Mikroskopia lokalizacyjna ultrasonograficzna do superrozdzielczego mapowania mikronaczynia mózgu gryzoni

Podsumowanie

Ultrasonograficzna mikroskopia lokalizacyjna (ULM) to niedawno opracowana technika, która pozwala na niespotykany dotąd poziom rozdzielczości obrazowania mikronaczyń in vivo. W niniejszej pracy szczegółowo opisujemy, jak uzyskać superrozdzielcze obrazy mikronaczyniowej mikronaczyniowej mózgu u gryzoni, wykorzystując standaryzowaną funkcjonalną platformę ultradźwiękową zaprojektowaną do badań przedklinicznych.

Streszczenie

Ultrasonograficzna Mikroskopia Lokalizacyjna (ULM) to technika obrazowania o superrozdzielczości, która umożliwia in vivo wizualizację architektury mikronaczyniowej mózgu, przekraczającą granicę dyfrakcyjną konwencjonalnego ultradźwięku. Poprzez wykrywanie i śledzenie mikrobąbelków wstrzykniętych dożylnie podczas ich krążenia przez naczynia mózgowe, ULM generuje mapy o wysokiej rozdzielczości gęstości naczyniowej, prędkości przepływu oraz amplitudy sygnału odwróconego na skalach przestrzennych do 5-10 μm. Protokół ten przedstawia kompletny workflow do wykonywania obrazowania ULM u gryzoni, w tym przygotowanie zwierząt, pozycjonowanie sondy, akwizycję obrazu, wstrzykiwanie mikropęcherzyków oraz przetwarzanie danych, przy użyciu dedykowanej funkcjonalnej platformy ultradźwiękowej. Opisane są dwie metody przygotowania, dostosowane dla myszy (przezczaszkowa) i szczurów (z oknami czaszkowymi), po których następują szczegółowe instrukcje dotyczące ustawienia sondy i celowania anatomicznego z wykorzystaniem zintegrowanego atlasu mózgu. Podczas akwizycji ultraszybkie sekwencje ultradźwiękowe są synchronizowane z bolusowymi wstrzykiwaniami mikrobąbelków w celu przechwycenia dynamicznych danych przepływu. Kolejne etapy rekonstrukcji obejmują filtrowanie zakłóceń, interpolację obrazów, wykrywanie mikrobąbelków, lokalizację subpikseli oraz śledzenie trajektorii. Wyniki obejmują mapy gęstości odzwierciedlające zajmowanie pojazdów, mapy prędkości ujawniające wzorce przepływu i kierunkowość oraz mapy amplitudy oferujące dodatkowy kontrast do interpretacji strukturalnej. Reprezentatywne wyniki ilustrują pomyślne pozyskiwanie przez pełne płaszczyzny koronalne i wskazują na typowe pułapki, takie jak słaba jakość wstrzykiwania, artefakty ruchu oraz aberracje wywołane przez czaszkę. Protokół jest kompatybilny zarówno z badaniami przekrojowymi, jak i podłużnymi, i szczególnie nadaje się do badania zmian mózgowo-naczyniowych w modelach starzenia, udaru, tętniaków i chorób neurodegeneracyjnych. Łącząc głęboką penetrację, wysoką rozdzielczość czasoprzestrzenną oraz obrazowanie naczyń bez oznakowania, ULM oferuje potężne narzędzie do nieinwazyjnej analizy mikrocyrkulacji mózgu w modelach przedklinicznych.

Wprowadzenie

Chociaż mózg odpowiada za zaledwie 2% masy organizmu, zużywa około 20% tlenu i glukozy, aby utrzymać aktywność neuronów¹. To wysokie zapotrzebowanie metaboliczne jest zaspokajane przez złożoną sieć naczyń, od dużych tętnic i żył po mikronaczynia takie jak tętnice, żyłki i naczynia włosowate, regulowane przez sprzężenie nerwowo-naczyniowe². Zakłócenie tego precyzyjnie dostrojonego procesu zostało powiązane z szerokim spektrum zaburzeń neurologicznych. Na przykład rozłączenie nerwowo-naczyniowe to wczesna cecha patologiczna w chorobach takich jak Alzheimer, Parkinson, Huntington i stwardnienie zanikowe boczne (ALS), często poprzedzając klasyczne cechy neurodegeneracji, takie jak patologia amyloid-beta i tau 3,4,5,6. Dlatego obrazowanie złożonego charakteru mózgu in vivo jest priorytetem dla rosnącej potrzeby zrozumienia procesów fizjologicznych. Postęp technologiczny zapewnił unikalne możliwości badania funkcji i aktywności mózgu, zarówno bezpośrednio, jak i pośrednio, z coraz większą precyzją, rozdzielczością i dostępnością.

USG Dopplera stało się potężnym narzędziem do funkcjonalnego pomiaru aktywności mózgu za pomocą przepływu krwi⁷. W szczególności obrazowanie mocowe Dopplera, zaprojektowane do wykrywania ruchu czerwonych krwinek (RBC), przesyła powtarzające się impulsy ultradźwiękowe do naczyń krwionośnych i rejestruje amplitudę echa ultradźwiękowego rozpraszanego przez poruszające się RBC⁸. Pojawienie się ultraszybkiego obrazowania ultrasonografycznego, a konkretnie ultrasonografii funkcjonalnej (fUS), było kluczowym punktem w przezwyciężaniu wcześniejszych ograniczeń. Rzeczywiście, konwencjonalne USG skanuje tkanki linię po linii – jest to podejście sekwencyjne, które ogranicza zastosowanie do głównych tętnic mózgowych, ponieważ wolny przepływ krwi typowy dla mikronaczynia mózgu nie może być wykrywany⁹. Nowsza technika fUS wykorzystuje wielokrotne transmisje fal płaskich do uzyskania tysięcy klatek na sekundę, co znacząco poprawia zarówno rozdzielczość czasową, jak i stosunek sygnału do szumu (SNR). Co istotne, fUS umożliwia wykrywanie zmian hemodynamicznych w bardzo małych naczyniach o prędkościach już od 1 mm/s, wspierając funkcjonalne obrazowanie aktywności mózgu w czasie rzeczywistym aż do poziomu tętnic⁸.

