Jednoczesna autofluorescencyjna mikroskopia wieloharmoniczna bez znaczników

Summary

Protokół ten przedstawia przewodnik krok po kroku dotyczący techniki mikroskopowej SLAM (Simultaneous Label-free Autofluorescence Multi-harmonic), w tym szczegółowe informacje na temat generowania laserowego źródła światła, przygotowania próbki tkanki, przeprowadzania obrazowania i analizowania danych. SLAM rozwija mikroskopię nieliniową, mierząc cztery komplementarne kontrasty bez znaczników w celu zbadania mikrośrodowiska tkankowego.

Abstract

Nieliniowa mikroskopia optyczna obrazuje próbki biologiczne poprzez wykrywanie sygnałów z nieliniowego oddziaływania ultrakrótkich impulsów laserowych z cząsteczkami endogennymi. Metoda ta umożliwia szybką identyfikację chemiczną i strukturalną w rozdzielczości subkomórkowej w sposób nieniszczący i wolny od znaczników lub znaczników, umożliwiając w ten sposób skuteczne podejście do badania komórek i tkanek. Te charakterystyczne nieliniowe kontrasty obejmują autofluorescencję wzbudzoną wieloma fotonami i generowanie harmonicznych. Ponieważ każdy z tych kontrastów ma unikalne zalety i ograniczenia, ich połączenie i czasoprzestrzenna współrejestracja zapewniają komplementarną paletę kontrastów, która zwiększa możliwości analityczne nieliniowej mikroskopii optycznej. Dlatego nasza grupa opracowała mikroskopię SLAM (Simultaneous Label-free Autofluorescence Multi-harmonic), technikę obrazowania, która mierzy cztery lub więcej jednocześnie generowanych nieliniowych sygnałów optycznych, mając na celu zidentyfikowanie odrębnych cech morfologicznych, metabolicznych i funkcjonalnych w próbkach biologicznych. W tym miejscu przedstawiamy protokół obrazowania tkanek w SLAM, skupiając się na istotnych elementach techniki, w tym źródle lasera, kompresji impulsu i mikroskopie. Ponadto omówiono przygotowanie próbki i nakreśliliśmy proces przetwarzania danych dla danych SLAM. Prezentowany przepływ pracy nadaje się do badania stanu metabolicznego, układu, odpowiedzi komórkowych i składu tkanek zarówno ludzkich, jak i zwierzęcych bez polegania na etykietach egzogennych.

Introduction

Nieliniowa mikroskopia optyczna wykorzystuje reakcję próbki na intensywne promieniowanie optyczne (światło o polach elektrycznych większych niż 3 ×^{10 3} V/cm) w celu uzyskania kontrastu obrazu, gdzie indukowana polaryzacja (a tym samym generowany sygnał) zależy nieliniowo od intensywności padania ^1,2,3. Ponieważ te wielokrotne kontrasty są mediowane przez różne interakcje światło-materia, mikroskopia nieliniowa zapewnia jednoczesny dostęp do unikalnych informacji dotyczących zarówno morfologii, jak i krajobrazu chemicznego próbki ^1,2,3. Podczas gdy tradycyjne techniki mikroskopowe obejmujące liniową interakcję ze światłem świetlnym również umożliwiają obrazowanie ilościowe, mikroskopia nieliniowa pozwala na bardziej multimodalne podejście, często poprawiając głębię obrazowania i przekrój optyczny, jednocześnie powodując mniejsze fotouszkodzenia^próbki4. W kontekście zastosowań biomedycznych, takich jak śródoperacyjna ocena histologiczna^{tkanek 5,6}, technika ta umożliwia bezpośrednie sondowanie natywnych biomolekuł, ułatwiając bezproblemowe badania żywych komórek bez konieczności stosowania zewnętrznych markerów lub modyfikacji. Takie podejście pozwala uniknąć stosowania znaczników, etykiet⁷, cząsteczek egzogennych, genetycznie wyrażanych białek fluorescencyjnych lub nanocząstek, które nie tylko wymagają dużego nakładu pracy, ale także mogą zakłócić natywną biochemię próbki i negatywnie wpłynąć na docelowe komórki lub tkanki ^8,9,10. W ten sposób mikroskop nieliniowy służy jako potężne i autentyczne narzędzie analityczne, które zapewnia ciągłe obrazowanie struktur mikroskopowych bez zmiany integralności chemicznej i strukturalnej próbki. Ta funkcja otwiera szeroki wachlarz zastosowań, począwszy od diagnozy i odkrywania leków, a skończywszy na sygnalizacji komórkowej i biologii systemów.

Kontrasty wielofotonowe, takie jak autofluorescencja dwufotonowa (2PAF), autofluorescencja trójfotonowa (3PAF), generacja drugiej harmonicznej (SHG) i generacja trzeciej harmonicznej (THG), dają korzyści analityczne w charakteryzowaniu próbek. 2PAF jest generowany przez endogenne flawiny, przy czym dinukleotyd flawino-adenozynowy (FAD) jest najliczniejszy w systemach biologicznych¹¹. 3PAF wykorzystuje wzbudzenie w bliskiej podczerwieni do wizualizacji wewnętrznych chromoforów, takich jak NAD(P)H, i umożliwia obrazowanie metaboliczne, jednocześnie omijając problemy związane z fototoksycznością i tłumieniem związane z promieniowaniem UV¹². SHG w szczególności ujawnia niecentrosymetryczne struktury molekularne, takie jak kolagen fibrylarny (typy I, II i III) oraz macierze białkowe 13,14,15,16,17, dostarczając wglądu strukturalnego 1. Wreszcie, THG, wrażliwy na interfejsy i małe cechy strukturalne, przoduje w obrazowaniu rozkładów lipidów i pęcherzyków zewnątrzkomórkowych 18,19,20,21,22^.

