Multi-omiczne techniki profilowania przejść stanu chromatyny w pierwotnych cholangiocytach myszy o niskim wkładzie

Podsumowanie

Ten manuskrypt przedstawia kompleksowy protokół dla niskowejściowego ChIP-seq do profilowania modyfikacji histonów oraz ATAC-seq do oceny dostępności chromatyny w małych ilościach pierwotnych mysich cholangiocytów.

Streszczenie

Wielotorbielowatość wątroby (PLD) jest dziedzicznym zaburzeniem charakteryzującym się powstawaniem wypełnionych płynem torbieli pochodzących z cholangiocytów, co prowadzi do postępu choroby i znacznego obniżenia jakości życia pacjentów. Obecne metody leczenia PLD są niewystarczające, co podkreśla potrzebę opracowania nowych strategii terapeutycznych. Rola regulacji epigenetycznej w progresji PLD, w szczególności dostępność chromatyny i modyfikacje histonów, pozostaje niedostatecznie zbadana. Tradycyjne techniki profilowania epigenetycznego, takie jak ChIP-seq i DNase-seq, wymagają dużej liczby komórek, które są trudne do uzyskania z pierwotnych cholangiocytów. Aby rozwiązać ten problem, zoptymalizowaliśmy protokoły ChIP-seq i ATAC-seq o niskim nakładzie wejściowym pod kątem małej liczby pierwszorzędowych cholangiocytów. Podejścia te pozwalają na analizę modyfikacji histonów i dostępności chromatyny przy minimalnym wkładzie komórkowym. Niskowejściowy ChIP-seq wykorzystuje nukleazę mikrokokową (MNazę) do fragmentacji DNA, podczas gdy ATAC-seq wykorzystuje transpozazę Tn5 do wychwytywania otwartych regionów chromatyny. Te techniki multiomiczne dostarczają cennych informacji na temat dynamiki stanu chromatyny podczas przemian losów cholangiocytów w PLD i innych chorobach dróg żółciowych. Co ważne, zoptymalizowane protokoły można z pewnością zastosować do innych komórek pierwotnych o niskim nakładzie pracy, umożliwiając badanie mechanizmów epigenetycznych w różnych kontekstach komórkowych. W pracy przedstawiono systematyczne podejście do badania zmian stanu chromatyny, przyczyniając się do opracowania opartych na epigenetyce strategii terapeutycznych dla PLD i chorób pokrewnych.

Wprowadzenie

PLD jest dziedzicznym zaburzeniem charakteryzującym się rozwojem wielu wypełnionych płynem torbieli pochodzących z cholangiocytów. W miarę jak torbiele te stopniowo się rozszerzają, poważnie wpływają na jakość życia pacjentów^1,2. Istniejące strategie leczenia PLD są niewystarczające, przynoszą jedynie ograniczone korzyści, a jednocześnie często prowadzą do wysokiego odsetka nawrotów i powikłań^3,4. W związku z tym istnieje pilna potrzeba opracowania bezpieczniejszych i skuteczniejszych podejść terapeutycznych, aby sprostać nierozwiązanym wyzwaniom klinicznym w leczeniu PLD.

W normalnych warunkach cholangiocyty pozostają w stanie spoczynku, podczas gdy w PLD wykazują nadmierną proliferację, co jest kluczowym czynnikiem progresji choroby^5,6. Mechanizmy molekularne leżące u podstaw tego przejścia torbielowatego pozostają niejasne. Podczas gdy regulacja epigenetyczna, w tym dostępność chromatyny i modyfikacje histonów, odgrywa istotną rolę w przemianach losu komórki^7,8, jej rola w progresji PLD pozostaje niedostatecznie zbadana. Jednak wiele technik profilowania epigenetycznego wymaga dużej liczby komórek. Tradycyjne sekwencjonowanie ChIP, które opiera się na fragmentacji chromatyny przez sonikację, a także testy dostępności chromatyny, takie jak sekwencja DNazy i sekwencja MNazy, zwykle wymagają ponad 10⁶ komórek - znacznie przekraczając liczbę możliwą do uzyskania z pierwotnych cholangiocytów.

