Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Sortowanie komórek oparte na zamku błyskawicznym Leucyny do oczyszczania komórek transdukowanych dwuwektorowo

620 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/68628

⸱

24 października 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1City of Hope Los Angeles and National Medical Center, 2Lymphoma and Cellular Therapy Services, Memorial Sloan Kettering Cancer Center, 3Department of Hematology and Hematopoietic Cell Transplantation, City of Hope National Medical Center

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

W tym miejscu opisujemy protokół selektywnego oczyszczania podwójnie transdukowanych limfocytów T z mieszaniny kotransdukowanych limfocytów T. Podejście to łączy dwa wektory retrowirusowe, z których każdy koduje jeden składnik sparowanej metodologii sortowania komórek opartej na zamku błyskawicznym leucyny, która umożliwia selektywne oczyszczanie immunomagnetyczne komórek transdukowanych dwoma wektorami.

Streszczenie

Adoptywne terapie limfocytami T, w tym limfocyty T z chimerycznym receptorem antygenowym (CAR), wykazały imponującą aktywność kliniczną przeciwko nowotworom hematologicznym i są obiecujące w leczeniu nowotworów litych. Pomimo tych sukcesów zidentyfikowano wiele mechanizmów oporności na immunoterapię limfocytami T, które ograniczają sukces terapeutyczny, w tym utratę lub słabą ekspresję docelowych antygenów, rozwój wyczerpania limfocytów T i obecność immunosupresyjnego mikrośrodowiska guza. Opracowano wiele strategii inżynierii komórkowej w celu przezwyciężenia tych mechanizmów oporności. Jednak wiele mechanizmów oporności może występować jednocześnie, co wymaga połączenia wielu strategii inżynieryjnych w celu optymalizacji aktywności przeciwnowotworowej. Ograniczenia związane z pakowaniem wektorów ograniczają dostarczanie dużych ilości informacji genetycznej do limfocytów T i stanowią wyzwanie w koekspresji wielu zmodyfikowanych konstruktów. W tym miejscu opisujemy protokół kotransdukcji limfocytów T z dwoma wektorami w celu kodowania wielu transgenów, zwiększając w ten sposób liczbę funkcji inżynieryjnych. Poprzez współekspresję metodologii sortowania komórek opartej na zamku błyskawicznym leucyny, zwanej sortowaniem Zip, kierujemy selektywnym oczyszczaniem immunomagnetycznym komórek z podwójnie transdukowaną transdukcją, które zawierają dwa odrębne wektory.

Wprowadzenie

Terapia komórkami CAR T zrewolucjonizowała leczenie białaczki z komórek B, chłoniaka i szpiczaka mnogiego 1,2. Limfocyty CAR T są również badane pod kątem nowotworów litych3. Zidentyfikowano jednak powtarzające się mechanizmy niepowodzenia terapii komórkami CAR T, w tym słabą ekspresję lub utratę docelowej cząsteczki antygenu CAR, rozwój dysfunkcji komórek T (wyczerpanie), aktywną supresję immunologiczną przez mikrośrodowisko guza oraz ograniczony transport limfocytów T i utrzymywanie się w mikrośrodowisku guza 3,4,5,6 . Podczas gdy indywidualne rozwiązania inżynieryjne zostały opracowane w celu przezwyciężenia każdego z tych mechanizmów oporności komórek CAR T3, wprowadzenie wielu funkcji inżynieryjnych do produktu terapii komórkowej w celu jednoczesnego pokonania wielu mechanizmów oporności jest wyzwaniem ze względu na ograniczoną zdolność pakowania genetycznego systemów wektorów retrowirusowych i lentiwirusowych7.

Aby przezwyciężyć ograniczenia w zdolności pakowania wektorów, coraz częściej stosuje się kotransdukcję limfocytów T z wieloma wektorami. Kotransdukcja wektorowa została wykorzystana do badania strategii inżynierii limfocytów T bramkowanych logicznie i regulowanych lekiem w badaniach przedklinicznych 8,9,10 oraz w niedawnym badaniu klinicznym oceniającym podwójne limfocyty T CD19 / CD22 w celu przezwyciężenia ograniczeń pakowania wektorów11. Jednak kotransdukcja generuje mieszane produkty komórkowe zawierające kombinacje jedno- i podwójnie transdukowanych limfocytów T, co może pogorszyć funkcjonalność produktu, jeśli zależy od składników kodowanych przez oba wektory, a także może prowadzić do konkurencji między jedno-transdukowanymi limfocytami T12.

Aby przezwyciężyć te wyzwania, opracowaliśmy metodologię zwaną sortowaniem Zip, która wykorzystuje heterodimeryzujące zamki leucynowe - każdy wyrażony z jednego z dwóch współtransdukowanych wektorów - do kierowania jednoetapowym oczyszczaniem immunomagnetycznym komórek z podwójną transdukcją13. W tym protokole opisujemy metody konstruowania wektorów retrowirusowych z uwzględnieniem naszej metodologii sortowania Zip, produkcji i koncentracji supernatantu retrowirusowego, aktywacji i kotransdukcji limfocytów T oraz oczyszczania immunomagnetycznego komórek z podwójną transdukcją (sortowanie Zip).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Badania na zwierzętach przeprowadzono w Laboratorium Badań nad Zwierzętami Parvin w Mieście Nadziei (COH) zgodnie z protokołem #23145 zatwierdzonym przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt COH oraz w wiwarium Memorial Sloan Kettering Cancer Center (MSKCC) zgodnie z protokołem #99-07-025 zatwierdzonym przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt MSKCC. Ludzkie limfocyty T wyizolowano z pozbawionych identyfikacji komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC), które zostały oczyszczone Ficoll-Paque z filtrów redukcyjnych leukocytów uzyskanych z Centrum Krwiodawstwa City of Hope i użytych zgodnie z protokołem #24427 zatwierdzonym przez Instytucjonalną Komisję Rewizyjną Miasta Nadziei. Wszystkie procedury zostały przeprowadzone zgodnie z instytucjonalnymi standardami bezpieczeństwa biologicznego.

