Artykuł metodologiczny

Podkreślenie przejścia mitochondrialnego cytochromu C za pomocą immunotransmisyjnej mikroskopii elektronowej

DOI:

10.3791/68633

⸱

15 sierpnia 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Medical Department, Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2Department of Critical Care Medicine, Traditional Chinese Medicine Hospital of Meishan, 3Sichuan Scientist Biotechnology Co., Ltd, 4Department of Critical Care Medicine, Deyang Hospital Affiliated Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 5Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 6Department of Critical Care Medicine, Hospital of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół opisuje metody badania zmian mikromorfologicznych w neuronach i przejścia mitochondrialnego cytochromu c za pomocą immunotransmisyjnej mikroskopii elektronowej.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zmiany lokalizacji białek w mikrostrukturze często prezentują precyzyjny mechanizm regulacji na poziomie patologicznych organelli. Jak dokładnie uchwycić lokalizację tego transferu białek organelli, ma pozytywne znaczenie i wartość dla diagnozowania i leczenia chorób. Mitochondria odgrywają kluczową rolę w martwicy i wewnętrznym szlaku apoptozy. W normalnych warunkach cytochrom c (Cyt c) występuje tylko między wewnętrzną i zewnętrzną błoną mitochondriów oraz w jądrze. Kiedy komórki ulegają apoptozie, zmienia się przepuszczalność wewnętrznej błony mitochondrialnej, a Cyt c jest uwalniany z mitochondriów do cytoplazmy. W pracy tej ustalono szczurzy model uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego mózgu, a zmiany mikromorfologiczne neuronów ulegających apoptozie wykazano za pomocą immunotransmisyjnej mikroskopii elektronowej. Dodatkowo bardziej precyzyjnie pokazuje wizję znakowania immunozłotem transferu Cyt c z macierzy mitochondrialnej do cytoplazmy po uszkodzeniu niedokrwienno-reperfuzyjnym mózgu. Technika immunotransmisyjnej mikroskopii elektronowej przedstawiona w tym protokole jest odpowiednia do wykazania dowolnych zmian położenia białka na poziomie mikroskopowym.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Według globalnego badania obciążenia chorobami z 2021 roku, udar mózgu byłtrzecią najczęstszą przyczyną zgonów iczwartą najczęstszą przyczyną lat życia skorygowanych niepełnosprawnością. Odnotowano 11,9 miliona nowych przypadków udaru, w których udar niedokrwienny stanowił 65,3% (7,8 miliona)1. Śmierć neuronów następuje po niedokrwieniu mózgu, w tym martwicy i apoptozie. Najciężej dotknięta tkanka mózgowa ulega następnie martwiczej śmierci komórkowej. Neurony w półcieniu niedokrwiennym lub strefie okołozawałowej mogą ulec apoptozie po kilku godzinach lub dniach2. Oprócz funkcji bioenergetycznych i metabolicznych, mitochondria odgrywają również kluczową rolę w wewnętrznym szlaku apoptozy3,4,5,6.

Cyt C to białko kodowane przez geny jądrowe. W normalnych warunkach Cyt C występuje tylko między wewnętrzną i zewnętrzną błoną mitochondriów oraz w jądrze. Szlak apoptozy, w którym pośredniczy jego uwalnianie, jest związany z kontrolą regulacyjną członków rodziny Bcl-2. Po stymulacji przez apoptozę powstają oligomery Bax/Bak i wprowadzane do porów zewnętrznej błony mitochondrialnej, co powoduje zmiany ciśnienia osmotycznego mitochondriów i utratę potencjału transbłonowego. Cyt C jest uwalniany z mitochondriów do cytoplazmy, gdzie wiąże się z aktywatorem apoptozy 1, tworząc kompleks apoptotyczny i aktywując pro-kaspazę-9. Z kolei kaspaza-3 i kaspaza-7 są aktywowane, co inicjuje kaskadę kaspazy i indukuje apoptozę komórek7.