Każdy z tych sygnałów kontrastowych został niezależnie zbadany przez grupy badawcze, ustanawiając niszę dla wielofotonowej mikroskopii nieliniowej jako niezawodnego i wszechstronnego narzędzia do zastosowań biologicznych 23,24,25,26. Wysiłki te zostały zainicjowane przez wynalazców mikroskopu 2PAF, którzy wykorzystali swoją innowacyjną technologię, aby uzyskać nowe informacje na temat morfologii tkanek, metabolizmu komórek, a nawet morfofunkcjonalnych cech patologii, takich jak choroba Alzheimera i rak²³. Ich praca ostatecznie doprowadziła do przełomowych zastosowań w neuronauce^27,28. W kolejnych latach kilku badaczy zwróciło uwagę na wrażliwość SHG na zmiany w macierzy zewnątrzkomórkowej, rusztowaniu, które zapewnia strukturalne wsparcie komórkom i które ulega znacznym zmianom podczas patogenezy raka²⁹. Warto zauważyć, że Campagnola i wsp.14,24,30,31 wykazali, że mikroskopia SHG umożliwia wizualizację zespołów makromolekularnych i supramolekularnych, ujawniając szczegóły, takie jak układ, stężenie i rodzaj kolagenu, które nie są wykrywalne za pomocą konwencjonalnych technik opartych na fluorescencji. Wyniki te podkreśliły potencjał mikroskopii SHG jako realnego narzędzia diagnostycznego w warunkach klinicznych. Wreszcie, mikroskopia THG została z powodzeniem zastosowana do wizualizacji warstw siatkówki u gryzoni w rozdzielczości subkomórkowej²⁵, mapowania struktur mózgu³² i uchwycenia wielofazowej topografii inwazji komórek czerniaka³³.

Te historyczne zastosowania mikroskopii nieliniowej zazwyczaj obejmowały laser femtosekundowy (fs) z synchronizacją modów sprzężony z obiektywem o wysokiej aperturze numerycznej (NA) w celu generowania i zbierania sygnałów nieliniowych, które następnie były kierowane za pomocą zwierciadła dichroicznego do filtra pasmowoprzepustowego i zbierane za pomocą lampy fotopowielacza (PMT)³⁴. Pomimo podobnych implementacji, większość aplikacji skupiała się na pozyskaniu tylko jednego, a co najwyżej dwóch kontrastów, pomijając pozostałe. Aby w pełni wykorzystać potencjał mikroskopu wielofotonowego, Boppart i in. najpierw zaimplementowali sekwencyjną akwizycję wielu kontrastów nieliniowych 21,35,36,37, a następnie ich jednoczesną detekcję 4,22,38,39,40,41 . Uzyskana w ten sposób technika, znana jako mikroskopia SLAM (Simultaneous Label-free Autofluorescence Multi-harmonic), rejestruje przestrzennie i czasowo nieliniowe sygnały 2PAF, 3PAF, SHG i THG poprzez wzbudzenie pojedynczego strzału i detekcję multipleksową, uzyskując w ten sposób doskonałą moc analityczną. Kolokacja czasoprzestrzenna tych czterech kanałów zapewnia wysoko uszeregowane i bogate w funkcje dane⁴² oferując przewagę nad danymi pozyskiwanymi sekwencyjnie, eliminując artefakty ruchu i zapewniając lepszą rejestrację obrazu. W związku z tym SLAM umożliwia generowanie cech kompozytowych, takich jak optyczne współczynniki redukcji i utleniania, które skutecznie charakteryzują właściwości metaboliczne 43,44,45. Co więcej, połączona analiza sygnałów z różnych modalności ułatwia projektowanie dodatkowych funkcji w oparciu o korelację i kolokalizację kanałów. Na przykład Shi i in. wykazali znaczenie cech kolokalizacji mikroskopii SLAM w dokładnej klasyfikacji komórek jajnika chomika chińskiego (CHO) stosowanych w produkcji farmaceutycznej⁴². W ten sposób SLAM kładzie podwaliny pod to, co jest obecnie uważane za najnowocześniejsze w mikroskopii wielofotonowej, torując drogę dla przyszłych postępów w tej dziedzinie⁴⁶.

W niniejszym protokole przedstawiamy kluczowe elementy mikroskopu SLAM (rysunek 1) i opisujemy krok po kroku metodologię jego wdrażania. Obejmuje to generowanie i kształtowanie impulsów wzbudzenia, przygotowanie reprezentatywnych próbek tkanek, procedury obrazowania i przetwarzanie, a także wyświetlanie uzyskanych danych. Dzięki wykorzystaniu gotowej technologii i sprawdzonych technik, protokół ten jest uniwersalny, przenośny i może być łatwo powielany przy użyciu podobnych systemów optycznych w różnych laboratoriach.