1. Projekt wektorowy sortowania z zamkiem błyskawicznym

  1. Wybierz wybrany wektor ekspresji do genetycznie modyfikowanych komórek, które Cię interesują.
    UWAGA: Metodologia sortowania suwakowego obejmuje wydzielane zamki błyskawiczne i zamki wychwytujące, z których oba są wyrażane z różnych wektorów i które łączą się wewnątrzkomórkowo i przemieszczają się na powierzchnię komórki, aby umożliwić selektywne oczyszczanie komórek zawierających oba wektory (Rysunek 1A-D)13. Wydzielane zamki błyskawiczne są wyrażone na podstawie wektora 1 i zawierają znacznik powinowactwa. Zamki przechwytujące są wyrażone z wektora 2 i utrzymują wydzielany zamek błyskawiczny na powierzchni komórki. Modyfikacja blokującego zamka błyskawicznego składa się z kowalencyjnie połączonego drugiego zamka błyskawicznego, który blokuje niespecyficzne parowanie zewnątrzkomórkowego zamka błyskawicznego wydzielanego zamka błyskawicznego. Modyfikacja blokującego zamka błyskawicznego jest wymagana, aby zapobiec parowaniu zewnątrzkomórkowemu podczas dodawania zamka błyskawicznego do białek z wydłużonymi domenami zewnątrzkomórkowymi (zwykle domenami zewnątrzkomórkowymi większymi niż domena z krótkimi zawiasami).
  2. Wybierz zestaw ukrytych i przechwytywanych zamków błyskawicznych z Tabeli uzupełniającej 1 i Pliku uzupełniającego 1 , aby przetestować i zbudować wektory.
  3. Sklonuj sekwencje zamka błyskawicznego do sparowanych wektorów ekspresji przy użyciu standardowych technik biologii molekularnej13 - każdy z dwóch wektorów zakoduje albo zamek błyskawiczny wydzielany przez znacznik powinowactwa, albo zamek błyskawiczny przechwytujący (rysunek 1D).
    1. Patrz Tabela Uzupełniająca 1 i Plik Uzupełniający 1 dla sekwencji konstrukcji zamka błyskawicznego. Sekwencje zamków błyskawicznych zostały umieszczone na końcu 5' (N) wiadomości policistronicznej, aby wzmocnić ich ekspresję, a tym samym zwiększyć wydajność sortowania. Umieść kolejne transgeny w dole, oddzielone samorozszczepiającymi się peptydami 2A (ryc. 1D). Jednak wcześniejsze eksperymenty zakończyły się sukcesem w umieszczeniu zamków błyskawicznych w konfiguracji 3 stóp, jeśli zachowana jest wysoka ekspresja.