Transmisyjna mikroskopia elektronowa (TEM) może wyraźnie zaobserwować zmiany w strukturze komórki na różnych etapach apoptozy. Obserwacja morfologiczna w mikroskopii elektronowej jest wiarygodną metodą określania apoptozy8. Nie może jednak zaobserwować zmian w Cyt C w ultrastrukturze. Istnieje kilka technik wykrywania określonych białek w ultrastrukturze: cytometria przepływowa, test immunoenzymatyczny sprzężony z enzymem, test immunoenzymatyczny z immunosorbentem, spektrofotometria i Western blot. Nie są jednak w stanie dokładnie uchwycić zmian lokalizacji białka w mikrostrukturze. Złoto koloidalne ma cząstki o różnych rozmiarach, a gęstość elektronowa złota koloidalnego jest wysoka. Technologia Immunogold jest szczególnie przydatna w jedno- lub wielopunktowych badaniach lokalizacyjnych w mikroskopii immunoelektronowej. Ze względu na swoje naturalne zabarwienie od jasnoczerwonego do ciemnoczerwonego, złoto koloidalne jest również podatne na obserwację pod mikroskopem świetlnym. Gdy określone białka są znakowane Immunogold, zmiany lokalizacji można zobrazować za pomocą TEM w rozdzielczości subkomórkowej9.

Ten protokół opisuje podkreślanie przejścia mitochondrialnego Cyt C za pomocą immunotransmisyjnej mikroskopii elektronowej (IEM). Ogólnym celem tej metody jest wizualizacja subkomórkowej translokacji Cyt C podczas apoptozy wywołanej niedokrwieniem za pomocą IEM. Uzasadnieniem dla IEM jest oznaczenie Cyt C złotem koloidalnym i wizualizacja jego zmian lokalizacji w rozdzielczości subkomórkowej za pomocą TEM9. IEM może obserwować dynamiczne zmiany białek na poziomie przestrzennym, dostarczając potężnych środków do wyjaśniania czynności fizjologicznych i patologicznych10.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Program dla zwierząt został zatwierdzony przez Komitet Etyczny SLAS (numer wydania IACUC: SYST-2024-018). W tym przypadku 6 wolnych od patogenów samców szczurów SD (200-220 g) hodowano w niezależnych klatkach wentylacyjnych, utrzymując środowisko laboratoryjne na poziomie 22-25 °C i wilgotności względnej 45%-65%. Wszystkie szczury były poddawane karmieniu adaptacyjnemu przez 1 tydzień z darmową wodą i dietą w tym okresie.

1. Opracowanie modelu niedrożności tętnicy środkowej mózgu (MCAO)

  1. Losowo podziel szczury na grupę MCAO i pozorowaną grupę operacyjną, z trzema szczurami w każdej grupie. Zobacz Rysunek 1 dla eksperymentalnego schematu blokowego.
  2. Sprawdź sprzęt zaangażowany w ten protokół zgodnie z listą w Rysunek 2.
  3. Aby ustalić model MCAO uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego szczura, należy zastosować procedurę szwu śródświetlnego.
  4. Pościć szczury przez 12 godzin przed operacją z dostępem do wody.
  5. Znieczulić szczury SD 2% izofluranem (patrz tabela materiałów) w mieszaninie powietrza i tlenu w tempie 0,6 l/min. Potwierdź prawidłowe znieczulenie, obcinając skórę kończyn kleszczami; szczury nie powinny mieć retrakcji ani odruchu nóg. Przymocuj całkowicie nieprzytomne szczury na stole operacyjnym i utrzymuj temperaturę ciała na poziomie 37 °C za pomocą urządzenia do utrzymywania temperatury zwierząt. Zaklej oczy taśmą zamkniętą podczas zabiegu, aby zapobiec wysuszeniu.
  6. Usuń sierść wokół szyi za pomocą golarki elektrycznej i zdezynfekuj skórę betadyną. Wykonaj 1,5 cm nacięcie szyi w linii środkowej nożyczkami chirurgicznymi (patrz tabela materiałów), wykonaj rozwarstwienie mięśni i powięzi okołonaczyniowej oraz odsłoń tchawicę, aby zlokalizować prawą tętnicę szyjną wspólną (CCA), tętnicę szyjną zewnętrzną (ECA) i tętnicę szyjną wewnętrzną (ICA). Narzędzia chirurgiczne należy sterylizować, aby zapobiec infekcji.
  7. Podwiązać dystalny koniec ECA za pomocą szwu chirurgicznego 6-0 i umieścić kolejny szew chirurgiczny luźno wokół bliższego końca ECA do punktu rozwidlenia. Uważaj, aby nie uszkodzić nerwu błędnego.
  8. Przyciąć CCA i ICA za pomocą klipsów naczyniowych i wykonać małe nacięcie w ECA między dwoma szwami chirurgicznymi.
  9. Wprowadzić szew monofilamentowy do światła ECA w dół w kierunku CCA, zacisnąć szew chirurgiczny wokół kikuta ECA, aby zabezpieczyć szew śródświetlny i zapobiec krwawieniu. Upewnij się, że szew monofilamentowy pasuje do wagi zwierzęcia, aby zminimalizować uszkodzenia i osiągnąć docelową objętość zawału 40% w półkuli ipsilateralnej.
  10. Odetnij pozostałą część ECA, aby uwolnić kikut i umieść kikut ECA poniżej punktu rozwidlenia tak, aby znajdował się mniej więcej w jednej linii z ICA.
  11. Zdejmij klips mikronaczyniowy z ICA, kontynuuj przesuwanie szwu, aż wyczujesz łagodny opór, wskazujący na niedrożność tętnicy środkowej mózgu; długość ta wynosi zwykle około 2 cm. Mocno zawiąż szew wokół żyłki. Usuń drugi zacisk mikronaczyniowy z CCA.
  12. Zamknij nacięcie szwem chirurgicznym i umieść szczura w klatce regeneracyjnej, opiekuj się zwierzęciem do 2 godzin po niedokrwieniu.

