Artykuł metodologiczny

Zdefiniowano przeprogramowanie ksenowolnych progenitorów krwi pępowinowej na indukowane pluripotencjalne i blastomeropodobne komórki macierzyste

DOI:

10.3791/68613

⸱

22 sierpnia 2025

 ,  , 
1Department of Oncology, Division of Pediatric Oncology and Institute for Cell Engineering, The Johns Hopkins University School of Medicine

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten przedstawia chemicznie zdefiniowane metody przeprogramowania komórek progenitorowych szpiku ludzkiej krwi pępowinowej (XF), bez karmienia (FF), bez karmienia (FF), do konwencjonalnych ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC). Te XF/FF CB-hiPSC (XF-hiPSC) mogą być skutecznie przekształcone w podobne do blastomerów naiwne komórki macierzyste regulowane inhibitorem tankyrazy / PARP1 (TIRN-SC) o zwiększonym różnicowaniu i międzygatunkowym potencjale chimerycznym.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przeprogramowanie progenitora szpiku ludzkiej krwi pępowinowej (CB) do stanu wysokiej wierności indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC) można osiągnąć za pomocą nieintegrujących wektorów episomalnych i sygnałów zrębowych. Te konwencjonalne, zagruntowane linie CB-hiPSC mogą być następnie chemicznie przywrócone z wysoką wydajnością do podobnego do blastomeru stanu naiwnych komórek macierzystych regulowanych przez tankyrazę/inhibitor PARP (TIRN-SC) z funkcjonalną totipotencją. TIRN-SC regulowane przez PARP to ludzkie komórki macierzyste o wysokiej plastyczności epigenetycznej, stabilnych odciskach epigenomicznych i mają większą siłę różnicowania niż konwencjonalne, oparte na linii hiPSC. W tym miejscu przedstawiono zoptymalizowane metody XF/FF do skutecznego przeprogramowania episomalnych komórek progenitorowych CD34 + CD33 + CB CD34 + + w konwencjonalne XF / FF hiPSC. Rewersja TIRN w sposób powtarzalny wzmacniała konwencjonalny hiPSC XF/FF w celu przyjęcia cech transkrypcyjnych, epigenetycznych i funkcjonalnych ludzkich komórek zarodkowych w fazie rozszczepienia ze zmniejszoną ekspresją genów zapoczątkowanych przez linię. Sprawdziliśmy, że XF-hiPSC pochodząca z CB odwrócona przez TIRN wykazała wyraźną poprawę w ukierunkowanym różnicowaniu wieloliniowym (w tym linii krwionośnych) w szerokim repertuarze genetycznie niezależnych środowisk. Metody te służą jako pierwszy krok do generowania zgodnych z cGMP linii TIRN-SC dla klinicznie zdefiniowanych przez HLA "uniwersalnych" banków dawców TIRN-SC (UTIRN-SC). Wyprowadzenie linii UTIRN-SC o zwiększonej wszechstronności różnicowania z progenitorów CD34 + CD33 + CB może mieć duży wpływ na medycynę regeneracyjną. Na przykład, UTIRN-SC mogą generować banki tkanek zdefiniowanych przez HLA, kriokonserwowanych komórek progenitorowych serca, naczyń krwionośnych i dawców nerwowych dla kompleksowych, wieloliniowych, "gotowych" terapii komórkowych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chociaż ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (hiPSC) oferują obiecujące możliwości spersonalizowanych terapii komórkowych, ich zastosowanie kliniczne wiąże się z poważnymi wyzwaniami, w tym rakotwórczością, immunogennością oraz heterogenicznością fenotypową i funkcjonalną1, które wpływają na ich bezpieczeństwo, skuteczność i opłacalność. Co więcej, genetorowie zaangażowani w linię wywodzący się z konwencjonalnych, zagruntowanych linii hiPSC są generowani z bardzo zmienną wydajnością różnicowania międzyliniowego2 i wykazują ograniczone wszczepienie i funkcjonalność in vivo. Ograniczenia te można jednak przezwyciężyć za pomocą zoptymalizowanych metod przeprogramowania3 lub alternatywnych stanów komórek macierzystych 4,5.

Chociaż niewirusowa skuteczność przeprogramowania episomalnego komórek somatycznych skóry lub krwi w hiPSC jest niska (~0,01%-2%)6, można osiągnąć wysoce zoptymalizowane czteroczynnikowe przeprogramowanie progenitorów CB i może osiągnąć do 50% wydajności masowej w warunkach kohodowli aktywowanej mezenchymalnym progenitorem zrębu (MSC)7. W tym systemie przeprogramowanie komórkowe komórek progenitorowych szpiku CB zostało przyspieszone przez rozpuszczalne i zależne od kontaktu sygnały zrębowe. Episomalne linie hiPSC pochodzące z CB pochodzącego ze zrębu (SP) różnicowały się w progenitory naczyniowe (VP) z wyższą skutecznością niż konwencjonalne hiPSC 3,5 pochodzące z fibroblastów. VP pochodząca z SP-CB-iPSC wykazywała bardziej autentyczną embrionalną tożsamość transkrypcyjną VP, zmniejszone starzenie się i wrażliwość na uszkodzenia DNA 3,4. VP pochodząca z SP-CB-iPSC wykazała również bardziej niezawodne wszczepienie in vivo niż konwencjonalne VP pochodzące z hiPSC po ogólnoustrojowym lub bezpośrednim przeszczepie do ciała szklistego dorosłego myszy z niedoborem odporności z uszkodzeniem niedokrwienia i reperfuzji siatkówki 3,4.

Zimmerlin i wsp. opracowali dwuetapowy system przeprogramowania chemicznego ("LIF-5i -> LIF-3i"), który przekształca zapoczątkowane, konwencjonalne ludzkie pluripotencjalne komórki macierzyste w stan TIRN-SC o zwiększonym potencjale różnicowania wieloliniowego5. Zróżnicowane progenitory naczyniowe pochodzące z TIRN-SC wykazywały wyższą funkcjonalność, większą stabilność genomu i lepsze wszczepienie in vivo, o czym świadczy ich lepsza zdolność do migracji i rewaskularyzacji głębokich warstw nerwowych niedokrwionej siatkówki4. TIRN-SC poddano przeprogramowaniu proteogenomicznemu w celu uzyskania funkcjonalnego hybrydowego stanu podobnego do blastomeru o dużym udziale w międzygatunkowym teście chimery8. TIRN-SC utrzymywały ekspresję DNMT1 i były chronione przed erozją w regionach genomowych wdrukowanych w metylację CpG. Co ciekawe, SP-CB-hiPSC zostały przekształcone w TIRN-SC bardziej efektywnie niż hiPSC uzyskane za pomocą alternatywnych, mniej wydajnych metod 5,9.

Tak więc TIRN-SC są alternatywnym stanem komórek macierzystych o ulepszonej zdolności różnicowania wielu linii i efektywnym udziale chimery. Dalsza optymalizacja
Przeprogramowanie TIRN-SC w zdefiniowanych, zgodnych z cGMP warunkach hodowli ułatwi generowanie szerokiej gamy funkcjonalnych, możliwych do wszczepienia typów komórek i tkanek do terapii. Aby zaspokoić zapotrzebowanie na opłacalne terapeutyczne czynniki progenitorowe, metody te mogą być stosowane do tworzenia banków klasy cGMP "uniwersalnego dawcy" TIRN-SC (UTIRN-SC) przy użyciu zdefiniowanych przez HLA hematopoetycznych CB CD34+ lub progenitorów krwi obwodowej. Zdefiniowane przez HLA komórki progenitorowe UTIRN-SC mogą zaspokoić potrzeby większej liczby pacjentów wymagających natychmiastowej, wieloliniowej regeneracji złożonych tkanek.

Paradygmaty opracowane dla klinicznego przeszczepiania szpiku kostnego (BMT) mogą ukierunkować rozwój banków UTIRN-SC z częściowo dopasowanych do HLA lub identycznych z HLA hematopoetycznymi komórek macierzystych z krajowych rejestrów dawców. Predykcyjna, globalna analiza obliczeniowa połączonych 10 najpopularniejszych haplotypów z 18 krajów, w tym z USA, wykazałaby, że średni odsetek pacjentów objętych takimi haplobankami hiPSC wynosi 68,4%10. Zdefiniowany bank UTIRN-SC mógłby nie tylko dostarczyć genetorów progenitorowych zaangażowanych w linię, ale także wspierać terapeutyczne zastosowania TIRN-SC międzygatunkowych systemów komplementacji blastocyst u zwierząt domowych (np. świń) do generacji całych narządów 11,12, w tym generacji indukujących tolerancję komórek progenitycznych hematopoetycznych w celu zmniejszenia odrzucenia przeszczepu w populacjach o szerokiej różnorodności genetycznej (np. USA).