2. Produkcja retrowirusów

  1. Przygotuj komórki Phoenix-Eco (ATCC CRL-3214, wirus tropowy myszy) lub komórki Phoenix-Eco ɑ-V β-313 (dodatek ɑ-V β-3 mający na celu zwiększenie przyczepności Phoenix-Eco) lub 293Vec-RD11414 (wirus ludzko-tropowy) lub komórki 293Vec-RD114 ɑ-V β-3 (dodanie ɑ-V β-3 w celu zwiększenia przyczepności 293Vec-RD114) na 1 dzień przed transfekcją.
    UWAGA: Protokół ten nie wymaga modyfikacji linii pakujących integrynami ɑ-V β-3, ale modyfikacja ta poprawia adhezję tej linii komórkowej do kolb do kultur tkankowych i ułatwia pobieranie supernatantu retrowirusowego.
    1. Trypsynizuj komórki w kolbie T175 zawierającej komórki Phoenix lub 293Vec-RD114 przy ~ 80% konfluencji z 0,25% trypsyny-EDTA.
      1. Usuń pożywkę, przemyj przylegające komórki 10 ml PBS, utrzymując komórki w stanie niezakłóconym, aby usunąć składniki surowicy, które hamują trypsynę, dodaj 5 ml 0,25% trypsyny-EDTA i inkubuj komórki w temperaturze 37 °C przez 5 minut.
      2. Oddziel i zbierz komórki w 5 ml DMEM uzupełnionym 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 1% penicyliną/streptomycyną i 1% GlutaMAX (określaną jako pełne DMEM).
      3. Umieścić komórki w stożkowej probówce o pojemności 15 ml, odwirowując przy 340 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Zdekantować pożywkę.
    2. Ponownie zawiesić komórki granulowane wirówką w 10 ml kompletnego DMEM i płytkę na 10 cm naczyniu do hodowli tkankowej około 1,5 x 106 komórek Phoenix-Eco, Phoenix-Eco ɑ-V β-3, 293Vec-RD114 lub 293Vec-RD114 ɑ-V β-3 komórek zliczonych za pomocą hemacytometru.
    3. Delikatnie wstrząsnąć lub zakręcić płytką, aby równomiernie rozprowadzić komórki, a następnie inkubować przez noc w temperaturze 37 °C, aby komórki mogły przylgnąć do płytki.
  2. Około 18-24 godziny później sprawdź, czy komórki są zlewające się w 60%-70%, a zdrowe, przylegające komórki wykazują wypustki dendrytyczne.
  3. Stabilnie transfekcyjne komórki Phoenix-Eco, Phoenix-Eco ɑ-V β-3, 293Vec-RD114 lub 293Vec-RD114 ɑ-V β-3 z retrowirusowymi konstruktami wektorowymi LZRS (Addgene Plasmid #31601, transfekcja episomalna oparta na EBNA) lub konstrukty wektorów PB13 (stabilna integracja genomowa oparta na transpozonach piggyBac, plik uzupełniający 1) przy użyciu zestawu do transfekcji (tabela materiałów), jak opisano poniżej.
    1. Połączyć 2 μg DNA wektora LZRS lub DNA wektora PB i 16 μl odczynnika wzmacniającego w 300 μl buforu EC w probówce mikrowirówkowej dla każdej reakcji transfekcji.
    2. Aby zapewnić stabilną integrację konstruktów wektorów PB, dodaj również 1 μg hiperaktywnego wektora transpozazy piggyBac pCMV-hyPBazy15 (Instytut Sangera).
    3. Delikatnie wirować przez 5 s i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Dodać 20 μl odczynnika do transfekcji, wirować przez 10 s i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut w celu wytworzenia kompleksów miceli DNA.
    4. Dodać 300 μl kompletnego DMEM do probówki, kilkakrotnie odpipetować w celu dokładnego wymieszania i dodać zawiesinę miceli kroplami do platerowanych komórek linii pakującej za pomocą pipety o pojemności 1 ml.
    5. Delikatnie mieszaj, aby zapewnić równomierne osadzanie się miceli. Po 24 godzinach trypsynizuj transfekowane komórki i oceń początkową ekspresję konstruktu kodowanego retrowirusowo za pomocą cytometrii przepływowej.
    6. Przenieś trypsynizowane komórki do kolby T75 z 20 ml kompletnego DMEM i dodaj 2 μg/ml puromycyny lub 10 μg/ml blasticydyny, w zależności od genów oporności na antybiotyki, aby wybrać transfekowane komórki. Gdy komórki osiągną zbieżność 70%-75%, trypsynizuj i przenieś do kolby T175 z 40 ml kompletnego DMEM. Utrzymanie selekcji antybiotyków w pożywkach podczas rozbudowy linii pakującej.
    7. Gdy komórki są zlewające się w 80% -85%, ponownie trypsynizuj i potwierdź ekspresję konstrukcji za pomocą cytometrii przepływowej. Zamrażać podwielokrotność komórek za pomocą pożywki do zamrażania (50% kompletnego DMEM, 40% FBS, 10% DMSO) i komórki pasażowe do dwóch kolb T175 (stosunek podziału 1:10-1:12) z 40 ml kompletnego DMEM.
  4. Zebrać i zagęścić retrowirusowy supernatant z w pełni wyselekcjonowanych, stabilnych linii pakujących hodowanych w kolbach T175, gdy komórki osiągną konfluencję 80%-85%.
    1. Usuń antybiotyki z pożywki przed pierwszym zbiorem, zastępując pożywkę w T175 40 ml świeżego, kompletnego DMEM na 24 godziny przed pierwszym planowanym pobraniem.
    2. Zebrać i przefiltrować supernatanty 24 godziny po wymianie pożywki, przepuszczając zebrany supernatant przez strzykawki o pojemności 50 ml wyposażone w filtry strzykawkowe (0,45 μm, polifluorek winylidenu). Zebrać w stożkowej probówce o pojemności 50 ml.
    3. Dodać 5x koncentrat roztworu glikolu polietylenowego (PEG) (40% (wag./obj.) PEG 8,000 MW zawierający 2,4% (wag./obj.) NaCl) przefiltrowany supernatant i kilkakrotnie odwrócić probówkę do góry nogami, aby dokładnie wymieszać (etap wytrącania PEG).
    4. Dodaj 40 ml kompletnego DMEM z powrotem do oryginalnie zebranej kolby T175, inkubuj przez kolejne 24 godziny i zbieraj supernatant wirusa codziennie przez kolejne 2 kolejne dni.
    5. Wytrącać wirusa przez 1-2 dni w temperaturze 4 °C. Wytrącony wirus pojawi się jako kłaczkowaty, pływający lub osadzony materiał.
    6. Odwirować zawiesinę wirusa wytrąconą PEG w temperaturze 2 100 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić niewytrącony supernatant.
    7. Zawiesić każdą osadkę wirusa wytrąconą przez PEG w 500 μl RPMI uzupełnionej 10% FBS, 1% penicyliny/streptomycyny, 1% GlutaMAX, 1% pirogronianu sodu, 1% aminokwasów endogennych i 0,1% β-merkaptoetanolu (określanego jako pełne RPMI).
    8. Natychmiast użyć zawieszonego wirusa do transdukcji lub przeniesienia do probówki do mikrowirówki i przechowywać w temperaturze -80 °C.

3. Dzień 0: Wzbogacenie i aktywacja mysich limfocytów T

  1. Pokryj 6-dołkową płytkę poddaną kulturze tkankowej 1,5 ml PBS na studzienkę zawierającą 2 μg/ml anty-CD3 (klon 145-2C11) i 2 μg/ml anty-CD28 (klon 37,51). Inkubować przez 2 godziny w temperaturze 37 °C.
  2. Zbierz śledzionę od myszy dawcy, zdysocjuj komórki przez filtr 40 μm i zbierz splenocyty w pełnym RPMI. Osady osadowe przez odwirowanie przy 340 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Samice myszy BALB/cJ w wieku 6-8 tygodni zostały wykorzystane jako myszy dawcy w tym badaniu.
  3. Odrzucić supernatant, delikatnie zagrodzić osad, dodać 1 ml buforu do lizy RBC, pipetować 3x-5x do mieszania, inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 min, schłodzić 10 ml pełnego RPMI i odwirować komórki przez odwirowanie przy 340 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  4. Odrzuć supernatant, dodaj 800 μl PBS z 0,5% BSA i 2 mM EDTA (określanymi jako bufor MACS) i dodaj 200 μl mikrokulek myszy-CD19. Odpipetować do mieszania i inkubować przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
  5. Przygotuj 1 kolumnę LD na śledzionę myszy. Przymocuj kolumnę LD do separatora MACS. Umieść pod spodem stożkową probówkę o pojemności 15 ml, aby zebrać splenocyty zubożone w CD19. Zwilżyć kolumnę 2 ml buforu MACS.
  6. Po inkubacji z mikrogranulkami CD19 przemyć komórki 5 ml zimnego buforu MACS, osadzać komórki przez odwirowanie przy 340 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant. Ponownie zawieś w 1 ml buforu MACS i dodaj komórki do kolumny LD. Poczekaj, aż zawiesina przejdzie przez śluz, a następnie przemyj je 1 ml, a następnie 2 ml buforu MACS.
  7. Zbierz przepływ splenocytów zubożonych w CD19 do wykorzystania w dalszej części strumienia. Odrzucić kolumnę LD, odwirować splenocyty zubożone w CD19 przez odwirowanie przy 340 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić w 18 ml pełnej prędkości obrotowej. Dodać rekombinowaną ludzką IL-2 (rhIL-2) do końcowego stężenia 50 j.m./ml.
  8. Wyrzucić roztwór przeciwciała z 6-dołkowej płytki pokrytej przeciwciałem. Dodaj 3 ml zawieszonych splenocytów zubożonych w limfocyty B do każdej studzienki 6-dołkowej płytki pokrytej przeciwciałem.