2. Przywrócenie przepływu krwi w tętnicy środkowej mózgu

  1. Przed ponownym znieczuleniem sprawdź neuroscore za pomocą skali Longa Score, aby ocenić powodzenie operacji, jak opisano w kroku 3.
  2. Znieczulij szczura jak powyżej i ponownie otwórz nacięcie. Umieść klips mikronaczyniowy na CCA, wyjmij szew zamykający częściowo z ICA, aż koniec szwu będzie widoczny przez ICA.
  3. Umieść kolejny mikroklips na ICA powyżej miejsca szwu śródświetlnego, całkowicie usuń szew okluzyjny i zawiąż kikut ECA. Reperfuzja przez 24h.
  4. Usuń klipsy z CCA i ICA. Zamknij nacięcie szwem chirurgicznym. Buprenorfinę (0,05 mg/kg; patrz Tabela Materiałów) podawać podskórnie.
  5. Włóż szczura z powrotem do klatki, zapewnij mu wodę i rozgniecione jedzenie i dbaj o niego, aż odzyska przytomność. Utrzymywać temperaturę ciała szczurów na poziomie 37± 0,5 °C podczas całej procedury doświadczalnej.

3. Ocena neuroscore

  1. Oceń deficyty neurologiczne po operacji i 24 godziny po reperfuzji za pomocą Longa Score Scale11: (0) brak deficytu; (1) niewyprostowanie w pełni lewej (sparaliżowanej strony) przedniej łapy; (2) krążenie w lewo (sparaliżowana strona); (3) upadek na lewą stronę (sparaliżowany); (4) brak spontanicznego chodzenia i zmniejszona świadomość; (5) martwy.
    UWAGA: Trzech operatorów zostało ocenionych zgodnie z powyższymi standardami.

4. Pobieranie tkanki mózgowej

  1. Pobranie tkanek mózgowych 24 godziny po reperfuzji po ocenie deficytów neurologicznych.
  2. Znieczulij szczura zgodnie z powyższym opisem. Przeciąć skórę, aby odsłonić głowę i szyję, a następnie odciąć rdzeń szyjny od odcinka szyjnego kręgosłupa nożyczkami chirurgicznymi (patrz Tabela materiałów).
  3. Oddziel i usuń tylne mięśnie szyi. Ostrożnie usuń czaszkę za pomocą zakrzywionych kleszczy (patrz Tabela materiałów). Zwróć uwagę na oponę twardą podczas oddzielania czaszki, aby uniknąć zarysowania tkanek mózgu. Całkowicie usuń tkanki mózgowe.
  4. Umieścić tkanki mózgowe w utrwalaczu TEM i IEM wstępnie schłodzonym w temperaturze 4 °C i przechowywać w lodówce w temperaturze 4 °C.