Ten zmodyfikowany protokół przeprogramowania do generowania linii XF/FF hiPSC kompetentnych dla TIRN jest pierwszym krokiem do opracowania przyszłych banków UTIRN-SC zgodnych z cGMP. Protokół ten przedstawia stopniowe przeprogramowanie zrębu i walidację funkcjonalną ludzkich komórek progenitorowych szpiku CB w konwencjonalne linie XF-hiPSC. Te XF-hiPSC wykazały łatwą rewersję do TIRN-SC, ze skutecznością podobną do metod innych niż XF7 i osiągnęły nieograniczoną funkcjonalną pluripotencję, w tym zwiększoną zdolność do wytwarzania dobrze uformowanych potworniaków o obniżonym odchyleniu linii (w stosunku do izogenicznie zagruntowanego XF-hiPSC)4,5,9. Przedstawiamy również protokoły, które weryfikują XF-hiPSC odwrócony przez TIRN pod kątem ich ulepszonego i solidnego bezpośredniego różnicowania z liniami hematonaczyniowymi.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie eksperymenty z przeprogramowaniem były zgodne z wytycznymi opublikowanymi przez Narodową Akademię Nauk i Międzynarodowe Towarzystwo Badań nad Komórkami Macierzystymi (ISSCR). W przypadku wytwarzania hiPSC protokoły pobierania komórek dawcy i świadoma zgoda dawcy zostały zatwierdzone przez nadzór Instytucjonalnej Komisji Rewizyjnej (IRB) Uniwersytetu Johnsa Hopkinsa (JHU). Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone pod nadzorem JHU Institutional Stem Cell Research Oversight (ISCRO) i są zgodne ze standardami instytucjonalnymi dotyczącymi oceny świadomej zgody i pochodzenia. Ponadto wszystkie zabiegi związane z użytkowaniem zwierząt i zabiegi chirurgiczne zostały przeprowadzone zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt JHU (IACUC). Wszystkie eksperymenty obejmujące procedury na zwierzętach (np. podskórne/domięśniowe wstrzyknięcia NOD. Myszy Cg-Prkdcscid IL2rgtm1Wjl/SzJ (NOG SCID) (Jackson Labs, Bar Harbor, ME) do analizy potworniaka i transferu blastocysty do myszy w rzekomej ciąży ICR) zostały ocenione i zatwierdzone przez JHU IACUC. Przeglądy te obejmowały rozważania dotyczące etycznego poświęcenia, humanitarnego trzymania zwierząt i odpowiednich środków mających na celu zminimalizowanie dyskomfortu zwierząt.

1. Przeprogramowanie episomalne hiPSC bez ksenopozycji

  1. Preparat krwiotwórczych komórek progenitorowych dawcy
    1. Należy użyć kriokonserwowanych hematopoetycznych komórek macierzystych/progenitorowych CD34+ (np. 1x106 noworodków komórek CB) natychmiast po dostarczeniu lub przechowywać kriowialne w zbiorniku do przechowywania ciekłego azotu. Upewnij się, że ogniwa były stale utrzymywane w stanie zamrożonym podczas transportu i przenoszenia.
      UWAGA: Alternatywnie, niekriokonserwowane komórki dawcy mogą być również wykorzystane natychmiast po pobraniu i wzbogaceniu CD34 przy użyciu zatwierdzonych protokołów.
    2. Przed rozmrożeniem komórek w łaźni wodnej delikatnie otwórz wysterylizowany kriowial w komorze bezpieczeństwa biologicznego, aby uwolnić uwięziony gaz wewnątrz fiolki, a następnie szczelnie zamknij fiolkę.
    3. Umieścić fiolkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na 1 do 2 minut. Delikatnie obracać fiolkę, aż prawie nie pozostanie lód. Wyjąć fiolkę z łaźni wodnej i dokładnie ją wysterylizować (tj. 70% etanol w sprayu).
      UWAGA: Wszystkie czynności wymagają odpowiedniej techniki aseptyki i są wykonywane w sterylnej komorze bezpieczeństwa biologicznego.
    4. Delikatnie i powoli przenieś komórki do pustej sterylnej stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Przemyć fiolkę 1 ml zimnego podłoża ekspandującego krwiotwórczy progenitor układu krwiotwórczego (XF-HP) (Tabela 1) i delikatnie połączyć (kroplami wzdłuż krawędzi probówki) z komórkami w celu rozcieńczenia krioprotektantu DMSO.
    5. Pozostaw probówkę w stojaku na 30 sekund i powoli (kroplami) dodaj 2 ml zimnego podłoża XF-HP. Delikatnie zamieszaj zawiesinę komórek, dodając pożywkę. Powtórz ten krok dwukrotnie, dodając kolejno 4, 8 i 4 ml zimnego podłoża XF-HP (do 20 ml całkowitej objętości). Odwirować rozcieńczone komórki w temperaturze 100 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
      UWAGA: Nie pipetować komórek w górę i w dół w roztworze krioprotektantu oraz podczas etapów rozcieńczania. Dodawaj XP-HP pożywkę kroplami i powoli, aż DMSO zostanie rozcieńczony co najmniej 10-krotnie. Użyj zimnego podłoża, ponieważ rozcieńczenie DMSO powoduje reakcję egzotermiczną.
    6. Odessać bezkomórkowy supernatant w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Delikatnie usuń osad komórkowy. Zawiesić w 2 ml pożywki rozszerzającej XF-HP w celu zliczenia komórek za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek.
    7. Przenieść rozmrożone komórki na wielodołkowe płytki do hodowli komórek o bardzo niskim przyczepie (np. przenieść 2 ml mieszaniny komórek/pożywki XF-HP do 1 dołka na płytce 6-dołkowej).
    8. Szczelnie owiń płytkę folią Saran, aby naśladować warunki niedotlenienia. Przenieść płytkę do inkubatora (37 °C, 5% CO2, wilgotna atmosfera). Alternatywnie, należy umieścić nieopakowaną płytkę w inkubatorze z kontroląO2 (5%O2, 5% CO2, wilgotna atmosfera).
    9. Hodowla krwiotwórczych komórek progenitorowych przez 3 dni w pożywce XF-HP.
  2. Preparat z mezenchymalnych komórek progenitorowych (MSC)
    1. Rozmrozić podwielokrotność (0,75 - 1x106 komórek) o niskim pasażowaniu (p2 do p3) ludzkiego MSC przez inkubację kriokonserwowanej podwielokrotności w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 1 do 2 minut. Delikatnie obracać fiolkę, aż prawie nie pozostanie lód. Wyjąć fiolkę z łaźni wodnej i dokładnie wysterylizować (tj. 70% etanolu).
      UWAGA: Ludzki MSC o niskim pasażowaniu (p2) można zakupić lub przygotować z ludzkiego szpiku kostnego przy użyciu ustalonych protokołów i kriokonserwować. MSC można rozmrozić około 7-10 dni wcześniej i napromieniować/posiać jako warstwę zasilającą dzień przed nukleofekcją (ryc. 1).
    2. Delikatnie i powoli (kroplami wzdłuż krawędzi probówki) przenieść komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml zawierającej zimne podłoże z mezenchymalnych komórek macierzystych wolnych od surowicy (XF-MSC) (Tabela 1) w komorze bezpieczeństwa biologicznego, aby rozcieńczyć krioprotektant DMSO co najmniej 10-krotnie (np . przenieść 1 ml kriokonserwowanej porcji komórek do 9 ml pożywki XF-MSC).
    3. Użyj 1 lub 2 ml zimnego podłoża XF-MSC do przepłukania probówki i połączenia z probówką stożkową. Odwirować rozcieńczone komórki w temperaturze 100 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
    4. Odessać bezkomórkowy supernatant w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Delikatnie zawiesić osad komórkowy w 1 ml pożywki XF-MSC w celu zliczenia komórek za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek.
    5. Przenieś rozmrożone komórki na wielodołkowe płytki do hodowli komórkowych poddanych działaniu tkanki (np. 5 000-6 000 komórek nacm2 lub około 50 000 komórek w 1 dołku płytki 6-dołkowej). Umieścić płytki w inkubatorze (37 °C, 5% CO2, wilgotna atmosfera). Pożywkę XF-MSC należy odświeżać co 2-3 dni w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
    6. Dzień przed nukleofekcją odessać bezkomórkowy supernatant w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Przemyć MSC raz za pomocą PBS (2 ml/dołek). Zasysać PBS. Dodać 1 ml / studzienkę odczynnika do dysocjacji komórek (np. 1X roztwór trypsyny-EDTA). Inkubować przez 5 minut w temperaturze 37 °C w inkubatorze z użyciem CO2 .
    7. Zneutralizować odczynnik dysocjacyjny, dodając 1 ml pożywki XF-MSC (co najmniej 2-krotne rozcieńczenie) i delikatnie rozprowadzić pipetą do zawiesiny jednokomórkowej. Zebrać zawiesinę komórek do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Wirować przy 100 x g przez 5 min.
    8. Odessać supernatant. Zawiesić osad komórkowy w 1 ml pożywki XF-MSC w celu zliczenia komórek za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek.
    9. Napromieniuj (2,000 rad) mezenchymalnych progenitorów pod 5 przejściami za pomocą promiennika g lub promieniowania rentgenowskiego i płytki na pokrytych peptydem Arg-Gly-Asp (RGD) syntetycznych płytkach 6-dołkowych (2x105 komórek na dołek) w pożywce XF-MSC. Płytki należy przechowywać przez noc w inkubatorze (37 °C, 5% CO2 , wilgotna atmosfera).
  3. Przeprogramowanie episomalne wolne od ksenoów
    1. Zebrać 3-dniowe kultury CB HP w pożywce ekspansywnej XF-HP do stożkowej probówki o pojemności 15 ml w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Wirować przy 200 x g przez 5 min.
    2. Odessać bezkomórkowy supernatant w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Delikatnie zawiesić osad komórkowy w 1 ml pożywki rozszerzającej XF-HP w celu zliczenia komórek za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek.
    3. Połącz1x10 6 rozszerzonych komórek HP ze 100 μl roztworu nukleofekcji ludzkich komórek CD34 + (zestaw nukleofektora ludzkiego CD34 + ). Dodać 6 μg oczyszczonego stężonego episomu (<5 μl) i ostrożnie przenieść do kuwety nukleofektorowej za pomocą plastikowej pipety transferowej zestawu do nukleofekcji. Unikaj bąbelków. Umieścić kuwetę w urządzeniu nukleofektorowym i użyć programu U-008.
      UWAGA: Przygotuj zapasy episomalnego wektora pCEP4 pEP4 EO2S EM2K na bazie EBNA (OCT4, SOX2, MYC, KLF4) przez rutynową transformację w TOP10 E. coli i oczyść za pomocą zestawów do przygotowania plazmidu Maxi. W dniu nukleofekcji oczyść i zagęść plazmid za pomocą zestawu do oczyszczania PCR 7.
    4. Bezpośrednio po nukleofekcji dodać 500 μl wstępnie podgrzanej pożywki ekspansacyjnej XF-HP do kuwety i przenieść komórki w 1 ml pożywki XF-HP do 1 dołka 6-dołkowej płytki z ultra niskiej hodowli komórek przyczepionych za pomocą sterylnej pipety transferowej.
      UWAGA: Komórki z jądrami są bardzo delikatne i nie przetrwają naprężeń ścinających ze zwykłych końcówek do pipet o pojemności 1 ml. Przenoszenie na płytki hodowlane o bardzo niskim przyczepie jest krokiem, który wspomaga regenerację komórek po nukleofekcji przed ostatecznym przyłączeniem do płytek pokrytych RGD.
    5. Szczelnie owiń płytkę w folię, aby naśladować warunki niedotlenienia. Umieścić płytkę w inkubatorze z użyciem CO2 (37 °C, 5% CO2 , wilgotna atmosfera). Alternatywnie, należy umieścić nieopakowaną płytkę w inkubatorze z kontroląO2 (5%O2, 5% CO2, wilgotna atmosfera). Inkubować przez 4 do 6 godzin.
      UWAGA: Ten krok pozwoli na regenerację nukleofektycznych komórek HP przed przeniesieniem na monowarstwy MSC.
    6. Zebrać komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Wirować przy 200 x g przez 5 min.
    7. Odessać supernatant w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Zawiesić osad komórkowy w 1 ml podłoża rozprężnego XF-HP. Płytki nukleofektowane komórki HP na napromieniowanym MSC o gęstości około 17 500 komórek nacm2 w płytkach pokrytych RGD w pożywce ekspansyjnej XF-HP (2 ml / dołek) uzupełnionej inhibitorem ROCK Y-27632 (końcowe stężenie 10 μM). Umieścić płytkę w inkubatorze z użyciem CO2 (37 °C, 5% CO2 , wilgotna atmosfera).
    8. Dwa dni po nukleofekcji dodać 2 ml (równą objętość) pożywki E8 do każdej studzienki w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
    9. Połowę objętości pożywki hodowlanej należy wymieniać co drugi dzień na pożywkę E8. Zebrać pływające komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml, odwirować przy 200 x g przez 5 minut i dodać odzyskane komórki z powrotem do hodowli.
    10. W dniu 21 przygotuj 6-dołkowe płytki pokryte witronektyną i poddane działaniu kultur tkankowych. Dodać 1 ml rozcieńczonego roztworu witronektyny (np. 40 ml/ml dla Vitronectin-XF) do 1 dołka na 6-dołkowej płytce i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
    11. Ręczne pobieranie poszczególnych kolonii XF-hiPSC za pomocą odwróconego mikroskopu w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Rozcierać pipetą i przenosić pojedyncze kolonie na płytki pokryte witronektyną w pożywce E8 uzupełnionej inhibitorem ROCK Y-27632 (końcowe stężenie 5 μM). Umieścić płytkę w inkubatorze z użyciem CO2 (37 °C, 5% CO2 , wilgotna atmosfera).
    12. Następnego dnia ostrożnie zastąp pożywkę pożywką E8 bez suplementacji inhibitorem ROCK. Następnie codziennie zmieniaj pożywkę E8 (2 ml / dołek) w komorze bezpieczeństwa biologicznego.