Rysunek 1: Konstrukcja optyczna mikroskopu multiharmonicznego z autofluorescencją bez znaczników (SLAM). Laser femtosekundowy emituje światło o długości fali 1040 nm w impulsach o długości fali 370 fs z częstotliwością powtarzania 10 MHz. Intensywność i polaryzacja lasera są dokładnie kontrolowane przed pompowaniem kryształu fotonicznego w celu wytworzenia superkontinuum. Impulsy są następnie kompresowane przez kształtownik impulsów i kierowane do dostosowanego do potrzeb laserowego mikroskopu skaningowego (pudełko przerywane). Zwierciadła dichroiczne i filtry pasmowoprzepustowe izolują nieliniowe sygnały generowane przez próbkę, zanim zostaną wykryte przez detektory fotonów o wysokiej czułości, takie jak fotopowielacze (PMT) lub fotodetektory hybrydowe (HPD). Konstrukcja optyczna oparta jest na wcześniej opisanym układzie⁴¹. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Protocol

Wszystkie badania na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z protokołem UIUC#23031 zatwierdzonym przez University of Illinois Institutional Animal Care and Use Committee i ściśle przestrzegały wszystkich odpowiednich wytycznych i przepisów.

1. Cięcie i wyrównywanie fotonicznego włókna krystalicznego (PCF)

1. Za pomocą nożyc do włókien lub przecinaków do drutu przyciąć odcinek fotonicznego włókna krystalicznego (PCF, Tabela Materiałów) na długość nieco ponad 15 cm.
   UWAGA: Długości co najmniej 1,5 cm zostaną rozcięte z każdego końca PCF, ponieważ ta długość jest wymagana do bezpiecznego zaciskania PCF podczas cięcia. Ostateczna długość PCF (12 cm) użyta w tym badaniu została określona na podstawie wcześniejszej symulacji z wykorzystaniem uogólnionego nieliniowego równania Schrödingera⁴⁷ i testów empirycznych. Ogólnie rzecz biorąc, najlepsza długość PCF może się różnić w zależności od typu PCF, wejścia lasera pompy i pożądanego superkontinuum.
   UWAGA: Podczas cięcia PCF należy nosić środki ochrony osobistej (PPE) w celu ochrony oczu i skóry eksperymentatora. Skrawki włókien należy natychmiast wyrzucić do pojemnika na ostre odpady.
2. Usuń około 3 cm plastikowej powłoki z każdego końca PCF za pomocą środka do usuwania włókien (tabela materiałów) lub żyletki, a następnie wyczyść wszelkie resztki plastiku bibułką (tabela materiałów) i 100% metanolem.
3. Umieść jeden koniec PCF w uchwycie na precyzyjnym obcinaczu światłowodowym (Tabela materiałów) i wyrównaj ostrze 1.5 cm od końca PCF. Ostrożnie zamknij zaciski i naciśnij przycisk rozszczepiania .
   UWAGA: Uważnie postępuj zgodnie z instrukcją obsługi tasaka do włókien, w tym szczegółowymi wytycznymi dotyczącymi rozcinania PCF. Ustawienia, takie jak naprężenie włókien, mogą wymagać precyzyjnego dostrojenia w celu uzyskania spójnych i wysokiej jakości rozszczepień dla każdego rodzaju PCF.
4. Sprawdź rozszczepioną powierzchnię i bok PCF za pomocą zintegrowanego mikroskopu (powiększenie 10×) na stacji roboczej do obróbki włókna szklanego (tabela materiałów), upewniając się, że szczelina jest dobrej jakości (rysunki 2A,C). Ponownie rozszczepij, jeśli są zanieczyszczenia (Rysunek 2D), zadrapania (Rysunek 2E) lub rozcięta powierzchnia nie jest płaska i prostopadła do długości PCF (Rysunek 2B).
   UWAGA: Na tym etapie i kolejnych krokach należy zachować szczególną ostrożność, aby uniknąć dotykania rozciętych końców PCF do jakiejkolwiek powierzchni, aby uniknąć uszkodzenia.
5. Rozciąć drugi koniec PCF, zapewniając pożądaną długość końcową.
   UWAGA: PCF używany w tym protokole jest przycinany do 12 cm.
6. Podobnie jak w poprzednich krokach, sprawdź nowo rozszczepiony koniec PCF (patrz krok 1.4). Jeśli rozszczepienie wydaje się wadliwe lub niespójne, wyrzuć obecny PCF i powtórz proces z nowym.
7. Clamp końcówkę wejściową PCF na 3-osiowym stoliku (tabela materiałów) w przybliżeniu na ogniskowej soczewki sprzęgającej światłowód, mierzonej linijką. Bezpiecznie podeprzyj drugi koniec PCF za pomocą tymczasowego słupka lub mocowania.
   UWAGA: Nie clamp jeszcze wyjście, aby uniknąć złamania PCF podczas regulacji brutto.
   UWAGA: Podparcie końca wyjściowego i otoczenie go wystarczającą ilością bloków wiązki jest konieczne, aby zmniejszyć ryzyko ekspozycji na laser.
