Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Generowanie matczynych mutantów przy użyciu zpc:cas9 Knock-in Danio pręgowanego

1.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/68642

⸱

22 lipca 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Shandong Provincial Key Laboratory of Animal Cell and Developmental Biology, School of Life Sciences Qilu Hospital (Qingdao), Cheeloo College of Medicine, Shandong University, 2Institut de Biologie Paris-Seine (IBPS), UMR CNRS 8263, INSERM U1345, Development, Adaptation and Ageing, Sorbonne Université, 3College of Marine Life Sciences, Ocean University of China, 4Key Laboratory for Experimental Teratology of the Ministry of Education, Shandong University, 5State Key Laboratory of Microbial Technology, Shandong University, 6Shandong University-Yuanchen Joint Biomedical Technology Laboratory

W tym artykule

Podsumowanie

W tym miejscu opisujemy protokół generowania matczynego mutanta, który łączy stabilną linię knock-in zpc: cas9 z dostarczaniem kaset ekspresyjnych sgRNA za pośrednictwem Tol2.

Streszczenie

Oogeneza i wczesny rozwój embrionalny są krytycznie zależne od mRNA i białek pochodzących od matki. Wyeliminowanie tych czynników matczynych wymaga homozygotycznych mutacji u samic danio pręgowanego, co często skutkuje letalnymi lub niepłodnymi fenotypami, które uniemożliwiają nabycie matczynych zmutowanych zarodków. W naszych poprzednich pracach wprowadziliśmy szybkie podejście do ominięcia śmiertelności jarzmowej poprzez edycję genomu specyficznego dla oocytów. Jednak wcześniej opisany transgen cas9 wykazuje niestabilność i ulega stopniowemu wyciszaniu w kolejnych pokoleniach. Co więcej, obecność elementów transpozycyjnych Tol2 otaczających kasetę zpc:cas9 w tej linii utrudnia potencjalną dalszą transgenezę sgRNA przy użyciu systemu Tol2, który jest obecnie najbardziej wydajnym systemem transgenicznym u danio pręgowanego. W związku z tym istnieje pilne zapotrzebowanie na linię danio pręgowanego wolną od Tol2, która zapewni stabilną i solidną ekspresję Cas9 specyficzną dla oocytów. Tutaj przedstawiamy linię z wpięciem zpccas9 w locus rbm24a , która spełnia ten wymóg. Korzystając z tego ulepszonego narzędzia, zapewniamy proces szybkiego generowania matczynych mutantów genów z zygotycznie letalnymi zmutowanymi fenotypami w modelu danio pręgowanego.

Wprowadzenie

Wczesny rozwój embrionalny kręgowców zależy w dużej mierze od RNA i białek przechowywanych w jaju, zwanych zbiorczo czynnikami matczynymi. Te matczyne produkty są głównie syntetyzowane podczas diplotenowego etapu mejozy I 1,2,3. Aby zbadać ich role funkcjonalne, konieczne jest wytworzenie homozygotycznych zmutowanych osobników płci żeńskiej, ponieważ tylko homozygotyczna mutacja w oocytach może całkowicie zubożyć te czynniki matczyne. Jednak uzyskanie takich homozygotycznych zmutowanych samic staje się wyzwaniem, gdy mutacje homozygotyczne powodują śmiertelność lub bezpłodność 4,5. Stanowi to istotną przeszkodę w wyjaśnieniu funkcji produktów matczynych kodowanych przez geny zygotyczne, letalne lub sterylne. Aby przezwyciężyć to ograniczenie techniczne, opracowano kilka innowacyjnych podejść 6,7,8. Niemniej jednak techniki te często borykają się z wydłużonymi czasami trwania eksperymentów lub poważnymi wyzwaniami technicznymi.

W naszej poprzedniej pracy opracowaliśmy również strategię warunkowego nokautu, która pozwala na wytworzenie matczynych mutantów w ciągu jednego pokolenia 9,10. System składa się z dwóch kluczowych komponentów: transgenicznego danio pręgowanego Tg(zpczcas9) oraz transgenicznego systemu plazmidowego I-SceI zawierającego kasety ekspresyjne 3-4 sgRNA. Wykorzystując ten system, udało nam się osiągnąć warunkowy nokaut czynników matczynych w oocytach 9,10, ale nadal jest miejsce na poprawę. Po pierwsze, efektywność edycji genomu wcześniej opisanej linii transgenicznej Tg(zpczcas9) nie była stabilna w utrzymaniu transgenicznej ekspresji Cas9. Ponadto, ponieważ ta linia transgeniczna została wygenerowana przy użyciu systemu transpozonów Tol2, transpozycja Tol2 nie może być dalej wykorzystywana do integracji kasety ekspresji sgRNA; zamiast tego wymagana jest transgeneza za pośrednictwem I-Sce. Jednak takie podejście jest mniej skuteczne niż Tol2, a także jest bardziej podatne na wyciszenie międzypokoleniowe.

