W badaniu tym ustanowiono wyrafinowany model zubożenia nerwu czuciowego rogówki za pomocą bupiwakainy, ujawniając jej wpływ na nerw rogówkowy i adhezję bakteryjną. Model symuluje stany neuropatyczne, dostarczając wglądu w interakcje neuroimmunologiczne w infekcjach oczu i oferując zastosowania w badaniach nad dostarczaniem leków, neuroprotekcją, modulacją immunologiczną i modyfikacją genów.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Ukierunkowane zubożenie nerwu czuciowego rogówki poprzez wstrzyknięcie podspojówkowe: model do badania adhezji bakteryjnej i interakcji neuroimmunologicznych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Nerwy czuciowe rogówki odgrywają kluczową rolę we wspieraniu integralności powierzchni oka i mechanizmów obrony immunologicznej. Utrata tego unerwienia wiąże się ze zwiększoną podatnością na inwazję drobnoustrojów, jednak dokładny udział wyczerpania nerwów w adhezji bakteryjnej na rogówce pozostaje niewystarczająco scharakteryzowany. W tym artykule przedstawiamy powtarzalną i kontrolowaną czasowo metodę selektywnego tłumienia nerwu czuciowego rogówki za pomocą bupiwakainy, długo działającego blokera kanału sodowego. Łącząc drogi dostarczania podspojówkowego i miejscowego, ta strategia podwójnej aplikacji pozwala na uzyskanie solidnego, trwałego odnerwienia, co pozwala na precyzyjne badanie, w jaki sposób zmienione bodźce sensoryczne wpływają na podatność nabłonka rogówki na kolonizację bakteryjną.
Korzystając z tego modelu, badamy, w jaki sposób denerwacja sensoryczna wpływa na dynamikę adhezji drobnoustrojów Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis i Pseudomonas aeruginosa, trzech klinicznie istotnych patogenów o odrębnych mechanizmach adhezji. Standaryzowana inokulacja bakteryjna za pomocą laboratoryjnej metody blottingu zapewnia równomierne osadzanie się na powierzchni rogówki, a następnie ilościową ocenę adhezji bakterii. Wyczerpanie nerwów wywołane bupiwakainą koreluje ze zmniejszoną gęstością nerwów rogówkowych i zwiększoną adhezją bakterii, co potwierdza funkcjonalny związek między zubożeniem czucia a podatnością drobnoustrojów.
Symulując stany neuropatyczne, takie jak neuropatia cukrzycowa i neurotroficzne zapalenie rogówki, podejście to zapewnia nowe ramy do badania interakcji neuroimmunologicznych w infekcjach oczu. Poza modelami infekcji, ta strategia iniekcji podspojówkowych stanowi wszechstronną platformę do badania farmakokinetyki leków ocznych, interwencji neuroprotekcyjnych i modulacji immunologicznej. Ponadto można go zaadaptować do badań nad modyfikacją genów, w tym do dostarczania podspojówkowego konstruktów CRISPR/Cas lub wektorów wirusowych, co poszerza jego zastosowania w badaniach okulistycznych i terapiach.
Wprowadzenie
Unerwienie czuciowe rogówki odgrywa kluczową rolę w utrzymaniu integralności powierzchni oka i homeostazy immunologicznej. Rogówka jest jedną z najgęściej unerwionych tkanek w organizmie, zaopatrywaną głównie przez podział oczny nerwu trójdzielnego1. Te nerwy czuciowe nie tylko pośredniczą w nocycepcji i odruchach mrugania, ale także regulują proliferację nabłonka, gojenie się ran i nadzór immunologiczny 2,3. Każde zakłócenie unerwienia czuciowego może zatem naruszyć barierę rogówkową, zmieniając mikrośrodowisko powierzchni oka i zwiększając podatność na infekcje bakteryjne.
Dysfunkcja czuciowa rogówki jest związana ze stanami ogólnoustrojowymi, takimi jak cukrzyca, i przyczynia się do patologii oka, w tym zespołu suchego oka, keratopatii cukrzycowej, neurotroficznego zapalenia rogówki i powikłań pooperacyjnych 3,4,5,6,7,8,9,10 . Upośledzenie nerwu czuciowego prowadzi do zmniejszonej produkcji łez, ścieńczenia nabłonka i opóźnionego gojenia się ran, co ułatwia kolonizację bakteryjną11,12. Jednak dokładny mechanistyczny związek między wyczerpaniem nerwu czuciowego a adhezją bakteryjną pozostaje niewystarczająco poznany. Chociaż badania wykazały zwiększoną adhezję bakteryjną po odnerwieniu rogówki, brakuje znormalizowanych modeli, które pozwalają na kontrolowane badanie tego związku.