8. Umieść miernik mocy optycznej (tabela materiałów) na ścieżce wiązki tuż przed PCF, aby zmierzyć moc wejściową. Upewnij się, że laser femtosekundowy (tabela materiałów) jest zablokowany przez migawkę 1 przed włączeniem lasera.
   UWAGA: Zawsze wykonuj wszelkie wymagane programy szkoleniowe w zakresie bezpieczeństwa lasera, aby zrozumieć ryzyko związane z użytkowaniem lasera.
   UWAGA: Podczas obsługi lasera należy nosić odpowiednie okulary ochronne do lasera, specjalnie przystosowane do długości fali i mocy używanego lasera. Przed uruchomieniem lasera usuń całą biżuterię, zegarki i inne przedmioty odblaskowe, które mogą powodować niebezpieczne odbicia rozproszone.
9. Włącz laser i pozwól mu się rozgrzać do określonego przez laser "czasu nagrzewania na zimno". Otwórz migawkę 1 i wyreguluj moc za pomocą płytki półfalowej (HWP1) tuż przed rozdzielaczem wiązki polaryzacyjnej, aż miernik mocy wskaże 260 mW lub mniej.
   UWAGA: Użycie 260 mW do wyrównania zostało określone empirycznie jako wystarczająco niskie, aby uniknąć uszkodzenia PCF (nawet w przypadku nieprawidłowego ustawienia), jednocześnie zapewniając jasną wiązkę do wizualizacji na wizjerze podczerwieni lub celu fluorescencyjnym.
10. Zablokuj laser za pomocą migawki 1 i przesuń miernik mocy do końca wyjściowego PCF.
11. Odblokuj laser i wyreguluj oś optyczną powierzchni wejściowej PCF za pomocą 3-osiowego stolika, aż na mierniku mocy pojawi się sygnał, wskazujący, że część światła jest sprzężona z rdzeniem, okładziną lub plastikową powłoką PCF. Jeśli ustawienie wejścia PCF w ognisku wiązki wykracza poza zakres 3-osiowego stage'a, zablokuj laser, a następnie wyreguluj i ponownie zaciśnij PCF.
    UWAGA: Wizjer podczerwieni (IR) lub cel fluorescencyjny może być używany do wizualizacji, gdzie skupia się wiązka.
12. Korzystając ze stolika 3-osiowego, dostosuj jeden wymiar osi optycznej PCF, aby znaleźć zakres, w którym światło jest sprzężone, oblicz środek tego zakresu i przesuń tam stolik. Powtórz to dla drugiego wymiaru, aby w przybliżeniu wyśrodkować belkę na rdzeniu PCF.
    UWAGA: Znaczniki μm na 3-osiowym stoliku mogą pomóc w pomiarze odległości i znalezieniu środka PCF.
13. Iteracyjnie dostosowuj trzy wymiary stolika 3-osiowego w powtarzającej się sekwencji, optymalizując jednocześnie wydajność sprzęgania, aby precyzyjnie wyśrodkować i skupić wiązkę w rdzeniu PCF.
    UWAGA: Jeśli maksymalna sprawność sprzężenia, mierzona przez miernik mocy, jest zauważalnie niższa niż 80% mocy wejściowej zamknij migawkę 1, odblokuj PCF i sprawdź, czy nie jest uszkodzona. W przypadku uszkodzenia uruchom ponownie od kroku 1.1, w przeciwnym razie zablokuj laser, ponownie zaciśnij PCF i uruchom ponownie wyrównanie od kroku 1.11.
14. Zablokuj wiązkę za pomocą migawki 1 i zwiększ moc lasera do 1,6 W.
    UWAGA: Użycie mocy 1,6 W zostało określone za pomocą symulacji i testów empirycznych w celu wygenerowania wystarczająco szerokiego superkontinuum, przy jednoczesnym pozostaniu poniżej progu uszkodzenia PCF.
15. Otwórz migawkę 1 i ponownie iteracyjnie dostosuj 3-osiowy stolik, aby dostosować lokalizację wejścia PCF w celu optymalizacji wydajności sprzężenia.
    UWAGA: Empirycznie maksymalna sprawność wynosi zwykle około 80%.
16. Zamknij migawkę 1 i zaciśnij wyjście PCF na mniej więcej ogniskowej zwierciadła parabolicznego. Umieść blok belki na wyjściu zwierciadła parabolicznego.
17. Ponownie zmniejsz moc lasera do 260 mW lub mniej.
18. Otwórz migawkę 1 i użyj 3-osiowego stolika zwierciadła parabolicznego, aby wyrównać oś optyczną zwierciadła parabolicznego, aby zminimalizować zniekształcenia wiązki. Następnie dostosuj ostrość i skolimuj wiązkę w dalekim polu.
    UWAGA: Użyj przeglądarki podczerwieni lub celu fluorescencyjnego, aby view wiązka wyjściowa.
19. Wyreguluj lustra za zwierciadłem parabolicznym, aby upewnić się, że wiązka jest wyrównana z resztą układu optycznego.
    UWAGA: Zainstaluj trwałe cele wyrównania lub tęczówki, aby ten krok był powtarzalny.
20. Zamknij migawkę 1 i zwiększ moc lasera do 1,6 W. Otwórz migawkę 1 i sprawdź, czy ścieżka wiązki nie uległa zmianie.
21. Zmierz moc wyjściową kształtownika impulsów (Tabela materiałów) za pomocą miernika mocy. Obróć płytkę półfalową przed kształtownikiem impulsów (HWP3), aby zoptymalizować wydajność transmisji kształtera impulsów.