2. Rutynowa hodowla i konserwacja hiPSC

  1. Kiedy kolonie stają się większe 5 do 6 dni później (tj. Średnica od 0,5 do 1 mm lub około 80% konfluencji), odessaj pożywkę w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
  2. Dodaj 2 ml/studzienkę PBS, aby umyć komórki. Zassać PBS. Dodaj 1 ml roztworu do dysocjacji komórek na bazie EDTA. Inkubować przez 5 minut w inkubatorze z użyciem CO2 ( 37 °C, 5% CO2 , wilgotna atmosfera). Sprawdź, czy komórki są luźno przymocowane (np. błyszczące okrągłe komórki, ale nadal przymocowane do płytki) za pomocą mikroskopu.
  3. Delikatnie zassać roztwór dysocjacyjny w komorze bezpieczeństwa biologicznego, nie przerywając pracy komórek.
  4. Zebrać komórki w 1-2 ml pożywki E8 uzupełnionej inhibitorem ROCK Y-27632 (końcowe stężenie 5 μM) z nieenergicznym pipetowaniem w celu utrzymania grudek komórek. Przenieść grudki komórek na płytki pokryte witronektyną (patrz sekcja 1.3.11) 6-dołkowe płytki poddane działaniu hodowli komórkowych (odpowiednik 10 kolonii na basenik lub podział 1:10). Umieścić płytkę w inkubatorze z użyciem CO2 (37 °C, 5% CO2 , wilgotna atmosfera).
  5. Kontynuuj hodowlę podwykonawczą za pomocą roztworu do dysocjacji komórek na bazie EDTA co 5-7 dni.
    UWAGA: Dodatkowe podklonowanie lub ręczne pobieranie kolonii nie jest zwykle wymagane do przeprogramowania SP-CB-hiPSC, ale jeśli klony hiPSC zawierają kolonie o nieprawidłowej morfologii (np. spontaniczne różnicowanie, takie jak fibroblasty lub tworzenie się ciała zarodka, pojawienie się nieprawidłowych, niepłaskich kolonii), ręcznie wybierz kolonie za pomocą mikropipety i mikroskopu w komorze bezpieczeństwa biologicznego lub odrzuć nieprawidłowe klony. Nieefektywne, niestabilne przeprogramowanie hiPSC nie jest kompatybilne z rewersją TIRN-SC.

