Method Article

Jednoczesna autofluorescencyjna mikroskopia wieloharmoniczna bez znaczników

DOI:

10.3791/68637

⸱

August 29th, 2025

 ,  ,  ,  , 
1Beckman Institute for Advanced Science and Technology, University of Illinois Urbana-Champaign, 2Department of Bioengineering, University of Illinois Urbana-Champaign, 3Department of Electrical and Computer Engineering, University of Illinois Urbana-Champaign, 4NIH/NIBIB Center for Label-free Imaging and Multiscale Biophotonics, University of Illinois Urbana-Champaign

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten przedstawia przewodnik krok po kroku dotyczący techniki mikroskopowej SLAM (Simultaneous Label-free Autofluorescence Multi-harmonic), w tym szczegółowe informacje na temat generowania laserowego źródła światła, przygotowania próbki tkanki, przeprowadzania obrazowania i analizowania danych. SLAM rozwija mikroskopię nieliniową, mierząc cztery komplementarne kontrasty bez znaczników w celu zbadania mikrośrodowiska tkankowego.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nieliniowa mikroskopia optyczna obrazuje próbki biologiczne poprzez wykrywanie sygnałów z nieliniowego oddziaływania ultrakrótkich impulsów laserowych z cząsteczkami endogennymi. Metoda ta umożliwia szybką identyfikację chemiczną i strukturalną w rozdzielczości subkomórkowej w sposób nieniszczący i wolny od znaczników lub znaczników, umożliwiając w ten sposób skuteczne podejście do badania komórek i tkanek. Te charakterystyczne nieliniowe kontrasty obejmują autofluorescencję wzbudzoną wieloma fotonami i generowanie harmonicznych. Ponieważ każdy z tych kontrastów ma unikalne zalety i ograniczenia, ich połączenie i czasoprzestrzenna współrejestracja zapewniają komplementarną paletę kontrastów, która zwiększa możliwości analityczne nieliniowej mikroskopii optycznej. Dlatego nasza grupa opracowała mikroskopię SLAM (Simultaneous Label-free Autofluorescence Multi-harmonic), technikę obrazowania, która mierzy cztery lub więcej jednocześnie generowanych nieliniowych sygnałów optycznych, mając na celu zidentyfikowanie odrębnych cech morfologicznych, metabolicznych i funkcjonalnych w próbkach biologicznych. W tym miejscu przedstawiamy protokół obrazowania tkanek w SLAM, skupiając się na istotnych elementach techniki, w tym źródle lasera, kompresji impulsu i mikroskopie. Ponadto omówiono przygotowanie próbki i nakreśliliśmy proces przetwarzania danych dla danych SLAM. Prezentowany przepływ pracy nadaje się do badania stanu metabolicznego, układu, odpowiedzi komórkowych i składu tkanek zarówno ludzkich, jak i zwierzęcych bez polegania na etykietach egzogennych.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nieliniowa mikroskopia optyczna wykorzystuje reakcję próbki na intensywne promieniowanie optyczne (światło o polach elektrycznych większych niż 3 ×10 3 V/cm) w celu uzyskania kontrastu obrazu, gdzie indukowana polaryzacja (a tym samym generowany sygnał) zależy nieliniowo od intensywności padania 1,2,3. Ponieważ te wielokrotne kontrasty są mediowane przez różne interakcje światło-materia, mikroskopia nieliniowa zapewnia jednoczesny dostęp do unikalnych informacji dotyczących zarówno morfologii, jak i krajobrazu chemicznego próbki 1,2,3

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie badania na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z protokołem UIUC#23031 zatwierdzonym przez University of Illinois Institutional Animal Care and Use Committee i ściśle przestrzegały wszystkich odpowiednich wytycznych i przepisów.