Rysunek 2: Rozszczepione końce światłowodu fotonicznego (PCF). (A, B) Obrazy boku rozszczepienia. (C-F) Obrazy twarzy rozszczepienia. (A) Dobrze rozszczepiony PCF ma płaską i prostopadłą powierzchnię. (B) Słabo rozszczepiony PCF z pochyloną i wyszczerbioną powierzchnią. (C) Dobrze rozszczepiony PCF z czystą powierzchnią. (D) Niewłaściwie obchodzony PCF, na którego powierzchni znajdują się zabrudzenia. (E) Słabo rozszczepiony PCF z rysami na jego powierzchni. (F) Stary PCF, który został wymieniony. Widoczne jest uszkodzenie rdzenia PCF, widoczne przez ciemną plamę w środku PCF. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

2. Charakterystyka i optymalizacja impulsów

1. Za pomocą spektrometru lub optycznego analizatora widma (OSA, Table of Materials) zmierz laser za zwierciadłem parabolicznym, aby zweryfikować generowanie PCF w superkontinuum.
2. Obróć płytkę półfalową za rozdzielaczem wiązki polaryzacyjnej (HWP2), aby zoptymalizować szerokość superkontinuum.
3. Włącz autokorelator mikroskopowy (Tabela materiałów). Korzystając z oprogramowania, ustaw detektor na detektor wewnętrzny i ustaw zakres skanowania na 5 ps, aby zapewnić uchwycenie całej szerokości autokorelacji impulsów.
   UWAGA: W przypadku konfiguracji z większymi szerokościami impulsów (na przykład z powodu dyspersji w długim PCF), zakres skanowania powinien być odpowiednio zwiększony. Należy pamiętać, że szerokość impulsu mierzona przez autokorelator intensywności nie jest rzeczywistym czasem trwania impulsu, ale nadal może służyć jako użyteczne odniesienie dla kompresji impulsów. W celu dokładnej i pełnej charakterystyki zarówno amplitudy impulsu, jak i fazy, należy stosować techniki spektralnie rozdzielcze, takie jak bramkowanie optyczne z rozdzielczością częstotliwościową (FROG)⁴⁸ .
4. Odblokuj laser i ustaw autokorelator w stosunku do wiązki wychodzącej z kształtownika impulsów, aż pojawi się sygnał.
   UWAGA: Umieszczenie tymczasowych zwierciadeł (dwóch na wejściu i dwóch na wyjściu autokorelatora) umożliwi wyrównanie wiązki z autokorelatorem bez wpływu na resztę układu optycznego.
5. Upewnij się, że migawka 2 jest zamknięta i nałóż odpowiednie media zanurzeniowe (takie jak woda lub olej) na soczewkę obiektywu (Tabela materiałów). Umieść zewnętrzny detektor autokorelatora na stoliku mikroskopu (tabela materiałów) i wyreguluj stolik tak, aby ustawić detektor bezpośrednio nad obiektywem.
   UWAGA: W przeciwieństwie do typowych obiektywów mikroskopowych, zalecane obiektywy stosowane w mikroskopii SLAM przepuszczają promieniowanie ultrafioletowe, aby poprawić wykrywalność THG³⁸.
6. Włącz lustra galwanometru skanującego (Tabela materiałów), aby ustawić ich napięcie na zero. Otwórz migawkę i użyj wizjera podczerwieni lub obiektywu fluorescencyjnego, aby sprawdzić, czy wiązka dociera do detektora zewnętrznego.
7. Ustaw detektor autokorelatora jako detektor zewnętrzny. Dostosuj stage pozycja, aż pojawi się sygnał.
   UWAGA: Jeśli detektor się nasyci, zmniejsz moc za pomocą filtra o neutralnej gęstości.
8. Dostosuj współczynniki wielomianowe (rzędy dyspersji) kształtownika impulsów, aby iteracyjnie zminimalizować szerokość impulsu mierzoną przez autokorelator. Zmniejsz odpowiednio zakres skanowania autokorelatora wraz ze zmniejszaniem się szerokości impulsu, aby poprawić dokładność i wizualizację funkcji autokorelacji.
   UWAGA: Optymalna szerokość impulsu mierzona przy dopasowaniu Gaussa powinna wynosić kilkadziesiąt femtosekund (fs).

3. Przygotowanie próbki

UWAGA: Dla uproszczenia niniejszy protokół opisuje obrazowanie tkanek ex vivo . Jednak ze względu na bezznacznikowy charakter SLAM, procedury obrazowania in vivo można łatwo dostosować³⁸.

1. Poddać zwierzę eutanazji poprzez uduszenie CO₂ lub inną metodę eutanazji zatwierdzoną przez IACUC.
2. W ciągu 10 minut pośmiertnej należy pobrać narząd(-y) będący przedmiotem zainteresowania przy użyciu standardowej procedury sekcji zwłok⁴⁹ i spłukać wstępnie schłodzonym roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS) w celu usunięcia krwi.
   UWAGA: W tym badaniu pobrano wątrobę i płuca.
3. Wypreparuj narząd pionowo lub poziomo za pomocą ostrza, w zależności od wymaganej orientacji do analizy. Upewnij się, że sekcja jest wykonana z precyzją, aby zachować integralność struktury tkanki.
4. Umieść kawałek tkanki w sterylnym naczyniu do hodowli tkankowej wypełnionym kompletną pożywką do hodowli komórkowych bez czerwieni fenolowej. Wstaw tkankę do lodówki w temperaturze 4 °C, jeśli nie pobierasz obrazów natychmiast.
   UWAGA: Pożywką do hodowli komórkowych użytą w tym badaniu była pożywka HEPES buffered-Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) uzupełniona 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 4 mM glutaminą i suplementami pożywki do wzrostu komórek śródbłonka (tabela materiałów). Pożywka ta została starannie dobrana, aby utrzymać fizjologiczną żywotność komórek nabłonka i śródbłonka znajdujących się w próbce tkanki nerkowej w czasie trwania obrazowania⁵⁰.
5. Aby przygotować wzorce kalibracji fluorescencji, należy wyzerować wagę precyzyjną do masy antystatycznej łodzi wagowej i zmierzyć około 5 mg soli disodowej dinukleotydu flawinoadeninowego (FAD, tabela materiałów) lub 5 mg zredukowanej soli disodowej dinukleotydu nikotynamidoadeninowego (NADH, tabela materiałów).
6. Za pomocą pipety jednokanałowej dozować odpowiednią objętość 1 M buforu HEPES do łódek wagowych zawierających wstępnie zważone proszki FAD lub NADH w celu przygotowania roztworów podstawowych o wielkości 5 mM. Kilkakrotnie pipetować w górę i w dół, aby rozpuścić proszek.
7. Przygotować 1 mM roztwory robocze z roztworów podstawowych przez rozcieńczenie 1:5 do buforu HEPES.
   UWAGA: Stężenie robocze 1 mM użyte w tym badaniu zostało określone empirycznie w celu wytworzenia wysokiego sygnału przy jednoczesnym uniknięciu nasycenia detektora.
8. Przechowywać podstawowe roztwory FAD i NADH w probówkach do mikrowirówek w temperaturze 4 °C.
   UWAGA: Wzorce roztworów mogą być przechowywane w lodówce przez kilka dni, ale zaleca się przygotowanie świeżych roztworów do każdego eksperymentu.
9. Tuż przed pobraniem obrazów z mikroskopii SLAM należy umieścić próbki tkanek w naczyniach do obrazowania ze szklanym dnem o średnicy 35 mm (tabela materiałów). Alternatywnie użyj szklanego szkiełka nakrywkowego. Roztwory FAD i NADH rozdzielić na identyczne szalki lub szkiełka nakrywkowe.
   UWAGA: Zdecydowanie zaleca się stosowanie szkła niepowlekanego lub szkła powlekanego poli-D-lizyną ze względu na zmniejszony sygnał tła. Upewnij się, że grubość szkła jest odpowiednia dla używanego obiektywu mikroskopu (w tym badaniu użyto #0).

