Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
W badaniu tym ustanowiono wyrafinowany model zubożenia nerwu czuciowego rogówki za pomocą bupiwakainy, ujawniając jej wpływ na nerw rogówkowy i adhezję bakteryjną. Model symuluje stany neuropatyczne, dostarczając wglądu w interakcje neuroimmunologiczne w infekcjach oczu i oferując zastosowania w badaniach nad dostarczaniem leków, neuroprotekcją, modulacją immunologiczną i modyfikacją genów.
Nerwy czuciowe rogówki odgrywają kluczową rolę we wspieraniu integralności powierzchni oka i mechanizmów obrony immunologicznej. Utrata tego unerwienia wiąże się ze zwiększoną podatnością na inwazję drobnoustrojów, jednak dokładny udział wyczerpania nerwów w adhezji bakteryjnej na rogówce pozostaje niewystarczająco scharakteryzowany. W tym artykule przedstawiamy powtarzalną i kontrolowaną czasowo metodę selektywnego tłumienia nerwu czuciowego rogówki za pomocą bupiwakainy, długo działającego blokera kanału sodowego. Łącząc drogi dostarczania podspojówkowego i miejscowego, ta strategia podwójnej aplikacji pozwala na uzyskanie solidnego, trwałego odnerwienia, co pozwala na precyzyjne badanie, w jaki sposób zmienione bodźce sensoryczne wpływają na podatność nabłonka rogówki na kolonizację bakteryjną.
Korzystając z tego modelu, badamy, w jaki sposób denerwacja sensoryczna wpływa na dynamikę adhezji drobnoustrojów Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis i Pseudomonas aeruginosa, trzech klinicznie istotnych patogenów o odrębnych mechanizmach adhezji. Standaryzowana inokulacja bakteryjna za pomocą laboratoryjnej metody blottingu zapewnia równomierne osadzanie się na powierzchni rogówki, a następnie ilościową ocenę adhezji bakterii. Wyczerpanie nerwów wywołane bupiwakainą koreluje ze zmniejszoną gęstością nerwów rogówkowych i zwiększoną adhezją bakterii, co potwierdza funkcjonalny związek między zubożeniem czucia a podatnością drobnoustrojów.
Symulując stany neuropatyczne, takie jak neuropatia cukrzycowa i neurotroficzne zapalenie rogówki, podejście to zapewnia nowe ramy do badania interakcji neuroimmunologicznych w infekcjach oczu. Poza modelami infekcji, ta strategia iniekcji podspojówkowych stanowi wszechstronną platformę do badania farmakokinetyki leków ocznych, interwencji neuroprotekcyjnych i modulacji immunologicznej. Ponadto można go zaadaptować do badań nad modyfikacją genów, w tym do dostarczania podspojówkowego konstruktów CRISPR/Cas lub wektorów wirusowych, co poszerza jego zastosowania w badaniach okulistycznych i terapiach.
Unerwienie czuciowe rogówki odgrywa kluczową rolę w utrzymaniu integralności powierzchni oka i homeostazy immunologicznej. Rogówka jest jedną z najgęściej unerwionych tkanek w organizmie, zaopatrywaną głównie przez podział oczny nerwu trójdzielnego1. Te nerwy czuciowe nie tylko pośredniczą w nocycepcji i odruchach mrugania, ale także regulują proliferację nabłonka, gojenie się ran i nadzór immunologiczny 2,3. Każde zakłócenie unerwienia czuciowego może zatem naruszyć barierę rogówkową, zmieniając mikrośrodowisko powierzchni oka i zwiększając podatność na infekcje bakteryjne.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wszystkie procedury z udziałem zwierząt zostały przeprowadzone zgodnie ze standardami ustanowionymi przez Stowarzyszenie Badań nad Wzrokiem i Okulistyką i zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) w New England College of Optometry i przestrzegały polityki PHS dotyczącej humanitarnej opieki i wykorzystania zwierząt laboratoryjnych. Sześcio- do ośmiotygodniowych samców i samic myszy C57BL/6J (typu dzikiego; szczep nr 000664) uzyskano z Laboratorium Jacksona, a myszy hodowano w normalnych rytmach okołodobowych (12-godzinny cykl światła/ciemności) i podawano im pożywienie i wodę. Utrzymuj sterylną technikę podczas wszyst....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
O ile nie określono inaczej, wszystkie eksperymenty przeprowadzono niezależnie w trzech powtórzeniach, przy czym każda replikacja obejmowała 3-4 myszy na grupę.
