odruchu prostowania.
- Dostosuj waporyzator tak, aby utrzymać stężenie 1,5-2% izofluranu.
- Utrzymuj temperaturę ciała myszy za pomocą koca rozgrzewającego do 37 °C, z docelowym zakresem 36-38 °C przez cały czas znieczulenia.
- Zastosuj maść okulistyczną Terramycyna.
2. Pozycjonowanie (1 ± 1 min)
- Użyj regulowanego adaptera stereotaktycznego do myszy.
- Ustaw mysz na brzuchu z wyrównaniem kręgosłupa, aby utrzymać fizjologiczną krzywiznę kręgosłupa.
- Zabezpiecz głowę myszy za pomocą pasków nausznych.
- Ustaw kończyny symetrycznie.
3. Przygotowanie pola operacyjnego (1 ± 1 min)
- Użyj elektrycznej maszynki do strzyżenia (odstęp ostrza 0,1 mm), aby usunąć włosy z pola operacyjnego.
- Upewnij się, że obszar depilacji ma około 3 cm × 1 cm.
- Wykonaj trzy przejścia przycinania w kierunku przeciwnym do wzrostu włosów.
4. Nacięcie i zbliżenie (2 ± 1 min)
- Zdezynfekuj obszar operacyjny jodoforem 3 razy (w odstępach 30 s), a następnie za każdym razem alkoholem. Potwierdź głębokość znieczulenia poprzez reakcję na uszczypnięcie palca u nogi.
- Zbadaj palpacyjnie ostatnie żebro (przyczepione do kręgu T13 u myszy) i użyj go jako
główny punkt orientacyjny. Wykonaj 2,5 cm nacięcie na poziomie kręgów T13 wzdłuż
grzbietowa linia środkowa za pomocą skalpela. - Sekwencyjnie rozetnij powięź podskórną.
- Odsłoń mięśnie przykręgosłupowe przez płaszczyzny anatomiczne.
5. Rozwarstwienie mięśni przykręgosłupowych (5 ± 1 min)
- Ustaw powiększenie mikroskopu chirurgicznego na 5x, aby uzyskać optymalną wizualizację mięśni przykręgosłupowych i struktur kręgowych.
- Wykonaj ostre rozwarstwienie mięśni przykręgosłupowych za pomocą mikronożyczek.
- Całkowicie wyciąć mięśnie grzbietowe i boczne przykręgosłupowe, zachowując brzuszne warstwy mięśni.
- Opanuj krwawienie za pomocą wchłanialnej gazy hemostatycznej.
6. Montaż metalowej podstawy (1 ± 1 min)
- Zamontuj pręt mocujący (plastikowy) do adaptera stereotaktycznego.
- Zamontuj niestandardową metalową podstawę (stal nierdzewna, 0.28 g) na dystalnym końcu pręta (Rysunek 1A).
- Umieść niestandardową metalową podstawę obustronnie na wyrostkach poprzecznych kręgosłupa T13.
- Sprawdź stabilność sprzęgu.
7. Przygotowanie interfejsu kostnego (2 ± 1 min)
- Usuń resztkową tkankę mięśniową z blaszki i wyrostków kolczystych pod mikroskopem operacyjnym.
- Osiągnij całkowitą hemostazę dzięki sterylnej kompresji z bawełny.
- Stwórz płaską powierzchnię kontaktową za pomocą precyzyjnego wiertła do kości z ciągłym nawadnianiem solą. Używaj wiertarki z prędkością 5 000-10 000 obr./min, aby zminimalizować wytwarzanie ciepła. Podczas wiercenia należy nosić osłonę oczu i maskę.
- Usuń pył kostny za pomocą wacików zwilżonych solą fizjologiczną.
8. Uszczelnienie systemu mocowania (3 ± 1 min)
- Wymieszaj materiały bazowe protez zębowych i klej cyjanoakrylowy (klej 502) w stosunku objętościowym 3:1. Nosić rękawice nitrylowe i okulary ochronne, aby zapobiec kontaktowi ze skórą/oczami.