4. Dzień 1: Transdukcja retrowirusowa mysich limfocytów T

  1. Pokryj 6-dołkową płytkę niepoddaną hodowli tkankowej 1,5 ml PBS na studzienkę zawierającą 2 μg/ml anty-CD3 (klon 145-2C11), 2 μg/ml anty-CD28 (klon 37,51) i 20 μg/ml RetroNectin.
    UWAGA: Podczas powlekania RetroNectin stosuje się płytki niepochodzące z hodowli tkankowej zgodnie z zaleceniami producenta.
  2. Inkubować przez 2 godziny w temperaturze 37 °C. Roztwór powlekający wyrzucić lub zachować do ponownego użycia (można użyć ponownie). Płytka blokowa z 1 ml PBS z 2% BSA na studzienkę, inkubować przez 10 minut w temperaturze 37 °C i odrzucić roztwór blokujący.
  3. W międzyczasie rozmrozić supernatant wirusowy wytrącony PEG w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
    UWAGA: 500 μL każdego współtransdukowanego retrowirusa skoncentrowanego w PEG wygenerowanego z kolby T175 powinno wystarczyć do podwójnej transdukcji do 2 x 106 aktywowanych limfocytów T na studzienkę z > 20% wydajnością podwójnej transdukcji.
  4. Dodać supernatanty wirusowe kotransdukcji do studzienki 6-dołkowej zgodnie z pożądanymi warunkami, doprowadzić końcową objętość do co najmniej 2 ml przy pełnym RPMI i 50 j.m./ml rhIL-2 i wirować przez 1 godzinę w temperaturze 2 100 x g i temperaturze 32 °C.
  5. Dodać 0,5-2 x 106 aktywowanych limfocytów T do dołka i obracać płytkę w temperaturze 340 x g przez 10 minut w temperaturze 32 °C. Jeśli komórki nie przylegają, powtórzyć wirowanie w temperaturze 340 x g przez kolejne 10-20 minut w temperaturze 32 °C. Inkubować w temperaturze 37 °C przez noc.

5. Dzień 2: Ocena ekspresji wektorowej i opcjonalna redukcja

  1. Rozbij 100-200 μl przylegających komórek na warunek z płytki transdukcyjnej do cytometrii przepływowej. Użytkownik powinien zidentyfikować wykrywalny przez cytometrię przepływową marker dla każdego pojedynczego znacznika wektora i powinowactwa i użyć ich do oceny wydajności transdukcji wektora jednowektorowego, wydajności transdukcji dwuwektorowej i prezentacji znacznika powinowactwa za pomocą cytometrii przepływowej.
  2. Wykonaj cytometrię przepływową na współtransdukowanych komórkach, jak opisano poniżej.
    1. Skonfiguruj osie parametrów akwizycji w celu wyświetlenia raportów wektorowych dla wektora 1 i wektora 2 (rysunek 1C).
    2. Wykreśl histogramy dla barwienia zamkiem błyskawicznym znacznika powinowactwa (np. FLAG lub CD34) dla każdego z czterech kwadrantów wyrażeń wektora 1 i wektora 2, aby upewnić się, że barwienie znacznika powinowactwa jest ograniczone do komórek wykazujących współekspresję reporterów transdukcji wektora 1 i wektora 2.
  3. Jeśli komórki są wystarczająco podwójnie transdukowane, aby zapewnić wystarczającą liczbę komórek do dalszych eksperymentów (zwykle 20% lub więcej podwójnej transdukcji), wykonaj następujące kroki.
    1. Pokryj podwójną liczbę początkowych studzienek używanych do transdukcji każdej linii komórek T PBS zawierającymi 2 μg / ml przeciwciał anty-CD3 i anty-CD28 w celu utrzymania stymulacji limfocytów T. Inkubować przez 2 godziny w temperaturze 37 °C.
    2. Przenieś komórki do nowych studzienek za pomocą pełnego RPMI z 50 IU / ml rhIL-2 (utrzymuje stymulację limfocytów T).
  4. Jeśli komórki nie są wystarczająco podwójnie transdukowane, aby zapewnić wystarczającą liczbę komórek do dalszych eksperymentów (zwykle < 20% podwójnej transdukcji), wykonaj następujące kroki.
    1. Ponowna transdukcja przy użyciu tego samego protokołu co Dzień 1, ale zwiększająca się do podwojenia liczby studzienek początkowo używanych do uwzględnienia ekspansji limfocytów T.
    2. Inkubować w temperaturze 37 °C przez noc. Powtórz cytometrię przepływową 24 godziny później.
      UWAGA: Konstrukcje kodowane wektorowo, w tym zamek błyskawiczny znacznika powinowactwa, wykazują maksymalną ekspresję 2 dni po początkowej transdukcji.