Aby przezwyciężyć te ograniczenia, staraliśmy się ustalić linię knock-in, która umożliwiłaby solidną i stabilną ekspresję Cas9 specyficzną dla oocytów. Linia ta pozwala na wykorzystanie systemu transpozonów Tol2 do wysoce wydajnego dostarczania plazmidów ekspresyjnych sgRNA u danio pręgowanego. Wykorzystując strategię edycji genomu opartą na intronie11, z powodzeniem wygenerowaliśmy linię knock-in zpccas9 ze zintegrowanym miejscem w ostatnim intronie genu rbm24a (Figura 1A, B). Wybraliśmy ten locus jako kandydata na genomiczną bezpieczną przystań dla ekspresji transgenu matki na podstawie dwóch niezależnych obserwacji. 1) Nieszkodliwa integracja: w naszym niedawnym badaniu12 homozygotyczne ryby knock-in przenoszące egzogenne DNA w tym miejscu pozostały w pełni zdolne do życia i płodne. 2) Solidna ekspresja: gdy kaseta zpccas9 została wprowadzona w tym samym locus, Cas9 ulegał ekspresji na wysokich poziomach, co dawało niezmiennie wysoką wydajność edycji genomu przez pokolenia (Figura 1C). Jako podstawowy składnik plazmy zarodkowej, białko wiążące RNA Rbm24a współpracuje z Buc w celu włączenia RNA plazmy zarodkowej do granulek zarodkowych. W konsekwencji matczyny niedobór Rbm24a prowadzi do całkowitego braku pierwotnych komórek rozrodczych (PGC)12. Tutaj, biorąc pod uwagę rbm24a jako przykład w naszej ostatniej pracy, zapewniamy ulepszony protokół wideo do generowania i charakteryzowania matczynych mutantów dla jarzygotycznych genów letalnych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi ARRIVE i zostały etycznie zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami Uniwersytetu Shandong (Zatwierdzenie nr. SYDWLL-2021-15). Przegląd tego protokołu przedstawiono na rysunku 2.