Chociaż ultraszybkie metody Dopplera znacząco poprawiły obrazowanie mikronaczyniowe, nadal są ograniczone rozdzielczością ograniczoną dyfrakcyjnie ultradźwiękową¹⁰. Równolegle z fUS, ultrasonografia lokalizacyjna (ULM) przełamuje tę przeszkodę, umożliwiając wizualizację struktur mikrokrwi na poziomie kapilar poprzez wykorzystanie środków kontrastowych i wysokoprecyzyjnych algorytmów lokalizacji¹¹. Daje to bezprecedensowe wglądy w morfologię i funkcjonowanie naczyń. Dokładniej, w ULM do krwiobiegu wstrzykuje się środki kontrastowe wykonane ze stabilizowanych wypełnionych gazem mikrobąbelków o średnicy około 1-3 μm. Działają one jako silne akustyczne rozpraszacze, które można wykryć jako pojedyncze punktowe źródła. Ponieważ mikropęcherzyki są znacznie mniejsze niż długość fali ultradźwiękowej, można je izolować przestrzennie i czasowo, występując jako funkcja rozproszenia punktowego (PSF) systemu. Zainspirowane optycznymi technikami superrozdzielczości, takimi jak STORM i PALM, lokalizacja tych mikrobąbelków w subpikselach jest osiągana metodami dekonwolucyjnymi, które mapują ich pozycje z wysoką precyzją 10,12,13,14. Pozwala to na rozdzielczość struktur naczyń z rozdzielczością przestrzenną 5-10 μm, znacznie przekraczającą granicę dyfrakcyjną konwencjonalnego ultraszybkiego ultradźwiękowego obrazowania Dopplera.

ULM jest potężnym i skutecznym narzędziem do mapowania naczyń aż do skali kapilarnej i przezwycięża ograniczenia wielu metod optycznych ograniczonych do warstw powierzchniowych. Jego zdolność do wykonywania obrazowania mikronaczyniowego u żywych zwierząt, umożliwiająca badania podłużne i farmakologiczne, jest kolejną kluczową zaletą ULM w porównaniu z innymi technikami wymagającymi utrwalania mózgu i barwienia. Wyciągnięte informacje wykraczają poza statyczne mapy naczyniowe, dostarczając ilościowe szacunki przepływu krwi aż do poziomu kapilarnych, otwierając tym samym obiecujące możliwości zarówno dla zastosowań przedklinicznych, jak i klinicznych. Aby ułatwić powtarzalność, opisujemy pełny workflow dla obrazowania mózgu u gryzoni opartego na ULM, realizowany przy użyciu standaryzowanej funkcjonalnej platformy ultradźwiękowej zaprojektowanej do badań przedklinicznych.

Protokół

Wszystkie procedury opisane w tym badaniu zostały przeprowadzone zgodnie z dyrektywą Rady Wspólnoty Europejskiej z dnia 22 września 2010 roku (010/63/UE) i zatwierdzone przez lokalną komisję etyki (Comité d'éthique en matière d'expérimentation animale number 59, 'Paris Centre et Sud', projekt #2020-16). Eksperymenty przeprowadzono na dorosłych samcach myszy C57BL/6 Rj (2 miesiące, 20-30 g) oraz szczurach Sprague-Dawley Rj:Han (200-300 g) pozyskiwanych komercyjnie. Zwierzęta trzymano w grupach po cztery osoby w klatce w 12-godzinnym cyklu światła/ciemności, przy stałej temperaturze 22 °C, a jedzenie i woda były dostarczane ad libitum. Przed rozpoczęciem eksperymentów wszystkie zwierzęta przeszły co najmniej tydzień przyzwyczajenia do warunków mieszkaniowych. Odczynniki i używany sprzęt są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Przygotowanie zwierząt

1. Znieczulenie i przygotowanie zwierząt u myszy
   1. Umieść mysz w komorze indukcyjnej izofluranu, podając 2% izofluranu z powietrzem (0,075 L/min) i tlenem (0,175 L/min, czyli powietrzem medycznym).
   2. Potwierdź odpowiednią głębokość znieczulenia, sprawdzając brak odruchów w odpowiedzi na uszczypnięcie palca lub ogonu przy użyciu silnego, ale nieszkodliwego nacisku. Jeśli występuje odruch, nieznacznie zwiększ stężenie izofluranu. Jeszcze raz ocenijcie sytuację przed dalszą pracą.
   3. Przenieś zwierzę do ramy stereotaksyjnej, która jest umieszczona na poduszce grzewczej ustawionej na 37 °C, aby utrzymać temperaturę ciała, i zapewnij ciągłe dostarczanie izofluranu przez maskę w tym samym stężeniu i przepływie.
   4. Stosuj maść do oczu, aby zapobiec owrzodzeniom i powstawaniu zaćmy.
   5. Ogol głowę myszy trymerem. Nałóż krem depilacyjny, pozwól mu odchować maksymalnie 1 do 1,5 minuty, następnie dokładnie przepłucz ciepłą wodą i wysusz gazą. Powtarzaj w razie potrzeby, aż wszystkie włosy zostaną usunięte. Unikaj zostawiania kremu depilacyjnego przez dłuższy czas, ponieważ może on powodować chemiczne uszkodzenia skóry.
   6. Nałóż żel ultradźwiękowy z wirówką (wolny od pęcherzyków, odgazowany) na głowicę, aby zapewnić sprzężenie akustyczne.
2. Znieczulenie i przygotowanie zwierząt u szczurów
   1. Po zważeniu szczura podaj dootrzewnkowy zastrzyk mieszaniny ketaminy (75 mg/kg) i ksylazyny (10 mg/kg) za pomocą strzykawki o pojemności 1 mL. Ogol futro na czubku głowy i oczyść skórę roztworem jodu.
      UWAGA: Ketamina jest substancją ściśle regulowaną w wielu krajach i może wymagać specjalnej autoryzacji na zakup i stosowanie. Alternatywne schematy znieczulenia, w tym izofluran, mogą być stosowane do uzyskania znieczulenia na poziomie chirurgicznym.
   2. Umieść zwierzę na urządzeniu stereotaksyjnym, które jest umieszczone na termoforze ustawionej na 37 °C, aby utrzymać temperaturę ciała. Nałóż dużą ilość maści okulistycznej na oczy, aby zapobiec wysuszeniu i powstawaniu zaćmy.
   3. Podskórnie podawaj meloksykam (2 mg/kg) za pomocą strzykawki o pojemności 1 mL w celu leczenia śródoperacyjnego.
   4. Potwierdź odpowiednią głębokość znieczulenia, sprawdzając brak odruchów w odpowiedzi na szczypanie palca lub ogona, używając mocnego, ale nieszkodliwego nacisku. Jeśli występuje odruch, podaj dodatkową dawkę równą jednej czwartej początkowej dawki znieczulującego. Poczekaj około 5 minut przed ponowną oceną głębokości znieczulenia. Należy przystąpić tylko po potwierdzeniu planu znieczulenia chirurgicznego i oceniać co 20-30 minut.
   5. Wykonaj nacięcie podłużne wzdłuż szwu strzałkowego skalpelem, upewniając się, że cięcie jest na tyle głębokie, by objąć skórę i tkanki łączne przyczepione do czaszki.
   6. Utrzymuj otaczające tkanki odpowiednio nawodnione przez cały zabieg za pomocą soli fizjologicznej.
   7. Za pomocą wiertła obrotowego delikatnie obrysuj zarys okna czaszki, oznaczając warstwę powierzchniową czaszki. Aby uzyskać optymalny dostęp do mózgu, okno powinno mieć około 14 mm w wymiarze bocznym i co najmniej 2 mm w wymiarze przed-tylnym, w zależności od wielkości czaszki.
   8. Kontynuuj frezowanie wzdłuż konturu, aż nie pozostanie żaden opór kości. Podczas wiercenia okresowo nakładaj kilka kropel soli fizjologicznej, aby schłodzić kość i zminimalizować uszkodzenia termiczne. Cienka, zaokrąglona szpatułka powinna być łatwo włożona w szczelinę bez siły.
   9. Używając krótkich, jednokierunkowych ruchów rozcień ostatnią warstwę kości, aż opór jest ledwo zauważalny.
   10. Na bocznej krawędzi okna czaszki włóż cienką, lekko zakrzywioną łopatkę z zaokrąglonymi krawędziami.
   11. Powoli przesuwaj łopatkę w stronę środka, delikatnie odłączając kość od opon. Gdy nie poczujesz oporu, podnieś i całkowicie usuń odłączony element kości.
   12. Nałóż żel ultrasonograficzny w wirówce na górę oponę. Opis układu eksperymentalnego przedstawiono na Rysunku 1.