5. Działanie pozorowane

  1. W przypadku operacji pozorowanych należy wykonać wszystkie procedury jak powyżej, z wyjątkiem tego, że okluzja nie jest wykonywana.

6. Przygotowanie i obrazowanie ultracienkich przekrojów

  1. Przygotowanie ultracienkiego przekroju TEM
    1. Utrwalenie: Określ miejsce pobierania próbek świeżej tkanki, aby zminimalizować uszkodzenia mechaniczne, takie jak trakcja, stłuczenie i wytłaczanie, oraz upewnij się, że grubość tkanki nie przekracza 2 mm. Upewnij się, że objętość tkanki nie przekracza 1 mm x 1 mm x 1 mm.
    2. Utrwalać utrwalaczem TEM w temperaturze 4 °C przez 24 godziny. Myć 3x po 15 minut w 0,1 M buforze fosforanowym PB (pH 7,4; patrz tabela materiałów).
    3. Po utrwaleniu: Dodać 1% kwasu osmowego ·0,1 M PB (patrz tabela materiałów) przez 2 godziny w temperaturze pokojowej (25 °C).
    4. Odwodnienie: Odwodnić tkankę kolejno w 30% etanolu przez 10 min, 50% etanolu przez 10 min, 70% etanolu przez 15 min, 90% etanolu przez 15 min, etanolu absolutnym przez 15 min i 100% acetonu przez 15 min.
    5. Zanurzanie gumy: Zanurzyć tkanki kolejno w roztworze żywicy epoksydowej SPI-Pon 812: aceton = 1:3 przez 30 min, roztwór SPI-Pon 812: aceton = 1:1 przez 30 min i roztwór SPI-Pon 812: aceton = 3:1 przez 1 h (patrz Tabela Materiałów).
    6. Polimeryzacja i zatapianie: Zanurzyć próbkę w czystym SPI-Pon 812 na noc w temperaturze 37 °C, wymienić na świeży SPI-Pon 812 na 8 godzin i polimeryzować w temperaturze 60°C przez 48 godzin (patrz tabela materiałów).
    7. Cięcie: Osadzony blok pokroić półcienko o grubości 0,8 μm za pomocą noża diamentowego, wybarwić błękitem aminotoluenowym w temperaturze 25 °C przez 5 minut. Zlokalizuj i wybierz obszary z gęsto upakowanymi neuronami za pomocą mikroskopu świetlnego do obserwacji w dużym powiększeniu. Wykonaj ultracienkie sekcje za pomocą mikromu o grubości 90 nm. Umieść próbki na siatkach miedzianych pokrytych formarem 200 Mesh (patrz Tabela materiałów).
    8. Barwienie końcowe: Siatki barwiące w octanie uranylu w temperaturze 25 °C przez 15 min, a następnie siatki barwiące w roztworze cytrynianu ołowiu w temperaturze 25 °C przez 5 min.
  2. Przygotowanie ultracienkich sekcji IEM
    1. Wykonaj kroki 6.1.1-6.1.4.
    2. Zanurzanie w gumie: Zanurz tkanki kolejno w roztworze LR Biała żywica: Etanol = 1: 3 przez 2 godziny, roztwór LR Biała żywica: Etanol = 1: 1 przez 2 godziny i roztwór LR Biała żywica: Etanol = 3: 1 przez 2 godziny.
    3. Polimeryzacja i zatapianie: Zanurzyć próbkę w czystej białej żywicy LR na noc w temperaturze 4 °C, wymienić na świeżą białą żywicę LR na 4 godziny w temperaturze 25 °C i polimeryzować w temperaturze 55 °C przez 78 godzin.
    4. Dzielenie na sekcje (jak w kroku 6.1.7): Pokrój osadzone bloki półcienko o grubości 0,8 μm, wybarwić błękitem aminotoluenowym w temperaturze 25 °C przez 5 minut. Zlokalizuj i wybierz obszary z gęsto upakowanymi neuronami za pomocą mikroskopu świetlnego. Wykonaj ultracienkie sekcje o grubości 90 nm. Umieść próbki na miedzianych kratkach.