6. Dzień 3: Selekcja immunomagnetyczna limfocytów T (sortowanie Zip)

  1. Zgrupuj studzienki komórek wytworzonych przy użyciu tych samych warunków kotransdukcji do stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
  2. Odwirować komórki przy 340 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i inkubować komórki w 500 μl buforu MACS zawierającego 30 μl mikrogranulek (DYKDDDDK (FLAG) lub ludzki CD34) na 1 x 107 komórek przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
  3. Po inkubacji przemyć komórki 5 ml zimnego buforu MACS. Odwirować komórki przy 340 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 1 ml buforu MACS.
  4. Pozytywnie wybierz transdukowane limfocyty T za pomocą kolumny LS, jak opisano poniżej.
    1. Zwilżyć kolumnę 2 ml buforu MACS. Nałóż zawiesinę ogniw na kolumnę LS w stojaku magnetycznym.
    2. Przemyć sekwencyjnie buforem MACS (1 ml, 2 ml, 3 ml). Elute zatrzymane komórki z kolumny poprzez wyjęcie kolumny ze stojaka magnetycznego, dodanie 5 ml pełnego RPMI do kolumny i włożenie tłoka ogniwa.
    3. Umieścić komórki w stożkowej probówce o pojemności 15 ml lub bezpośrednio w kolbie T25. Zrównoważyć komórki przy 0,5 x 106 komórek/ml w pełnym RPMI z 50 IU / ml rhIL-2.
    4. Jeśli zaczynasz od < 20% podwójnej transdukcji, opcjonalnie eluuj komórki do drugiej kolumny LS w celu sekwencyjnej selekcji pozytywnej w celu zwiększenia czystości po sortowaniu.
  5. Hodowla limfocytów CAR T w kolbach T25 lub T75 przy około 0,5 x 106 komórek /ml pełnego RPMI i 50 j.m./ml rhIL-2.
  6. Opcjonalnie: Jeśli limfocyty T będą używane do eksperymentów in vivo, rozważ hodowlę w 1 μM dazatynibu w celu osłabienia dysfunkcji wywołanej sygnalizacją toniczną komórek T CAR, która wystąpiła w początkowym okresie hodowli13,16.
  7. Wykonać cytometrię przepływową zgodnie z krokami 2.1 i 2.2 powyżej dla wstępnie posortowanych i posortowanych limfocytów T, aby ocenić wydajność i czystość po sortowaniu Zip (% podwójnie transdukowane).
    Wydajność = 100 x całkowita liczba odzyskanych komórek z podwójną transdukcją / całkowita liczba komórek z podwójną transdukcją obecnych w populacji wstępnie sortowanej)

7. Dzień 4: Kontynuacja hodowli limfocytów T

  1. Dodaj świeże pełne RPMI i 50 j.m./ml rhIL-2 dla całej objętości hodowli, aby utrzymać stężenie limfocytów T na poziomie 0,5-1 x 106 komórek/ml.
  2. Opcjonalnie: Jeśli limfocyty T będą używane do eksperymentów in vivo , dodaj świeży 1 μM dazatynib.

8. Dzień 5: Charakterystyka limfocytów T posortowanych metodą Zip

  1. Opcjonalnie: Przygotuj 100-200 μl zawiesiny limfocytów T na stan wybarwiony przeciwciałami w celu wykrycia CAR lub innych produktów białkowych kodowanych przez wektory sortowania Zip za pomocą cytometrii przepływowej.
  2. Przeprowadzanie eksperymentów in vitro lub in vivo na limfocytach CAR T.
  3. Opcjonalnie: Jeśli limfocyty T będą używane do eksperymentów in vivo , umyj komórki w celu usunięcia dazatynibu. Zawiesić komórki w stężeniu wymaganym do wstrzyknięcia do żyły zaoczodołowej lub ogonowej zgodnie z wytycznymi instytucji.

9. Dzień 0: Oczyszczanie i stymulacja ludzkich limfocytów T

  1. Szybko rozmrozić fiolkę z kriokonserwowanymi ludzkimi komórkami jednojądrzastymi krwi obwodowej (PBMC) w łaźni wodnej (lub użyć świeżo wyizolowanych PBMC). Dodać rozmrożone PBMC do stożkowej probówki o pojemności 15 ml zawierającej 5 ml buforu MACS, przygotować podwielokrotność do liczenia i osadzać komórki przez odwirowanie w temperaturze 340 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  2. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w buforze MACS (użyć 40 μl buforu na 1 x 107 wszystkich komórek). Kontynuuj izolację komórek T za pomocą zestawu do izolacji komórek Pan T, człowieka, zgodnie z instrukcjami producenta.
    1. Krótko dodając 10 μl koktajlu biotyny i przeciwciał z limfocytów Pan T na 1 x 107 wszystkich komórek. Inkubować przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
    2. Dodać 30 μl buforu MACS na 1 x 107 wszystkich komórek. Dodaj 20 μl koktajlu mikrokulek z komórek T na 1 x10 7 komórek.
    3. Inkubować przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Uzupełnić objętość zawiesiny komórek za pomocą buforu MACS do co najmniej 500 μl.
    4. Przejdź do magnetycznej separacji komórek za pomocą kolumny LS i zbierz przepływ przez zawierające wzbogacone (nietknięte) limfocyty T.
  3. Odliczyć wydajność limfocytów T i komórek osadu przez odwirowanie w temperaturze 340 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant. Ponownie zawiesić ludzkie limfocyty T w pełnym RPMI przy 1 x 106 komórkach / ml z rhIL-2 w 50 IU / ml.
  4. Do stożkowej probówki o pojemności 15 ml zawierającej 2 ml PBS dodać wymaganą objętość ludzkiego aktywatora T CD3/CD28 do ekspansji i aktywacji limfocytów T Dynabeads (25 μl kulek na 1 x 106 komórek, stosując stosunek kulek 1:1 do limfocytów T) i wirować w temperaturze 340 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C w celu umycia kulek. Odrzucić supernatant.
  5. Wymieszać zawieszone limfocyty T z przemytymi kulkami i przenieść do kolby T25 w celu hodowli.