Ten manuskrypt zawiera kompleksowy protokół dla niskowejściowego ChIP-seq^9,10,11 do profilowania modyfikacji histonów i ATAC-seq^11,12,13 do oceny dostępności chromatyny w małej liczbie pierwotnych cholangiocytów. Niskowejściowy ChIP-seq wykorzystuje MNazę do fragmentacji DNA⁹, podczas gdy ATAC-seq wychwytuje fragmenty DNA z otwartych regionów chromatyny za pomocą transposazy Tn5¹². Analiza multiomiczna wykorzystująca te podejścia dostarcza cennych informacji na temat dynamiki stanu chromatyny podczas przemian losu cholangiocytów w PLD i innych chorobach dróg żółciowych, ułatwiając w ten sposób rozwój terapii ukierunkowanych na epigenetykę.

Protokół

1. Przygotowanie roztworów i cholangiocytów dla ATAC-seq

1. Co najmniej 1 dzień przed eksperymentem ATAC-seq należy przygotować bufor do lizy ATAC przy użyciu odczynników wymienionych w tabeli 1.
   UWAGA: ATAC Lysis Buffer może być przechowywany w temperaturze 4 °C w ciemności przez co najmniej 1 miesiąc.
2. W przypadku świeżo wyizolowanych cholangiocytów pierwotnych¹⁴ należy policzyć komórki za pomocą hemocytometru natychmiast po izolacji i przeprowadzić eksperyment ATAC-seq.
   UWAGA: Im szybciej, tym lepiej, aby zminimalizować wpływ na żywotność komórek. Jeśli jednak jest trzymany na lodzie, postępowanie w ciągu 2 godzin na ogół nie stanowi problemu.

2. ATAC-seq

UWAGA: Użyj 100 000 cholangiocytów dla sekwencji ATAC. Próbki i roztwory należy przechowywać na lodzie. W przypadku eksperymentu ATAC-seq cała procedura trwa około 2 dni.

1. Wirować przy 500 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
2. Odrzucić supernatant, dodać 200 μl buforu do lizy ATAC zawierającego inhibitor proteazy, delikatnie odpipetować do wymieszania i inkubować na lodzie przez 20 minut. Przez pierwsze 10 minut delikatnie odpipetować do mieszania.
3. Wirować przy 1 500 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
4. Przygotuj bufor do reakcji transpozycji (50 μl), mieszając 3 μl mieszanki enzymów z zestawu ATAC DNA Library Prep Kit, 10 μl 5x Buffer z ATAC DNA Library Prep Kit i 37 μL wody wolnej od nukleaz. Dokładnie wymieszaj.
5. Ostrożnie wyrzucić supernatant, umieścić zebrany pastylek jądrowy na lodzie i natychmiast dodać 50 μl buforu do reakcji transpozycji. Delikatnie zawiesić ponownie i inkubować w temperaturze 37 °C przez 60 minut, przesuwając dno probówki co 10 minut w celu wymieszania.
   UWAGA: Przygotować bufor do reakcji transpozycji przed wyrzuceniem supernatantu, aby zapobiec wysychaniu komórek.
6. Oczyść DNA za pomocą zestawu do oczyszczania PCR zgodnie z instrukcjami producenta.
   UWAGA: Resztki białka G z procesu izolacji cholangiocytów ¹⁴ mogą zostać usunięte w tym kroku. Próbki DNA mogą być przechowywane w temperaturze -80 °C w celu długotrwałej konserwacji.
7. Budowę biblioteki należy wykonać za pomocą zestawu ATAC DNA Library Prep Kit zgodnie z instrukcjami producenta.
   UWAGA: Wszystkie próbki i roztwory należy przechowywać na lodzie, chyba że określono inaczej. Chociaż procedury mogą się różnić między innymi markami zestawów, wszystkie są zgodne z naszym protokołem.
   1. Wzbogacanie PCR: Przygotuj mieszankę wzbogacającą PCR (50 μl) w probówce do PCR, mieszając następujące składniki w określonej kolejności: 10 μl próbki DNA (z kroku 2.6), 14 μl wody wolnej od nukleaz, 10 μL 5x TAB, 5 μL PPM, 1 μL TAE, 5 μL startera P5, i 5 μl startera P7. Delikatnie odpipetować do wymieszania.
   2. Przenieść probówkę do przyrządu do PCR i uruchomić następujący program: (72 °C przez 3 min) x 1 cykl, (98 °C przez 30 s) x 1 cykl, (98 °C przez 15 s, 60 °C przez 30 s, 72 °C przez 3 min) x 15 cykli i (72 °C przez 5 min) x 1 cykl, i utrzymywać w temperaturze 4 °C.
   3. Oczyszczanie: Przed użyciem doprowadź koraliki DNA Clean do temperatury pokojowej na 30 minut, a następnie wykonaj dwuetapowe oczyszczanie kulek magnetycznych.
      1. Pierwsza runda: Dodać 30 μl kulek DNA Clean do produktów PCR (z kroku 2.7.2), delikatnie pipetować do wymieszania i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Umieścić probówkę PCR na separatorze magnetycznym i poczekać, aż roztwór stanie się klarowny (~5 min). Ostrożnie przenieś supernatant do nowej probówki i wyrzuć kulki DNA Clean.
      2. Druga runda: Dodać 7,5 μl kulek DNA Clean do zebranego supernatantu (z kroku 2.7.3.1), delikatnie odpipetować do wymieszania i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Umieścić probówkę na separatorze magnetycznym i poczekać, aż roztwór stanie się klarowny (~5 min). Ostrożnie wyrzucić supernatant.
   4. Trzymaj probówkę na separatorze magnetycznym i płucz kulki DNA Clean przez 2 x 30 s 200 μl świeżo przygotowanego 80% etanolu w temperaturze pokojowej. Ostrożnie wyrzucić supernatant po każdym płukaniu. Trzymając probówkę nadal na separatorze magnetycznym, otwórz pokrywę probówki i susz kulki na powietrzu przez 10 minut. Na koniec dodaj 22 μl wody wolnej od nukleaz, aby wymyć DNA.
      UWAGA: Próbki DNA mogą być przechowywane w temperaturze -80 °C w celu długotrwałego przechowywania.
8. Sekwencjonowanie bibliotek przy użyciu standardowego sekwencera nowej generacji.
   UWAGA: Zalecamy uzyskanie co najmniej 50 milionów odczytów na końcu pary.