7. Oznakowanie Immunogold

  1. Przepłukać 2x PBS i 1x buforem glicynowym w temperaturze 25 °C przez 5 min każdy, następnie dodać 2% bufor fosforanowy albuminy surowicy bydlęcej (PBS-BSA) i inkubować przez 30 min.
  2. Inkubować w roztworze przeciwciała pierwszorzędowego (królicze przeciwciało poliklonalne przeciwko cytochromowi C) w temperaturze 37 °C przez 2 godziny. Przeciwciało pierwszorzędowe rozcieńcza się PBS-BSA w stosunku 1:50.
  3. Płukać PBS w temperaturze 25 °C przez 5x przez 5 minut każdy. Inkubować w roztworze przeciwciała drugorzędowego znakowanego złotem koloidalnym (IgG kozy sprzężonej ze złotem) w temperaturze 25 °C przez 1 godzinę. Przeciwciało drugorzędowe rozcieńcza się PBS-BSA w stosunku 1:20 (patrz tabela materiałów).
  4. Płukać PBS w temperaturze 25 °C przez 5x przez 5 minut każdy. Spłukiwać wodą destylowaną o temperaturze 25 °C przez 5x po 5 minut (patrz Tabela Materiałów).
  5. Barwienie końcowe: Siatki barwiące w octanie uranylu w temperaturze 25 °C przez 10 minut, a następnie siatki barwiące w roztworze cytrynianu ołowiu w temperaturze 25 °C przez 2 minuty (patrz tabela materiałów).
  6. Zobrazuj ultracienki przekrój i zrób zdjęcia pod transmisyjnym mikroskopem elektronowym przy napięciu 80 kV.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ocena neuroscore potwierdza sukces MCAO, według Longa Score Scale, szczury w grupie MCAO prezentowały co najmniej krążenie w lewo (neuroscore 2). Szczury z pozorowanej grupy operacyjnej nie wykazywały oczywistej dysfunkcji neurologicznej (neuroscore 0). W dniu operacji nie zaobserwowano śmiertelności. Neuroscore zwierząt przedstawiono w Tabeli 1.