Aby wypełnić tę lukę, opracowaliśmy ukierunkowany model wyczerpania nerwu czuciowego rogówki za pomocą bupiwakainy, długo działającego blokera kanału sodowego, który naśladuje neuropatię kliniczną, nie powodując trwałego uszkodzenia nerwów 13,14,15. To farmakologiczne podejście zapewnia kontrolowaną i powtarzalną metodę badania wyczerpania nerwu rogówkowego i jego wpływu na powierzchnię oka15. Integrując ten model z testami adhezji bakteryjnej, możemy systematycznie oceniać wpływ wyczerpania nerwów czuciowych na kolonizację mikrobiologiczną, naśladując kluczowe aspekty keratopatii cukrzycowej i neurotroficznego zapalenia rogówki.
Adhezja drobnoustrojów jest krytycznym wczesnym zdarzeniem w infekcjach rogówki, na które wpływa skład filmu łzowego, właściwości powierzchni nabłonka i odpowiedź immunologiczna gospodarza. Wśród różnych patogenów zdolnych do kolonizacji powierzchni oka, S. aureus, S. epidermidis i P. aeruginosa reprezentują trzy klinicznie istotne bakterie o różnych mechanizmach adhezji. P. aeruginosa, wysoce zjadliwa bakteria Gram-ujemna, wykorzystuje pilusy, wici i wydzielane czynniki wirulencji do szybkiego przylegania i atakowania komórek nabłonka rogówki, często prowadząc do ciężkiego wrzodziejącego zapalenia rogówki16,17. Natomiast S. epidermidis, Gram-dodatnia bakteria komensalna, głównie wykorzystuje uszkodzone powierzchnie nabłonka i zmiany filmu łzowego do tworzenia biofilmów, przyczyniając się do uporczywych i często subklinicznych infekcji18,19. Różnice w strategiach adhezji między tymi gatunkami podkreślają potrzebę zrozumienia, w jaki sposób wyczerpanie nerwu rogówkowego zmienia mikrośrodowisko oka, sprzyjając kolonizacji bakteryjnej.
Kluczowym wyzwaniem w badaniu adhezji bakteryjnej jest wybór odpowiedniego modelu inokulacji. Konwencjonalny model zadrapań, często stosowany w badaniach nad infekcjami, tworzy defekty nabłonka, aby ułatwić przyleganie bakterii. Chociaż podejście to jest skuteczne w symulowaniu infekcji wywołanych traumą, wprowadza istotne zmienne zakłócające, w tym nadmierne uszkodzenie tkanek i przesadną reakcję zapalną, które nie reprezentują dokładnie wczesnych etapów kolonizacji bakteryjnej w rogówkach neuropatycznych. Dodatkowo zmienność urazów mechanicznych utrudnia osiągnięcie powtarzalnych wyników. Aby przezwyciężyć te ograniczenia, wymagana jest bardziej kontrolowana i fizjologicznie odpowiednia metoda inokulacji bakterii.
Technika laboratoryjnego wycierania chusteczek oferuje ustandaryzowane podejście do osadzania się bakterii, zapewniając równomierne przyleganie bakterii bez naruszania bariery nabłonkowej20. Metoda ta ściśle naśladuje rzeczywiste scenariusze podatności, w których adhezja bakteryjna zachodzi przy braku jawnego urazu mechanicznego, ale w warunkach zmienionego składu łez i homeostazy nabłonka. Eliminując zmienność związaną z urazami mechanicznymi, laboratoryjna metoda wycierania zapewnia dokładniejszą ocenę dynamiki adhezji drobnoustrojów w neuropatycznych rogówkach. Ponadto pozwala na kontrolowaną ocenę udziału filmu łzowego w kolonizacji bakteryjnej, co jest szczególnie istotne w przypadkach dysfunkcji czucia rogówki, gdzie wydzielanie łez jest upośledzone.