1. Generowanie linii knock-in rbm24a-RFP zpc:cas9

  1. Badanie przesiewowe sgRNA pod kątem knock-in
    1. Wybierz i zsyntetyzuj kandydatów na sgRNA knock-in
      1. Prześlij sekwencję ostatniego intronu rbm24a do skanowania CRISPRscan (http://www.crisprscan.org), aby zidentyfikować optymalnych kandydatów na sgRNA wykazujących zarówno wysokie wyniki skanowania CRISPRs (wskazujące na skuteczność w miejscu), jak i niskie wyniki CFD (odzwierciedlające efekty poza celem). Zsyntetyzuj długi oligo dla każdego sgRNA (oligo sgRNA).
        UWAGA: CRISPRscan generuje oligonukleotydy sgRNA zawierające niezbędne elementy funkcjonalne, w tym sekwencję promotora T7, 20-nukleotydową sekwencję docelową sgRNA i 16-nukleotydową sekwencję rusztowania sgRNA. Tutaj wybraliśmy sgRNA o następującej sekwencji: 5′-taatacgactcactataGGGCTGCTGTCATGTTGG
        GTgttttagagctagaa-3′ (małe litery promotora T7, wielkie litery przewodnika 20-nt, małe litery rusztowania częściowego).
      2. Aby uzyskać matrycę DNA do syntezy sgRNA, należy przygotować 50 μL reakcji Fill-in PCR: 2x Taq Master mix 25 μL; starter sgRNA (10 μM) 2 μL; Uniwersalny podkład (10 μM) 2 μL; Dejonizowany H2O 21 μL.
        UWAGA: Sekwencje wszystkich podkładów są pokazane w Tabeli materiałów.
      3. Dokładnie wymieszać i przenieść mieszaninę reakcyjną do wstępnie zaprogramowanego termocyklera i zainicjować protokół amplifikacji, stosując parametry cykliczne w następujący sposób: 1 cykl w temperaturze 94 °C przez 3 min, 35 cykli (94 °C przez 15 s, 50 °C przez 15 s, 72 °C przez 30 s) i 1 cykl w temperaturze 72 °C przez 5 min.
      4. Przygotować mieszaninę reakcyjną do syntezy sgRNA w probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml; połączyć wszystkie składniki w temperaturze pokojowej w następującej kolejności: 11 μl wody destylowanej, 2 μl ATP/GTP/CTP/UTP (po 10 mM), 10 μl produktu PCR, 4 μl buforu reakcyjnego 10x polimerazy RNA, 2 μl polimerazy T7 RNA i 1 μl inhibitora RNazy. Całkowita objętość reakcyjna wynosi 40 μl. Dokładnie wymieszać przez strzepywanie i przeprowadzić krótkie odwirowanie.
      5. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 1,5 godziny. Dodać 1 μl DNazy I, wymieszać przez trzebanie i krótko odwirować. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 15 minut, aby zapewnić całkowite usunięcie matrycy DNA.
      6. Dodać 5 μl kulek magnetycznych krzemionkowych, a następnie 120 μl (4x objętość) buforu wiążącego RNA (Gu-HCl 1 M 9,55 g, Tween-20 0,05%, etanol 100 ml). Dokładnie wymieszać pipetując. Inkubować na termomikserze z prędkością 1 500 obr./min przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
      7. Umieść probówkę na stojaku magnetycznym i ostrożnie usuń supernatant za pomocą pipety lub systemu próżniowego.
      8. Dodaj 400 μl 90% etanolu i odwiruj, aby ponownie zawiesić kulki. Umieść probówkę na stojaku magnetycznym i wyrzuć supernatant.
      9. Powtórz kroki mycia etanolem, aby zakończyć łącznie dwa cykle prania.
      10. Usunąć resztki supernatantu i wysuszyć otwartą probówkę na powietrzu na bloku grzewczym o temperaturze 50 °C przez 10 minut.
      11. Dodać 15 μl wody wolnej od nukleaz i inkubować na termomikserze z prędkością 1 500 obr./min przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
      12. Umieść probówkę na stojaku magnetycznym i przenieś eluat do świeżej probówki do mikrowirówki.
      13. Potwierdź pasmo sgRNA 98 pz za pomocą elektroforezy agarozowej. Określić ilościowo stężenie RNA za pomocą mikrospektrofotometru i elektroforezy agarozowej, wyraźnie oznaczyć i przechowywać w temperaturze -20 °C.
    2. Testowanie wydajności sgRNA
      1. Aby określić rzeczywistą wydajność sgRNA, należy przygotować kompleks rybonukleoproteinowy (RNP) do mikroiniekcji. Zmieszać 1 μl każdego sgRNA (stężenie końcowe 50 ng/μl) z 1 μl białka Cas9 (stężenie końcowe 100 ng/μl) na lodzie przez pipetowanie. Dostarczyć 2 nl kompleksu RNP do każdego zarodka w stadium jednokomórkowym za pomocą mikrowstrzyknięcia.
      2. Po 24 godzinach od zapłodnienia (hpf) należy pobrać 10 zarodków z każdego wstrzykniętego Cas9 RNP do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml i ostrożnie usunąć nadmiar pożywki. Dodać 100 μl 50 mM NaOH (10 μl na zarodek) i inkubować w temperaturze 95 °C przez 15 minut przy użyciu bloku grzewczego lub termocyklera. Zneutralizować lizat, dodając 10 μL 1 M Tris-HCl (pH 7,0).
      3. Zneutralizowany lizat zarodkowy należy wykorzystać bezpośrednio jako matrycę do amplifikacji PCR. Zaprojektuj startery, aby wzmocnić fragment zawierający miejsce docelowe z sekwencjami flankującymi ≥100 pz po obu stronach. Zweryfikuj produkty PCR za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym i w razie potrzeby oczyść za pomocą ekstrakcji żelu. Wykonaj sekwencjonowanie Sangera amplifikowanych produktów.
      4. Kwantyfikacja efektywności edycji CRISPR: analiza chromatogramów sekwencjonowania za pomocą narzędzia analitycznego ICE (Inference of CRISPR Edits) (https://ice.synthego.com/#/). Znormalizuj wydajność edycji w stosunku do niewstrzykniętych próbek kontrolnych zgodnie z protokołami zalecanymi przez witrynę internetową.
  2. Budowa plazmidu dawcy do knock-in
    1. Do przeprowadzenia reakcji ligacji13 należy zastosować uznaną metodologię TEDA (składanie DNA egzonukleazy T5).
    2. Zastosuj trzyfragmentową strategię montażu Gibsona do budowy plazmidu dawcy knock-in rbm24a-RFP KIzpc:cas9 . Pierwszy fragment zawiera ramię homologii 5' o długości 1 704 pz, obejmujące region genomu bezpośrednio przed kodonem stop rbm24a . Druga to sekwencja kodowania GFP. Trzeci zawiera ramię homologiczne 3' 2,274 bp za kodonem stop rbm24a , a następnie kasetę ekspresji zpccas9 umieszczoną w kierunku 3' dystalnym do rbm24a 3'-UTR.
    3. Złóż trzy fragmenty w miejscu ApaI wektora pBluescript SK- za pomocą zestawu Gibsona.
    4. Zweryfikuj końcowy plazmid poprzez trawienie restrykcyjne i sekwencjonowanie Sangera.
  3. Mikroiniekcja i selekcja zarodków z wczesną integracją
    1. Przygotować mieszaninę iniekcyjną zawierającą 12 pg plazmidu dawcy knock-in rbm24a-RFP KI zpc:cas9 , 200 pg sgRNA i 600 ng rekombinowanego białka Cas9 w wodzie wolnej od nukleaz. Dostarczyć 1-2 nL mieszaniny do blastodysku zarodków w stadium jednokomórkowym przy użyciu standardowych technik mikroiniekcji. Przy 30 hpf przesiewaj zarodki pod kątem wzorców ekspresji RFP, które naśladują endogenną ekspresję rbm24a, co wskazuje na integrację plazmidu dawcy już na etapie rozszczepienia. Wybierz te zarodki z wczesną integracją do hodowli, które wykazały sygnał RFP w soczewce, sercu, mięśniach szkieletowych i komórkach rzęsatych ucha wewnętrznego (ryc. 3A, B).
      UWAGA: Przed wstrzyknięciem należy oczyścić plazmid przez ekstrakcję fenolowo-chloroformową, aby wyeliminować wszelkie pozostałości RNaz wprowadzonych podczas przygotowania plazmidu.
    2. Przeanalizuj wzorce ekspresji matczynego Rbm24a-RFP w zarodkach pokolenia F1 pochodzących z krzyżówek rbm24a-RFP KIzpc:cas9 (Figura 4A,B).
  4. Ocena ekspresji białka Cas9 i efektywności edycji
    1. Aby ocenić skuteczność edycji Cas9, należy wstrzyknąć 200 pg bmp2b sgRNA do 1-komórkowych zarodków rbm24a-RFP KIzpc:cas9 (Figura 1C,D).
    2. Aby ocenić stabilność edycji Cas9, określ ilościowo liczbę zarodków wykazujących fenotypy grzbietowe i wykonaj analizę sekwencjonowania Sangera w celu oceny skuteczności edycji (ryc. 5A-D).
      UWAGA: Chociaż nie wykryliśmy żadnego zmniejszenia ekspresji Cas9 w ciągu trzech generacji, nadal zalecamy sprawdzenie wydajności edycji w każdej generacji tej linii knock-in.