10. Dzień 3: Transdukcja retrowirusowa ludzkich limfocytów T

  1. Pokryj 6-dołkową płytkę bez hodowli tkankowej 1,5 ml PBS na studzienkę, zawierającą 20 μg/ml retronektyny.
  2. Inkubować przez 2 godziny w temperaturze 37 °C. Roztwór powlekający wyrzucić lub zachować do ponownego użycia (można użyć ponownie).
  3. W międzyczasie rozmrozić supernatanty wirusowe wytrącone PEG w celu kotransdukcji w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
  4. Dodać supernatant wirusa kotransdukcji do studzienek 6-dołkowej płytki pokrytej retronektyną zgodnie z pożądanymi warunkami transdukcji, policzyć i dodać żądaną ilość limfocytów T (zwykle 0,5 - 2 x 106 limfocytów T / dołek), zwiększyć objętość do 3 ml z pełnym RPMI zawierającym rhIL-2 i wirować przez 45 minut w temperaturze 340 x g w temperaturze 32 °C.
  5. Po 24 godzinach utrzymuj limfocyty T na poziomie 1 x 106 komórek/ml w pełnym RPMI z 50 IU / ml rhIL-2.
  6. Przenieść komórki z płytki 6-dołkowej do kolby T25, jeśli objętość potrzebna do utrzymania pożądanego stężenia limfocytów T przekracza objętość płytki 6-dołkowej.

11. Dzień 6: Sortowanie ludzkich limfocytów CAR T za pomocą zamka błyskawicznego

  1. Usuń Dynabeads z limfocytów T przed oczyszczaniem immunomagnetycznym opartym na znaczniku powinowactwa (sortowanie Zip), aby uniknąć możliwego zatrzymywania związanego z Dynabead w kolumnie magnetycznej oraz przed cytometrią przepływową, aby uniknąć potencjalnych zakłóceń analizy cytometrii przepływowej.
  2. Krótko wiruj, aby oddzielić Dynabeads i przenieść limfocyty T do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i włożyć do magnesu Dynabead. Odwróć rurkę kilka razy i odczekaj 5 minut, aż Dynabeads zostaną związane z magnesem.
  3. Ostrożnie przenieść zawiesinę komórek bez Dynabeads do nowej stożkowej probówki o pojemności 15 ml, zasysając pipetą. Policz stężenie odzyskanych komórek i użyj objętości, aby obliczyć całkowitą wydajność komórek.
  4. Oceń ekspresję CAR za pomocą cytometrii przepływowej zgodnie z powyższym protokołem transdukcji myszy.
  5. Odwirować komórki przez odwirowanie przy 340 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i inkubować w 500 μl buforze MACS zawierającym 30 μl mikrogranulek (DYKDDDDK (FLAG) lub ludzki CD34) na 1 x 10,7 komórek.
  6. Wykonaj kroki 6.3-6.5, aby uzyskać ludzkie komórki CAR T posortowane za pomocą kodu zip.
  7. Oceń żywotność po sortowaniu za pomocą kontroli żywotności hemacytometru przy użyciu wykluczenia błękitu trypanowego. Oczekuje się, że żywotność przed sortowaniem wyniesie > 80%. Może spaść poniżej 80% po sortowaniu zip, ale wraca w ciągu 4-5 dni.
  8. Rozszerz ludzkie limfocyty T w pełnym RPMI za pomocą 50 IU / ml rhIL-2 i utrzymuj stężenie limfocytów T na poziomie około 1 x 106 komórek / ml. Rozbudowę i konserwację limfocytów T po sortowaniu można dostosować do standardowych protokołów rozbudowy i użytkowania użytkownika.
  9. Przeprowadzić dalsze testy eksperymentalne, takie jak testy zabijania, produkcja cytokin, analiza in vivo przy użyciu limfocytów T na ogół po 8 dniu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W tym protokole demonstrujemy kotransdukcję i jednoetapową selekcję immunomagnetyczną limfocytów T podwójnie transdukowanych dwoma odrębnymi wektorami retrowirusowymi (określanymi jako sortowanie Zip, ryc. 1)13. Każdy wektor koduje jedną część heterodimeryzującej pary zamków błyskawicznych leucyny, która jest selektywnie wyświetlana na powierzchni podwójnie transdukowanych limfocytów T (Figura 1A). Zamek błyskawiczny wydzielany przez znac...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym miejscu opisaliśmy protokół generowania zestawów wektorów sortowania Zip, wytwarzania retrowirusów, kotransdukcji mysich i ludzkich limfocytów T oraz immunomagnetycznego oczyszczania komórek podwójnie transdukowanych (sortowanie Zip). Powyższy protokół został zoptymalizowany pod kątem wektorów retrowirusowych oraz mysich i ludzkich limfocytów T. Chociaż metodologia sortowania Zip nie została oceniona z innymi systemami wektorowymi, zasadniczo inne systemy wektorowe mogą być kompatybilne, w tym lentiwirus

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

A.R., S.C., S.E.J. i M.v.d.B. są współtwórcami zgłoszeń patentowych związanych z technologią sortowania Zip. A.P.B. świadczy usługi konsultingowe dla firm Abbvie i Bristol Myers Squibb. M.v.d.B. otrzymał wsparcie badawcze od Seres Therapeutics oraz opcje na akcje od Seres Therapeutics i ThymoFox; otrzymywał tantiemy od Wolters Kluwer; był konsultantem, otrzymał honorarium lub uczestniczył w radach doradczych Seres Therapeutics, Vor Biopharma, Rheos Medicines, Frazier Healthcare Partners, Nektar Therapeutics, Notch Therapeutics, Ceramedix, Lygenesis, Pluto Therapeutics, GlaskoSmithKline, Da Volterra, ThymoFox, Garuda, Novartis (małżonek), Synthekine (małżonek), Beigene (małżonek), Kite (małżonek), MustangBio (małżonek) i Cellectar (małżonek); posiada licencje na własność intelektualną w Seres Therapeutics i Juno Therapeutics; pełni funkcję powiernika w Radzie Fundacji DKMS (organizacji non-profit); Jest także przewodniczącym naukowej rady doradczej Smart Immune.