- Przymocuj kolimator ultradźwiękowy (plastikowy, 0,6 g, rysunek 1B) i metalową podstawę do kręgosłupa za pomocą mieszanki kleju (rysunek 1C).
- Pozostawić mieszaninę kleju do utwardzenia w kontrolowanych warunkach otoczenia (24 ± 1 °C, 40-60% wilgotności względnej). Utrzymuj statyczne położenie przez 60 s, aż do wizualnego potwierdzenia całkowitego zestalenia (utrata połysku powierzchni i powstanie sztywnego interfejsu).
- Oddziel metalową podstawę od plastikowego pręta mocującego.
- Weryfikacja stabilności mocowania: Przyłóż delikatną siłę obrotową do metalowej podstawy w płaszczyźnie poziomej. Obserwuj interfejs kolimator-kręg pod 5-krotnym powiększeniem dla dowolnego przemieszczenia (tolerancja <0,1 mm). Jeśli ruch przekracza tolerancję, ponownie nałóż mieszaninę kleju (krok 8.2) i powtórz utwardzanie (krok 8.3).
9. Zamknięcie rany (1 ± 1 min)
- Wyrównaj krawędzie rany, aby całkowicie otoczyć metalową podstawę.
- Wykonaj przerwane szycie za pomocą nylonowych szwów 4-0.
- Przetrzyj nacięcie jodoforem.
- Usuń resztki krwi/kości w miejscu laminarnej ekspozycji kolimatora i zapakuj w sterylną bawełnę w celu uszczelnienia i hemostazy.
10. Postępowanie pooperacyjne
- Termoregulacja: Trzymaj mysz na kocu rozgrzewającym (37°C) do pełnego powrotu do zdrowia (zwykle 2-3 godziny po znieczuleniu).
- Pooperacyjna profilaktyka antybiotykowa: Sól sodowa cefazoliny (50 mg/kg, rozpuszczona w 0,9% soli fizjologicznej do stężenia 50 mg/ml) należy podać we wstrzyknięciu podskórnym w okolicę grzbietu szyi bezpośrednio po zabiegu.
- Utrzymuj higienę ran. Oczyść ranę za pomocą bawełnianego wacika nasączonego solą fizjologiczną raz dziennie przez pierwsze 3 dni i wykonuj codzienną kontrolę miejsca operowanego pod kątem oznak infekcji, rozejścia się lub stanu zapalnego.
- Analgezja pooperacyjna: Karprofen (5 mg/kg, podskórnie) należy podawać co 12 godzin przez 3 dni po zabiegu11.
UWAGA: Rysunek 1D przedstawia system mocowania wszczepiony żywej myszy po wyzdrowieniu.
11. Utylizacja odpadów niebezpiecznych
- Zbieraj pył kostny i materiały skażone krwią w szczelnych workach na zagrożenia biologiczne oznaczonych symbolami "Biohazard" w celu przekazania do licencjonowanego zakładu utylizacji odpadów medycznych.
- Umieść nieutwardzony materiał bazowy protezy zębowej i pozostałości kleju 502 w szczelnych, odpornych na chemikalia pojemnikach oznaczonych jako "Odpady chemiczne" i przechowuj je w przeznaczonej do tego wentylowanej szafce w celu utylizacji zgodnie z protokołami postępowania z odpadami chemicznymi.
- Wyrzuć igły, ostrza skalpela i wiertła do kości do odpornych na przebicie pojemników na ostre przedmioty oznaczonych etykietami "Biohazard".
12. Ostrzeżenia dotyczące bezpieczeństwa
- Podczas pracy z materiałami opartymi od protez należy unikać bezpośredniego kontaktu ze skórą, zakładając rękawice nitrylowe i okulary ochronne, a mieszanie i utwardzanie należy wykonywać w dobrze wentylowanym okapie, aby zminimalizować wdychanie lotnych monomerów.