Biorąc pod uwagę kluczową rolę nerwów czuciowych rogówki w regulacji produkcji łez i homeostazy nabłonka, konieczne jest ustanowienie powtarzalnego modelu do badania konsekwencji wyczerpania nerwów czuciowych na adhezja drobnoustrojów. Badanie to ma na celu udoskonalenie protokołu ukierunkowanego zubożenia nerwu czuciowego rogówki za pomocą bupiwakainy, długo działającego środka miejscowo znieczulającego, w celu oceny jej wpływu na wydzielanie łez i adhezję bakterii. Dzięki zastosowaniu kombinacji podspojówkowej i miejscowej aplikacji bupiwakainy, podejście to zapewnia miejscowe i trwałe wyczerpanie czucia w określonym punkcie czasowym szczytowej skuteczności. Korzystając z tego modelu, badamy, w jaki sposób denerwacja czuciowa zmienia dynamikę adhezji S. aureus, S. epidermidis i P. aeruginosa, dostarczając cennych informacji na temat związku między wyczerpaniem nerwów, zmianami filmu łzowego i podatnością drobnoustrojów. Odkrycia te mają szersze implikacje dla zrozumienia podatności na infekcje w stanach neuropatycznych, takich jak keratopatia cukrzycowa i neurotroficzne zapalenie rogówki, i stanowią podstawę do przyszłych badań nad interakcjami neuroimmunologicznymi oczu i interwencjami terapeutycznymi.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie procedury z udziałem zwierząt zostały przeprowadzone zgodnie ze standardami ustanowionymi przez Stowarzyszenie Badań nad Wzrokiem i Okulistyką i zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) w New England College of Optometry i przestrzegały polityki PHS dotyczącej humanitarnej opieki i wykorzystania zwierząt laboratoryjnych. Sześcio- do ośmiotygodniowych samców i samic myszy C57BL/6J (typu dzikiego; szczep nr 000664) uzyskano z Laboratorium Jacksona, a myszy hodowano w normalnych rytmach okołodobowych (12-godzinny cykl światła/ciemności) i podawano im pożywienie i wodę. Utrzymuj sterylną technikę podczas wszystkich zabiegów.
1. Preparat dla zwierząt do wstrzyknięcia podspojówkowego
- Wywołaj znieczulenie za pomocą 2-3% izofluranu w tlenie za pomocą skalibrowanego parownika. Monitoruj głębokość znieczulenia, sprawdzając, czy nie ma odruchowej reakcji na delikatne uszczypnięcie palca.
- Stale obserwuj zwierzę pod kątem oznak silnego dyskomfortu lub niepokoju.
- W przypadku zaobserwowania niepokoju należy wywołać głębokie znieczulenie 5% izofluranem i potwierdzić brak reakcji.
- Wykonaj zwichnięcie szyjki macicy, aby zapewnić eutanazję.
- W przeciwnym razie należy natychmiast wykonać enukleację za pomocą zakrzywionych kleszczy enukleacyjnych do dalszych analiz.
2. Blokada nerwu rogówkowego za pomocą wstrzyknięcia podspojówkowego
UWAGA: Wdrożyć dwuetapowy protokół obejmujący wstrzyknięcie podspojówkowe i miejscowe stosowanie bupiwakainy w celu osiągnięcia docelowego wyczerpania nerwu czuciowego rogówki. Wykonaj zastrzyki podspojówkowe i aplikacje miejscowe w ciągu 15 minut, aby zminimalizować ogólnoustrojową ekspozycję na znieczulenie.
- Przygotowanie miejsca i nacięcie
- Wykonać małe (~0,5 mm) nacięcie w okolicy rąbka nadskroniowego za pomocą igły 30 G. Unikaj naczyń krwionośnych i minimalizuj urazy tkanek. Użyj nacięcia, aby uzyskać dostęp do przestrzeni podspojówkowej w celu kontrolowanego dostarczania leku.
- Wstrzyknięcie bupiwakainy
- Przygotować 0,5% roztwór chlorowodorku bupiwakainy w sterylnych warunkach.
- Załadować 5 μl roztworu do strzykawki Hamilton 10 μl wyposażonej w igłę o pojemności 33 g z małą piastą (końcówka 3).
- Wstrzyknąć roztwór do przestrzeni podspojówkowej pod kątem 15-20°, aby zminimalizować refluks i zapewnić równomierne rozprowadzenie.
- Obserwuj tworzenie się pęcherzyków w miejscu wstrzyknięcia; Pozwól mu przetrwać przez 5-10 s i rozproszyć się w kieszonce podspojówkowej, aż do całkowitego wchłonięcia.
- Miejscowe wzmocnienie odczulania rogówki
- Dodatkowe 5 μl 0,5% bupiwakainy należy nałożyć bezpośrednio na centralną rogówkę natychmiast po wstrzyknięciu podspojówkowym.
UWAGA: Użyj tego kroku, aby zwiększyć odczulanie nerwów powierzchniowych i przedłużyć efekt znieczulenia miejscowego.
- Dodatkowe 5 μl 0,5% bupiwakainy należy nałożyć bezpośrednio na centralną rogówkę natychmiast po wstrzyknięciu podspojówkowym.
- Grupa kontrolna
- Podawać 5 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) zarówno we wstrzyknięciu podspojówkowym, jak i miejscowo w identycznych punktach czasowych dla zwierząt kontrolnych. Dopasuj etapy procedury i objętość, aby uwzględnić efekty związane z wstrzyknięciem.