2. Transgeneza sgRNA w linii rbm24a-RFP KI zpc cas9

  1. Wybierz i zsyntetyzuj sgRNA do nokautu rbm24a .
    1. Wybierz i zsyntetyzuj kandydatów na sgRNA zgodnie z opisem w kroku 1.1.1.
      UWAGA: Bardzo ważne jest, aby wybrać sgRNA, które celują w przednią połowę regionu kodującego, aby zapewnić wysoce efektywną utratę funkcji. Dodatkowo, jeśli krytyczne domeny białkowe zostaną zidentyfikowane w regionie C-końcowym, dopuszczalne są również sgRNA ukierunkowane na koniec 3' sekwencji kodującej. CRISPRscan generuje oligonukleotydy sgRNA zawierające niezbędne elementy funkcjonalne, w tym sekwencję promotora T7, 20-nukleotydową sekwencję docelową sgRNA i 16-nukleotydową sekwencję rusztowania sgRNA. Aby osiągnąć skuteczny nokaut genów matczynych, zaleca się zaprojektowanie 6-8 kandydatów, aby niezawodnie zidentyfikować 3-4 wysoce wydajne sgRNA. Szczegółowy protokół można znaleźć w poprzednim artykule9.
    2. Zbadaj wydajność sgRNA we wczesnym zarodku danio pręgowanego, jak opisano w kroku 1.1.2.
      UWAGA: preferowane są sgRNA o wydajności edycji przekraczającej 50%.
  2. Budowa transgenicznego plazmidu wykazującego ekspresję sgRNA
    UWAGA: Aby zmaksymalizować wydajność edycji, zalecamy użycie czterech odrębnych, nienakładających się na siebie sgRNA, z których każdy jest oddzielony o co najmniej 36 pz. Te sgRNA są indywidualnie ligowane w wektory pU6x: sgRNA (pU6x: sgRNA #1, #2, #3, #4), z których każdy zawiera unikalne promotory U6 wraz z rusztowaniem 3'14. Następnie te cztery wektory U6, z których każdy zawiera kasetę ekspresji sgRNA, są łączone w wektor docelowy pGGDestISceIEB-4sgRNA za pomocą ligacji Golden Gate.
    Wektory pU6x:sgRNA należy wybierać sekwencyjnie. Na przykład, jeśli klonujesz trzy sgRNA, użyj wektorów od #1 do #3; jeśli klonujesz cztery sgRNA, użyj wektorów od #1 do #4.
    1. Subklonowanie sekwencji docelowej sgRNA do wektorów pU6x:sgRNA
      1. Zgodnie z sekwencją wybranego sgRNA, zsyntetyzować startery wyżarzające: Starter do przodu: TTCGN(19); Starter odwrotny: AAAC[N(19)]*. Gdzie GN(19) jest 20 nt sekwencją docelową sgRNA. [N(19)]* reprezentuje odwrotną sekwencję dopełniacza 19 nt celu sgRNA w kierunku 3'.
      2. Aby wyżarzać startery, przygotuj mieszaninę w następujący sposób: 1 μl startera do przodu (100 μM), 1 μl startera wstecznego (100 μM), 2 μl buforu 10x i 16 μl dejonizowanegoH2O, aby uzyskać całkowitą objętość 20 μL. Dokładnie wymieszaj.
        UWAGA: Sekwencje wszystkich podkładów zostały pokazane w Tabeli materiałów.
      3. Umieścić mieszaninę w termocyklerze i uruchomić program w następujący sposób: 1 cykl w temperaturze 95 °C przez 15 minut, następnie stopniowo schładzać do 50 °C z kontrolowaną szybkością narastania 0,1 °C/s i utrzymywać tę temperaturę przez 10 minut; Utrzymywać w temperaturze 4 °C przez 10 min.
      4. Przygotować mieszaninę reakcyjną do klonowania wyżarzonej sekwencji docelowej sgRNA na wektory pU6x-sgRNA zgodnie z opisem: 1 μL 10x buforu enzymu restrykcyjnego, 1 μL 10x buforu ligazy T4, 0,3 μL ligazy T4, 0,3 μL BsmBI, 0,2 μL PstI, 0,2 μL SalI, 1 μl wyżarzonego startera sgRNA, 5 μl pU6x:sgRNA#x (20 ng/μL) i 1 μL dejonizowanegoH2O, dostosowując końcową objętość reakcji do 10 μL.
      5. Dokładnie wymieszać składniki reakcji i uruchomić następujący program termocyklera: 6 cykli (37 °C przez 20 min, 16 °C przez 15 min), 1 cykl w temperaturze 37 °C przez 10 min, 1 cykl w temperaturze 55 °C przez 15 min, 1 cykl w temperaturze 80 °C przez 15 min.
      6. W celu przemiany rozmrozić komórki DH5α na lodzie, delikatnie wymieszać 50 μl komórek z mieszaniną ligacji, przesuwając probówkę, i inkubować mieszaninę na lodzie przez 30 minut. Przeprowadzić szok termiczny w temperaturze 42 °C przez 60 s, a następnie natychmiast przenieść probówkę z powrotem do lodu na 2 minuty. Umieścić przekształcone komórki na płytce LB zawierającej 100 μg/ml spektynomycyny i inkubować płytkę do góry nogami w temperaturze 37 °C przez co najmniej 16 godzin, aby umożliwić utworzenie kolonii.
      7. W przypadku PCR kolonii należy pobrać każdą kolonię bakteryjną za pomocą końcówki pipety i przenieść do 10 μl dejonizowanegoH2O. Dokładnie zawiesić kolonię, pipetując w górę iw dół, aby zapewnić pełną dyspersję do dalszej analizy PCR. Przygotować mieszaninę reakcyjną PCR, łącząc 5 μl 2x Taq Mix, 2 μl cieczy kolonijnej, po 0,4 μl startera M13 do przodu (10 μM) i startera odwrotnego (10 μM) oraz 2,2 μl dejonizowanegoH2O, uzyskując całkowitą objętość reakcji 10 μL.