Rysunek 1: Schemat eksperymentalnego systemu obrazowania mózgu ULM u gryzoni. System obrazowania składa się z jednostki akwizycji ultradźwiękowej połączonej z sondą wysokoczęstotliwościową zamontowaną na zmotoryzowanym stopniu pozycjonującym. Zarówno myszy, jak i szczury są pokazane w ramach stereotaksycznych: mysz ma ogoloną skórę głowy do obrazowania przezczaszkowego, podczas gdy szczur jest poddawany obrazowaniu przez chirurgicznie przygotowane okno czaszki. Cewnik żyły ogonowy jest zakładany do wstrzykiwania środka kontrastowego u obu gatunków. Takie rozwiązanie umożliwia stabilne pozyskiwanie wysokiej rozdzielczości funkcjonalnych danych ultradźwiękowych podczas wstrzykiwania mikropęcherzyków. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

3. Cewnikowanie żyły ogonowej u myszy lub szczurów
   1. Użyj zestawu infuzyjnego o średnicy 27 G × 1/2" połączonym z igłą 18 G × 1/2" z rurką 8". Jeśli to możliwe, skrróć rurkę, aby zminimalizować martwą objętość.
   2. Delikatnie obróć ogon zwierzęcia o 90 stopni, aby odsłonić boczne żyły ogonowe (patrz Rysunek 2). Zabezpiecz ogon taśmą, aby zapewnić stabilność i zapobiec niepotrzebnemu ruchowi podczas cewnikowania.
   3. Zidentyfikuj żyłę ogonową, zaczynając od dalszego końca (czubek ogona) i przesuwając się w kierunku podstawy. Aby ułatwić ten krok, ogon można podgrzać letnią wodą, aby sprzyjać rozszerzaniu naczyń i poprawiać widoczność żył.
   4. Palcem delikatnie naciskaj u nasady ogona i przesuwaj go w kierunku miejsca wkłucia (czyli przeciwnie do kierunku przepływu krwi). Ten manewr tymczasowo utrudnia powrót żylny, powodując rozszerzenie i większe wyeksponowanie żył ogonowych i ułatwiające wprowadzenie cewnika.
   5. Włóż igłę 27 G × 1/2" zestawu infuzyjnego równolegle do żyły, upewniając się, że faza jest skierowana do góry.
   6. Obserwuj rurkę pod kątem obecności powrotu krwi, co potwierdza prawidłowe umieszczenie igły.
      UWAGA: Rozpocznij cewnikowanie od dalszego końca ogonowego, aby uniknąć wycieku z wcześniejszych nakłuć podczas kolejnych iniekcji. Jeśli cewnikowanie żyły ogonowej okaże się trudne lub nieskuteczne, można rozważyć alternatywne drogi centralne. Należą do nich zatoka zatoka lub splot zaoczodołowy, żyła szta szyjną lub żyła odpiszczelowa.

Rysunek 2: Przekrój poprzeczny ogona gryzoni ilustrujący punkty orientacyjne naczyniowe do cewnikowania. Schematyczny rysunek poprzecznego przekroju przez dalszy ogon gryzonia, pokazujący względne położenie głównych naczyń krwionośnych. W pobliżu linii środkowej znajdują się dwie tętnice: tętnica ogonowa grzbietowa, położona w górnej (grzbietowej) części ciała, oraz tętnica odwrotna ogonowa, umieszczona w dolnej (brzusznej) części przekroju ogonowego. Te tętnice są zazwyczaj unikane podczas zabiegów dożylnych. Po obu stronach tętnic bocznie znajdują się żyły ogonowe, które biegną symetrycznie po obu stronach i leżą tuż pod skórą, co czyni je preferowanymi punktami dostępu do cewnikowania lub wstrzyknięcia mikropęcherzyków. Ten anatomiczny przegląd pomaga w precyzyjnym lokalizowaniu żył, zwłaszcza gdy jest wzmocniony przez ocieplenie, aby sprzyjać rozszerzeniu naczyń. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

4. Pozycjonowanie sondy za pomocą oprogramowania IcoScan
   1. Na platformie akwizycyjnej uruchom oprogramowanie fUS (np. IcoScan dla Iconeus One) i stwórz sesję eksperymentalną. Popraw pozycję sondy USG.
      UWAGA: Umieść sondę około 1 mm nad głową szczura lub myszy. Upewnij się, że sonda jest w kontakcie z żelem ultradźwiękowym przed rozpoczęciem jakiejkolwiek sekwencji obrazowania.
   2. Rozpocznij akwizję w trybie Live View i dostosuj pozycję sondy w razie potrzeby, korzystając z obrazowania objętości krwi mózgowej (CBV) w czasie rzeczywistym. Mózg powinien być skoncentrowany na obrazie. Optymalizuj parametry obrazowania, takie jak kontrast i kompresja, aby poprawić jakość wizualizacji.
   3. Otwórz menu Angio3D w oprogramowaniu do akwizycji. Dostosuj parametry skanowania (Pierwszy Fragment, Ostatni Fragment i Rozmiar Kroku), upewniając się, że obejmują cały mózg. Rozpocznij akwizycję.
      UWAGA: Podczas ustalania parametrów skanowania upewnij się, że badanie obejmuje tylną część mózgu, czyli całe tylne tętnice.
   4. Zachowaj otwarte oprogramowanie do pozyskiwania i uruchom oprogramowanie IcoStudio do analizy i wizualizacji danych. Załaduj skan Angio3D .
   5. Przejdź do panelu rejestracji mózgu i zarejestruj skan w Allen Mouse Common Coordinate Framework , używając w pełni automatycznego lub ręcznego trybu rejestracji.
   6. Zapisz rejestrację jako plik .bps.
   7. Następnie przejdź do menu Nawigacji Mózgu . W panelu Atlas Manager użyj nawigatora drzewa rodzic/dziecko, aby przeglądać atlas mózgu myszy Allen. Wybierz wybrane obszary anatomiczne, które zostaną nałożone na skan w panelu 3-widokowym.
   8. Wybierz płaszczyznę obrazowania, która nakłada się na interesujące obszary. Ręcznie ustaw dwa markery w widoku koronalnym, aby zdefiniować docelowy przełom obrazowania.
   9. Kliknij na System Pozycjonowania Mózgu (BPS), aby wyodrębnić współrzędne motoryczne odpowiadające pozycji sondy do obrazowania wybranej płaszczyzny. Sprawdź podgląd obrazu, obliczony ze skanu Angio3D, i kliknij Skopiuj współrzędne BPS.
   10. Przełącz się na oprogramowanie IcoScan i otwórz panel pozycjonowania sondy . Kliknij na Enter Coordinates BPS i wklej wartości wyodrębnione w kroku 1.4.9. Sonda automatycznie się porusza i ustawia z wybraną płaszczyzną obrazowania.
   11. Wykonaj akwizycję w trybie Live View , aby potwierdzić, że aktualna płaszczyzna obrazowania odpowiada przewidywanej płaszczyźnie z kroku 1.4.8.
       UWAGA: Poprzez zapisywanie i ponowne wykorzystanie tych samych znaczników przestrzennych, płaszczyzna obrazowania może być konsekwentnie redefiniowana między sesjami, co umożliwia precyzyjne przemianowanie sondy do badań podłużnych.