- Czas trwania leczenia i analiza punktu końcowego
- Leczenie bupiwakainą należy podawać co drugi dzień przez 15 dni w celu uzyskania trwałego wyczerpania nerwów czuciowych przy jednoczesnym zminimalizowaniu toksyczności.
- W dniu 15 należy poddać myszy eutanazji 4 godziny po ostatnim leczeniu bupiwakainą przy użyciu 5% izofluranu w tlenie za pomocą skalibrowanego parownika, a następnie zwichnąć szyjkę macicy.
- Natychmiast pobrać rogówki od jednej grupy myszy (patrz krok 5.5.) w celu oceny zmian gęstości nerwów za pomocą immunohistochemii (patrz rycina 1 i sekcja 6 protokołu) oraz od innej grupy w celu analizy adhezji bakteryjnej (patrz rysunek 1 i sekcja 5 protokołu).
3. Przygotowanie zwierząt do inokulacji bakteryjnej
- Ketaminę (80-100 mg/kg) i deksmedetomidynę (0,25-0,5 mg/kg) należy podawać dootrzewnowo w celu znieczulenia myszy cztery godziny po ostatnim wstrzyknięciu bupiwakainy i zastosowaniu miejscowym w 15. dniu.
- Potwierdź głębokie znieczulenie, sprawdzając brak odruchowych reakcji na szczypanie palca u nogi.
- Przepłukać powierzchnię oka 3 razy za pomocą pipety z 5 μl sterylnego PBS w celu usunięcia resztek płynu łzowego i zanieczyszczeń, zapewniając czystą powierzchnię rogówki do badań adhezji bakteryjnej (patrz rysunek 1)
- W wyznaczonej grupie eksperymentalnej użyj niestrzępiącej się chusteczki laboratoryjnej, aby osuszyć powierzchnię rogówki w znormalizowany sposób.
- Złóż bibułę, aby zapewnić pewny chwyt.
- Delikatnie przetrzyj rogówkę znieczulonej myszy 4x, zaczynając od środkowej rogówki i wykonując ruch obrotowy w prawo i w lewo, aby objąć obszary peryferyjne20.
UWAGA: Zastosuj minimalny nacisk, aby uniknąć obrażeń mechanicznych, jednocześnie skutecznie usuwając płyn łzowy, aby ułatwić przyleganie bakterii.
4. Przygotowanie inokulum bakteryjnego i inokulacja rogówki
- Hodowla i przygotowanie bakterii
- Hodowlę S. aureus ATCC 25923, S. epidermidis ATCC 12228 i P. aeruginosa O1 na tryptycznym agarze sojowym (TSA) i inkubację w temperaturze 37 °C ze sterylną wodą umieszczoną w inkubatorze w celu utrzymania wilgotności.
- Zebrać pojedyncze kolonie i zawiesić w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Odwirować zawiesinę o stężeniu 5 000 × g przez 5 minut jeden raz, aby usunąć martwe komórki i produkty uboczne przemiany materii.
- Ponownie zawiesić osad bakteryjny w PBS i dostosować stężenie do ~10¹¹ CFU/ml, aby zapewnić wysokie obciążenie bakteryjne do badań adhezji.
- Protokół inokulacji rogówki
- Nakładać 5 μl porcji przygotowanej zawiesiny bakteryjnej na powierzchnię rogówki raz na godzinę przez 4 godziny w długotrwałym znieczuleniu.
- Ustaw myszy pod lekkim nachyleniem, aby zapobiec spływaniu i zapewnić stałą ekspozycję na inokulum.
- Powtarzaj inokulację w odstępach godzinowych, aby naśladować utrzymującą się ekspozycję na bakterie istotne dla klinicznych scenariuszy infekcji.
- Eutanazja po inokulacji i ocena adhezji bakteryjnej
- Po 4 godzinach należy podać dootrzewnowe wstrzyknięcie ketaminy (80-100 mg/kg) i ksylazyny (5-10 mg/kg) w celu zapewnienia głębokiego znieczulenia.
- Wykonaj zwichnięcie szyjki macicy, aby humanitarnie poddać myszy eutanazji.
- Wyłuszczaj oczy za pomocą sterylnych kleszczy z zakrzywioną końcówką, zachowując ścisłe warunki aseptyki, aby zapobiec zanieczyszczeniu.
- Przepłukać powierzchnię oka 5-6 razy sterylnym 2 ml PBS na szalce Petriego, delikatnie potrząsając, aby dokładnie usunąć nieprzylegające bakterie.
- Homogenizować wyłuszczone oczy w 1 ml sterylnego PBS za pomocą mechanicznego homogenizatora tkankowego, aby zapewnić stałą regenerację bakterii i utrzymać warunki aseptyki, aby zapobiec zanieczyszczeniu.