Podziękowania

S.C. otrzymała wsparcie Niemieckiej Fundacji Badawczej (Research Fellowship; Deutsche Forschungsgemeinschaft, DFG). S.E.J. otrzymuje wsparcie w postaci nagrody za rozwój kariery przyznawanej przez NCI (numer nagrody K08-CA252157). S.E.J. otrzymał również wsparcie od Amerykańskiego Towarzystwa Onkologii Klinicznej (nagroda dla młodego badacza), Narodowego Programu Dawców Szpiku (nagroda Amy Program) oraz Parker Institute for Cancer Immunotherapy (nagroda Bridge Scholar). Badania w laboratorium van den Brink są wspierane przez nagrody National Cancer Institute P01-CA023766, R35-CA284024, R01-CA228308; Nagroda Narodowego Instytutu Serca, Płuc i Krwi R01-HL164902 oraz nagroda Narodowego Instytutu Starzenia się P01-AG052359. Badania te są częściowo wspierane przez Fundację Deana i Steve'a Campbellów Chief Physician Executive Distinguished Chair.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Linia komórkowa nowotworu
Zobacz materiał C1498Kontroler ATCC (Kontroler TTIB-49 powiedział:
Zobacz materiał BM185-CD19Nr kat. 13
Zobacz materiał BM185-CD20Nr kat. 13
Jednostka główna 4D-NucleofectorLonzaAAF-1003B
Jednostka 4D-Nucleofector XLonzaAAF-1003X
Zestaw buforowy Lonza SF
Virus Production
10 cm Naczynie do hodowli komórkowych poddanych kulturze tkankowej (TC)Corning353003
Probówka stożkowa 50 mlThermo Scientific339652
EfektenQiagen powiedział:301425
plazmid pENTR1aAddgene powiedział:17398
LZRS-RfaAddgene powiedział:31601
PB MMLV puro (wektor wirusowy dla mysich limfocytów T)Nr kat. 13
PB SFG blastR (wektor wirusowy dla ludzkich limfocytów T)Nr kat. 13
pCMV-hyPBazaInstytut Sangera
Feniks-EkologicznyKontroler ATCC (Kontroler TCRL-3214
Phoenix-Eco alpha V beta 3Nr kat. 13Phoenix-Eco zmodyfikowany tak, aby przylegał do kolb hodowlanych z większą zachłannością
PB-EF1a intron WPRE mCD4 P2A MCS integryna beta 3Nr kat. 13opcjonalnie w celu zwiększenia przyczepności komórek linii pakującej do kolb hodowlanych
PB-EF1a intron WPRE hCD8a 2A integryna alfa VNr kat. 13opcjonalnie w celu zwiększenia przyczepności komórek linii pakującej do kolb hodowlanych
Biovec-RD113 powiedział:Biovec Pharma
Biovec-RD113 alfa V beta 3Biovec PharmaTo badanie, transfekowane wektorami alfa V beta 3
Filtry strzykawkowe Millex-HV (0,45 μ m)MiliporySLHVR33RRS
Glikol polietylenowy 8000 (PEG)Fisher NaukowyZobacz materiał BP233-1
Chlorek soduFisher NaukowyZobacz materiał S271-500
PuromycynaBiotechnologia Santa Cruzsc-108071B
BlasticydynaBiotechnologia Santa CruzSC-204655 powiedział:
Kolby T175 z powłoką TC Corning353112
Trypsyna-EDTA (0,25%), czerwień fenolowaGibco (firma Gibco)25200056
Nośniki komórkowe
2-merkaptoetanolGibco (firma Gibco)21985023
RPMI1640Gibco (firma Gibco)11-875-119
DMEM (DMEM)Gibco (firma Gibco)11-965-118
FBS (Sieć UsługowaSigmaF2442 powiedział:
Glutamax (Glutamax)Gibco (firma Gibco)35050061
Aminokwasy endogenne MEMGibco (firma Gibco)11140050
Penicylina-streptomycynaGibco (firma Gibco)15140-163
Pirogronian soduGibco (firma Gibco)11360070
stymulacja/transdukcja limfocytów T
Rurka stożkowa 15 mlThermo Scientific339650
6-dołkowa płytka bez TCGibco (firma Gibco)351146
6-dołkowa płytka TCGibco (firma Gibco)353046
Mikrogranulki anty-CD19 Miltenyi Biotec130-121-301
InVivoMab anty-myszy CD28 (klon 37.51)Dzwonek BioXCellBE0015-1
InVivoPlus anty-myszy CD3 i epsilon; (Klon 145-2C11)Dzwonek BioXCellBE0001-1
Albumina surowicy bydlęcejSigma AldrichA4737-1G
DazatynibChemiczny Kajmany11498
Dynabeads Ludzki T-aktywator CD3/CD28Gibco (firma Gibco)Numer katalogowy 11131D
EDTA (0,5 M), pH 8,0, wolny od RNazInvitrogenAM9260G
HybriMax Bufor do lizy RBCSigmaCzynnik chłodniczy R7757-100ML
Kolumna LDMiltenyi Biotec130-042-901
Zestaw do izolacji limfocytów Pan T, ludzkiMiltenyi Biotec130-096-535
Magnes Dynamag-15InvitrogenNumer katalogowy 12301D
sól fizjologiczna buforowana fosforanami (1X)Corning21040CV
RetronektynaTakaraZobacz materiał T100B
rhIL-2Proleukina (aldesleukina)
Kolba do hodowli komórkowych T25Corning353109
Sort-zip
&mikro; Zestaw izolacyjny MACS DYKDDDDKMiltenyi Biotec130-101-591
CD34 MicroBead Kit, ludzkiMiltenyi Biotec130-046-702
Układ QuadroMACSMiltenyi Biotec130-090-976
Stojak wielofunkcyjny MACSMiltenyi Biotec130-042-303
Kolumna LSMiltenyi Biotec130-042-401
Cytometria przepływowa i monitorowanie komórek
Anty-CD90.1 Thy1.1 APC (klon OX-7)BD Nauki biologiczneKot# 561409; RRID:AB_10683163
Przeciwciało ze znacznikiem anty-V5, (klon 4C12E11) iFluor 488Język GenScriptNr kat.# A01803, RRID:AB_2925231
Myc PETechnologia sygnalizacji komórkowejNr kat.# 2233; RRID:AB_823474
Myc Alexa 647Technologia sygnalizacji komórkowejNr kat.# 2233; RRID:AB_823474
Znacznik APC anty-DYKDDDK (klon L5)Legenda biologicznaKot# 637307; RRID:AB_2561496
Mysie przeciwciało anty CD34, Alexa Fluor 647, (klon QBEnd/10)Novus BiologicalsNr kat.# NBP2-34713AF647; RRID:AB_2925234
Paciorkowiec FITCJęzyk GenScriptNr kat.# A01736; RRID:AB_2622221
Incucyte SX5Sartorius Sartorius (Wyspa Sar
Cytometr przepływowy PenteonAgilent