3. Przygotowanie roztworów i cholangiocytów dla niskowejściowego ChIP-seq

1. Co najmniej 1 dzień przed eksperymentem ChIP-seq o niskim nakładzie należy przygotować bufor lizy ChIP, bufor ChIP MNase, bufor zatrzymujący ChIP, bufor ChIP 2x RIPA, bufor ChIP RIPA i bufor ChIP LiCl przy użyciu odczynników wymienionych w Tabeli 2, Tabeli 3, Tabeli 4 i Tabeli 5.
   UWAGA: Powyższe roztwory można przechowywać w temperaturze 4 °C przez co najmniej 1 miesiąc.
2. W przypadku świeżo wyizolowanych cholangiocytów pierwotnych¹⁴ należy policzyć komórki za pomocą hemocytometru natychmiast po izolacji i przeprowadzić eksperyment ChIP-seq o niskim poziomie wejściowym.
   UWAGA: Im szybciej, tym lepiej, aby zminimalizować wpływ na żywotność komórek. Jeśli jednak jest trzymany na lodzie, postępowanie w ciągu 2 godzin na ogół nie stanowi problemu.

4. Dzień 1 niskowejściowego sekwencjonowania ChIP: liza komórek, trawienie MNazy i inkubacja przeciwciał

UWAGA: W przypadku eksperymentu z sekwencją ChIP o niskim wkładzie cała procedura trwa około 3 dni.