Analiza IEM grupy MCAO ujawniła neurony ze skurczonymi jądrami i podwyższoną gęstością elektronów cytoplazmatycznych, którym towarzy...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Podstawowym celem terapii reperfuzyjnej w ostrym udarze niedokrwiennym mózgu jest przywrócenie perfuzji krwi w okolicy niedokrwiennej. Teraz możemy osiągnąć ten cel poprzez trombolizę dożylną, leczenie wewnątrznaczyniowe i terapię przeciwzakrzepową. Jednak przywrócenie perfuzji krwi prowadzi do uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjnego, nasila martwicę neuronów i apoptozę, prowadząc do upośledzenia neurologicznego. Podczas niedokrwienno-reperfuzyjnej nieprawidłowy wyciek elektronów z mitochondrialnego łańcucha transportu ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była wspierana przez Specjalny Projekt Badań Naukowych na temat Tradycyjnej Medycyny Chińskiej Prowincji Syczuan Administracji Tradycyjnej Medycyny Chińskiej (2021MS414).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,9% soli fizjologicznejSichuan Kelun Pharmaceutical Co., Ltd.
200 siatek miedzianych powlekanych formvarZhongjingkeyi Technology Co., Ltd.BZ10262a
220-230g Monofile MCAOBeijing Cinontech Co., Ltd.A4-243250
Alkohol absolutnyChengdu  Kelong  Chemiczny Co., Ltd.
acetonChengdu  Kelong  Chemiczny Co., Ltd.
System znieczulenia dla zwierzątRayward Life Technology Co., Ltd.R500
Utrzymywanie temperatury zwierzątRayward Life Technology Co., Ltd.69020
Stół do pieczeniaShenzhen Bangqi Chuangyuan Technology Co., Ltd.CT-946
Nożyce do kościFine Science Tools16102-11
formy do osadzania kapsułekZhongjingkeyi Technology Co., Ltd.GP130-B
WirówkaSCILOGEXD3024R
Konwencjonalna mikroskopia optyczna jasnego polaZeiss (Niemcy)Zakrzywione
(10 cm)Shanghai Medical Equipment Co., Ltd.
Nóż diamentowyDiatome (Szwajcaria)DU4530
Kleszcze preparacyjneRayward Life Technology Co., Ltd.F12018-10
Kleszcze preparacyjneRayward Life Technology Co., Ltd.F12010-10
Elektryczny piec do suszenia strumieniowegoShanghai YiHENG Scientific Instrument Co., Ltd.DHG-9030A Golarka
elektrycznaYiwu Kemei Electric Appliances Co., Ltd.KM-PG5002
Płyn utrwalającySichuan Scientist Biotechnology CO., Ltd.Szkiełko SC0001
Nantong Mevid Life Science Co., Ltd.
Złoto sprzężone z kozą anty-króliczą lgGSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.
Kleszcze hemostatyczne (12,5 cm)Anqisheng Biotechnological Co., Ltd.PL068
Kleszczyki hemostatyczne (14 cm)Anqisheng Biotechnological Co., Ltd.PL002
IsofluraneRayward Life Technology Co., Ltd.
L. R. Biała żywicaTianjin Tainuo Science and Technology Co., Ltd.
Cytrynian ołowiuSPI (USA)GA10701
Uchwyt igły Jiachi Technologia Medyczna Co., Sp. z o.o.
Tetroksynek osmuTED PELLA (US)4008-220501
PBSServicebioG4202
Królicze przeciwciało poliklonalne przeciwko cytochromowi c   Affinity Biosciences, Sp. z o.o.AF0146
SzczuryPekin Huafukang Biotechnology Co., Ltd.
Zestaw żywicy do zatapiania SPI-Pon 812SPI(US)GS02660
StereomikroskopSunny Optical Technology Co., Ltd.Soptop SZMN
Nożyczki z prostą główką (10 cm)Anqisheng Biotechnological Co., Ltd.PL063
Kleszcze okulstyczne proste (10cm)Shanghai Medical Equipment Co., Ltd.
Nożyczki chirurgiczneRayward Life Technology Co., Ltd.S14001-10
Transmisyjna mikroskopia elektronowaHitachi (Japonia), Ltd.HT7800
ultramikrotomLeica (Niemcy)UC7
Octan uranuSPI (USAGS02624
H2008340020231012012023120501 kleszczyki okulistyczne Primo Star 211001220518001D1110942024071201AGR1281A10044036898028110322241102187881211001