      8. Uruchom program, jak pokazano poniżej: 1 cykl w temperaturze 94 °C przez 3 minuty, 23 cykle (94 °C przez 15 s, 55 °C przez 15 s, 72 °C przez 30 s) i 1 cykl w temperaturze 72 °C przez 5 minut.
      9. Poddaj produkty PCR elektroforezie. Wybierz dodatnią kolonię o oczekiwanej wielkości 482 pz (ryc. 6).
      10. Zaszczepić pozostałą ciecz kolonijną w 3 ml pożywki LB uzupełnionej 100 μg/ml spektynomycyny. Inkubować w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 200 obr./min przez 14 godzin.
      11. Ekstrahuj plazmidy z kultury bakteryjnej za pomocą zestawu Plasmid Miniprep Kit zgodnie z instrukcjami producenta. Zmierzyć stężenie plazmidu za pomocą mikrospektrofotometru.
      12. Poddaj wyekstrahowane plazmidy sekwencjonowaniu Sangera przy użyciu startera M13 do przodu. Dopasuj wyniki sekwencjonowania do oczekiwanej mapy wektorowej U6, aby zweryfikować poprawność insercji celu sgRNA.
    2. Montaż wektora pGGDestEB-4sgRNA
      UWAGA: Jak pokazano na rysunku 7, cztery kasety ekspresji sgRNA sterowane przez U6 mogą być skutecznie ligowane do wektora szkieletowego pGGDestEB-4sgRNA przy użyciu montażu Golden Gate. Liczba sgRNA, które mają być zligowane, determinuje użycie wektorów. Na przykład, składając cztery kasety sgRNA, użyj pU6a:sgRNA#1, pU6a:sgRNA#2, pU6b:sgRNA#3, pU6c:sgRNA#4 i pGGDestEB-4sgRNA.
      1. Przygotować 20 μL mieszaniny reakcyjnej Golden Gate zawierającej: 2 μL 10× buforu enzymu restrykcyjnego, 2 μL 10x buforu ligazy DNA T4, 100 ng każdego konstruktu pU6x:sgRNA#x, 50 ng wektora docelowego pGGDestIEB-4sgRNA, 1 μL BsaI, 1 μL ligazy DNA T4, i woda dejonizowana, aby dostosować końcową objętość do 20 μl.
      2. Przeprowadzić reakcję montażu Golden Gate przez 3 cykle po 20 minut w temperaturze 37 °C, następnie 15 minut w temperaturze 16 °C, a następnie zakończyć końcową 15-minutową inkubacją w temperaturze 80 °C w celu inaktywacji enzymu.
      3. Aby przetworzyć, przenieś 5 μl mieszaniny reakcyjnej do odpowiednich komórek i umieść płytkę na pożywce LB uzupełnionej ampicyliną.
      4. Wykonaj PCR kolonii, przesiewając kolonie za pomocą starterów Dest do przodu i do tyłu (patrz tabela materiałów), aby potwierdzić obecność insertu (ryc. 8).
        UWAGA: Główny pas 2,415 pz i wzór drabinkowy powinny być obecne dla pozytywnego klonu.
      5. Wyodrębnij plazmidy z dodatnich kolonii i sekwencjonuj za pomocą starterów Dest do przodu i do tyłu dla każdego celu sgRNA.
      6. Dopasuj wyniki sekwencjonowania Sangera do przewidywanej sekwencji wektorów w celu weryfikacji.
  3. Mikroiniekcja i wstępne badania przesiewowe założycieli transgenicznych
    1. Zbierz zarodki tarzone przez homozygotyczne ryby rbm24a-RFP KIzpc:cas9 .
    2. Przygotować mieszaninę do wstrzykiwań, łącząc 1 μl pGGDestEB-rbm24a-4sgRNA (12 ng/μL) z 1 μl mRNA transpozazy Tol2 (50 ng/μL).
      UWAGA: Oczyść plazmid za pomocą ekstrakcji fenolowo-chloroformowej przed wstrzyknięciem, aby usunąć wszelkie resztki RNazy, które mogły zostać wprowadzone podczas procesu ekstrakcji plazmidu. Plazmid i mRNA Tol2 rozcieńczono bezpośrednio w czystej wodzie.
    3. Umieść szklane szkiełko nakrywkowe w naczyniu o średnicy 15 cm. Ułóż zarodki wzdłuż krawędzi szkiełka nakrywkowego i ostrożnie usuń nadmiar wody za pomocą pipety. Wstrzyknąć 2 nl mieszaniny do blastodysku każdego zarodka w stadium 1-komórkowym. Po wstrzyknięciu należy delikatnie spłukać zarodki niebieską wodą i przenieść je do świeżego naczynia. Na koniec umieść naczynie w inkubatorze o temperaturze 28 °C w celu uprawy.
      UWAGA: Przygotuj roztwór roboczy błękitu metylenowego (niebieska woda) w następujący sposób: Rozpuść 180 g soli morskiej w 2,7 l wody destylowanej i wysterylizuj, aby uzyskać 100x bulion z wody morskiej. Rozcieńczyć ten wywar 200-krotnie sterylną wodą destylowaną, aby uzyskać 1/100x wody morskiej. Dodać 10 μl 5% (m/v) roztworu podstawowego błękitu metylenowego do 1 l tej 1/100 x wody morskiej, aby przygotować końcowy roztwór roboczy.
    4. Przy 24 hpf wybrane zarodki wykazujące silną i wszechobecną ekspresję BFP. Przy 4 dpf podnieś tylko te, które utrzymują silne transgeniczne sygnały fluorescencyjne (ryc. 9).