2. Przejęcie przez ULM

1. Przygotowanie mikrobąbelków
   UWAGA: Można stosować różne komercyjnie dostępne środki kontrastu ultradźwiękowego. Jednak skład gazu, stężenie pęcherzyka, średnica i stabilność mogą się różnić w zależności od użytego produktu. Prosimy o stosowanie się do zaleceń producenta dotyczących przygotowania i przechowywania.
   1. Za pomocą sterylnej strzykawki wstrzyknij 5 ml roztworu chlorku sodu 0,9% do fiolki przez przegrodę.
      UWAGA: Przy powtarzanych podawaniach bolusowych lub ciągłych infuzji można użyć mniejszej objętości roztworu chlorku sodu 0,9% do przygotowania bardziej skoncentrowanej zawiesiny mikropęcherzykowej. Dostosuj współczynnik rozcieńczenia odpowiednio do zamierzonego zastosowania.
   2. Intensywnie mieszaj fiolkę przez 20 sekund, aby całkowicie zawiesił mikropęcherzyki i osiągnąć równomierną dyspersję.
2. Nagrania ULM
   1. Wstępnie zdefiniuj parametry nagrywania, w tym sekwencję ultradźwięków, liczbę klatek na sekundę i całkowity czas nagrywania.
      UWAGA: Zalecane parametry do nagrywania to 5-10 minut przy częstotliwości 2,5 Hz.
   2. Narysuj objętość mikrobąbelków do wstrzyknięcia i rozpocznij akwizycję. Po rozpoczęciu akwizycji przystąpi się do wstrzyknięcia mikropęcherzyków. Zaleca się wstrzykiwanie 200 μL dla szczurów i 100 μL dla myszy, przy odpowiednim rozcieńczeniu.
   3. Potwierdź wzmocnienie kontrastu na obrazie Live View. Bezpośrednio potem przepłukaj pozostałe mikrobąbelki w martwej objętości, wstrzykując płyn fizjologiczny do cewnika. Typowy przykład profilu intensywności mikropęcherzyka przedstawiono na Rysunku 3.
   4. Poczekaj na zakończenie akwizycji i zapisz dane.
   5. Na końcu akwizycji postępujemy następująco, w zależności od użytego protokołu:
      1. Dla myszy (protokół nieinwazyjny): Odwróć znieczulenie, przerywając podawanie izofluranu i monitoruj zwierzę podczas rekonwalescencji w ciepłym środowisku, aż do całkowitej przytomności.
      2. Dla szczurów (protokół inwazyjny z oknem czaszkowym): Uśpić zwierzę przez intraperitonealny zastrzyk Euthasolu (pentobarbital sodu, 140 mg/kg), zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi i etycznymi.

Rysunek 3: Natężenie sygnału mikrobąbelkowego w czasie. (A) Ilustracja obszaru zainteresowania (ROI) używanego do ekstrakcji sygnału, obejmującego całą koronalną przecięcie mózgu. (B) Przebieg czasowy intensywności sygnału mikropęcherzyka podczas 5-minutowego pozyskiwania. Mikrobąbelkowy bolus był wstrzyknięty z prędkością 30 sekund, co spowodowało charakterystyczny wzrost amplitudy sygnału. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

3. Rekonstrukcja obrazu z użyciem oprogramowania IcoLab

1. Otwórz IcoLab i przejdź do ULM, klikając zakładkę ULM w najbardziej lewej części ekranu.
2. Kliknij na Compute ULM Maps , aby rozpocząć proces przetwarzania, zgodnie ze szczegółami na Rysunku 4.
3. Wybierz folder źródłowy zawierający pozyskane dane.
4. Wybierz konkretny skan do przetworzenia i w razie potrzeby dostosuj granice czasu przetwarzania.
5. Kliknij Dalej, aby przejść do kroku Raportowanie. W etapie raportowania skonfiguruj ścieżkę folderu wyjściowego, w której będą zapisywane przetworzone pliki. Ustaw parametry wizualizacji dla obrazów, które zostaną uwzględnione w raporcie PowerPoint.
6. Przejrzyj podsumowanie wybranych opcji wyświetlane na ekranie końcowym.
7. Gdy będziesz gotowy, kliknij RUN , aby rozpocząć przetwarzanie. Po zakończeniu przetwarzania zostanie wygenerowany plik .trk, zawierający wszystkie współrzędne zlokalizowanych mikrobąbelków oraz rasteryzowane pliki TIFF dotyczące gęstości, prędkości i amplitudy rozproszenia wstecznego (BSA).
   UWAGA: 5-minutowe pozyskiwanie może wymagać kilku godzin przetwarzania. Ten krok najlepiej wykonać w nocy lub na dedykowanym stanowisku roboczym.
   1. Generowanie map gęstości mikropęcherzyków: Lokalizowane pozycje wszystkich wykrytych mikrobąbelków są gromadzone w wybranym czasie pozyskania. Odwzoruj te pozycje na siatkę przestrzenną o stałej rozdzielczości.
      UWAGA: Każdy piksel w powstałej mapie gęstości odzwierciedla liczbę mikrobąbelków zlokalizowanych w tym przestrzennym pojemniku. Ostatecznym wynikiem jest obraz w skali szarości (TIFF), gdzie intensywność pikseli odpowiada obsadzeniu naczyń, co umożliwia wysokorozdzielczą rekonstrukcję sieci naczyniowej.
   2. Generowanie map prędkości: Oprogramowanie śledzi pojedyncze mikrobąbelki w kolejnych klatkach, aby utworzyć trajektorie. Dla każdej trajektorii oprogramowanie oblicza wektor prędkości, dzieląc przemieszczenie przez upływany czas (dając wektor prędkości w mm/s).
      UWAGA: Można wygenerować dwa typy map prędkości: mapy prędkości bezwzględnej, gdzie każdy piksel przechowuje średnią prędkość i wielkość przechodzących przez nią mikrobąbelków, oraz mapy prędkości kierunkowej, gdzie prędkość jest rozkładana wzdłuż wybranej osi anatomicznej (np. x lub z), a odpowiadający mu składowy ze znakiem jest przechowywany. Te mapy są rasteryzowane na tej samej siatce przestrzennej i zapisywane jako poszczególne obrazy TIFF.
   3. Generowanie map BSA: Dla każdej zlokalizowanej mikrobąbelki wyświetlana jest surowa amplituda sygnału ultrasonograficznego (intensywność rozproszenia wstecznego). Rzutuj te amplitudy na siatkę przestrzenną, kumulując intensywność sygnału w każdym pikselu. Powstała mapa BSA podkreśla obszary, w których mikropęcherzyki przechodziły przez ogniskową strefę wiązki, zapewniając kontrast uzupełniający mapy gęstości i prędkości¹⁵.