3. Walidacja fenotypowa klonów XF-hiPSC

  1. Rozszerz klony XF-hiPSC przez co najmniej 5-7 pasaży w celu wstępnej walidacji (Figura 2), jak opisano w sekcji 2, przed długotrwałą kriokonserwacją i zastosowaniem w badaniach funkcjonalnych. Zapisać liczbę pasaży na każdej kriokonserwowanej fiolce.
    UWAGA: Wstępną charakterystykę klonów XF-hiPSC o niskim pasażu można potwierdzić za pomocą wielu testów, takich jak aktywność fosfatazy akalinowej i antygen TRA-1 lub immunodetekcja NANOG.
  2. Przeprowadzić walidację i liczenie XF-hiPSC za pomocą barwienia fosfatazą alkaliczną (Figura 2A,B).
    UWAGA: Wydajność przeprogramowania w hodowlach masowych można określić w P0 3-5 tygodni po jądrzakach episomalnych, wyliczając liczbę w pełni przeprogramowanych kolonii na pojedynczą komórkę wejściową posianą w dniu 3 7,13.
    1. Odessać pożywkę hodowlaną w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
    2. Umyj komórki PBS (2 ml na studzienkę). Zasysać PBS. Napraw komórki, dodając 2% roztwór paraformaldehydu/PBS. Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
    3. Usunąć i zutylizować roztwór paraformaldehydu/PBS zgodnie z wytycznymi dotyczącymi bezpieczeństwa odpadów chemicznych.
    4. Umyj komórki PBS (2 ml na studzienkę). Zasysać PBS. Dodać 1-2 ml substratu fosfatazy alkalicznej i inkubować przez 10 do 15 minut w temperaturze pokojowej z powolnym mieszaniem.
    5. Przemyć 3 razy PBS, aby zatrzymać reakcję. Mikrofotografia i wyliczenie.
      UWAGA: Unikaj nadmiernego czasu inkubacji lub temperatury, ponieważ może to spowodować fałszywie dodatnie barwienie.
  3. Przeprowadzić walidację i wyliczenie barwienia XF-hiPSC za pomocą barwienia immunologicznego antygenu TRA-1 (Figura 2C).
    UWAGA: W przypadku przeprogramowania epizodycznego wykrywanie ekspresji transgenicznej i szkieletu wektora EBNA1 podczas początkowych pasaży powinno być przeprowadzone przy użyciu opublikowanych protokołów7. Rutynowa walidacja obejmuje kariotypowanie za pomocą pasm G (ryc. 2D) lub testów pokrycia opartych na macierzy całego genomu. Podstawową funkcjonalną pluripotencję można również oznaczyć za pomocą protokołów różnicowania potworniaków (ryc. 2E) lub ilościowych kart wyników ekspresji wielogenowej nieskierowanych różnicowań ciała zarodka14.
    1. W komorze bezpieczeństwa biologicznego immunostaina replikuje studzienki dla antygenów TRA-1-60 lub TRA-1-81 przez 30 minut, dodając przeciwciała żywego barwienia sprzężone z fluorochromem do pożywki E8 w odpowiednim stężeniu.
    2. Odessać pożywkę hodowlaną. Przemyć dwukrotnie pożywką E8 (2 ml na studzienkę).
    3. Mikrofotografować i oznaczać liczbę w pożywce E8 lub podłożu wolnym od czerwieni fenolowej.
      UWAGA: Alternatywnie, utrwal komórki za pomocą 2% roztworu paraformaldehydu/PBS przez 10 minut w temperaturze pokojowej i wybarwić immunologicznie antygeny TRA-1 za pomocą standardowych przeciwciał.
  4. Walidacja immunofenotypu XF-hiPSC za pomocą cytometrii przepływowej.
    1. W komorze bezpieczeństwa biologicznego odessać pożywkę hodowlaną.
    2. Umyj komórki w PBS (2 ml na studzienkę). Zasysać PBS. Dodać enzymatyczny odczynnik dysocjacyjny (np. Accutase, 1 ml na studzienkę). Inkubować płytkę przez 5 minut w temperaturze 37 °C w inkubatorze z użyciem CO2 (5 % CO2 , wilgotna atmosfera).
    3. Zebrać komórki, dodając równą objętość pożywki hodowlanej i przepuścić przez sitko do komórek (filtr 40-70 μm). Odwirować komórki przy 200 x g przez 5 min.
    4. Zawiesić osad komórkowy w PBS z 5% FBS (1 ml na ekwiwalent studzienki). Policz liczbę komórek za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek. Rozprowadź około 100 000-200 000 komórek w probówkach z okrągłym dnem na test FACS (utrzymując objętość na poziomie około 100 μl na test).
    5. W przypadku barwienia zewnątrzkomórkowego, po opcjonalnym etapie blokowania przy użyciu czystej surowicy mysiej (dodać 5 μl na test, 5 minut w temperaturze pokojowej), inkubować z przeciwciałami sprzężonymi z fluorochromem (np. TRA-1-81 PE, SSEA4 APC) zgodnie z instrukcjami producenta. Umyć 3 ml PBS. Wirować przez 5 minut przy 300 x g. Ponowne zawieś w buforze FACS (np. PBS z 5% FBS) i uzyskaj za pomocą instrumentu FACS.
      UWAGA: zawsze używaj odpowiednich kontroli izotypów i barwij próbki równoległe, aby potwierdzić swoistość białek wykrytych immunologicznie.
    6. W przypadku barwień wewnątrzkomórkowych (np. NANOG-PE, OCT3/4-PE, SOX2-PE) należy postępować zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi etapów utrwalania/przepuszczalności. Inkubować z przeciwciałami sprzężonymi z fluorochromem lub pasującymi kontrolami izotypu. Pobieranie za pomocą instrumentu FACS.

4. Kriokonserwacja i rozmrażanie klonów XF-hiPSC

  1. Rozszerz klony XF-hiPSC przez co najmniej 5-7 pasaży, aby przeprowadzić wstępną walidację (ryc. 2) przed długotrwałą kriokonserwacją i zastosowaniem w badaniach funkcjonalnych. Zapisać liczbę pasaży na każdej kriokonserwowanej fiolce.
    1. Odessać pożywkę hodowlaną w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
    2. Umyj komórki PBS (2 ml na studzienkę). Zasysać PBS. Dodaj roztwór do odrywania komórek na bazie EDTA (1 ml na studzienkę), aby zdysocjować kolonie XF-hiPSC w grudki komórek. Inkubować płytkę przez 5 minut w inkubatorze CO2 (37 °C, 5% CO2, wilgotna atmosfera). Sprawdź, czy komórki są luźno przymocowane (np. błyszczące okrągłe komórki) za pomocą mikroskopu.
    3. Delikatnie odessać roztwór dysocjacyjny bez przerywania kolonii jednowarstwowych komórek i zebrać komórki w 1-2 ml pożywki E8 z nieenergicznym pipetowaniem, aby utrzymać grudki komórek (10-50 komórek na grudkę). Zebrać XF-hiPSC do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Odwirować komórki przy 200 x g przez 5 min.
    4. Odessać supernatant w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Zawiesić osad komórkowy w roztworze zamrażającym (tabela 2, ~ 1 studzienka równoważna na ml).
    5. Przenieś komórki do probówek kriogenicznych do długotrwałego przechowywania. Umieścić probówki w pojemniku do powolnego zamrażania i pozostawić próbki do zamrożenia przez noc w zamrażarce o temperaturze -80 °C. Następnego dnia umieść kriowiale w zamrażarce z ciekłym azotem w celu długotrwałego przechowywania.
  2. Do rozmrażania należy przygotować płytkę, wstępnie pokrywając ją witronektyną (patrz sekcja 1.3.11).
    1. Umieść zamrożoną fiolkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C i rozmrażaj komórki przez ~1-2 min. Sterylizuj (tj. etanolem w sprayu).
    2. Powoli przenieś XF-hiPSC do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 15 ml, która zawiera 9 ml pożywki do rozmrażania (Tabela 2), aby powoli rozcieńczyć komórki 10-krotnie w sterylnej komorze z kapturem bezpieczeństwa biologicznego.
      UWAGA: Nie pipetować energicznie.
    3. Wirować przy 200 x g przez 5 min.
    4. Odessać bezkomórkowy supernatant w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Zawiesić osad komórkowy w pożywce E8 (1-2 ml) uzupełnionej inhibitorem ROCK (stężenie końcowe 5 mM).
      Uwaga: Wykluczenie Y-27632 spowoduje słabą skuteczność odzyskiwania po rozmrożeniu.
    5. Przenieś rozmrożone komórki do 1 lub 2 studzienek pokrytych witronektyną na 6-dołkowej płytce. Następnego dnia zmień pożywkę na zwykłą pożywkę E8 bez inhibitora ROCK do ekspansji komórek.