3. Charakterystyka podwójnie transgenicznych zarodków

  1. Fenotypowanie podwójnych zarodków transgenicznych
    1. Zbieraj zarodki od mozaikowych transgenicznych samic założycieli kojarzących się z samcami typu dzikiego.
    2. Pobrać zarodki BFP-dodatnie (BFP+) w stadium jednokomórkowym pod steromikroskopem fluorescencyjnym.
    3. Zidentyfikuj wady rozwojowe pojawiające się w zarodkach BFP+, ale nie w zarodkach BFP.
    4. Utrwalić zarodki w 4% paraformaldehydzie (PFA) w temperaturze 4 °C przez noc. W razie potrzeby wykonaj hybrydyzację in situ w całości, barwienie immunofluorescencyjne lub inne analizy histologiczne.
      UWAGA: Wiarygodne są tylko wadliwe fenotypy, które powstają wyłącznie w zarodkach z ekspresją GFP lub BFP-dodatnim sgRNA. Wnioski należy wyciągać ostrożnie, a zmutowane fenotypy matek muszą być poparte więcej niż 10 przypadkami.
  2. Genotypowanie zmutowanych zarodków matek
    UWAGA: W celu identyfikacji zarodków Mrbm24a można je łatwo wykryć pod mikroskopem fluorescencyjnym przy braku Rbm24a-RFP. W przeciwieństwie do tego, identyfikacja matczynych mutantów innych genów opiera się głównie na strategii aspiracji komórki przed aktywacją genomu zygotycznego, a następnie na analizie RT-PCR matczynych mRNA w pobranych komórkach (Figura 10).
    1. Aspiracja komórek
      1. Przygotuj 1,5% roztwór agarozy, rozpuszczając go w 1/3x buforze Ringera i gotując do stopienia. Wlej roztwór do szalki Petriego o średnicy 90 mm i włóż formę (WPI, z-molds) do stopionej agarozy. Po zestaleniu delikatnie wyjmij formę, aby uzyskać gotową do użycia płytę.
      2. Wykorzystaj szklane kapilary i ściągacz, aby stworzyć igły uszczelnione ze stopu. Aby uzyskać optymalne igły do aspiracji komórek, ustaw dwie lekkie ciężarki i moc grzewczą na Lv1: 60 i Lv2: 90, a następnie wybierz procedurę Step2. Przytnij końcówki kapilar spiczastą pęsetą (patrz Tabela materiałów), aby uzyskać średnicę otworu 30-40 μm. Następnie utwórz kolec na końcu igły za pomocą mikrokuźni, która pomaga w penetracji i minimalizuje uszkodzenie zarodka.
      3. Połącz domniemane samice założycielki z danio pręgowanym typu dzikiego i zbierz zarodki. Wyizolować zarodki BFP-dodatnie w stadium jednokomórkowym.
      4. Przy 3 hpf dechorionate zarodki przez inkubację w 1 mg / ml Pronazy w 1/3x buforze Ringera przez 10 minut i delikatne pipetowanie, a następnie ostrożnie umieścić zarodki na płytce agarozowej zalanej 1/3x buforem Ringera uzupełnionym 1x penicyliną-streptomycyną. Zmień orientację zarodków tak, aby blastomer był skierowany w stronę końcówki naczynia włosowatego.
        UWAGA: Bardzo ważne jest, aby przenosić zarodki z zachowaniem ostrożności, ponieważ są one niezwykle delikatne bez ochrony kosmówki. Nie pozwól im dotknąć powierzchni podłoża!
      5. Zastosuj mikrowstrzykiwacz do odessania 20-40 komórek z każdego zarodka, ostrożnie zmniejszając ciśnienie równowagi, które kompensuje siłę aspiracji z działania kapilarnego15. Uwolnij te komórki do 2 μl dejonizowanegoH2Ona krawędzi otwierającej probówek PCR, zwiększając ciśnienie równowagi.
        UWAGA: Aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego, szklaną igłę należy oczyścić poprzez odsysanie i wyrzucanie dejonizowanego H2O 3x przed każdą aspiracją.
      6. Dodaj 200 μl odczynnika do ekstrakcji RNA, aby zmyć komórki i tymczasowo przechowywać probówki na lodzie. Następnie przeanalizuj genotypy komórek z zarodków z wadami rozwojowymi lub bez.
        UWAGA: Komórki zachowane w odczynniku ekstrakcyjnym mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C do momentu, gdy odpowiednie zarodki wykażą nieprawidłowe fenotypy.
      7. Pozostaw zarodki po aspiracji komórek na płytce agarozowej lub umieść je pojedynczo na 24-dołkowych płytkach zalanych 1/3x roztworem Ringera zawierającym 1x penicylinę-streptomycynę.
        UWAGA: Należy zachować ostrożność przy przenoszeniu zarodków z odwążówką! Zazwyczaj badamy 20-40 zarodków w jednym eksperymencie, który trwa około 1 godziny.
    2. Analiza matczynego mRNA będącego przedmiotem zainteresowania w komórkach aspirowanych
      1. Dodać 40 μl chloroformu do komórek w odczynniku ekstrakcyjnym i delikatnie wymieszać. Odwirować mieszaninę w temperaturze 12 000 × g przez 1 minutę w temperaturze 4 °C.
      2. Ostrożnie zebrać supernatant. Dodać 1 μl roztworu glikogenu (20 mg/ml) i równą objętość izopropanolu (jeżeli objętość supernatantu wynosi 100 μl, dodać 100 μl izopropanolu) i dobrze wymieszać. Inkubować mieszaninę w temperaturze -20 °C przez 30 minut, aby ułatwić wytrącanie.
        UWAGA: Ze względu na niewielką ilość całkowitego RNA w odsysanych komórkach, należy dodać glikogen, aby zwiększyć wydajność wytrącania i ułatwić wizualizację osadu.
      3. Odwirować próbkę o masie 12 000 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant.
      4. Przemyć granulat 2x przez dodanie 500 ml 70% etanolu i odwirować przy 12 000 × g przez 1 min.
      5. Wylej płyn i otwórz pokrywkę, aby granulka wyschła w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
      6. Dodaj 7 μl wody, aby rozpuścić osad. Przeprowadź odwrotną transkrypcję przy użyciu zestawu do syntezy pierwszej nici cDNA, postępując zgodnie ze szczegółowym protokołem podanym w instrukcji obsługi.
      7. Amplifikować cały obszar kodujący odpowiednimi starterami (patrz Tabela materiałów) i przeprowadzić elektroforezę agarozową.
      8. Sklonuj produkty PCR i zsekwencjonuj co najmniej 30 klonów dla każdego zarodka, aby przeanalizować mutację pojawiającą się w mRNA.
        UWAGA: Aby potwierdzić, że obecność wadliwego fenotypu jest spowodowana celowaną mutacją zainteresowanego czynnika matczynego, wszystkie zarodki (n > 5) z wadliwymi fenotypami powinny wykazywać brak transkryptów matczynych typu dzikiego. I odwrotnie, mRNA matki typu dzikiego powinny być obecne we wszystkich normalnie rozwijających się zarodkach wykazujących ekspresję sgRNA (n > 5). Jednocześnie w zarodkach sgRNA-ujemnych wykrywalne są tylko mRNA typu dzikiego (n > 5).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Szybkie generowanie matczynych mutantów rbm24a
Skonstruowaliśmy wektor transgeniczny umożliwiający ekspresję matczynego markera BFP i czterech wysoce wydajnych sgRNA ukierunkowanych na sekwencję kodującą rbm24a. Po wprowadzeniu tego wektora do homozygotycznych zarodków rbm24a-RFP KIzpc: cas9 poprzez transpozycję Tol2, Mrbm24a został łatwo i szybko zidentyfikowany wśród zarodków F1 dodatnich BFP ze względu na bra...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Śmiertelne mutacje zygotyczne utrudniają analizę wkładu genu w rozwój genów u matki. Alternatywne strategie, w szczególności wymiana linii zarodkowej i mikroiniekcja komórek jajowych in situ (OMIS), są technicznie wymagające 6,8. W procesie przeszczepiania komórek w celu wymiany linii zarodkowej zarodek biorcy otrzymuje bardzo mało PGC, co często uniemożliwia prawidłowy rozwój samicy 16,17,18.<...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Protokół ten został przyznany jako patent przez Chińską Narodową Administrację Własności Intelektualnej, który złagodzi ograniczone stosowanie metody po uzyskaniu zgody autorów. Autorzy oświadczają, że nie mają żadnych innych konkurencyjnych lub finansowych interesów.