Rysunek 4: Schemat przepływowy pipeline'u przetwarzania do rekonstrukcji map ULM. Rysunek ilustruje kolejne kroki przetwarzania wykonywane w oprogramowaniu analitycznym w celu generowania map ULM na podstawie surowych danych ultrasonograficznych. Zaczynając od układów złożonych (n = 200), Krok 1 stosuje filtrowanie zakłóceń z dekompozycją wartości osobliwych (SVD), aby odizolować sygnały mikrobąbelków (MB) od tła tkanki. W kroku 2 sygnały MB przechodzą interpolację Lanczos, co skutkuje powstaniem wstępnie przetworzonego stosu obrazów. Krok 3 wykonuje lokalne wykrywanie maksimów i koreluje je z funkcją rozpraszania punktowego systemu (PSF), aby zidentyfikować kandydujące lokalizacje mikropęcherzyków. W kroku 4 do wyodrębnienia trajektorii mikrobąbelków wykorzystuje się lokalizację subpikseli (detekcję centroidów) oraz śledzenie cząstek, z których oblicza się mapy prędkości i amplitudy rozproszenia wstecznego. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

4. Wizualizacja danych z wykorzystaniem oprogramowania IcoStudio

1. Załaduj plik .trk w IcoStudio, aby rozpocząć eksplorację danych.
2. Dostosuj parametry wizualizacji, takie jak kontrast, kompresję i mapę kolorów w prawym panelu bocznym, aby doprecyzować reprezentację danych.
3. Ustaw czas integracji, używając podwójnego suwaka na dole głównego widoku, aby zdefiniować klatki początkowe i końcowe.
4. Otwórz zakładkę Gęstość , aby zobaczyć występowania mikrobąbelków i wybierz między gęstością bezwzględną (liczba na piksel) a gęstością kierunkową (ważoną osiowo).
5. Użyj zakładki Prędkość, aby wyświetlić prędkość mikrobąbelka w mm/s w kilku trybach: Absolutny, Kierunkowy, Osiowy i Boczny. Dostosuj progi kontrastu, kompresji i prędkości, aby poprawić wizualizację.
6. Sprawdź zakładkę BSA, aby zobrazować odbicie mikropęcherzyków, oferując alternatywny mechanizm kontrastu podkreślający struktury mikronaczyniowe i ruchy poza płaszczyzną. Eksportuj zrzuty PNG w wysokiej rozdzielczości lub generuj pliki TIFF do analizy ilościowej z możliwością dostosowania rozmiaru pikseli i typów danych.

Wyniki

Reprezentatywne przykłady na Rysunku 5 pokazują typowy przykład danych ULM z mózgiem szczura uzyskanym w ciągu 1 minuty zapisu po wstrzyknięciu 200 μL bolusu mikrobębelkowego, z rozdzielczością 10 μm.

Rysunek 5: Reprezentatywne wyjścia ULM uzyskane od kraniotomizowanego szczura po pojedynczym zastrzyku mikropęcherzyka. Przykładowe mapy gęstości mikropęcherzyków (MB) (po lewej), prędkości (w centrum) i amplitudy rozproszenia wstecznego (po prawej) przedstawiono dla pełnego koronalnego cięcia mózgu, uzyskanego w ciągu 1 minuty zapisu po wstrzyknięciu bolusu mikropęcherzyków 200 μL. Pasek skalowy: 2mm. Powiększone wstawki podkreślają mikronaczynia lewej kory (pasek skali: 0,5 mm). Mapa gęstości odzwierciedla przestrzenny rozkład wystąpień MB, ujawniając strukturę sieci naczyniowej. Mapa prędkości ilustruje prędkość przepływu i kierunkowość poszczególnych MB, umożliwiając rozróżnienie typów naczyń. Mapa amplitudy pokazuje sygnał ultradźwiękowy rozproszony wstecznie z MB, zapewniając dodatkowy mechanizm kontrastu, który poprawia wizualizację morfologii naczyń i ruchu poza płaszczyzną. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Uzyskane mapy ilustrują trzy uzupełniające się spojrzenia mikronaczynia mózgu: gęstość mikrobąbelka (MB) (po lewej), prędkość (środek) oraz amplitudę rozproszenia wstecznego (po prawej). Każda mapa odpowiada pełnemu przekrojowi koronalnemu mózgu, z powiększonym wstawką podkreślającym mikronaczynia lewej kory (paski skalowe: odpowiednio 2 mm i 0,5 mm).

Mapa gęstości pokazuje przestrzenny rozkład wystąpień MB w polu widzenia. Morfologia naczyń jest rozwiązywana znacznie poniżej granicy dyfrakcyjnej, co ujawnia zarówno duże naczynia, jak i drobne struktury kapilarne. Ten typ mapy umożliwia wyraźną wizualizację topologii sieci naczyniowej, w tym bifurkacji i wzorców rozgałęzień, nawet w głębokich obszarach kory.

Mapa prędkości pokazuje prędkość przepływu poszczególnych MB rzutowanych wzdłuż kierunku osiowego (z). Ta projekcja generuje wartości prędkości z oznaką, gdzie ujemne prędkości odzwierciedlają przepływ w górę do kory, a wartości dodatnie przepływ w dół. W korze mózgowej gryzoni architektura naczyniowa jest silnie stereotypowa: tętnice penetrujące schodzą z powierzchni pialu do warstw korowych, natomiast żyłki wznoszą się z kory z powrotem na powierzchnię, odprowadzając odtlenioną krew¹⁶. To spójne ułożenie anatomiczne umożliwia stosowanie pomiarów prędkości kierunkowej do rozróżniania typów naczyń, przy czym dodatnie prędkości osiowe zazwyczaj wskazują na przepływ tętniczy, a ujemne na drenaż żylny. Ogólnie wartości prędkości mierzone metodą ULM są zgodne z wcześniej podawanymi zakresami w literaturze^10,17, obejmując od 10-20 mm/s w tętnikach penetracyjnych do kilku centymetrów na sekundę w głównych tętnicach śródczaszkowych. Wyniki te są zgodne z wcześniejszymi obserwacjami, że przepływające mikrobąbelki ściśle naśladują reologiczne zachowanie czerwonych krwinek¹⁸, potwierdzając zastosowanie ULM do ilościowego określania dynamiki przepływu krwi fizjologicznej na mikroskali.