1. Podziel cholangiocyty na porcje po 100 000 komórek na probówkę i trzymaj próbki i roztwory na lodzie.
   UWAGA: W przypadku wykonywania niskowejściowego eksperymentu ChIP-seq dla wielu modyfikacji histonów, dopuszczalne jest proporcjonalne zwiększenie objętości przed dodaniem przeciwciała modyfikującego histon. Objętości odczynników w poniższych krokach są oparte na jednej probówce zawierającej 1 × 10⁵ komórek.
2. Wirować przy 2 000 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
3. Odrzucić supernatant, dodać 19 μl buforu do lizy ChIP zawierającego inhibitor proteazy, delikatnie odpipetować do wymieszania i inkubować na lodzie przez 10 minut. Unikać tworzenia pęcherzyków.
4. Dodać 19 μl buforu ChIP MNase i delikatnie odpipetować do wymieszania.
5. Dodać 2 μl MNazy (0,01 U/μL) i delikatnie odpipetować do wymieszania. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 min.
   UWAGA: Czas inkubacji ma kluczowe znaczenie. Końcowe stężenie MNazy wynosi 0,0005 U/μL. Optymalne stężenie MNazy można określić na podstawie typu i liczby komórek.
6. Natychmiast umieścić próbkę na lodzie, dodać 5 μl buforu Chip STOP w celu zakończenia trawienia i delikatnie odpipetować do wymieszania.
7. Dodać 45 μl ChIP 2x bufor RIPA zawierający inhibitor proteazy, delikatnie pipetować do wymieszania i dalej inkubować na lodzie przez 10 minut.
8. Wirować przy 20 000 × g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Powoli przenieść supernatant do nowej probówki.
   UWAGA: Resztki białka G z procesu izolacji cholangiocytów ¹⁴ mogą zostać usunięte na tym etapie.
9. Dodać 40 μl bufora ChIP RIPA.
10. W przypadku próbek immunoprecypitacji (IP) dodać 1 μg przeciwciała na próbkę i inkubować zawiesinę na rotatorze (20 obr./min) w temperaturze 4 °C przez noc.
11. W przypadku próbek wejściowych nie dodawać żadnych przeciwciał i inkubować zawiesinę na rotatorze (20 obr./min) w temperaturze 4 °C przez noc.

5. Dzień 2 niskowejściowego sekwencji: immunoprecypitacja, płukanie i elucja

UWAGA: Dla próbek IP, wykonaj kroki 5.1-5.7. W przypadku próbek wejściowych wykonaj kroki 5.8–5.12.

1. Umyj wstępnie kulki białka G 1 ml lodowatego buforu ChIP RIPA.
2. Dodać 400 μg kulek białka G do próbek i inkubować z rotacją (20 obr./min) w temperaturze 4 °C przez 2 godziny.
3. Myć kulki przez 5 x 5 minut 150 μl lodowatego buforu ChIP RIPA przez 5 minut w temperaturze 4 °C na rotatorze (20 obr./min). Usunąć supernatant za pomocą separatora magnetycznego.
4. Przemyć kulki 150 μl lodowatego buforu ChIP LiCl przez 5 minut w temperaturze 4 °C na rotatorze (20 obr./min). Usunąć supernatant za pomocą separatora magnetycznego.
5. Dodać 30 μl buforu elucyjnego ChIP (29 μl wody wolnej od nukleaz i 1 μl proteinazy K) w celu ponownego zawieszenia kulek i wstrząsać z prędkością 900 obr./min w temperaturze 55 °C przez 90 min. Delikatnie przesuwaj probówkę od czasu do czasu, aby kulki pozostały w zawiesinie.
6. Zebrać supernatant za pomocą separatora magnetycznego i powoli przenieść go do nowej probówki. Inkubować w temperaturze 72 °C przez 40 minut w celu inaktywacji proteinazy K.
7. Zmierz stężenie DNA za pomocą fluorometru.
   UWAGA: Próbki DNA mogą być przechowywane w temperaturze -80 °C w celu długotrwałego przechowywania.
8. W przypadku próbek wejściowych dodać 1 μl proteinazy K i wstrząsać z prędkością 900 obr./min w temperaturze 55 °C przez 90 minut.
9. Oczyść DNA za pomocą ekstrakcji fenolowo-chloroformowej. Dodać 130 μl odczynnika do ekstrakcji DNA i energicznie wirować, aż roztwór zmieni kolor na różowy. Wirować przy 20 000 × g przez 5 min.
10. Przenieść supernatant do nowej probówki, dodać 130 μl lodowatego izopropanolu, a następnie dodać 1 μl glikogenu i 6,5 μl 3M NaAc. Wirować przy 20 000 × g przez 15 min.
11. Wyrzuć supernatant, przemyj raz 1 ml 70% etanolu i odwiruj przy 20 000 × g przez 15 minut. Wysuszyć osad i ponownie zawiesić go w 30 μl wody wolnej od nukleaz.
12. Zmierz stężenie DNA za pomocą fluorometru.
    UWAGA: Próbki DNA mogą być przechowywane w temperaturze -80 °C w celu długotrwałego przechowywania.