Podziękowania

Dziękujemy Jianlin Shen, Yiteng Xu i Qingqing Wei z Core Facility and Service Platform, School of Lifesciences. Praca ta była wspierana przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (granty 32170816, 32370860, 32450630 i 31871451), Program Wybitnych Uczonych w Średnim i Młodym Wieku Uniwersytetu Shandong, Taishan Scholars z prowincji Shandong.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
2x mieszanka M5 HiPer Taq PCRMei5bio powiedział:Nr kat.#MF001-BD-100
AgarozyLek MDbioKot#A006L
Zestaw AxyPrep Plasmid MiniprepAxygen (Axigen)Kot#AP-MN-P-4
Przyrząd do elektroforezy kapilarnej (Qsep400)Układ BiOpticN/A
Mieszanka do etykietowania DIGRocheKot#11277073910
DNaza IRocheKot#4716728001
Naziemna telewizja cyfrowaThermo Fisher NaukowyKot#R0861
Zestaw do syntezy pierwszej nici cDNATransGen BiotechnologiaKot#AT301
Nukleaza GenCrispr NLS-Cas9-NLSJęzyk GenScriptKot#Z03389
Kapilary szklane (1,0 x 100 mm)Fabryka sprzętu edukacyjnego RantaiKot#OS-2B
GlikogenBBI Nauki przyrodniczeKot#28985
Grafton Pryzmat 9Podkładka graficznahttps://www.graphpad.com/
ObrazJOtwarty kod źródłowyhttps://imagej.net/software/fiji/
Agaroza niskotopliwaBiotechnologicznychKot#CA1351
Mikrokuźnia (MF2)NARISHIGE (NARISZGIE)N/A
Mikrospektrofotometr (Nano-300)ALLSHENG (WSZYSTKO)N/A
OlyVIA (OlyVIA)OLYMPUSN/A
Penicylina-streptomycynaGibco (firma Gibco)Kot#15140122
Wtryskiwacz Pico-Litr (PLI-100A) Aparatura HarvardaN/A
Spiczasta pęsetaWskaźnik WPIKot#500341
Spiczasta pęseta  WPI 500341
Ściągacz (PC-100)NARISHIGE (NARISZGIE)N/A
Inhibitor RNazy RiboLockThermo Fisher NaukowyKot#EO0381
Protokół rNTPThermo Fisher NaukowyNr kat.#R0481
Krzemowe hydroksylowe kulki magnetyczneSangon BiotechnologiaKot#B518720-0001
Polimeraza RNA T7NEBKot#M0251L
Zold powiedział:Wskaźnik WPIFormy z Cat#