5. Ksenowolne różnicowanie krwionośno-naczyniowe XF-hiPSC

  1. Różnicuj XF-hiPSC za pomocą naszego zoptymalizowanego protokołu różnicowania krwiotwórczo-naczyniowego (ryc. 3)4.
    UWAGA: Ten protokół jest modyfikowany z15.
    1. Przygotuj XF-hiPSC przy ~40-50% zbieganiu (1-3 dni po pasażu).
    2. Odessać pożywkę hodowlaną i dodać 2 ml mezodermalnej pożywki do oznaczania (Tabela 2) do komory bezpieczeństwa biologicznego.
    3. Po 2 dniach odessać pożywkę i dodać 2 ml / studzienkę pożywki do różnicowania naczyń krwionośnych (Tabela 2) do komory bezpieczeństwa biologicznego. Jeśli na tym etapie widocznych jest dużo martwych lub pływających komórek, przemyj je raz 2 ml PBS.
    4. Pożywkę do różnicowania naczyń krwionośnych należy wymieniać co drugi dzień w komorze bezpieczeństwa biologicznego do 11 dnia.
      UWAGA: Jeśli podłoże zmieni kolor na żółty z powodu dużej gęstości komórek i niskiego pH, dodaj 1 ml świeżej pożywki lub wymieniaj ją codziennie.
  2. Po 7-10 dniach hodowli w pożywce różnicującej naczyń krwionośnych należy oczyścić komórki naczyniowe CD31 + lub CD34 + z przylegającej monowarstwy za pomocą metody magnetycznego sortowania komórek kulkowych.
    UWAGA: Każdy pojedynczy klon może wykazywać odmienną kinetykę różnicowania. Określ szczytowy punkt czasowy ekspresji CD31 / CD34 za pomocą analizy FACS (Figura 4A). Wymagana jest analiza FACS przed i po wzbogaceniu kulek magnetycznych. Krwiotwórcze czynniki progenitorowe (HP) mogą być na tym etapie odzyskane z supernatantu i wzbogacone za pomocą mikrogranulek CD34. CD34+ XF-hiPSC HP może być dalej walidowany za pomocą testu metylocelulozy (Figura 4B-C)16.
    1. W komorze bezpieczeństwa biologicznego odessać pożywkę hodowlaną i przemyć komórki w PBS (2 ml na studzienkę). Odessać PBS i dysocjować kolonie hiPSC na pojedyncze komórki, dodając enzymatyczny odczynnik dysocjacyjny (np. Accutase, 1 ml na studzienkę). Inkubować komórki przez 5 minut w temperaturze 37 °C w inkubatorze z użyciem CO2 (5% CO2 w wilgotnej atmosferze).
    2. W komorze bezpieczeństwa biologicznego zbierz komórki, dodając równą objętość pożywki hodowlanej. Odwirować komórki przy 200 x g przez 5 min.
    3. Zawiesić osad komórkowy w podłożu różnicowania naczyniowego (Tabela 2). Policz liczbę komórek za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek. Odłóż około 50 000-100 000 komórek do testu FACS z pre-magnetycznym wzbogacaniem kulek przy użyciu bezpośrednio sprzężonego przeciwciała anty-CD31 lub anty-CD34.
    4. Odwirować pozostałe komórki przy 300 x g przez 5 minut. Zawiesić osad komórkowy w buforze wzbogacającym kulki magnetyczne (PBS pH 7,2, 0,5% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) i 2 mM EDTA) w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
    5. Przepuść komórki przez sitko (filtr 40-70 μm). Wirować przy 300 x g przez 5 min. Zawiesić ponownie w 60 μl buforze do wzbogacania kulek magnetycznych.
    6. Dodać 20 μl odczynnika blokującego FcR, następnie dodać 20 μl mikrogranulek CD31 lub CD34 i inkubować przez 15-20 minut w temperaturze 4 °C.
    7. Umyć komórki 2 ml buforem wzbogacającym kulki magnetyczne w komorze bezpieczeństwa biologicznego i odwirować (300 x g, 5 min).
    8. Zawiesić osad komórkowy w 1 ml buforze do wzbogacania kulek magnetycznych w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
    9. Umieść kolumnę LS w polu magnetycznym magnetycznego separatora komórkowego w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Kolumna płucząca z 3 ml buforem wzbogacającym kulki magnetyczne.
    10. Zastosuj komórki do kolumny. Zbierz nieoznakowane komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Przemyć kolumnę 3 razy za pomocą 3 ml buforu do wzbogacania kulek magnetycznych.
    11. Wyjmij kolumnę z separatora i umieść ją na nowej stożkowej probówce o pojemności 15 ml.
    12. Wypłucz magnetycznie znakowane komórki, dodając 3-5 ml pożywki do wzrostu śródbłonka. Wirować przy 200 x g przez 5 min.
    13. Zawiesić w 1 ml śródbłonka pożywki wzrostowej w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Policz liczbę komórek za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek. Odłóż około 50 000 komórek do czystości sortowania po wzbogaceniu kulek magnetycznych za pomocą analizy FACS przy użyciu bezpośrednio sprzężonego przeciwciała anty-CD31 lub anty-CD34.
    14. Wyizolowany VP można dalej namnażać na pokrytych fibronektyną (10 μg/ml) płytkach kolb poddanych kulturze tkankowej w pożywce wzrostowej śródbłonka.

6. Wytyczne do projektowania eksperymentów dla walidacji funkcjonalnej XF-hiPSC

  1. Ustalić zapasy zwalidowanego XF-hiPSC przy najwcześniejszych pasażach przy użyciu ustalonej metody nieintegrującej, takiej jak przeprogramowanie episomalnego 7,17, wirusa Sendai18 lub mRNA19.
    UWAGA: Porównanie wydajności i niezawodności metod niewymagających przeprogramowania znajduje się w innym miejscu6. Klirens materiału transgenicznego w metodach przeprogramowania wirusa episomalnego lub Sendai można zweryfikować podczas początkowych pasaży przy użyciu metod PCR 7,20. Retencja transgenu nie jest kompatybilna z generacją TIRN-SC.
  2. Walidacja prawidłowego kariotypu w klonach XF-hiPSC za pomocą pasm G lub testów pokrycia opartych na macierzy całego genomu9.
  3. Walidacja ekspresji genów i integralności epigenomicznej linii XF-hiPSC (tj. odcisków rodzicielskich, aktywacji X) za pomocą metylacji DNA i macierzy ekspresji genów lub metod sekwencjonowania 5,11,14.
  4. Walidacja podstawowej funkcjonalnej pluripotencji za pomocą protokołów różnicowania potworniaków (ryc. 2E), ilościowych testów różnicowania ciał zarodkowych (EB) przy użyciu matryc RT-PCR14 lub testów różnicowania ukierunkowanego w kierunku 3 listków zarodkowych9.
    UWAGA: Metody ilościowe zdolności różnicowania wieloliniowego i wewnątrzliniowego wskaźnika proliferacyjnego w testach potworniaków z wykorzystaniem charakterystyki histologicznej za pomocą mikroskopii przedstawiono w innym miejscu4. Protokoły ukierunkowanego różnicowania w kierunku linii mezodermalnych i specyfikacji hemato-naczyniowej (Figura 4A-C) zostały wcześniej szczegółowo opisane 4,5,9, a także ukierunkowany test różnicowania w kierunku ostatecznej endodermy (Figura 4D)5. Przykłady ukierunkowanego testu różnicowania w kierunku ektodermy podano w innym miejscu 4,5.

7. Chemiczna adaptacja XF-hiPSC do TIRN

  1. Zakup lub przygotowanie własnych karmników MEF o niskim przepływie z zarodków myszy CF1 lub CF1 x DR4 hybrid E13.5 zgodnie z opublikowanymi protokołami 9,21. Umieść 200 000 podajników MEF na studzience na żelatynizowanej (0,1% żelatyny w wodzie, 1 ml na studzienkę) 6-dołkowej płytce poddanej kulturze tkankowej co najmniej jeden dzień przed etapem adaptacji TIRN (szczegółowe protokoły TIRN znajdują się gdzieindziej 4,5,9).
  2. Utrzymanie i ekspansja wolnych od transgenów kultur XF-hiPSC z zwalidowanymi normalnymi kariotypami w systemie hodowli bez karmienia (np. pożywka E8, patrz tabela 1 dla preparatu własnego).
  3. Zastąp pożywkę E8 pożywką LIF-5i (2 ml na studzienkę; Tabela 1) po osiągnięciu ~50% konfluencji kultur XF-hiPSC (tj. 3-5 dni po wstępnym posiewie) w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
  4. Następnego dnia odessać pożywkę hodowlaną i przemyć XF-hiPSC przystosowany do LIF-5i za pomocą PBS (2 ml na studzienkę) w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Odessać supernatant i dodać 1 ml odczynnika enzymatycznego do dysocjacji komórek do każdej studzienki. Inkubować przez 5 minut w temperaturze 37 °C w inkubatorze z użyciem CO2 .
  5. Delikatnie rozprowadzić pipetą do zawiesiny jednokomórkowej w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Zneutralizować pożywką LIF-5i (1 ml na dołek). Zawiesinę komórkową zebrać do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Wirować przy 200 x g przez 5 minut.
  6. Odessać supernatant w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Zawiesić osad komórkowy w 2 ml pożywki LIF-5i.
    UWAGA: Jeśli to możliwe, weź podwielokrotność do zliczania komórek. Możliwe jest zneutralizowanie aktywności enzymatycznej za pomocą pożywki LIF-5i/LIF-3i bez suplementacji inhibitorami lub czynnikami wzrostu.
  7. Przemyć płytkę MEF dwukrotnie PBS (2 ml na studzienkę w płytkach 6-dołkowych) i dodać komórki (1 studzienkowy odpowiednik komórek przystosowanych do LIF-5i do 1 dołka podajników MEF w 2 ml pożywki LIF-5i).
    UWAGA: Optymalizacja początkowych gęstości poszycia dla każdej pojedynczej linii XF-hiPSC jest opcjonalna. Jeśli komórki zostały policzone w poprzednim kroku, należy umieścić co najmniej 1x106 komórek w każdym dołku na podajnikach. Przenieść płytkę do inkubatora CO2 (37 °C, 5% CO2, wilgotna atmosfera).
  8. Hodowla i utrzymanie XF-hiPSC przez 3-5 dni w LIF-5i na MEF w inkubatorze CO2 (37 °C, 5% CO2, wilgotna atmosfera). Zmieniaj pożywkę LIF-5i codziennie.
  9. Po utworzeniu kolonii TIRN-SC w kształcie kopuły (po 3-5 dniach hodowli na karmnikach) należy zassać pożywkę hodowlaną w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Umyj każdą studzienkę 2 ml PBS.
  10. Zasysać PBS. Dodać 1 ml roztworu do oddzielania komórek (np. Accutase) do każdego dołka. Inkubować przez 5 minut w temperaturze 37 °C w inkubatorze z użyciem CO2 (5% CO2 w wilgotnej atmosferze).
  11. Dodaj 1 ml pożywki LIF-3i (Tabela 1) do każdej studzienki w komorze bezpieczeństwa biologicznego, aby zneutralizować odczynnik dysocjacyjny. Delikatnie rozetrzeć i zebrać komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Wirować przy 200 x g przez 5 min.
  12. Odessać supernatant w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Ponownie zawiesić w pożywce LIF-3i (1 ml na studzienkę) w celu zliczenia komórek za pomocą hemocytometru lub automatycznego licznika komórek. Płytka ~ 5 x 105 komórek w 2 ml pożywki LIF-3i na studzienkę na napromieniowany MEF w żelatynizowanych 6-dołkowych płytkach w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
    UWAGA: powtórz kroki 7.12 5o 7.16 dla wszystkich kolejnych pasaży. Po początkowej hodowli przystosowanej do LIF-5i, płytkie LIF-3i hoduje się w mniejszej gęstości (2x105 komórek/basenik) i pasażuje co 3-4 dni.
  13. Pasaż XF-hiPSC odwrócony przez TIRN przez co najmniej 6-7 ciągłych pasaży w pożywce LIF-3i przed użyciem w badaniach funkcjonalnych lub kriokonserwacji. Zapisać liczbę pasaży w pożywce zagruntowanej bez ksenopozycji (np. E8) lub pożywce LIF-5i/LIF-3i TIRN.
    UWAGA: Odwrócenie TIRN linii XF-hiPSC o wysokim przejściu (np. >p40) jest nieefektywne i nie jest zalecane. Linie o wysokim pasażu często zawierają defekty chromosomowe lub subchromosomowe, które nie są zgodne z efektywną rewersją TIRN i skutkują słabą wydajnością rewersji i ograniczoną stabilnością hodowli. Również stosowanie kultur TIRN, które przeszły więcej niż 15 pasaży w pożywce LIF-3i, nie jest zalecane do badań funkcjonalnych. Funkcjonalny wpływ odwrócenia XF-hiPSC przez TIRN jest najbardziej widoczny między 7 a 15 pasażami w pożywce LIF-3i.