- Wykonać seryjne sześciokrotne rozcieńczenia homogenatu w sterylnym PBS.
- Porcje każdego rozcieńczenia należy nanieść na płytki TSA i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C, aby umożliwić wzrost kolonii.
- Policz jednostki tworzące kolonie (CFU) i wyraź wyniki jako log CFU na rogówkę w celu porównania ilościowego.
5. Immunohistochemia
- Eutanazja myszy przez zwichnięcie szyjki macicy w 15 dniu po leczeniu.
- Ostrożnie wyłuszczyć oczy i przepłukać raz PBS w temperaturze pokojowej przy delikatnej rotacji.
- Utrwalić wyłuszczone oczy w 2% paraformaldehydzie (PFA) przez 1 godzinę, aby zachować integralność strukturalną
- Umyj nieruchome oczy 3 x 10 minut w 1 ml PBS pod delikatnym obracaniem w temperaturze pokojowej.
- Postępuj zgodnie z wcześniej opisanym protokołem rozwarstwienia rogówki21,22
- Wyciąć rogówki na szalce Petriego o szerokości 35 mm wypełnionej minimalną ilością PBS.
- Użyj kleszczy o prostych krawędziach, aby ustabilizować wyłuszczone oko i nożyczek chirurgicznych, aby utworzyć małe nacięcie w tylnej części gałki ziemskiej.
- Użyj małego punktu nacięcia, aby ostrożnie przeciąć wzdłuż tylnej części 360°.
- Odrzuć mysią siatkówkę, nerw wzrokowy, soczewkę, pigment tęczówki i wszelkie dodatkowe struktury tkankowe, które nie są rogówką.
- Usuń nadmiar tkanki za pomocą kleszczy o prostych krawędziach lub ostrożnie nacinając nożyczkami chirurgicznymi, zachowując rogówkę w stanie nienaruszonym.
- Przemyć wypreparowane rogówki 3 x 10 minut w 1 ml PBS umieszczonym w probówkach do mikrowirówek pod delikatnym obracaniem w temperaturze pokojowej.
- Inkubować rogówki w 1 ml roztworu blokującego (3% BSA + Triton X-100 w PBS) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej z ciągłą rotacją.
- Zwiększ przepuszczalność tkanek, inkubując rogówki w 1 ml 20% EDTA przez dodatkową godzinę w tych samych warunkach.
- Inkubować rogówki przez noc w temperaturze 4 °C z pierwszorzędowym przeciwciałem króliczym anty-β-tubuliną III pod delikatnym obracaniem w temperaturze pokojowej.
- Następnego dnia inkubować tkanki z sprzężonym z Alexa Fluor 488 kozim przeciwciałem anty-króliczym IgG i DAPI do barwienia jądrowego przez 2-3 godziny w temperaturze 4 °C w ciemności.
- Umyj rogówki 3 x 10 min za pomocą PBS pod delikatnym obrotem.
- Postępuj zgodnie z opisanym wcześniej protokołem płaskiego montażu rogówki21,22
- Zamontuj płasko zabarwione rogówki na szkiełkach, umieszczając rogówkę na krawędzi szkiełka, aby usunąć nadmiar płynu.
- Umieść rogówkę na środku szkiełka mikroskopowego stroną nabłonkową skierowaną w dół, w kontakcie z powierzchnią szkiełka.
- Wykonaj cztery proste nacięcia (o długości 1-2 mm) od krawędzi obwodowej w kierunku środka, używając ostrza z piór chirurgicznych, aby utworzyć półćwiartki.
- Nałóż 20 μl środka mocującego i umieść szkiełko nakrywkowe o średnicy 8 mm na rogówce.
- Delikatnie dociśnij szkiełko nakrywkowe, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza i zapobiec marszczeniu się rogówki.
- Przechowywać próbkę w temperaturze pokojowej w ciemności w celu wysuszenia.
- Uszczelnij krawędzie szkiełka nakrywkowego przezroczystym ochraniaczem paznokci, aby zapobiec wysychaniu na powietrzu, i przechowuj szkiełka w ciemności, aż będą gotowe do obrazowania.
6. Obrazowanie
- Wykonaj mikroskopię konfokalną za pomocą pionowego dwufotonowego mikroskopu konfokalnego z obiektywem zanurzanym w wodzie 20x/1,00 NA.
- Umieść płaskie próbki na stoliku mikroskopu i ustaw soczewkę obiektywu zanurzeniowego w wodzie 20x/1,00 NA.
- Przyciemnij światła w pomieszczeniu i przykryj mikroskop nieprzezroczystą czarną szmatką, aby zminimalizować zakłócenia światła zewnętrznego podczas obrazowania.