Mapa amplitudy rozproszonej wstecznie (BSA) dostarcza przestrzenną reprezentację intensywności sygnału ultradźwiękowego zwracanego przez każdy MB. Ponieważ energia rozproszenia wstecznego jest maksymalizowana, gdy MB przechodzą przez obszar ogniskowej, ta mapa oferuje kontrast w zależności od położenia wysokościowego. Pomaga doprecyzować segmentację poprzez identyfikację ruchów poza płaszczyzną lub o niskiej amplitudzie, szczególnie na większych głębokościach lub w pobliżu krawędzi ogniskowych. Mapy BSA są również cenne do wykrywania tłumienia sygnału związanego z głębokością lub identyfikacji niezgodności w ustawieniu ogniskowym¹⁵.

Aby zademonstrować powtarzalność celowania na płaszczyźnie za pomocą Brain Positioning System, Rysunek 6A pokazuje mapy gęstości naczyniowej ULM wykonane w tej samej myszy pod znieczuleniem w dniu 0 (Tydzień 1) i dniu 7 (Tydzień 2), celując w tę samą płaszczyznę koronalną. Nałożenie obu map pokazuje silną przestrzenną zgodność sygnału naczyniowego, potwierdzając precyzję przesuwania płaszczyzn oraz wiarygodność eksperymentów podłużnych, jak pokazano wcześniej¹⁹.

Analiza ilościowa może być stosowana do każdego z tych wyników. Na przykład użytkownicy mogą segmentować naczynia za pomocą progów intensywności lub algorytmów klastrowania, a następnie wyodrębniać regionalne statystyki, takie jak gęstość naczyń, średnia prędkość przepływu oraz parametry morfometryczne, w tym promień naczyń, średnia długość, liczba odgałęzień oraz inne wskaźniki strukturalne sieci naczyniowej. Porównania między regionami korowymi lub grupami eksperymentalnymi (np. leki poddane ws. kontrolne) można przeprowadzić bezpośrednio na tych mapach lub poprzez wyprowadzone statystyki parametryczne na powszechnie identyfikowanych naczyniach^20,21. Jako przykład takiej analizy przeprowadziliśmy regionalne kwantyfikacje parametrów naczyniowych w lewej korze somatosensorycznej (S1BF, rysunek 6B) oraz lewym wzgórzu (rysunek 6C). Mapy gęstości zostały najpierw binarizowane, skeletonizowane, a promienie naczyń oszacowano za pomocą euklidesowej transformacji odległości. Prędkości przepływu były bezpośrednio obliczane na podstawie trajektorii MB, a przepływ wyprowadzono z promienia naczynia za pomocą prawa Poiseuille'a, jak wcześniej szczegółowo opisano²¹. Zastosowano tu tę samą metodologię, co opisana w tamtym badaniu. Wykresy wąsów pokazują rozkłady promienia naczynia, prędkości i przepływu dla d0 i d7, co wykazuje dobrą powtarzalność między sesjami. Razem te multimodalne wyniki ULM umożliwiają kompleksową charakterystykę sieci mikronaczyniowej mózgu, oferując zarówno anatomiczne, jak i dynamiczne wglądy z niespotykaną dotąd rozdzielczością.

Rysunek 6: Podłużna powtarzalność celowania płaszczyznowego oraz przykład ilościfikacji naczyniowych za pomocą Systemu Pozycjonowania Mózgu. (A) Mapy gęstości naczyń ULM pobrane od tej samej znieczulonej myszy w dniu 0 (Tydzień 1) i dniu 7 (Tydzień 2), celując w tę samą płaszczyznę koronną za pomocą Systemu Pozycjonowania Mózgu (pasek skali = 1 cm). Nałożenie obu map pokazuje silną przestrzenną zgodność sygnału naczyniowego, ilustrując powtarzalność pozycjonowania płaszczyzn w różnych sesjach. (B,C) Reprezentatywna ilościowa ilościowa liczba parametrów naczyniowych wyodrębniona z dwóch obszarów zainteresowania: lewej kory somatosensorycznej (S1BF, B) oraz lewego wzgórza (C). Dla każdego obszaru wyświetlamy mapę gęstości naczyniowej w d0 (pasek skali = 0,5 cm), wraz z wykresami wąsów pokazującymi rozkład promienia naczyń (μm), prędkości przepływu (mm/s) i przepływu (mm³/s) przy d0 i d7 (mediana, 25.-75. percentyl, wąsy = 1,5×IQR, wartości odstające poszczególne wykreślone). Wyniki te ilustrują zdolność pipeline'u do wyodrębniania metryk morfometrycznych i hemodynamicznych z danych ULM. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Dyskusja

Ultrasonografia lokalizacyjna (ULM) stanowi przełomowy postęp w obrazowaniu ultrasonograficznym, umożliwiając superrozdzielczą wizualizację mikronaczyniowej poza konwencjonalnym limitem dyfrakcyjnym. Niniejsza dyskusja podkreśla kluczowe kroki protokołu ULM, omawia potencjalne modyfikacje i strategie rozwiązywania problemów, bada ograniczenia metody, ocenia jej znaczenie w porównaniu z alternatywnymi metodami obrazowania oraz rozważa jej znaczenie i potencjalne zastosowania w badaniach biomedycznych.

Kluczowe kroki w protokole ULM

Kilka kroków jest kluczowych dla pomyślnej realizacji ULM, a ich wpływ ilustruje Rysunek 7. Jednym z najważniejszych kroków jest podawanie mikropęcherzyków, ponieważ zarówno stężenie, jak i jakość dostarczania bezpośrednio wpływają na wyniki badań obrazowych. Optymalna koncentracja jest konieczna, aby zrównoważyć rozdzielczość przestrzenną i wykrywalność. Niewystarczające podanie, takie jak źle założenie cewnika lub ekstravazacja, może skutkować bardzo niskim sygnałem naczyniowym i niekompletnymi rekonstrukcjami, jak pokazano na Rysunku 7B, gdzie do krwiobiegu dociera tylko niewielka liczba mikropęcherzyków. Obrazowanie przy wysokiej liczbie klatek, zazwyczaj w zakresie kiloherców, jest niezbędne do uchwycenia szybkiego ruchu mikrobąbelków i umożliwienia niezawodnego śledzenia między klatkami. Każda niestabilność podczas akwizycji, taka jak ruch wywołany przez oddychanie, słabe stabilizowanie lub niewystarczająca anestezja, może pogorszyć dokładność lokalizacji. Przykład tego ilustruje rysunek 7C, gdzie nadmierny ruch podczas akwizycji skutkuje rozmytą i nieużyteczną mapą gęstości.