4. Konfiguracja i obsługa SLAM

1. Sprawdź, czy wejście lasera do PCF jest zablokowane przez migawkę 1 i włącz laser. Pozwól laserowi rozgrzać się przez określony "czas nagrzewania na zimno" lasera.
   UWAGA: W tym badaniu dla lasera stosuje się 30-minutowy czas nagrzewania w zimnej temperaturze.
2. Sprawdź, czy ścieżka wiązki jest wolna od przeszkód i umieść miernik mocy optycznej na ścieżce wiązki tuż przed PCF. Otwórz migawkę 1 i zmierz moc wejściową.
3. Zamknij migawkę 1 i przesuń miernik mocy na wyjście PCF za zwierciadłem parabolicznym. Otwórz migawkę 1 i zmaksymalizuj moc wyjściową PCF za pomocą wejściowego 3-osiowego stage.
4. Pozwól PCF rozgrzać się przez 10 minut, a następnie ponownie zmaksymalizuj moc wyjściową. Nagraj transmisję PCF. Jeśli transmisja spadnie poniżej 50%, wymień PCF.
   UWAGA: Przez cały okres pracy mikroskopu SLAM (w kolejnych krokach) zaleca się pomiar mocy wyjściowej PCF co godzinę, aby zapewnić spójne dane.
5. Przesuń miernik mocy za filtrem o neutralnej gęstości (ND) i obróć filtr, aby kontrolować moc lasera, która dociera do próbki.
   UWAGA: Pomnóż zmierzoną moc przez transmitancję pozostałych elementów optycznych. Przepuszczalność mierzy się, umieszczając miernik mocy za soczewką obiektywu. Do tego badania wykorzystano średnią moc lasera wynoszącą 20 mW na próbce. Moc lasera została określona empirycznie dla danej próbki, głębokości obrazowania i systemu mikroskopowego w celu wygenerowania wysokiej jakości obrazów przy jednoczesnym uniknięciu uszkodzenia próbki lub nieliniowości detektora. Chociaż nie ma ostatecznego standardu, typowe obrazowanie wielofotonowe bez znaczników jest ograniczone do kilkudziesięciu do setek miliwatów 7,32,33,51,52.
6. Włącz galwanometry i scenę. Otwórz oprogramowanie do akwizycji i wprowadź żądane parametry obrazowania.
   UWAGA: W tym badaniu wykorzystano 512 × 512 pikseli i czas przebywania pikseli wynoszący 13,65 μs, aby zobrazować pole widzenia 360 × 360^μm2 . Pięć klatek zarejestrowanych z częstotliwością odświeżania 0,333 Hz zostało uśrednionych w jedną klatkę o wysokiej jakości.
7. Umieścić próbkę na stoliku przy użyciu odpowiedniego medium zanurzeniowego dla obiektywu, tak jak zostało to użyte wcześniej w kroku 2.5.
8. Wyłącz światła w pokoju i zasłoń zasłony.
   UWAGA: Aby uniknąć uszkodzenia czujników, nigdy nie włączaj światła w pomieszczeniu, gdy czujniki są włączone lub przesłony czujnika są otwarte.
9. Włącz detektor, zasilacze i wzmacniacze.
10. Zamknij kaseton świetlny otaczający scenę.
11. Za pomocą elektronicznych przełączników sterujących ręcznie otwórz żaluzje czujki (S3, S4, S5, S6).
12. W oprogramowaniu do akwizycji mikroskopów kliknij przycisk Kliknij, aby rozpocząć akwizycję , aby rozpocząć zbieranie obrazów SLAM. Wyreguluj ostrość mikroskopu, obracając pokrętło na kontrolerze stage mikroskopu (tabela materiałów), aż próbka znajdzie ostrość.
    UWAGA: Szklane szkiełko nakrywkowe generuje silny sygnał THG, który można wykorzystać do dokładnego określenia głębokości obrazowania za pomocą pozycji stolika wyświetlanej na sterowniku stolika mikroskopu. Na przykład wszystkie obrazy wzorców roztworów wykonane w tym badaniu zostały wykonane w płaszczyźnie ogniskowej 20 μm powyżej szkiełka nakrywkowego.
13. Użyj joysticka na kontrolerze stolika mikroskopu, aby zlokalizować żądane pole view w próbce, a następnie kliknij przycisk Stop and Reset (Zatrzymaj i zresetuj).
    UWAGA: Jeśli obraz się nasyci, wróć do kroku 4.5 i zmniejsz moc. Jeśli obraz ma stosunek sygnału do szumu poniżej 10, moc można zamiast tego ostrożnie zwiększyć.
14. Na karcie Zapisywanie kliknij przycisk Zapisz dane , aby przełączyć go na Tak, a następnie kliknij przycisk Kliknij, aby rozpocząć pobieranie. Poczekaj, aż pobieranie się zakończy, zanim przejdziesz dalej.
15. Aby zmienić lub manipulować próbką podczas obrazowania, zamknij przesłony detektora i użyj latarki lub czołówki do światła. Po zmodyfikowaniu próbki wróć do kroku 4.10.
    UWAGA: Aby umożliwić powtarzalność i analizę ilościową, należy zebrać obrazy SLAM standardów roztworów FAD i NADH. Upewnij się, że pole widzenia, rozmiar obrazu i moc wzbudzenia są zgodne z tym, co zostało użyte dla próbek biologicznych.
16. Aby zakończyć akwizycję obrazu SLAM, zamknij przesłony czujnika i wyłącz czujniki przed włączeniem oświetlenia w pomieszczeniu.
17. Zablokuj laser za pomocą migawki 1, a następnie wyłącz laser.
18. Wyłącz galwanometry i stage. Zamknij oprogramowanie do akwizycji mikroskopu.
19. Zutylizuj chusteczkę w odpowiedni sposób i oczyść miejsce pracy.