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. GBD 2021 Nervous System Disorders Collaborators. Global, regional, and national burden of disorders affecting the nervous system, 1990-2021: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2021. Lancet Neurol. 23 (4), 344-381 (2024).
  2. Taylor, R. C., Cullen, S. P., Martin, S. J. Apoptosis: controlled demolition at the cellular level. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (3), 231-341 (2008).
  3. Li, G. R., et al. Albiflorin: a promising natural monoterpene glycoside with potential therapeutic benefits for multiple physiological systems. Food Med Homol. , (2025).
  4. Ye, X. S., et al. The food and medicine homologous Chinese Medicine from Leguminosae species: A comprehensive review on bioactive constituents with neuroprotective effects on nervous system. Food Med Homol. 2 (2), 9420033(2025).
  5. Mubeen, M., Sakarwala, A. S., Bijarani, A. I., Kamal, M. T. Enhancing heart health: expanding the use of SGLT2 inhibitors in cardiovascular disease. Med Adv. 3 (2), 122-126 (2025).
  6. Zhang, Y. C., et al. Comprehensive analyses of nuclear mitochondria-related genes in the molecular features, immune infiltration, and drug sensitivity of clear cell renal cell carcinoma. Med Adv. 2 (3), 238-253 (2024).
  7. Broughton, B. R., Reutens, D. C., Sobey, C. G. Apoptotic mechanisms after cerebral ischemia. Stroke. 40 (5), e331-e339 (2009).
  8. Guo, M. J., Lu, B., Gan, J. L., Wang, S. C., Jiang, X. J., Li, H. H. Apoptosis detection: a purpose-dependent approach selection. Cell cycle. 20 (11), 1033-1040 (2021).
  9. Squarzoni, S. Immunoelectron Microscopy Methods. Methods Mol Biol. 2655, 201-210 (2023).
  10. Liu, Y., Ohgaki, R., Okanishi, H., Xu, M., Kanai, Y. Amino acid transporter LAT1 is expressed on cancer cell-derived exosomes with potential as a diagnostic and prognostic biomarker. Sci Rep. 14 (1), 28458(2024).
  11. Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).
  12. Sanderson, T. H., Reynolds, C. A., Kumar, R., Przyklenk, K., Hüttemann, M. Molecular mechanisms of ischemia-reperfusion injury in brain: pivotal role of the mitochondrial membrane potential in reactive oxygen species generation. Mol Neurobiol. 47 (1), 9-23 (2013).
  13. Lesnefsky, E. J., Chen, Q., Tandler, B., Hoppel, C. L. Mitochondrial Dysfunction and Myocardial Ischemia-Reperfusion: Implications for Novel Therapies. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 57, 535-565 (2017).
  14. Hetz, C., et al. channel inhibitors prevent mitochondrion-mediated apoptosis and protect neurons in a model of global brain ischemia. J Biol Chem. 280 (52), 42960-42970 (2005).
  15. Sanderson, T. H., Kumar, R., Sullivan, J. M., Krause, G. S. Insulin blocks cytochrome c release in the reperfused brain through PI3-K signaling and by promoting Bax/Bcl-XL binding. J Neurochem. 106 (3), 1248-1258 (2008).
  16. Goldberg, M. W., Fiserova, J. Immunogold labelling for scanning electron microscopy. Methods Mol Biol. 657, 297-313 (2010).
  17. Sachse, M., de Castro, I. F., Fournier, G., Naffakh, N., Risco, C. Metal-Tagging Transmission Electron Microscopy and Immunogold Labeling on Tokuyasu Cryosections to Image Influenza A Virus Ribonucleoprotein Transport and Packaging. Methods Mol Biol. 1836, 281-301 (2018).
  18. Amiry-Moghaddam, M., Ottersen, O. P. Immunogold cytochemistry in neuroscience. Nat Neurosci. 16 (7), 798-804 (2013).
  19. Veeramachaneni, R., Gu, X., Herrera, G. A. Atypical amyloidosis: diagnostic challenges and the role of immunoelectron microscopy in diagnosis. Ultrastruct Pathol. 28 (2), 75-82 (2004).
  20. Fossmark, R., et al. Ultrastructure and chromogranin A immunogold labelling of ECL cell carcinoids. APMIS. 113 (7-8), 506-512 (2005).
  21. Page, L. J., et al. Secretion of amyloidogenic gelsolin progressively compromises protein homeostasis leading to the intracellular aggregation of proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (27), 11125-11130 (2009).
  22. Vainer, B., Sørensen, S., Nielsen, O. H., Horn, T. Subcellular localization of intercellular adhesion molecule-1 in colonic mucosa in ulcerative colitis. Ultrastruct Pathol. 26 (2), 113-121 (2002).
  23. Cheng, X. T., et al. Revisiting LAMP1 as a marker for degradative autophagy-lysosomal organelles in the nervous system. Autophagy. 14 (8), 1472-1474 (2018).
  24. Karreman, M. A., van Donselaar, E. G., Gerritsen, H. C., Verrips, C. T., Verkleij, A. J. VIS2FIX: a high-speed fixation method for immuno-electron microscopy. Traffic. 12 (7), 806-814 (2011).
  25. Wang, X. B., et al. Mechanistic Insights into salidroside's mitochondrial protection via AMPK/Sirt1/HIF-1α pathway in hypoxic HT22 Cells. J Vis Exp. (218), e66923(2025).
  26. Hou, Y., et al. Rhodiola crenulata alleviates hypobaric hypoxia-induced brain injury by maintaining BBB integrity and balancing energy metabolism dysfunction. Phytomedicine. 128, 155529(2024).
  27. Hou, Y., et al. Salidroside intensifies mitochondrial function of CoCl2-damaged HT22 cells by stimulating PI3K-AKT-MAPK signaling pathway. Phytomedicine. 109, 154568(2023).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Uwalnianie cytochromu Clokalizacja bia ekniedokrwienie m zguszlak apoptozyznakowanie immunoz otemapoptoza neuron wprzepuszczalno mitochondrialnamodel szczurzy
Film wkrótce dostępny

Powiązane artykuły