Bibliografia

  1. Fuentes, R., et al. The maternal coordinate system: Molecular-genetics of embryonic axis formation and patterning in the zebrafish. Curr Top Dev Biol. 140, 341-389 (2020).
  2. Yan, L., et al. Maternal Huluwa dictates the embryonic body axis through β-catenin in vertebrates. Science. 362 (6417), eaat1045(2018).
  3. Abrams, E. W., et al. Molecular genetics of maternally-controlled cell divisions. PLoS Genet. 16 (4), e1008652(2020).
  4. Shao, M., et al. Rbm24 controls poly(A) tail length and translation efficiency of crystallin mRNAs in the lens via cytoplasmic polyadenylation. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (13), 7245-7254 (2020).
  5. Weidinger, G., et al. dead end, a novel vertebrate germ plasm component, is required for zebrafish primordial germ cell migration and survival. Curr Biol. 13 (16), 1429-1434 (2003).
  6. Ciruna, B., et al. Production of maternal-zygotic mutant zebrafish by germ-line replacement. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (23), 14919-14924 (2002).
  7. Xing, Y. Y., et al. Mutational analysis of dishevelled genes in zebrafish reveals distinct functions in embryonic patterning and gastrulation cell movements. PLoS Genet. 14 (8), e1007551(2018).
  8. Wu, X., Shen, W., Zhang, B., Meng, A. The genetic program of oocytes can be modified in vivo in the zebrafish ovary. J Mol Cell Biol. 10 (6), 479-493 (2018).
  9. Zhang, C., et al. Generation of zebrafish maternal mutants via oocyte-specific knockout system. Bio Protoc. 14 (21), e5092(2024).
  10. Zhang, C., et al. Rapid generation of maternal mutants via oocyte transgenic expression of CRISPR-Cas9 and sgRNAs in zebrafish. Sci Adv. 7 (32), abg4243(2021).
  11. Li, J., et al. Intron targeting-mediated and endogenous gene integrity-maintaining knockin in zebrafish using the CRISPR/Cas9 system. Cell Res. 25 (5), 634-637 (2015).
  12. Zhang, Y., et al. Rbm24a dictates mRNA recruitment for germ granule assembly in zebrafish. EMBO J. 44 (11), 3121-3149 (2025).
  13. Xia, Y., et al. T5 exonuclease-dependent assembly offers a low-cost method for efficient cloning and site-directed mutagenesis. Nucleic Acids Res. 47 (3), e15(2019).
  14. Yin, L., et al. Multiplex conditional mutagenesis using transgenic expression of Cas9 and sgRNAs. Genetics. 200 (2), 431-441 (2015).
  15. Shao, M., Cheng, X. N., Liu, Y. Y., Li, J. T., Shi, D. L. Transplantation of zebrafish cells by conventional pneumatic microinjector. Zebrafish. 15 (1), 73-76 (2018).
  16. Siegfried, K. R., Nüsslein-Volhard, C. Germ line control of female sex determination in zebrafish. Dev Biol. 324 (2), 277-287 (2008).
  17. Aharon, D., Marlow, F. L. Sexual determination in zebrafish. Cell Mol Life Sci. 79 (1), 8(2021).
  18. Ye, D., et al. Abundance of early embryonic primordial germ cells promotes zebrafish female differentiation as revealed by lifetime labeling of germline. Mar Biotechnol (NY). 21 (2), 217-228 (2019).
  19. Wang, X., et al. Induced formation of primordial germ cells from zebrafish blastomeres by germplasm factors. Nat Commun. 14 (1), 7918(2023).
  20. Thermes, V., et al. I-SceI meganuclease mediates highly efficient transgenesis in fish. Mech Dev. 118 (1-2), 91-98 (2002).
  21. Bertho, S., et al. Zebrafish dazl regulates cystogenesis and germline stem cell specification during the primordial germ cell to germline stem cell transition. Development. 148 (7), dev.187773(2021).
  22. Houwing, S., et al. A role for Piwi and piRNAs in germ cell maintenance and transposon silencing in Zebrafish. Cell. 129 (1), 69-82 (2007).
  23. Shao, M., et al. Vegetally localised Vrtn functions as a novel repressor to modulate bmp2b transcription during dorsoventral patterning in zebrafish. Development. 144 (18), 3361-3374 (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Edycja genomu rybki zebraknockout specyficzny dla oocyt wrybki zebra wolne od Tol2delecja czynnik w macierzy skichmikroiniekcja zarodk waspiracja kom rekmarker bia ka fluorescencyjnegoPCR z odwrotn transkrypcj
Generowanie matczynych mutantów przy użyciu zpc:cas9 Knock-in Danio pręgowanego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.