5. Wizualizacja danych

UWAGA: Poniższa analiza obrazu może być wykonywana w oprogramowaniu do analizy obrazu, takim jak ImageJ⁵³ (Table of Materials) lub w języku programowania z możliwością analizy obrazu, takim jak Python lub MATLAB. W poniższych krokach opisano sposób wykonywania wizualizacji danych przy użyciu narzędzia ImageJ.

1. Upewnij się, że obrazy z każdego kanału są w bezstratnym formacie obrazu (np. TIFF lub PNG).
   UWAGA: Niestandardowe oprogramowanie sterujące mikroskopem użyte w tym badaniu automatycznie zapisywało obrazy jako pliki TIFF. Aby zapisać obraz jako TIFF, otwórz go w ImageJ i wybierz Plik > Zapisz jako > Tiff.
2. Aby wygenerować standardowe obrazy oświetlenia, otwórz obrazy kanałów FAD i NAD(P)H roztworów FAD i NADH, odpowiednio, w ImageJ. Dla każdego obrazu wybierz opcję Process > Filters (Przetwarzaj filtry) > Rozmycie gaussowskie..., ustaw wartość Sigma (promień) na 41, a następnie kliknij przycisk OK.
   UWAGA: Dostosuj sigma (promień) filtra Gaussa zgodnie z potrzebami, aby wystarczająco wygładzić obraz.
3. Aby jednocześnie skorygować nierównomierne oświetlenie i znormalizować intensywność fluorescencji, otwórz obrazy kanałów FAD i NAD(P)H próbki. Dla każdego obrazu wybierz opcję Process > Image Calculator..., w polu Image1 wybierz przykładowy obraz, w polu Operation wybierz opcję Divide, a w polu Image2 wybierz obraz o standardowym oświetleniu, który odpowiada kanałowi przykładowego obrazu, a następnie kliknij przycisk OK.
   UWAGA: Ten krok ma kluczowe znaczenie dla skorygowania zmienności systemu i utrzymania spójności w ilościowych ocenach autofluorescencji, takich jak optyczny współczynnik redoks (ORR).
4. Jeśli wykonano wiele obrazów w celu utworzenia większego pola widzenia lub stosu z, zszyj lub połącz obrazy w jeden obraz lub stos obrazów.
5. Aby wygenerować obraz ORR, najpierw zsumuj obrazy FAD i NAD(P)H. Wybierz Process > Image Calculator..., dla Image1 i Image2 wybierz odpowiednio obrazy kanałów FAD i NAD(P)H, w polu Operation (Operacja) wybierz Dodaj, a następnie kliknij OK. Aby obliczyć obraz ORR, wybierz Process > Image Calculator..., w polu Image1 wybierz obraz kanału FAD, w polu Operation (Operacja) wybierz Divide (Podziel), a w polu Image2 wybierz wynik sumy FAD i NAD(P)H, a następnie kliknij przycisk OK.
6. Aby zastosować mapę kolorów do obrazu ORR, wybierz opcję Obraz > Kolor > Edytuj tablicę LUT..., kliknij przycisk Otwórz, wybierz żądany plik tabeli przeglądowej (.lut) i kliknij przycisk OK. Wybierz Obraz > Dostosuj > Jasność/Kontrast i dostosuj kontrast zgodnie z potrzebami.
   UWAGA: Zaleca się stosowanie izoluminancyjnej mapy kolorów, takiej jak (odwrócona) mapa kolorów CET-I2 ^54,55 używana w tym badaniu. Aby odwrócić mapę kolorów w obrazie ImageJ po zastosowaniu jej do obrazu, wybierz opcję Image > Color (Kolor obrazu) > Invert LUTs.
7. Aby poprawić klarowność obiektów na obrazie ORR, należy przeskalować jasność przez intensywność kanałów fluorescencyjnych. Najpierw wybierz wynik sumy FAD i NAD(P)H i wybierz Przetwarzaj > Zwiększ kontrast..., upewnij się, że zaznaczona jest opcja Normalizuj , a następnie kliknij OK. Wybierz Edytuj > Kopiuj , aby skopiować ten wynik do schowka. Następnie wybierz obraz ORR i wybierz Typ obrazu > > Kolor RGB", a następnie wybierz Typ > obrazu > HSB (32-bitowy). Przesuń suwak u dołu obrazu maksymalnie w prawo, aby wyświetlić kanał Jasność , wybierz Edytuj > Wklej, a następnie wybierz Typ obrazu > > Kolor RGB.
8. Aby zobrazować obraz SLAM jako kompozyt, otwórz cztery kanały SLAM w ImageJ i wybierz: Image > Color > Merge Channels... Dla C2 (zielony) wybierz obraz kanału SHG, dla C5 (cyjan) wybierz obraz kanału NAD(P)H, dla C6 (magenta) wybierz obraz kanału THG, a dla C7 (żółty) wybierz obraz kanału FAD. Upewnij się, że jest zaznaczona opcja Utwórz kompozyt, a następnie kliknij przycisk OK.