1. Cięcie i wyrównywanie fotonicznego włókna krystalicznego (PCF)

  1. Za pomocą nożyc do włókien lub przecinaków do drutu przyciąć odcinek fotonicznego włókna krystalicznego (PCF, Tabela Materiałów) na długość nieco ponad 15 cm.
    UWAGA: Długości co najmniej 1,5 cm zostaną rozcięte z każdego końca PCF, ponieważ ta długość jest wymagana do bezpiecznego zacis....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Złożone, wielokanałowe, multimodalne podejście mikroskopu SLAM (ilustracja 1) może utrudniać nowym użytkownikom rozwiązywanie problemów i zrozumienie wyników. Po pierwsze, dobrze rozcięty PCF ma czystą powierzchnię (rysunek 2C) z płaską powierzchnią prostopadłą do długości PCF (rysunek 2A). Ukośna, wyszczerbiona powierzchnia rozszczepienia (rysunek 2B) i obecność zadrapań (rysunek 2.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wygenerowanie odpowiedniego superkontinuum ma kluczowe znaczenie dla udanego obrazowania SLAM, ale może być trudne ze względu na złożoność konfiguracji PCF. Zapewnienie precyzyjnego rozłupywania i ostrożnego obchodzenia się z PCF jest niezbędne do utrzymania czystych powierzchni wolnych od zanieczyszczeń, brudu lub zadrapań, które mogą zakłócać efektywne sprzęganie, generowanie superkontinuum, a nawet skrócić żywotność PCF. Ponieważ PCF wymaga regularnej wymiany, ćwiczenie rozszczepiania włókien i dostrajanie ustawień ta.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Finansowanie sprzętu użytego w tym badaniu zostało częściowo zapewnione przez GSK za pośrednictwem Centrum Optycznego Obrazowania Molekularnego w Beckman Institute for Advanced Science and Technology. Prace te były również częściowo wspierane przez NIH/NIBIB Center for Label-free Imaging and Multiscale Biophotonics (CLIMB) (P41EB031772) oraz Centrum Nauki i Technologii NSF ds. Ilościowej Biologii Komórki. K.K.D.T był wspierany przez NIEHS Research Training Program w zakresie toksykologii i zdrowia środowiskowego (5T32ES007326-25), A.D.C był wspierany przez program Beckman Institute for Advanced Science and Technology Postdoctoral Fellows, a AH był wspierany przez NIBI....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Stolik 3-osiowyThorLabs powiedział:MAX316Przerwać.
Szklana antena obrazowa 35 mmMatTek powiedział:P35G-0-14-CNiepowlekane szkło nakrywkowe #0.
DMEM (DMEM)Gibco (firma Gibco)21063029Wysoki poziom glukozy, HEPES, brak czerwieni fenolowej.
Suplementy pożywki do wzrostu komórek śródbłonkaKomórka promocyjnaC-39210Pomiń płodową surowicę cielęcą.
Laser femtosekundowy FemtoTrainFizyka widm1040-5Moc średnia: >5,0 W, Energia impulsu: >500 nJ, Długość fali: 1040 nm ± 8 nm, Częstotliwość powtarzania: 10 MHz, Szerokość impulsu (FWHM): < 220 fs.
Surowica bydlęca płoduCytiva (Cytiwa)SH30071.03Scharakteryzowany HyClone.
Ściągacz izolacji z włókienThorLabs powiedział:Zobacz materiał T10S13
Sól disodowa dinukleotydu flawinoadeninowego hydratSigma-AldrichZobacz materiał F6625 powiedział:
Lustra galwanometryczneTechnologia Cambridge6215HPrzerwać.
Stanowisko do obróbki szkłaVytran powiedział:GPX3800
ObrazJLaboratorium Eliceiri na Uniwersytecie Wisconsin w MadisonWersja 2.16.0Dystrybucja FIDŻI.
Bibuła KimwipeKimberly-Clark Profesjonalistka34120
L-glutaminaCytiva (Cytiwa)SH30034.01
Stolik mikroskopowyStosowane oprzyrządowanie naukoweFTP-2050 (wersja elektroniczna)
Kontroler stolika mikroskopuStosowane oprzyrządowanie naukoweMS-2000-500-UDSW
Autokorelator mikroskopowyAngewandte Physik und Elektronik GmbHCarpe
Soczewka obiektywuOlympusXLPLN25XWMP2Zanurzenie w wodzie, 25-krotne powiększenie, 1,05 NA.
Miernik mocy optycznejNewport919P-003-10600 - 1700 nm.
Optyczny analizator widmaThorLabs powiedział:OSA202C
Fotoniczne światłowód krystalicznyNKT PhotonicsLMA-PM-15 NKTDuży obszar trybu, utrzymanie polaryzacji. Średnica rdzenia: 15 &mikrom.
Precyzyjna obcinarka do światłowodówFujikura powiedział:Zobacz materiał CT-101
Kształtownik impulsówRozwiązania biofotoniczne Inc.FemtoJock-DPrzerwać.
β-dinukleotyd nikotynamidoadeninowy, zredukowany hydrat soli disodowejSigma-Aldrich10128023001

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Boyd, R. W. Nonlinear optics. , Academic Press. Amsterdam. (2008).
  2. Potma, E. O. Foundations of nonlinear optical microscopy. , John Wiley and Sons. (2024).
  3. Mukamel, S. Principles of nonlinear optical spectroscopy. , O....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Label Free MicroscopyNonlinear Optical MicroscopyMultiphoton MicroscopyHarmonic GenerationAutofluorescence ImagingPhotonic Crystal FiberPulse CompressionTissue ImagingMetabolic ImagingRedox Ratio

Related Articles