6. Dzień 3 niskowejściowego sekwencji: Budowa biblioteki i sekwencjonowanie

1. Wykonaj budowę biblioteki za pomocą zestawu do przygotowania biblioteki ChIP DNA zgodnie z instrukcjami producenta.
   UWAGA: Kroki obejmują przygotowanie końcowe, ligację adaptera i wzmocnienie biblioteki. Pipeta 5 ng próbek ChIP (próbki wejściowe i IP) do budowy biblioteki. Wszystkie próbki i roztwory należy przechowywać na lodzie, chyba że określono inaczej. Chociaż procedury mogą się różnić między innymi markami zestawów, wszystkie są zgodne z naszym protokołem.
2. Przygotowanie końcowe: Przygotuj bufor reakcyjny przygotowania końcowego (65 μl) w probówce do PCR, mieszając 5 ng próbki DNA (z kroku 5.6 lub kroku 5.11), 15 μl mieszanki End Prep Mix 4, 6,5 μl Tris EDTA i wodę wolną od nukleaz do końcowej objętości 65 μl. Delikatnie pipetę do wymieszania. Przenieś probówkę do instrumentu PCR i uruchom następujący program: 20 °C przez 15 minut, 65 °C przez 15 minut i przytrzymaj w temperaturze 4 °C (gorąca pokrywa: 105 °C).
3. Podwiązanie adaptera: Rozcieńczyć adapter DNA S w stosunku 1:100. Przygotuj bufor reakcyjny do ligacji adaptera (100 μl) w probówce do PCR, mieszając 65 μl produktów przygotowania końcowego (z kroku 6.2), 25 μl buforu do szybkiej ligacji 2, 5 μl ligazy Rapid DNA i 5 μl rozcieńczonego adaptera DNA S. Delikatnie odpipetować do mieszania. Przenieś probówkę do przyrządu do PCR i uruchom następujący program: 20 °C przez 15 minut, a następnie przytrzymaj w temperaturze 4 °C (gorąca pokrywa: 105 °C).
4. oczyszczanie:
   1. Doprowadź koraliki DNA Clean do temperatury pokojowej na 30 minut przed użyciem. Dodaj 60 μl kulek DNA Clean do produktów do ligacji adaptera (od kroku 6.3). Delikatnie odpipetować do wymieszania i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
   2. Umieść probówkę PCR na separatorze magnetycznym i poczekaj, aż roztwór stanie się klarowny (~5 min). Ostrożnie wyrzucić supernatant.
   3. Trzymaj rurkę na separatorze magnetycznym. Płucz kulki DNA Clean przez 2 x 30 s 200 μl świeżo przygotowanego 80% etanolu w temperaturze pokojowej. Ostrożnie wyrzucić supernatant po każdym płukaniu.
   4. Gdy rurka nadal znajduje się na separatorze magnetycznym, otwórz pokrywę probówki i susz kulki na powietrzu przez 5 minut. Na koniec dodaj 22,5 μl 10 mM Tris-HCL (PH 8,0), aby wymyć DNA.
5. Amplifikacja biblioteki: Przygotuj bufor reakcyjny do amplifikacji biblioteki (50 μl) w probówce PCR, mieszając 20 μl produktów oczyszczających (z kroku 6.4), 2,5 μl i5 PCR Primer, 2,5 μl i7 PCR Primer i 25 μl mieszanki amplifikacyjnej. Delikatnie odpipetować do wymieszania. Przenieś probówkę do przyrządu do PCR i uruchom następujący program: (95 °C przez 3 min) x 1 cykl, (98 °C przez 20 s, 60 °C przez 15 s, 72 °C przez 30 s) x 18 cykli, (72 °C przez 5 min) x 1 cykl i trzymaj w temperaturze 4 °C.
6. Oczyszczanie: Przed użyciem doprowadź koraliki DNA Clean do temperatury pokojowej na 30 minut, a następnie wykonaj dwuetapowe oczyszczanie kulek magnetycznych.
   1. Pierwsza runda: Dodaj 30 μl kulek DNA Clean do produktów do amplifikacji bibliotecznej (od kroku 6.5). Delikatnie odpipetować do wymieszania i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Umieść probówkę PCR na separatorze magnetycznym i poczekaj, aż roztwór stanie się klarowny (~5 min). Ostrożnie przenieś supernatant do nowej probówki i wyrzuć kulki DNA Clean.
   2. Druga runda: Dodaj 7,5 μl kulek DNA Clean do zebranego supernatantu. Delikatnie odpipetować do wymieszania i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Umieść probówkę na separatorze magnetycznym i poczekaj, aż roztwór stanie się klarowny (~5 min). Ostrożnie wyrzucić supernatant. Trzymaj rurkę na separatorze magnetycznym. Płucz kulki DNA Clean przez 2 x 30 s 200 μl świeżo przygotowanego 80% etanolu w temperaturze pokojowej. Ostrożnie wyrzucić supernatant po każdym płukaniu. Trzymając probówkę nadal na separatorze magnetycznym, otwórz pokrywę probówki i susz kulki na powietrzu przez 10 minut. Na koniec dodaj 22,5 μl 10 mM Tris-HCl (PH 8,0), aby wymyć DNA.
      UWAGA: Próbki DNA mogą być przechowywane w temperaturze -80 °C w celu długotrwałego przechowywania.
7. Sekwencjonowanie bibliotek w standardowym sekwencerze nowej generacji.
   UWAGA: Zalecamy uzyskanie co najmniej 10-20 milionów odczytów na końcu pary.