- Pozostałości materiału należy utylizować jako odpady chemiczne zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi. W przypadku klejów cyjanoakrylowych 502 należy unikać kontaktu ze skórą lub oczami i natychmiast spłukać wodą przez 15 minut, jeśli dojdzie do narażenia, zwracając się o pomoc medyczną. Używaj ich w wentylowanych miejscach, przechowuj je w chłodnych, suchych miejscach, z dala od źródeł zapłonu i unikaj kontaktu z tkaninami bawełnianymi lub wełnianymi.
- Podczas korzystania z wierteł precyzyjnych zabezpiecz rękojeść, załóż osłonę twarzy i maskę chirurgiczną oraz przepłucz miejsce wiercenia solą fizjologiczną, aby zapobiec obrażeniom termicznym.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Test otwartej przestrzeni
Test otwartej przestrzeni został zaprojektowany w celu oceny potencjalnych zmian behawioralnych u myszy po operacji (Ryc. 2A). Zastosowano standardową komorę otwartej przestrzeni o wymiarach 40 cm × 40 cm, aby zapewnić myszom wystarczającą przestrzeń do aktywności, zachowując jednocześnie względnie stałe warunki środowiskowe i minimalizując zakłócenia zewnętrzne. Eksperyment składał się z dwóch faz: przedoperacyjnej oraz 7 dni po operacji. W każ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Badanie to przedstawia nowatorski protokół sprzęgania kręgów, który ułatwia precyzyjną neuromodulację ultradźwiękową rdzenia kręgowego u przytomnych, swobodnie zachowujących się myszy. W przeciwieństwie do konwencjonalnych metod fiksacji, metodologia ta przezwycięża ograniczenia konwencjonalnych metod fiksacji. W przeciwieństwie do sztywnych ram stereotaktycznych wymagających ciągłego znieczulenia (które tłumi aktywność neuronalną i komplikuje ocenybehawioralne10) i elastycznych pasów podatnych na...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Prace te były częściowo wspierane przez High-Level Talent Scientific Research Startup Project Szpitala Uniwersytetu w Hongkongu-Shenzhen w ramach grantu HKUSZH202207003. Serdecznie dziękujemy wszystkim członkom laboratorium za pomoc w optymalizacji protokołu i opiece nad zwierzętami, a także Instytutowi Zaawansowanych Technologii Chińskiej Akademii Nauk (SIAT) w Shenzhen za wsparcie instytucjonalne.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Komora indukcyjna anestezjologii | Shenzhen RWD | https://www.rwdls.com/product-solutions/life-sciences/modeling/anesthesia-parts | |
| Klej cyjanoakrylowy (klej 502) | Pekińskie Zakłady Chemiczne | https://item.taobao.com/item.htm? detail_redpacket_pop=prawda& identyfikator=736 869038961& LTK2=1752156592779 MDBP47Qqp4vyv57MQ156E& ns=1& cenaTId=214780251752156543206 3926e1996& query=502%E8%83% B6%E6%B0%B4%20%E5%8C%97 %E4%BA%AC%E5%8C%96%E5% B7%A5%E5%8E%82& skuId=52584 34238219 | |
| Materiały bazowe protez zębowych | Stomatologia Nowego Wieku | https://www.sncdental.com/product-item-11.html | |
| Pręt mocujący | Zwyczaj | ||
| Izofluran | Shenzhen RWD | https://www.rwdls.com/product-solutions/life-sciences/modeling/anesthesia-parts | |
| Metalowa podstawa | Zwyczaj | ||
| Mikroinstrument | Shenzhen Zongshi Instrumenty Naukowe Co., Ltd. | ||
| Wiertarka precyzyjna | Shenzhen RWD | https://www.rwdls.com/product-solutions/life-sciences/modeling/auxiliary-equipment | |
| Wielokanałowy system znieczulenia małych zwierząt | Shenzhen RWD | https://www.rwdls.com/product-solutions/life-sciences/modeling/anesthesia/data_66.html | |