Results

Złożone, wielokanałowe, multimodalne podejście mikroskopu SLAM (ilustracja 1) może utrudniać nowym użytkownikom rozwiązywanie problemów i zrozumienie wyników. Po pierwsze, dobrze rozcięty PCF ma czystą powierzchnię (rysunek 2C) z płaską powierzchnią prostopadłą do długości PCF (rysunek 2A). Ukośna, wyszczerbiona powierzchnia rozszczepienia (rysunek 2B) i obecność zadrapań (rysunek 2...

Discussion

Wygenerowanie odpowiedniego superkontinuum ma kluczowe znaczenie dla udanego obrazowania SLAM, ale może być trudne ze względu na złożoność konfiguracji PCF. Zapewnienie precyzyjnego rozłupywania i ostrożnego obchodzenia się z PCF jest niezbędne do utrzymania czystych powierzchni wolnych od zanieczyszczeń, brudu lub zadrapań, które mogą zakłócać efektywne sprzęganie, generowanie superkontinuum, a nawet skrócić żywotność PCF. Ponieważ PCF wymaga regularnej wymiany, ćwiczenie rozszczepiania włókien i dostrajanie ustawień ta...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Stolik 3-osiowy	ThorLabs powiedział:	MAX316	Przerwać.
Szklana antena obrazowa 35 mm	MatTek powiedział:	P35G-0-14-C	Niepowlekane szkło nakrywkowe #0.
DMEM (DMEM)	Gibco (firma Gibco)	21063029	Wysoki poziom glukozy, HEPES, brak czerwieni fenolowej.
Suplementy pożywki do wzrostu komórek śródbłonka	Komórka promocyjna	C-39210	Pomiń płodową surowicę cielęcą.
Laser femtosekundowy FemtoTrain	Fizyka widm	1040-5	Moc średnia: >5,0 W, Energia impulsu: >500 nJ, Długość fali: 1040 nm ± 8 nm, Częstotliwość powtarzania: 10 MHz, Szerokość impulsu (FWHM): < 220 fs.
Surowica bydlęca płodu	Cytiva (Cytiwa)	SH30071.03	Scharakteryzowany HyClone.
Ściągacz izolacji z włókien	ThorLabs powiedział:	Zobacz materiał T10S13
Sól disodowa dinukleotydu flawinoadeninowego hydrat	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał F6625 powiedział:
Lustra galwanometryczne	Technologia Cambridge	6215H	Przerwać.
Stanowisko do obróbki szkła	Vytran powiedział:	GPX3800
ObrazJ	Laboratorium Eliceiri na Uniwersytecie Wisconsin w Madison	Wersja 2.16.0	Dystrybucja FIDŻI.
Bibuła Kimwipe	Kimberly-Clark Profesjonalistka	34120
L-glutamina	Cytiva (Cytiwa)	SH30034.01
Stolik mikroskopowy	Stosowane oprzyrządowanie naukowe	FTP-2050 (wersja elektroniczna)
Kontroler stolika mikroskopu	Stosowane oprzyrządowanie naukowe	MS-2000-500-UDSW
Autokorelator mikroskopowy	Angewandte Physik und Elektronik GmbH	Carpe
Soczewka obiektywu	Olympus	XLPLN25XWMP2	Zanurzenie w wodzie, 25-krotne powiększenie, 1,05 NA.
Miernik mocy optycznej	Newport	919P-003-10	600 - 1700 nm.
Optyczny analizator widma	ThorLabs powiedział:	OSA202C
Fotoniczne światłowód krystaliczny	NKT Photonics	LMA-PM-15 NKT	Duży obszar trybu, utrzymanie polaryzacji. Średnica rdzenia: 15 &mikrom.
Precyzyjna obcinarka do światłowodów	Fujikura powiedział:	Zobacz materiał CT-101
Kształtownik impulsów	Rozwiązania biofotoniczne Inc.	FemtoJock-D	Przerwać.
β-dinukleotyd nikotynamidoadeninowy, zredukowany hydrat soli disodowej	Sigma-Aldrich	10128023001