7. Analiza danych ATAC-seq i ChIP-seq o niskim wkładzie

1. Przygotowanie wirtualnego środowiska analitycznego (miniconda)
   1. Pobierz Miniconda3 ze strony internetowej za pomocą następujących poleceń i postępuj zgodnie z instrukcjami instalacji Miniconda.
      wget https://mirrors.tuna.tsinghua.edu.cn/anaconda/miniconda/Miniconda3-4.7.12.1-Linux-x86_64.sh
      bash Miniconda3-4.7.12.1-Linux-x86_64.sh
   2. Utwórz środowisko wirtrualne dla potoku analizy zarówno ATAC-seq, jak i ChIP-seq.
      conda create -n NGSpipeline
      conda aktywuj NGSpipeline
      conda install bioconda::fastqc bioconda::multiqc bioconda::trim-galore bioconda::bowtie2 bioconda::samtools bioconda::macs2 bioconda::d eeptools bioconda::p icard bioconda::igv
   3. Pobierz plik referencyjnej sekwencji genomu i utwórz indeks dopasowania dla wyrównania bowtie2.
      wget https://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/gencode/Gencode_mouse/release_M25/GRCm38.p6.genome.fa.gz
      Zamek błyskawiczny GRCm38.p6.genome.fa.gz
      muszka2-build-s GRCm38.p6.genome.fa GRCm38_bowtie2_index
2. Przeprowadzaj kontrolę jakości odczytów ATAC-seq i odczytów ChIP-seq za pomocą FastQC i podsumuj raport kontroli jakości za pomocą MultiQC, aby zapewnić stronniczość GC wyników sekwencjonowania i wystarczającą złożoność biblioteki do dalszej analizy. Odrzuć bibliotekę sekwencji ze znaczącymi wynikami kontroli jakości.
   fastqc -o
   ......
   Multiqc
3. Adapter sekwencjonowania przycinania za pomocą trymowania galore.
   trim_galore -q 20 --phred33 --rygorystyczność 3 --długość 25 -e 0.1 --sparowany -j -o
4. Mapuj przycięte odczyty do zespołu genomu referencyjnego mm10 z Bowtie2 przy użyciu parametrów domyślnych i przekaż parametry dodawania (--very-sensitive -X 2000) do bowtie2 dla ATAC-seq ze względu na szeroki rozkład długości fragmentu ATAC-seq.
   1. Dla ATAC-seq:
      muszka2 -p --bardzo-wrażliwy -X 2000 -x -1 -2 | samtools view -S -O BAM -@ -o
   2. Dla ChIP-seq:
      Bowtie2 -p -x -1 -2 | samtools view -S -O BAM -@ -o
5. Usuń odczyty z niskim wynikiem dopasowania (q30) i odczyty wyrównane do genomu mitochondriów i niestandardowego chromosomu.
   samtools view -bh -q 30 -f 2 | samtools view -h | grep -v 'chrM' | grep -v 'losowy' | grep -v 'chrUn' | samtools sort -l 9 -O BAM -o
6. Użyj polecenia Picard MarkDuplicates, aby usunąć duplikaty PCR reads.
   picard MarkDuplicates I= O= M= REMOVE_DUPLICATES=true
7. Szczyt połączenia za pomocą polecenia MACS2 callpeak z parametrem -f BAMPE -g mm -B -q 0.01.
   macs2 callpeak -f BAMPE -t > -g mm -n -B -q 0.01
8. Generuj pliki BigWig za pomocą polecenia Deeptools BamCoverage.
   Samtools Index -@ 4
   bamCoverage -b -o
   -bs 50 -p --effectiveGenomeSize2652783500--normalizeUsing RPGC -e -ignoreDuplicates
9. Użyj przeglądarki genomu IGV, aby wyświetlić plik narrowPeak z macs2 i pliki BigWig z Deeptools BamCoverage.