Znaczący spadek gęstości nerwów rogówki po leczeniu bupiwakainą
Aby systematycznie ocenić wpływ ukierunkowanego uszczuplenia czuciowych nerwów rogówki, gęstość nerwów rogówki oceniono za pomocą immunoznakowania i mikroskopii konfokalnej. Myszy otrzymywały co drugi dzień podspójówkowe iniekcje bupiwakainy przez 15 d.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Nerwy czuciowe rogówki odgrywają kluczową rolę w utrzymaniu integralności powierzchni oka, regulacji homeostazy nabłonka i modulowaniu odpowiedzi immunologicznej. Zapalenie nerwu rogówki, charakteryzujące się zwyrodnieniem nerwów i stanem zapalnym, jest powszechnie obserwowane w stanach ogólnoustrojowych, takich jak cukrzyca, gdzie przewlekła hiperglikemia przyczynia się do neuropatii obwodowej, w tym utraty nerwu rogówkowego. Badania wykazały, że neuropatia cukrzycowa prowadzi do zmniejszenia wrażliwości rogówki, suchoś.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 0,5% roztwór chlorowodorku bupiwakainy | Pfizer INC. Stany Zjednoczone | NDC 00409-1162-01 | |
| Igła 30 G | Producent: BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA | 305106 | |
| 33 G mała igła w piaście (typ punktowy 3) | Hamilton Company, Reno, NV, Stany Zjednoczone | 7803-05 | |
| 4',6-diamidyno-2-fenyloindol, dichlorowodorek | Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, Stany Zjednoczone | Zobacz materiał D1306 | |
| Albumina surowicy bydlęcej | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Stany Zjednoczone | A7906 powiedział: | |
| Myszy C57BL/6J (typu dzikiego) | Laboratorium Jacksona | . 000664 | |
| Rotator Cantrifuge | The Lab Depot, Inc. (Dawsonville, Georgia, Stany Zjednoczone) | Czynnik chłodniczy 2020 | |
| Przezroczysty ochraniacz na paznokcie | Mokry i dziki | N/A | |
| Mikroskop preparacyjny (SMZ-160-TLED Stereoskop (preparacyjny) z portem trójokularowym) | Stellar Scientific (Baltimore, Maryland, Stany Zjednoczone) | 1.1002E+12 TGL | |
| Kwas etylenodiaminotetraoctowy | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Stany Zjednoczone | E6511 powiedział: | |
| Kozia anty-królicza IgG Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, Stany Zjednoczone | A-11008 | |
| Hamilton 10-μ Strzykawka L | Hamilton Company, Reno, NV, Stany Zjednoczone | 7635-01 | |
| Precyzyjne mikronożyczki preparacyjne | Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, Stany Zjednoczone | 08-953-1B | |
| Izofluran | Patterson Veterinary, Stany Zjednoczone | 07-890-8115 | |
| Waporyzator z izofluranem | Kent Scientific, Stany Zjednoczone | VETFLO1205S | |
| Chlorowodorek ketaminy | Dechra Veterinary Products, Overland Park, KS, USA | DP00050 | |
| Niestrzępiąca się bibułka Kimwipe | Kimberly-Clark Professional, Roswell, Georgia, Stany Zjednoczone | 34155 | |
| Kleszczyk do mikropreparacji zakrzywiony z przodu (do enukleacji) | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Stany Zjednoczone | F4142-1EA | |
| Kleszcze mikropreparacyjne proste przód | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Stany Zjednoczone | Zobacz materiał F4017 | |
| Szalki Petriego (100 mm) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, Stany Zjednoczone | 263991 | |
| Szalki Petriego (35 mm) | Avantor, za pośrednictwem VWR International (Radnor, PA, USA). | 25373-041 | |
| Sól fizjologiczna buforowana fosforanami | Thomas Scientific, Swedesboro, NJ, Stany Zjednoczone | C987D24 | |
| Mocowanie antyblaknięcia ProLong Gold | Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, Stany Zjednoczone | Zobacz materiał P36930 powiedział: | |
| Królicza anty-β-tubulina III | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Stany Zjednoczone) | Zobacz materiał T2200 | |
| Szkiełko nakrywkowe okrągłe szkło niemieckie (8 mm) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, Stany Zjednoczone | 50-949-314 | |
| Rękojeści do skalpeli | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Stany Zjednoczone) | S2896-1EA powiedział: | |
| Szkiełka mikroskopowe | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Stany Zjednoczone) | S8902-1PAK | |
| Probówki wirówkowe o niskiej retencji Snap Cap | Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, Stany Zjednoczone | 3453 | |
| Sorvall Instruments RT6000B Wirówka stołowa | Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, Stany Zjednoczone | 3367898 | |
| Ostrza z piór chirurgicznych | World Precision Instruments (Sarasota, Floryda, Stany Zjednoczone) | 504169 | |
| Tryptyczny agar sojowy | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Stany Zjednoczone) | 22091 | |
| Ksylazyna | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, Stany Zjednoczone | 1236-20-8 |
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Ten artykuł został opublikowany
Film wkrótce dostępny