8. Eksperymentalne wytyczne projektowe dla ukierunkowanego różnicowania TIRN-SC pochodzącego z XF/FF hiPSC.

  1. Bezpośrednie wykorzystanie TIRN-SC pochodzącego z hiPSC XF/FF w ustalonych protokołach ukierunkowanego różnicowania bez żadnego etapu "ponownego przygotowania" (tj. braku wymogu przełączania komórek macierzystych TIRN z powrotem do konwencjonalnych warunków "zagruntowanych" przed ich użyciem w testach ukierunkowanego różnicowania).
  2. W celu funkcjonalnej oceny wpływu TIRN na XF-hiPSC, należy równolegle skonfigurować siostrzane kultury izogeniczne o równoważnej liczbie pasaży. Utrzymuj równolegle izogeniczne kultury XF-hiPSC z rodzeństwem zagruntowanym/TIRN w ich odpowiednich pożywkach (np. E8 na witronektynie vs. LIF-3i na MEF) i jednocześnie wykonać test potworniaka (ryc. 5) lub różnicować przy użyciu identycznego ciała zarodka lub protokołów i materiałów do ukierunkowanego różnicowania (ryc. 6).
  3. Jeśli to możliwe, przeprowadź funkcjonalną ocenę zróżnicowanych linii końcowych. Na przykład progenitorów naczyniowych można ocenić za pomocą ekspresji białka, testu wychwytu acetylowanej lipoproteiny o niskiej gęstości (LDL) sprzężonej z DiI i testu probówki Matrigel (ryc. 7).
    UWAGA: Dodatkowe testy funkcjonalne dla VP pochodzącego z CB-hiPSC i TIRN-SC (tj. testy wychwytu/starzenia/proliferacji/migracji DiI-Ac-LDL, testy probówki Matrigel in vitro, test zatyczki Matrigel u zwierząt, testy ksenotransplantacji) są szczegółowo opisane w innym miejscu 3,4.
  4. Dostosuj i zoptymalizuj początkową gęstość posiewu i kinetykę (rysunek 6) dla każdego pojedynczego klonu XF-hiPSC w każdym teście różnicowania.
    UWAGA: XF-hiPSC odwrócony przez TIRN ma bardziej silną zdolność proliferacyjną i różnicującą w testach ukierunkowanego różnicowania niż primedowane XF-hiPSC.Hodowle TIRN zazwyczaj wymagają niższej początkowej gęstości posiewu niż kultury E8 i nie wymagają stosowania suplementów antyapoptotycznych w celu zwiększenia przeżycia klonów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten optymalizuje opublikowane metody skutecznego przeprogramowania progenitorów szpiku do stanu pluripotencjalnego o wysokiej wierności przy użyciu wektorów episomalnych i sygnałów zrębowych7. Protokół (ryc. 1) przedstawia zdefiniowane metody przeprogramowania episomalnego zrębu XF / FF ludzkich progenitorów CB CD34 + w XF-hiPSC i instruuje, jak zweryfikować ich funkcjonalność poprzez ukierunkowaną specyfikację krwiotwórczo-naczyniową, a n...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Grupa z Zambidu pierwotnie opisała wysoce zoptymalizowaną czteroczynnikową metodę episomalną do przeprogramowania komórek progenitorowych szpiku CB zaangażowanych w linię w CB-hiPSC z masową wydajnością sięgającą do 50% w oczyszczonych komórkach eksprymujących episom7. W niniejszym artykule przedstawiliśmy zmodyfikowaną wersję oryginalnego protokołu przeprogramowania episomalnego ludzkiego progenitora CB w warunkach zrębu XF / FF. W metodzie tej wykorzystano zwiększoną zdolność przeprogramowywania...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Brak informacji do zadeklarowania.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prace te były wspierane przez granty z NIH/NEI (R01EY032113; ETZ), Fundusz Badań nad Komórkami Macierzystymi Maryland (2023-MSCRFV-5995; 2024-MSCRFV-6248; 2025-MSCRFV-0005; 2025-R2-MSCRFV-0004 (ETZ) oraz Fundacja Lisy Dean Moseley (ETZ).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Amaxa Biosystems Nucleofector IILonzaZobacz materiał AAB-1001
przeciwciało anty-CD143 (BB9), sprzężone z APC BD Nauki biologiczne557929Użyj 10-20 i mikro; L na test (FACS)
przeciwciało anty-CD144, sprzężone z PE BD Nauki biologiczne560410Użyj 10-20 i mikro; L na test (FACS)
przeciwciało anty-CD146, sprzężone z PE BD Nauki biologiczne550315Użyj 10-20 i mikro; L na test (FACS)
przeciwciało anty-CD184/CXCR4, sprzężone z APC BD Nauki biologiczne555976Użyj 10-20 i mikro; L na test (FACS)
przeciwciało anty-CD31BD Nauki biologiczne550389Rozcieńczyć w stosunku 1:100 w roztworze blokującym do testu immunofluorescencyjnego
przeciwciało anty-CD31, sprzężone z APC eBionauka17-0319-42Użyj 2 i mikro; L na test (FACS)
przeciwciało anty-CD34, sprzężone z APC BD Nauki biologiczne555824Użyj 5 i mikro; L na test (FACS)
przeciwciało anty-CD45, sprzężone z PE BD Nauki biologiczne555483Użyj 10-20 i mikro; L na test (FACS)
przeciwciało anty-NANOG, PE sprzężoneBD Nauki biologiczne560483Użyj 10-20 i mikro; L na test (FACS)
przeciwciało anty-OCT4, PE sprzężoneR& Systemy DIC1759PUżyj 10 i mikro; L na test (FACS)
przeciwciało anty-SOX17, sprzężone z Alexa488 BD Nauki biologiczne562205Użyj 5 i mikro; L na test (FACS)
przeciwciało anty-SOX2, sprzężone z PER& Systemy DIC2018PUżyj 10 i mikro; L na test (FACS)
przeciwciało anty-SSEA-4, sprzężone z APC R& Układ DFAB1435AUżyj 5 i mikro; L na test (FACS)
przeciwciało anty-SSEA-4 GloLIVE, sprzężone z NL493R& Układ DNLLC1435GStosować w rozcieńczeniu 1:50 (żywe i utrwalone barwienia immunologiczne)
zestaw koniugatu anty-TRA-1-60 A488ThermoFisher NaukowyA25618
przeciwciało anty-TRA1-60, sprzężone z PEBD Nauki biologiczne560193Użyj 10 i mikro; L na test (FACS)
przeciwciało anty-TRA-1-60 GloLIVE, sprzężone NL557 R& Systemy DNLLC4770RKorzystanie w  rozcieńczenie 1:50 (żywe i utrwalone barwienia immunologiczne)
przeciwciało anty-TRA-1-60 StainAlive, sprzężone z DyLight 488Stemgent (Łodyga)09-0068Stosować w rozcieńczeniu 1:100 (żywe i utrwalone barwienia immunologiczne)
przeciwciało anty-TRA1-81, sprzężone z PEBD Nauki biologiczne560161Użyj 10 i mikro; L na test (FACS)
przeciwciało anty-TRA-1-81 StainAlive, sprzężone z DyLight 488Stemgent (Łodyga)09-0069Stosować w rozcieńczeniu 1:100 (żywe i utrwalone barwienia immunologiczne)
CD31 MicroBead Kit, ludzkiMiltenyi Biotec130-091-935
CD34 MicroBead Kit, ludzkiMiltenyi Biotec130-046-702