- Wizualizuj nerwy rogówki za pomocą kanału laserowego Alexa Fluor 488 nm i wykrywaj jądra komórkowe za pomocą kanału laserowego DAPI 405 nm.
- Ustaw rozmiar klatki na 1 536 x 1 536, otworek na 1 jednostkę Airy (AU), a prędkość skanowania na 1,02 μs. Włącz skanowanie dwukierunkowe i zastosuj uśrednianie 2x.
- Dostosuj wzmocnienie główne (~750 V) i zminimalizuj intensywność mocy lasera, aby zapobiec fotowybielaniu i fototoksyczności, zapewniając jednocześnie wyraźne uchwycenie obrazu.
- Wykonaj obrazowanie Z-stack, aby uchwycić pełną grubość rogówki. Ustaw pierwszą płaszczyznę ogniskowej na najbardziej wysuniętym do przodu aspekcie, a ostatnią na najbardziej wysunięty do tyłu aspekt próbki.
- Uzyskuj stosy Z w odstępach co 0,8 μm lub 1,0 μm, rejestrując około 60 - 80 całkowitych stosów na próbkę.
- Ocena gęstości nerwu rogówkowego
- Analizuj gęstość nerwów rogówkowych za pomocą oprogramowania Imaris.
- Potwierdź pełną grubość obrazu, sprawdzając wymiary objętości.
- Włącz opcję renderowania objętościowego , aby wygenerować rekonstrukcję 3D.
- Utwórz projekcję maksymalnej intensywności, aby przekształcić stos Z w widok 2D w celu wizualizacji i kwantyfikacji.
- Oceń gęstość nerwu rogówkowego w skali 0-10 przez zaślepionych oceniających, aby zapewnić obiektywną ocenę.
7. Analiza statystyczna
- Oceń rozkład danych za pomocą testów Shapiro-Wilka i Kołmogorowa-Smirnowa.
- Jeśli większość danych jest zgodna z rozkładem normalnym, należy przedstawić wyniki jako średnią ± odchylenie standardowe (SD).
- W przypadku porównań między dwiema grupami zastosuj test t Studenta i użyj jednoczynnikowej ANOVA, a następnie testu wielokrotnych porównań Tukeya dla analiz obejmujących trzy lub więcej grup.
- Rozważmy, że wartość p < 0,05 jest statystycznie istotna.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
O ile nie określono inaczej, wszystkie eksperymenty przeprowadzono niezależnie w trzech powtórzeniach, przy czym każda replikacja obejmowała 3-4 myszy na grupę.
Znaczący spadek gęstości nerwów rogówki po leczeniu bupiwakainą
Aby systematycznie ocenić wpływ ukierunkowanego uszczuplenia czuciowych nerwów rogówki, gęstość nerwów rogówki oceniono za pomocą immunoznakowania i mikroskopii konfokalnej. Myszy otrzymywały co drugi dzień podspójówkowe iniekcje bupiwakainy przez 15 d...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Nerwy czuciowe rogówki odgrywają kluczową rolę w utrzymaniu integralności powierzchni oka, regulacji homeostazy nabłonka i modulowaniu odpowiedzi immunologicznej. Zapalenie nerwu rogówki, charakteryzujące się zwyrodnieniem nerwów i stanem zapalnym, jest powszechnie obserwowane w stanach ogólnoustrojowych, takich jak cukrzyca, gdzie przewlekła hiperglikemia przyczynia się do neuropatii obwodowej, w tym utraty nerwu rogówkowego. Badania wykazały, że neuropatia cukrzycowa prowadzi do zmniejszenia wrażliwości rogówki, suchoś...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 0,5% roztwór chlorowodorku bupiwakainy | Pfizer INC. Stany Zjednoczone | NDC 00409-1162-01 | |
| Igła 30 G | Producent: BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA | 305106 | |
| 33 G mała igła w piaście (typ punktowy 3) | Hamilton Company, Reno, NV, Stany Zjednoczone | 7803-05 | |
| 4',6-diamidyno-2-fenyloindol, dichlorowodorek | Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, Stany Zjednoczone | Zobacz materiał D1306 | |
| Albumina surowicy bydlęcej | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Stany Zjednoczone | A7906 powiedział: | |
| Myszy C57BL/6J (typu dzikiego) | Laboratorium Jacksona | . 000664 | |
| Rotator Cantrifuge | The Lab Depot, Inc. (Dawsonville, Georgia, Stany Zjednoczone) | Czynnik chłodniczy 2020 | |
| Przezroczysty ochraniacz na paznokcie | Mokry i dziki | N/A | |
| Mikroskop preparacyjny (SMZ-160-TLED Stereoskop (preparacyjny) z portem trójokularowym) | Stellar Scientific (Baltimore, Maryland, Stany Zjednoczone) | 1.1002E+12 TGL | |
| Kwas etylenodiaminotetraoctowy | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Stany Zjednoczone | E6511 powiedział: | |