Bibliografia

  1. June, C. H., Sadelain, M. Chimeric Antigen Receptor Therapy. New Engl J Med. 379 (1), 64-73 (2018).
  2. Mikkilineni, L., Kochenderfer, J. N. CAR T cell therapies for patients with multiple myeloma. Nat Rev Clin Oncol. 18 (2), 71-84 (2021).
  3. Labanieh, L., Mackall, C. L. CAR immune cells: design principles, resistance and the next generation. Nature. 614 (7949), 635-648 (2023).
  4. Berger, T. R., Maus, M. V. Mechanisms of response and resistance to CAR T cell therapies. Curr Opin Immunol. 69, 56-64 (2021).
  5. Labanieh, L., Majzner, R. G., Mackall, C. L. Programming CAR-T cells to kill cancer. Nat Biomed Eng. 2 (6), 377-391 (2018).
  6. Fucà, G., Reppel, L., Landoni, E., Savoldo, B., Dotti, G. Enhancing Chimeric Antigen Receptor T-Cell Efficacy in Solid Tumors. Clin Cancer Res. 26 (11), 2444-2451 (2020).
  7. Ghosh, S., Brown, A. M., Jenkins, C., Campbell, K. Viral Vector Systems for Gene Therapy: A Comprehensive Literature Review of Progress and Biosafety Challenges. Appl Biosafety. 25 (1), 7-18 (2020).
  8. Hyrenius-Wittsten, A., et al. SynNotch CAR circuits enhance solid tumor recognition and promote persistent antitumor activity in mouse models. Sci Transl Medi. 13 (591), eabd8836(2021).
  9. Tousley, A. M., et al. Co-opting signalling molecules enables logic-gated control of CAR T cells. Nature. 615 (7952), 507-516 (2023).
  10. Li, Y., et al. KIR-based inhibitory CARs overcome CAR-NK cell trogocytosis-mediated fratricide and tumor escape. Nat Med. 28 (10), 2133-2144 (2022).
  11. Ghorashian, S., et al. CD19/CD22 targeting with co-transduced CAR T-cells to prevent antigen negative relapse after CAR T-cell therapy of B-ALL. Blood J. , (2023).
  12. Qin, H., et al. Preclinical Development of Bivalent Chimeric Antigen Receptors Targeting Both CD19 and CD22. Mol Ther Oncol. 11, 127-137 (2018).
  13. James, S. E., et al. Leucine zipper-based immunomagnetic purification of CAR T cells displaying multiple receptors. Nat Biomed Eng. 8 (12), 1592-1614 (2024).
  14. Ghani, K., et al. Efficient Human Hematopoietic Cell Transduction Using RD114- and GALV-Pseudotyped Retroviral Vectors Produced in Suspension and Serum-Free Media. Human Gene Ther. 20 (9), 966-974 (2009).
  15. Yusa, K., Zhou, L., Li, M. A., Bradley, A., Craig, N. L. A hyperactive piggyBac transposase for mammalian applications. Proc Natl Acad Sci U S Am. 108 (4), 1531-1536 (2011).
  16. Weber, E. W., et al. Transient rest restores functionality in exhausted CAR-T cells through epigenetic remodeling. Science. 372 (6537), eaba1786(2021).
  17. Bulcha, J. T., Wang, Y., Ma, H., Tai, P. W. L., Gao, G. Viral vector platforms within the gene therapy landscape. Signal Transduct Targeted Ther. 6 (1), 1-24 (2021).
  18. Kahlig, K. M., Saridey, S. K., Kaja, A., Daniels, M. A., George, A. L., Wilson, M. H. Multiplexed transposon-mediated stable gene transfer in human cells. Proc Natl Acad Sci. 107 (4), 1343-1348 (2010).
  19. Shy, B. R., et al. High-yield genome engineering in primary cells using a hybrid ssDNA repair template and small-molecule cocktails. Nat Biotechnol. 41 (4), 521-531 (2023).
  20. Liu, Z., et al. Systematic comparison of 2A peptides for cloning multi-genes in a polycistronic vector. Sci Rep. 7 (1), 2193(2017).
  21. Cui, Z., Yuan, P., Zhao, Z., Zhao, F., Lu, L. Retroviral CRISPR/Cas9-Mediated Gene Targeting for the Study of Th17 Differentiation in Vitro. J Vis Exp. (213), e66966(2024).
  22. Montini, E., et al. The genotoxic potential of retroviral vectors is strongly modulated by vector design and integration site selection in a mouse model of HSC gene therapy. J Clin Invest. 119 (4), 964-975 (2009).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Transdukcja dwuwektorowain ynieria limfocyt w Toczyszczanie immunomagnetyczneadoptywna terapia limfocytami Tlimfocyty CAR Tmikro rodowisko guzakoekspresja transgenuoczyszczanie kom rek
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.