| Adapter stereotaktyczny dla myszy i młodych szczurów | Changsha Mayue | https://item.taobao.com/item.htm?abbucket=14&detail_redpacket_pop =prawda& id=651346369142& LTK2=1752 157416717WLSROZZ5uROEHTBQ5YCIM4 & ns=1& cenaTId=214781ce1752157 3520498589e101a& query=%E8%84 %91%E7%AB%8B%E4%BD%93%E5%AE% 9A%E4%BD%8D%E4%BB%AA%20% E9%95%BF%E6%B2%99%E8%BF% 88%E8%B6%8A& skuId=4891677573 207& spm=a21n57.1.hoverItem.14& utparam=%7B%22aplus_abtest% 22%3A%22a478799868a3178d0dd 433b763909e16%22%7D& xxc= taobaoSearch | |
| Mikroskop chirurgiczny | Shenzhen Zongshi Instrumenty Naukowe Co., Ltd. | https://www.rwdls.com/product-solutions/life-sciences/modeling/auxiliary-equipment | |
| Szew chirurgiczny (Prolene) | Ethicon (Johnson & Johnsona) | https://item.taobao.com/item.htm?abbucket=14&detail_redpacket_pop =prawda& id=774292384846& LTK2= 1752157506907C0321Finubb5 RPKUB6AV6N& ns=1& priceTId= 214781ce1752157493734800 4e101a& query=%E5%BC%B A%E7%94%9F%E7%BC%9D %E7%BA%BF& skuId=594224 1331046& spm=a21n57.1.hoverI | |
| Maść okulistyczna Terramycyna | Pfizer | https://theterramycin.com/terramycin-ophthalmic-ointment/ | |
| Kolimator ultradźwiękowy | Zwyczaj |
Bibliografia
- Song, W., et al. Transspinal focused ultrasound suppresses spinal reflexes in healthy rats. Neuromodulation. 27 (4), 614-624 (2024).
- Tsehay, Y., et al. Low-intensity pulsed ultrasound neuromodulation of a rodent's spinal cord suppresses motor evoked potentials. IEEE Trans Biomed Eng. 70 (7), 1992-2001 (2023).
- Kim, E., Kum, J., Kim, H. Trans-spinal focused ultrasound stimulation selectively modulates descending motor pathway. IEEE Trans Neural Syst Rehabil Eng. 30, 314-320 (2022).
- Hong, Y. -R., et al. Ultrasound stimulation improves inflammatory resolution, neuroprotection, and functional recovery after spinal cord injury. Sci Rep. 12 (1), 3636(2022).
- Hwang, B. Y., et al. Ultrasound in traumatic spinal cord injury: A wide-open field. Neurosurgery. 89 (3), 372-382 (2021).
- Liao, Y. -H., et al. Low-intensity focused ultrasound alleviates spasticity and increases expression of the neuronal K-Cl cotransporter in the l4-l5 sections of rats following spinal cord injury. Front Cell Neurosci. 16, 882127(2022).
- Payne, A. H., et al. Magnetic resonance imaging-guided focused ultrasound to increase localized blood-spinal cord barrier permeability. Neural Regen Res. 12 (12), 2045-2049 (2017).
- Fletcher, S. -M. P., Choi, M., Ogrodnik, N., O'Reilly, M. A. A porcine model of transvertebral ultrasound and microbubble-mediated blood-spinal cord barrier opening. Theranostics. 10 (17), 7758-7774 (2020).
- Liao, Y. -H., Wang, B., Chen, M. -X., Liu, Y., Ao, L. -J. Lifu alleviates neuropathic pain by improvingthe kcc2 expression and inhibiting the camkiv-kcc2 pathway in the l4-l5 section of the spinal cord. Neural Plast. 2021, 6659668(2021).
- Song, W., Giannotti, A., Bekiaridou, A., Bloom, O., Zanos, S. Low intensity trans-spinal focused ultrasound reduces mechanical sensitivity and suppresses spinal microglia activation in rats with chronic constriction injury. Bioelectron Med. 11 (1), 8(2025).
- Glasenapp, A., Bankstahl, J. P., Bähre, H., Glage, S., Bankstahl, M. Subcutaneous and orally self-administered high-dose carprofen shows favorable pharmacokinetic and tolerability profiles in male and female C57bl/6j mice. Front Vet Sci. 11, 1430726(2024).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