| Kozia anty-królicza IgG Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, Stany Zjednoczone | A-11008 | |
| Hamilton 10-μ Strzykawka L | Hamilton Company, Reno, NV, Stany Zjednoczone | 7635-01 | |
| Precyzyjne mikronożyczki preparacyjne | Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, Stany Zjednoczone | 08-953-1B | |
| Izofluran | Patterson Veterinary, Stany Zjednoczone | 07-890-8115 | |
| Waporyzator z izofluranem | Kent Scientific, Stany Zjednoczone | VETFLO1205S | |
| Chlorowodorek ketaminy | Dechra Veterinary Products, Overland Park, KS, USA | DP00050 | |
| Niestrzępiąca się bibułka Kimwipe | Kimberly-Clark Professional, Roswell, Georgia, Stany Zjednoczone | 34155 | |
| Kleszczyk do mikropreparacji zakrzywiony z przodu (do enukleacji) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Stany Zjednoczone | F4142-1EA | |
| Kleszcze mikropreparacyjne proste przód | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Stany Zjednoczone | Zobacz materiał F4017 | |
| Szalki Petriego (100 mm) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, Stany Zjednoczone | 263991 | |
| Szalki Petriego (35 mm) | Avantor, za pośrednictwem VWR International (Radnor, PA, USA). | 25373-041 | |
| Sól fizjologiczna buforowana fosforanami | Thomas Scientific, Swedesboro, NJ, Stany Zjednoczone | C987D24 | |
| Mocowanie antyblaknięcia ProLong Gold | Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, Stany Zjednoczone | Zobacz materiał P36930 powiedział: | |
| Królicza anty-β-tubulina III | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Stany Zjednoczone) | Zobacz materiał T2200 | |
| Szkiełko nakrywkowe okrągłe szkło niemieckie (8 mm) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, Stany Zjednoczone | 50-949-314 | |
| Rękojeści do skalpeli | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Stany Zjednoczone) | S2896-1EA powiedział: | |
| Szkiełka mikroskopowe | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Stany Zjednoczone) | S8902-1PAK | |
| Probówki wirówkowe o niskiej retencji Snap Cap | Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, Stany Zjednoczone | 3453 | |
| Sorvall Instruments RT6000B Wirówka stołowa | Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, Stany Zjednoczone | 3367898 | |
| Ostrza z piór chirurgicznych | World Precision Instruments (Sarasota, Floryda, Stany Zjednoczone) | 504169 | |
| Tryptyczny agar sojowy | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Stany Zjednoczone) | 22091 | |
| Ksylazyna | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Stany Zjednoczone | 1236-20-8 |
Bibliografia
- Belmonte, C. Pain, dryness, and itch sensations in eye surface disorders are defined by a balance between inflammation and sensory nerve injury. Cornea. 38 (Suppl 1), S11-S24 (2019).
- Müller, L. J., Marfurt, C. F., Kruse, F., Tervo, T. M. T. Corneal nerves: Structure, contents and function. Exp Eye Res. 76 (5), 521-542 (2003).
- Gao, N., Me, R., Yu, F. S. X. Diabetes exacerbates Pseudomonas aeruginosa keratitis in streptozotocin-induced and db/db mice via altering programmed cell death pathways. Invest Ophthalmol Vis Sci. 64 (7), 14(2023).
- Heigle, T. J., Pflugfelder, S. C. Aqueous tear production in patients with neurotrophic keratitis. Cornea. 15 (2), 135-138 (1996).
- Asiedu, K., et al. Tear film and ocular surface neuropeptides: Characteristics, synthesis, signaling and implications for ocular surface and systemic diseases. Exp Eye Res. 218, 108973(2022).
- Zhou, T., Lee, A., Lo, A. C. Y., Kwok, J. S. W. J. Diabetic corneal neuropathy: Pathogenic mechanisms and therapeutic strategies. Front Pharmacol. 13, 816062(2022).
- Yu, F. S. X., et al. The impact of sensory neuropathy and inflammation on epithelial wound healing in diabetic corneas. Prog Retin Eye Res. 89, 101039(2022).
- Bron, A. J., et al. TFOS DEWS II pathophysiology report. Ocul Surf. 15 (3), 438-510 (2017).
- Belmonte, C., et al. TFOS DEWS II pain and sensation report. Ocul Surf. 15 (3), 404-437 (2017).
- Vereertbrugghen, A., Galletti, J. G. Corneal nerves and their role in dry eye pathophysiology. Exp Eye Res. 222, 109191(2022).