Wyniki

Aby wygenerować krajobraz chromatyny głównych cholangiocytów, zoptymalizowaliśmy protokoły ChIP-seq i ATAC-seq o niskim wkładzie dla niskiej liczby (~100 000) pierwotnych cholangiocytów. Wyniki elektroforezy w żelu agarozowym dla cholangiocytów pierwotnych wykazały, że dla 1 ×^{10 5} pierwotnych cholangiocytów, 0,02 U MNazy w temperaturze 37 °C przez 5 minut powodowało wytwarzanie mononukleosomów, które określono jako optymalne stężenie (Ryc. 1).

Prz...

Dyskusja

Aby systematycznie i kompleksowo zmapować dynamikę stanu chromatyny leżącą u podstaw przejścia w stan cholangiocytów torbielowatych, z powodzeniem zoptymalizowaliśmy niskowejściowe sekwencje ChIP-seq i ATAC-seq dla ograniczonej liczby pierwotnych cholangiocytów. Chociaż badanie to koncentrowało się na pierwotnych cholangiocytach, jesteśmy przekonani, że protokół można również zastosować do innych komórek pierwotnych o wysokiej żywotności o ograniczonej dostępności. Podobnie, podczas gdy badanie to przedstawia tylko wynik...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
0,5 M EDTA	Solarbio	E1170
1 M Tris-HCl (pH=7,5)	Solarbio	T1140
1 M Tris-HCl (pH=8,0)	Solarbio	T1150
3 M NaAc	Beyotime	ST342
8 M LiCl	Sigma	L7026
Żel agarozowy	Biosharp	BS081
ATAC Biblioteka DNA Zestaw przygotowawczy	Vazyme	TD501
CaCl2	Sangon Biotech	A501330	1 M zapasów
Zestaw przygotowawczy biblioteki DNA ChIP	Vazyme	ND607
Czyste koraliki DNA	Vazyme	N411
Odczynnik do ekstrakcji DNA	Solarbio	P1012
EGTA	Solarbio	E8050	100 mM (pH = 8) zapas
Fluorometr	Invitrogen	Q33226
Glikogen	Thermo Scientific	R0561
Hemocytometr	QIUJING	XB. K.25.
Igepal CA-630	Sigma	I8896	10% zapasów
Separator magnetyczny	Promega	Z5342
MgCl2	Sangon Biotech	A100288	1,5 M zapas
MNase	Sigma	N3755	0,01 U/µ L zapas
NaCl	Sangon Biotech	A610476	5 M zapas
NP40	Solarbio	N8030
Woda bez nukleaz	Technologie życia Instrumenty	AM9937
	Applied Biosystems	4484073
Zestaw do oczyszczania PCR	QIAGEN	28106
Inhibitor proteazy	Roche
Białko G kulki	Invitrogen	10004D
Proteinaza K	TransGen	GE201-01
Rotator	Kylin-Bell	QB-528
SDS	Solarbio	S8010	10%  stock
Deoksycholan sodu	Sigma	S1827
Thermomixer comfort	Eppendorf	5355
Triton X-100	Solarbio	T8200
Tween-20	Solarbio	T8220
Software	Citation (PMID)/Company	Version	Website
Bowtie2	22388286	2.3.5.1	https://github.com/BenLangmead/bowtie2
Deeptools	27079975	3.4.3	https://deeptools.readthedocs.io/en/latest/
FastQC		0.12.1	https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/
IGV	21221095	2.12.3	https://igv.org/
MACS2	18798982	2.2.7.1	https://hbctraining.github.io/Intro-to-ChIPseq/lessons/05_peak_calling_macs.html
Miniconda	Anaconda	4.7.12.1	https://www.anaconda.com/
MultiQC	27312411	1.23	https://seqera.io/multiqc/
Picard		2.27.5	https://broadinstitute.github.io/picard/
samtools	33590861	1.6	https://www.htslib.org/
Trymowanie w bród		0.6.6	https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/