CD34+ Dawcy mieszani,  Krew pępowinowa, 1 milion komórekWszystkie komórkiCB, CR, CD34+, Mieszane, PS, CS10, 1MAlternatywnymi źródłami komórek są wątroba płodu, szpik kostny dorosłego człowieka i zmobilizowana krew obwodowa
Mysz CF1Rzeka Karola023
CHIR99021R& Układ DL5283rozpuszczona w 100 mM w DMSO
Płytki 6-dołkowe Corning Costar poddane kulturze tkankowejCorning3506
Corning Synthemax II-SC Substrat, fiolka 10 mgCorning3535stosować w 5 μ g/cm2 zamiennik dla Corning 3978
Corning Synthemax-R płytka 6-dołkowaCorning3978Wycofane i zastąpione przez 3535
Costar 6-dołkowa przezroczysta, z płaskim dnem i ultra-niską nasadką 6-dołkowa płytkaCorning3471
Hrabina  Suwak komory zliczania komórekThermo Fisher NaukowyZobacz materiał C10228
Automatyczny licznik komórek CountessThermo Fisher NaukowyAMQAX1000
CryoStore CS10Technologie komórek macierzystych100-1061
DII-AC-LDLThermo Fisher NaukowyL3484stosować przy 5-15 &mikro; g/ml
DMEM (zmodyfikowane podłoże Dulbecco's Eagle Medium) Thermo Fisher Naukowy11995065
DMEM/F-12 , suplement GlutaMAXThermo Fisher Naukowy10565018
DMEM/F-12, HEPESThermo Fisher Naukowy11330032
DMSO (sulcotlenek dimetylu)Sigma AldrichZobacz materiał D2650
Mysz DR4Laboratorium Jacksona3208
Podstawowy 8 (E8) średniTechnologie komórek macierzystych5940
Surowica bydlęca płodu (FBS)Thermo Fisher NaukowySH30071.03
NAPRAWA & Zestaw do permeabilizacji komórek PERMThermo Fisher NaukowyGAZ004 powiedział:
ForskolinaStemgent (Łodyga)04-0025rozpuszczona w 100 mM w DMSO
Żelatyna (wieprzowa)Sigma AldrichG1890-100GPonownie zawiesić w wodzie i sterylizować w autoklawie
ludzki jądro komórkowe CD34+  zestawLonzaVPA-1003
Izotyp myszy IgG1 PE sprzężonyBD Nauki biologiczne554680
Izotyp myszy IgG2a PE sprzężonyBD Nauki biologiczne558595
Izotyp szczura IgG2b PE sprzężonyR& Systemy DIC013P
Wymiana serum KnockOutThermo Fisher Naukowy10828-028
Kwas L-askorbinowyMillipore SigmaNumer katalogowy A8960
L-Glutamina (100X)Thermo Fisher Naukowy25030-081
Kolumny LSMiltenyi Biotec130-042-401
MatrigelCorning356237Użyj 200 &mikro; L/studzienka w płytkach 48-dołkowych
MEM Aminokwas endogenny (MEM NEAA) (100X)Thermo Fisher Naukowy11140-050
MethoCult SF H4436Technologie komórek macierzystych04436
MidiMACS SeparatorMiltenyi Biotec130-042-302
mTeSR1 średniTechnologie komórek macierzystych85850
Fiolki kriogeniczne NalgeneThermo Fisher Naukowy5000-0020
Roztwór paraformaldehydu, 4% w PBSThermo Fisher NaukowyJ19943. Zobacz materiał K2rozcieńczyć do wymaganego stężenia przy użyciu PBS
PD0325901Sigma AldrichZobacz materiał PZ0162rozpuszczona w 100 mM w DMSO
Penicylina/streptomycyna (10 000 U/ml)Thermo Fisher Naukowy15140-122
episom pEP4 E02S EM2KAddgene powiedział:20923Plazmidy rozmnażano w TOP10 E.  coli (Invitrogen) i oczyszczone za pomocą zestawów QIAGEN plasmid Maxi. 
Solanka fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)Przemysł biologiczny02-023-1A
Poietics ludzkie mezenchymalne komórki macierzyste LonzaZobacz materiał PT-2501750 000 komórek w przejściu 2 można rozmrozić i rozmnożyć zgodnie z instrukcjami producenta dla 1-2 przejść przed użyciem lub wtórnym bankowaniem
PurmorfaminaStemgent (Łodyga)04-0009rozpuszczono w 10 mM w DMSO
rekombinowana aktywina APeprotech120-14EPonowne zawieszenie w  (100 &mikro; g/ml) w sterylnym PBS, 0,1% albuminy surowicy ludzkiej lub bydlęcej
rekombinowany ludzki FGF2Peprotech100-18 mldPonowne zawieszenie w  (100 &mikro; g/ml) w sterylnym PBS, 0,1% albuminy surowicy ludzkiej lub bydlęcej
rekombinowany ludzki FGF-zasadowy (bFGF)Peprotech100-18 mldreupend na 100 µ g/ml w 0,1% surowicy bydlęcej/albuminie ludzkiej w PBS
rekombinowany ludzki ligand FLT3R& Systemy D308-FKHB lub  308E-GMPPonowne zawieszenie w  (100 &mikro; g/ml) w sterylnym PBS, 0,1% albuminy surowicy ludzkiej lub bydlęcej
rekombinowana insulina ludzkaBioklejnoty10-365
rekombinowany ludzki ligand Kit-ligandR& Systemy DBT-SCF lub BT-SCF-GMPPonowne zawieszenie w  (100 &mikro; g/ml) w sterylnym PBS, 0,1% albuminy surowicy ludzkiej lub bydlęcej
rekombinowany ludzki LIFPeprotech300-05reupend na 100 µ g/ml w 0,1% albuminie surowicy bydlęcej/ludzkiej w PBS
rekombinowany ludzki TGF i beta; 1Peprotech  100-21reupend na 100 µ g/ml w 0,1% albuminie surowicy bydlęcej/ludzkiej w PBS
Rekombinowana ludzka trombopoetyna R& Systemy D288-TPN lub 288E-GMPPonowne zawieszenie w  (100 &mikro; g/ml) w sterylnym PBS, 0,1% albuminy surowicy ludzkiej lub bydlęcej
rekombinowana transferyna ludzkaMillipore SigmaZobacz materiał T3705
występujący u ludzi BMP4Peprotech120-05Ponowne zawieszenie w  (100 &mikro; g/ml) w sterylnym PBS, 0,1% albuminy surowicy ludzkiej lub bydlęcej
SB431543Selleckchem powiedział:Zobacz materiał S1067rozpuszczono w 10 mM w DMSO
SIGMAFAST, podłoże fosfatazy alkalicznej, chromogeniczne, tabletkaMillipore SigmaZobacz materiał B56551 tabletkę rozpuścić w 10 ml oczyszczonej wody
Selenin soduMillipore SigmaZobacz materiał S5261
Stemolekuła Y27632 w roztworzeStemgent (Łodyga)04-0012-02Inhibitor ROCK w roztworze (10 mM)
StemPro Accutase Odczynnik do dysocjacji komórekThermo Fisher NaukowyA11105-01
StemPro MSC SFM XenoFree (XF-MSC)Thermo Fisher NaukowyA1067501Przygotuj pożywkę XF-MSC, mieszając 5 ml suplementu StemPro MSC SFM XenoFree z 500 ml pożywki StemPro MSC SFM Basal Balance. Podłoże można kriokonserwować w temperaturze -20°C.
StemSpan SFEMTechnologie komórek macierzystych9600
Thermo Scientific Mr. Frosty Pojemnik do zamrażaniaThermo Fisher Naukowy5100-0001
Ulex Europaeus Agglutin I (UEA-1), biotynilowanyLaboratoria wektoroweB-1065-2Rozcieńczyć w stosunku 1:200 w roztworze blokującym do oznaczania fluorescencyjnego
VEGF (Fundusz Energii NożnejPeprotech100-20Ponowne zawieszenie w  (100 &mikro; g/ml) w sterylnym PBS, 0,1% albuminy surowicy ludzkiej lub bydlęcej
Roztwór VerseneThermo Fisher Naukowy15040066
Matryca witronektyny XFTechnologie komórek macierzystych7180rozcieńczyć w 40 &mikro; L/ml w buforze do rozcieńczania CellAdhere
XAV939Sigma AldrichZobacz materiał X3004rozpuszczona w 100 mM w DMSO
β-merkaptoetanolThermo Fisher Naukowy21985-023wrażliwy na światło