Lokalizacja i śledzenie mikrobańków zależą od zaawansowanych algorytmów przetwarzania obrazów, które wykrywają pojedyncze pęcherzyki, lokalizują subpiksele i rekonstruują trajektorie z precyzją subdyfrakcyjną. Nawet przy właściwym pozyskiwaniu i przetwarzaniu czynniki anatomiczne, takie jak aberracje wywołane czaszką, mogą nadal wpływać na jakość obrazu. W obrazowaniu przezczaszkowym, szczególnie u starszych myszy, pogrubienie czaszki może powodować zniekształcenia akustyczne. Prowadzi to do charakterystycznych artefaktów cieniowania pod szwem strzałkowym, gdzie nie wykrywa się mikrobąbelków, jak pokazano na Rysunku 7D. Takie aberracje zmniejszają stosunek sygnału do szumu i mogą zaciemniać struktury naczyniowe, jeśli nie zostaną skorygowane filtrowaniem adaptacyjnym lub doprecyzowaniem rozmieszczenia sondy.

Gdy wszystkie kroki zostaną wykonane pomyślnie, możliwe są wysokiej jakości mapy ULM, jak pokazano na Rysunku 7A, gdzie gęsta i dobrze rozdzielona sieć naczyniowa jest rekonstruowana metodą przezczaszkową.

Rysunek 7: Przykłady referencyjne i rozwiązujące problemy dotyczące jakości obrazowania ULM u myszy. Panel (A) pokazuje wysokiej jakości przezczaszkową mapę gęstości mikrobąbelków ULM (MB) uzyskaną u młodej dorosłej myszy, ilustrującą udane mapowanie naczyniowe na całej płaszczyźnie koronalnej. Panel (B) pokazuje przykład słabego sygnału naczyniowego spowodowanego ekstrawazacją mikropęcherzyków lub niewystarczającym dostępem żylnym, co skutkuje rzadkimi wykrywaniami MB. Panel (C) pokazuje akwizycję wpływającą na nadmierny ruch zwierząt, co daje rozmytą i nieinterpretowalną mapę gęstości. Panel (D) podkreśla aberrację akustyczną wywołaną przez czaszkę, powszechnie obserwowaną u starszych myszy, widoczną jako stożek cienia pod szwem strzałkowym, gdzie nie wykrywa się żadnych MB z powodu zmniejszonego stosunku sygnału do szumu. Te przykłady służą jako wizualne odniesienia do identyfikacji i adresowania typowych artefaktów eksperymentalnych w obrazowaniu ULM. Pasek skali: 1 mm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Ograniczenia metody

Pomimo wielu zalet, ULM ma wrodzone ograniczenia, które wpływają na jego zastosowanie. Błędne napięcie naczyń poza płaszczyzną jest istotnym problemem w obrazowaniu 2D, ponieważ naczynia wystające poza płaszczyznę obrazowania nie są odpowiednio odbudowane, co prowadzi do niepełnych map naczyń. To ograniczenie można złagodzić, przechodząc na obrazowanie objętościowe (3D) na^{poziomie 22}, choć zwiększa to złożoność obliczeniową. Wyzwania związane z dożylną cewnikowaniem stanowią również wyzwanie, zwłaszcza w modelach zwierząt, gdzie osiągnięcie spójnego dostarczania mikropęcherzyków może być technicznie wymagające. Stabilność mikropęcherzyków jest również czynnikiem ograniczającym, zwłaszcza podczas dłuższych sesji obrazowania. Ze względu na krótki okres półtrwania krążenia, mikrobąbelki mogą wymagać powtarzanych zastrzyków bolusowych lub ciągłych protokołów infuzji, aby utrzymać odpowiedni kontrast przez cały okres pozyskiwania. Artefakty ruchu pozostają istotnym problemem, szczególnie u osób przytomnych, gdzie nawet niewielkie mimowolne ruchy mogą pogorszyć obrazowanie w superrozdzielczości. Wreszcie, penetracja głębokości w ULM jest z natury ograniczona przez tłumienie ultradźwięków. Chociaż zazwyczaj nie stanowi to problemu przy obrazowaniu gryzoni na wysokich częstotliwościach (np. 15 MHz), to staje się to trudniejsze u większych zwierząt, takich jak świnie czy naczelne niebędące ludźmi. W takich przypadkach mogą być wymagane sondy o niższej częstotliwości, aby osiągnąć odpowiednią głębię obrazowania, ale wiąże się to z obniżoną rozdzielczością przestrzenną – podkreślając kluczowy kompromis między głębią a szczegółowością, który należy uwzględnić przy przenoszeniu ULM na większe modele przedkliniczne.

Znaczenie ULM w porównaniu z istniejącymi metodami

Ultrasonograficzna mikroskopia lokalizacyjna (ULM) oferuje znaczące przewagi w porównaniu z konwencjonalnymi metodami obrazowania, szczególnie w kontekście obrazowania mikronaczyniowego. Jedną z jego największych zalet jest zdolność do przekraczania granicy dyfrakcyjnej tradycyjnego ultradźwięku, umożliwiając obrazowanie subdyfrakcyjne na skalach przestrzennych porównywalnych z technikami optycznymi, takimi jak mikroskopia dwufotonowa. W przeciwieństwie do tych metod optycznych, ULM zapewnia głębsze przenikanie tkanek, umożliwiając dostęp do obszarów mózgu, które w innym przypadku trudno byłoby nieinwazyjnie zobaczyć.

ULM oferuje również funkcjonalne możliwości obrazowania, umożliwiające ilościową ocenę prędkości przepływu krwi, dynamiki perfuzji oraz remodelacji naczyń. Te cechy czynią ją doskonale odpowiednią do badania zarówno procesów fizjologicznych, jak i zmian patologicznych w sieciach nerwowo-naczyniowych. W porównaniu z MRI i PET, ULM jest bardziej opłacalny, nie wymaga zaawansowanej infrastruktury i unika stosowania środków kontrastowych o znanym ryzyku toksyczności, polegając zamiast tego na wypełnionych gazami mikrobąbelkach o korzystnym profilu bezpieczeństwa.

Połączenie wysokiej rozdzielczości przestrzennej i czasowej sprawia, że ULM jest szczególnie cenny w wielu zastosowaniach badawczych. Jest szczególnie skuteczny w badaniach ukierunkowanych na struktury mikronaczyniowe i głębokie jądra mózgu, gdzie tradycyjne metody często zawodzą. Co więcej, w przeciwieństwie do metod histologicznych wymagających utrwalania i barwienia tkanek, ULM umożliwia obrazowanie w czasie rzeczywistym u żywych zwierząt, wspierając projekty podłużne i dynamiczne interwencje, takie jak wyzwania farmakologiczne.