- Gonzalez, O. A., et al. Antimicrobial peptides: Defending the mucosal epithelial barrier. Front Oral Health. 1 (3), 958480(2022).
- Fusco, A., Savio, V., Perfetto, B., Mattina, R., Donnarumma, G. Antimicrobial peptide human β-defensin-2 improves in vitro cellular viability and reduces pro-inflammatory effects induced by enteroinvasive Escherichia coli in Caco-2 cells by inhibiting invasion and virulence factors' expression. Front Cell Infect Microbiol. 12, 1009415(2022).
- Nau, C., Vogel, W., Hempelmann, G., Brä, M. E. Stereoselectivity of bupivacaine in local anesthetic-sensitive ion channels of peripheral nerve. Anesthesiology. 91, 786-795 (1999).
- Valenzuela, C., Snyders, D. J., Bennett, P. B., Tamargo, J., Hondeghem, L. M. Stereoselective block of cardiac sodium channels by bupivacaine in guinea pig ventricular myocytes. Circulation. 92 (10), 3014-3024 (1995).
- Becker, D. E., Reed, K. L. Local anesthetics: Review of pharmacological considerations. Anesth Prog. 59 (2), quiz 103-103 90-102 (2012).
- Khalifa, A. B. H., Moissenet, D., Thien, H. V., Khedher, M. Virulence factors in Pseudomonas aeruginosa: Mechanisms and modes of regulation. Ann Biol Clin (Paris). 69 (4), 393-403 (2011).
- Laventie, B. J., et al. A surface-induced asymmetric program promotes tissue colonization by Pseudomonas aeruginosa. Cell Host Microbe. 25 (1), 140-152.e6 (2019).
- Büttner, H., Mack, D., Rohde, H. Structural basis of Staphylococcus epidermidis biofilm formation: Mechanisms and molecular interactions. Front Cell Infect Microbiol. 5 (17), 14(2015).
- Brescó, M. S., et al. Pathogenic mechanisms and host interactions in Staphylococcus epidermidis device-related infection. Front Microbiol. 8, 1401(2017).
- Wan, S., et al. Nerve-associated transient receptor potential ion channels can contribute to intrinsic resistance to bacterial adhesion in vivo. FASEB J. 35 (10), e21899(2021).
- Datta, A., et al. TRPA1 and TPRV1 ion channels are required for contact lens-induced corneal parainflammation and can modulate levels of resident corneal immune cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 64 (11), 21(2023).
- Datta, A., et al. Contact lens-induced corneal parainflammation involving Ly6G+ cell infiltration requires IL-17A and γδ T cells. Ocul Surf. 28, 79-89 (2023).
- Datta, A., Orallo, G. K., Nelson, N. Corneal sensory nerve loss induced by repeated subconjunctival and topical bupivacaine disrupts tear secretion and enhances bacterial adhesion via neuropeptide modulation. PLOS ONE. , In Press (2025).
- Schultz, R. O., Peters, M. A., Sobocinski, K., Nassif, K., Schultz, K. J. Diabetic keratopathy as a manifestation of peripheral neuropathy. Am J Ophthalmol. 96 (3), 368-371 (1983).
- Belmonte, C., Acosta, M. C., Gallar, J. Neural basis of sensation in intact and injured corneas. Exp Eye Res. 78 (3), 513-525 (2004).
- Sitompul, R. Corneal sensitivity as a potential marker of diabetic neuropathy. Acta Med Indones. 49 (2), 166-172 (2017).
- O'Brien, P. D., Hur, J., Hayes, J. M., Backus, C., Sakowski, S. A., Feldman, E. L. BTBR ob/ob mice as a novel diabetic neuropathy model: Neurological characterization and gene expression analyses. Neurobiol Dis. 73, 348-355 (2015).
- Wang, B., Chandrasekera, P. C., Pippin, J. J. Leptin-and leptin receptor-deficient rodent models: Relevance for human type 2 diabetes. Curr Diabetes Rev. 10 (2), 131-145 (2014).
- Islam, M. S. Animal models of diabetic neuropathy: Progress since 1960s. J Diabetes Res. 2013, 149452(2013).
- Ma, L., et al. CGRP released by corneal sensory nerve maintains tear secretion of the lacrimal gland. Invest Ophthalmol Vis Sci. 65 (4), 30(2024).
- Bower, J. J., Song, Z., Song, L. Subconjunctival administration of adeno-associated virus vectors in small animal models. J Vis Exp. (181), e63532(2022).
- Jumelle, C., Gholizadeh, S., Annabi, N., Dana, R. Advances and limitations of drug delivery systems formulated as eye drops 1. J Control Release. 321, 1-22 (2020).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