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Yamanaka, S. Pluripotent stem cell-based cell therapy: Promise and challenges. Cell Stem Cell. 27 (4), 523-531 (2020).
  2. Kyttala, A., et al. Genetic variability overrides the impact of parental cell type and determines iPS cell differentiation potential. Stem Cell Rep. 6 (2), 200-212 (2016).
  3. Park, T. S., et al. Vascular progenitors from cord blood-derived induced pluripotent stem cells possess augmented capacity for regenerating ischemic retinal vasculature. Circulation. 129 (3), 359-372 (2014).
  4. Park, T. S., et al. Vascular progenitors generated from tankyrase inhibitor-regulated naïve diabetic human iPS cells potentiate efficient revascularization of ischemic retina. Nat Commun. 11 (1), 1195(2020).
  5. Zimmerlin, L., et al. Tankyrase inhibition promotes a stable human naïve pluripotent state with improved functionality. Development. 143 (23), 4368-4380 (2016).
  6. Schlaeger, T. M., et al. A comparison of non-integrating reprogramming methods. Nat Biotechnol. 33 (1), 58-63 (2015).
  7. Park, T. S., et al. Growth factor-activated stem cell circuits and stromal signals cooperatively accelerate non-integrated iPSC reprogramming of human myeloid progenitors. PLoS One. 7 (8), e42838(2012).
  8. Zimmerlin, L., et al. Proteogenomic reprogramming to a functional human blastomere-like stem cell state via a PARP-DUX4 regulatory axis. Cell Rep. 44 (5), 115671(2025).
  9. Park, T. S., Zimmerlin, L., Evans-Moses, R., Zambidis, E. T. Chemical reversion of conventional human pluripotent stem cells to a naive-like state with improved multi-lineage differentiation potency. J Vis Exp. (136), e57921(2018).
  10. Maiers, M., et al. Harnessing global HLA data for enhanced patient matching in iPSC haplobanks. Cytotherapy. 27 (3), 300-306 (2025).
  11. Thomas, J., et al. Running the full human developmental clock in interspecies chimeras using alternative human stem cells with expanded embryonic potential. NPJ Regen Med. 6 (1), 25(2021).
  12. Zheng, C., Ballard, E. B., Wu, J. The road to generating transplantable organs: From blastocyst complementation to interspecies chimeras. Development. 148 (12), 195792(2021).
  13. Chan, E. M., et al. Live cell imaging distinguishes bona fide human iPS cells from partially reprogrammed cells. Nat Biotechnol. 27 (11), 1033-1037 (2009).
  14. Bock, C., et al. Reference maps of human ES and iPS cell variation enable high-throughput characterization of pluripotent cell lines. Cell. 144 (3), 439-452 (2011).
  15. Orlova, V. V., et al. Generation, expansion, and functional analysis of endothelial cells and pericytes derived from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 9 (6), 1514-1531 (2014).
  16. Park, T. S., Zimmerlin, L., Zambidis, E. T. Efficient and simultaneous generation of hematopoietic and vascular progenitors from human induced pluripotent stem cells. Cytometry A. 83 (1), 114-126 (2013).
  17. Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nat Methods. 8 (5), 409-412 (2011).
  18. Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 85 (8), 348-362 (2009).
  19. Warren, L., et al. Highly efficient reprogramming to pluripotency and directed differentiation of human cells with synthetic modified mRNA. Cell Stem Cell. 7 (5), 618-630 (2010).
  20. Ban, H., et al. Efficient generation of transgene-free human induced pluripotent stem cells (iPSCs) by temperature-sensitive Sendai virus vectors. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (34), 14234-14239 (2011).
  21. Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. J Vis Exp. (64), e3854(2012).
  22. Zimmerlin, L., Park, T. S., Zambidis, E. T. Capturing human naïve pluripotency in the embryo and in the dish. Stem Cells Dev. 26 (16), 1141-1161 (2017).
  23. Brunner, S., et al. Circulating angiopoietic cells and diabetic retinopathy in type 2 diabetes mellitus, with or without macrovascular disease. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (7), 4655-4662 (2011).
  24. Caballero, S., et al. Ischemic vascular damage can be repaired by healthy, but not diabetic, endothelial progenitor cells. Diabetes. 56 (4), 960-967 (2007).
  25. Jarajapu, Y. P., Grant, M. B. The promise of cell-based therapies for diabetic complications: Challenges and solutions. Circ Res. 106 (5), 854-869 (2010).
  26. Khullar, M., Cheema, B. S., Raut, S. K. Emerging evidence of epigenetic modifications in vascular complications of diabetes. Front Endocrinol (Lausanne). 8, 237(2017).
  27. Manzar, G. S., Kim, E. M., Zavazava, N. Demethylation of induced pluripotent stem cells from type 1 diabetic patients enhances differentiation into functional pancreatic beta cells. J Biol Chem. 292 (34), 14066-14079 (2017).
  28. French, A., et al. Enabling consistency in pluripotent stem cell-derived products for research and development and clinical applications through material standards. Stem Cells Transl Med. 4 (3), 217-223 (2015).
  29. Zimmerlin, L., Park, T. S., Bhutto, I., Lutty, G., Zambidis, E. T. Generation of pericytic-vascular progenitors from tankyrase/parp-inhibitor-regulated naïve (tirn) human pluripotent stem cells. Methods Mol Biol. 2416, 133-156 (2022).
  30. Thorsell, A. G., et al. Structural basis for potency and promiscuity in poly(adp-ribose) polymerase (PARP) and tankyrase inhibitors. J Med Chem. 60 (4), 1262-1271 (2017).
  31. Huang, S. M., et al. Tankyrase inhibition stabilizes axin and antagonizes Wnt signalling. Nature. 461 (7264), 614-620 (2009).
  32. Ying, Q. L., et al. The ground state of embryonic stem cell self-renewal. Nature. 453 (7194), 519-523 (2008).
  33. Theunissen, T. W., et al. Molecular criteria for defining the naïve human pluripotent state. Cell Stem Cell. 19 (4), 502-515 (2016).
  34. Pastor, W. A., et al. Naïve human pluripotent cells feature a methylation landscape devoid of blastocyst or germline memory. Cell Stem Cell. 18 (3), 323-329 (2016).
  35. Taapken, S. M., et al. Karyotypic abnormalities in human induced pluripotent stem cells and embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 29 (4), 313-314 (2011).
  36. Mitalipova, M. M., et al. Preserving the genetic integrity of human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 23 (1), 19-20 (2005).
  37. Beers, J., et al. Passaging and colony expansion of human pluripotent stem cells by enzyme-free dissociation in chemically defined culture conditions. Nat Protoc. 7 (11), 2029-2040 (2012).
  38. Laurent, L. C., et al. Dynamic changes in the copy number of pluripotency and cell proliferation genes in human ESCs and iPSCs during reprogramming and time in culture. Cell Stem Cell. 8 (1), 106-118 (2011).
  39. Hussein, S. M., et al. Copy number variation and selection during reprogramming to pluripotency. Nature. 471 (7336), 58-62 (2011).
  40. Yang, Y., et al. Derivation of pluripotent stem cells with in vivo embryonic and extra-embryonic potency. Cell. 169 (2), 243-257.e25 (2017).
  41. Yang, J., et al. Establishment of mouse expanded potential stem cells. Nature. 550 (7676), 393-397 (2017).
  42. Gao, X., et al. Establishment of porcine and human expanded potential stem cells. Nat Cell Biol. 21 (6), 687-699 (2019).
  43. Liu, B., et al. Chemically defined and xeno-free culture condition for human extended pluripotent stem cells. Nat Commun. 12 (1), 3017(2021).
  44. Wu, J., et al. Interspecies chimerism with mammalian pluripotent stem cells. Cell. 168 (3), 473-486.e15 (2017).
  45. Yamaguchi, T., et al. Interspecies organogenesis generates autologous functional islets. Nature. 542 (7640), 191-196 (2017).
  46. Kobayashi, T., et al. Generation of rat pancreas in mouse by interspecific blastocyst injection of pluripotent stem cells. Cell. 142 (5), 787-799 (2010).
  47. Theunissen, T. W., et al. Systematic identification of culture conditions for induction and maintenance of naïve human pluripotency. Cell Stem Cell. 15 (4), 471-487 (2014).
  48. Gafni, O., et al. Derivation of novel human ground-state naïve pluripotent stem cells. Nature. 504 (7479), 282-286 (2013).
  49. Fang, R., et al. Generation of naïve induced pluripotent stem cells from rhesus monkey fibroblasts. Cell Stem Cell. 15 (4), 488-496 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Indukowane pluripotencjalne kom rki macierzysteprzeprogramowanie episomalnemetody wolne od komponent w pochodzenia zwierz cegoinhibitor tankiryzyinhibitor PARPnaiwne kom rki macierzyster nicowanie wielolinioweuniwersalne donatorskie kom rki macierzyste
Film wkrótce dostępny

Powiązane artykuły