Poza statycznym mapowaniem naczyń, ULM umożliwia także obrazowanie funkcjonalne o wysokiej rozdzielczości, rejestrując dynamikę przepływu krwi w mózgu z wyjątkową precyzją przestrzenną i czasową. Najnowsze osiągnięcia wykazały jego wykonalność w funkcjonalnym neuroobrazowaniu całego mózgu u gryzoni, ujawniając zmiany przepływu krwi na poziomie kapilar wywołane bodźcem i zależne od aktywności spontaniczne. To pozycjonuje ULM jako potężne narzędzie do badań funkcjonalnych, skutecznie łącząc obrazowanie hemodynamiczne mezoskalowe z mapowaniem aktywności neuronalnej.

Aspekty użyteczności, efektywności i powtarzalności

Workflow ULM opisany w tym protokole został zoptymalizowany pod kątem łatwości implementacji i powtarzalności w różnych konfiguracjach eksperymentalnych. Zastosowanie komercyjnie dostępnych komponentów, w tym zatwierdzonych przez FDA i EMA mikrobąbelków oraz standardowych procedur znieczulających gryzoni, zapewnia szeroki dostęp. Ponadto integracja całego pipeline'u przetwarzania w dedykowanym oprogramowaniu (IcoLab) znacznie zwiększa użyteczność poprzez automatyzację złożonych kroków, takich jak lokalizacja mikrobąbelków, rekonstrukcja trajektorii oraz generowanie map. Ten uprościony interfejs zmniejsza potrzebę stosowania własnego kodu i minimalizuje ingerencję użytkownika, wspierając spójne wyniki między użytkownikami i eksperymentami. Chociaż przetwarzanie ULM o wysokiej rozdzielczości jest wymagające obliczeniowo, zwłaszcza przy długich akwizycjach lub danych wolumetrycznych, narzędzia do przetwarzania wsadowego oraz akceleracja GPU znacznie skracają czas analizy. Modułowa konstrukcja protokołu wspiera również powtarzalność, pozwalając badaczom precyzyjnie dopracowywać parametry akwizycji i przetwarzania przy zachowaniu solidnych ram analitycznych. Protokół zawiera również dedykowaną sekcję dotyczącą pozycjonowania sondy za pomocą IcoScan i IcoStudio, która pozwala użytkownikom niezawodnie przesuwać sondę na dokładnie ten sam przejście obrazowania w różnych sesjach, z dokładnością około 100 μm. Ta cecha jest szczególnie cenna w badaniach podłużnych, gdzie precyzyjna spójność przestrzenna jest niezbędna do śledzenia zmian naczyń w czasie. Te funkcje łącznie obniżają barierę wejścia dla nowych użytkowników i wspierają skalowalne wdrożenie ULM zarówno w badaniach eksploracyjnych, jak i podłużnych.

Podsumowanie

Protokół ten przedstawia kompleksowy workflow wdrażania Ultrasonografii Lokalizacyjnej (ULM) w obrazowaniu mózgu gryzoni, obejmujący przygotowanie chirurgiczne, podawanie mikropęcherzyków, pozyskiwanie obrazów oraz wysokorozdzielcze mapowanie naczyń z wykorzystaniem standaryzowanej platformy do pozyskiwania i analizy zoptymalizowanej do badań przedklinicznych. ULM stanowi znaczący postęp w obrazowaniu biomedycznym, oferując superrozdzielczą wizualizację mikronaczyniową in vivo z niespotykaną dotąd szczegółowością. W porównaniu z istniejącymi metodami obrazowania, ULM oferuje unikalne połączenie wysokiej rozdzielczości przestrzennej, funkcjonalnej ilościowej ilościowości przepływu oraz dostępności, co czyni go szczególnie dobrym do badań rozwoju naczyń, sprzężenia nerwowo-naczyniowego oraz patofizjologii chorób. W miarę jak technologia nadal dojrzewa, ULM jest na dobrej drodze, by stać się filarem zarówno badań przedklinicznych, jak i w przyszłości klinicznych zastosowań neuroobrazowania.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Regulator temperatury zwierząt (płyta grzewcza połączona z sondą odbytniczą)	Physitemp	TCAT-2DF
Atipamezole	Orion Pharma, Francja	Antisedan	Roztwór do zastrzyków 5 mg/mL
Myszy C57BL/6	Janvier Labs	SC-C57J-M	Samce myszy C57BL/6Rj, 8 tygodni
Wiertarka dentystyczna	Foredom, USA	Zestaw mikrosilnika obrotowego K.1070 o dużych prędkościach
Krem do depilacji	Vichy	Nie ma
Maść do oczu	TVM, Wielka Brytania	Ocry-żel
Podcięcie włosów	Phymep	ISIS GT 421 Aesculap
Oprogramowanie do przetwarzania IcoLab (w wersji 1.2.0.0)	Iconeus, Francja	IcoLab
Konfiguracja Iconeus One Xpand	Iconeus, Francja	IconeusOne Xpand
Sonda IcoPrime 15MHz	Iconeus, Francja	Sonda IcoPrime-15MHz
Oprogramowanie do pozyskiwania IcoScan (wersja 1.9.0)	Iconeus, Francja	IcoScan
Oprogramowanie analityczne IcoStudio (v2.2.0)	Iconeus, Francja	IcoStudio
Roztwór jodu	Mylan, Francja	Nie ma
Stacja znieczulenia izofluranowego	Minerve, Esternay, Francja	Nie ma
Ketamina	Virbac, Francja	Ketamina1000	Roztwór do zastrzyków 100 mg/mL
Meloksykam	Boehringer Ingelheim	Metacam	Roztwór do zastrzyków 0,5 mg/mL
Needles	Terumo, Francja	AN*1838R1	18 G x ½ ” igła z 8" Rurki
Woda solna	Laboratoire Gilbert Physiodose, Pharmacy, Francja	Nie ma
Skalpel	DREXCO Medical, Francja	80011
Mikropęcherzyki SonoVue	Bracco Imaging	SonoVue 8ul/ml
Łopatka	Phymed, Francja.	Zestaw mikrosilnika obrotowego K.1070 o dużych prędkościach
Sprague-Dawley Rj: Szczury Han	Janvier Labs	RN-SD-M	RjHan:SD - Samce szczurów Sprague Dawley, 200-300 g
Rama stereotaksyczna	David Kopf (Tujunga, USA)	900-WA	Używając adaptera do myszy i nie; (Ref: 922) oraz niepęknięte drążki uszne (ref: 922)
Strzykawka	DREXCO Medical, Francja	2058
Żel ultradźwiękowy	DREXCO Medical, Francja	Medi'Gel
Skrzydlaty zestaw infuzujący	Terumo, Francja	SV*27EL
Ksylazyna 2%	Bayer, Francja	Rompun	Roztwór do wstrzykiwania 20 mg/mL