Artykuł metodologiczny

Skalowanie w dół w celu uzyskania dużego wpływu: Usprawniona produkcja rekombinowanych wirusów związanych z adenowirusem o wysokiej przepustowości

DOI:

10.3791/68646

⸱

12 września 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Roche Pharma Research and Early Development, Therapeutic Modalities, Roche Innovation Center Basel, Hoffmann-La Roche Ltd, 2Roche Pharma technical development Cell and Gene Therapy, Roche Innovation Center Munich, Roche Diagnostics GmbH, 3Center of Biomedical Education and Research - ZBAF, University of Witten/Herdecke, 4Roche Pharma Research and Early Development, Therapeutic Modalities, Roche Innovation Center Munich, Roche Diagnostics GmbH, 5Biozentrum, University of Basel

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pomimo szerokiego zastosowania w dostarczaniu genów, rekombinowane wektory wirusowe związane z adenowirusem (rAAV) stoją przed znacznymi wyzwaniami produkcyjnymi. Protokół ten przedstawia metody produkcji w skali mikro i mini, wykorzystujące zarówno ogniwa adherentne, jak i zawiesinowe. Metody te usprawniają generowanie, oczyszczanie i optymalizację wektorów, przyspieszając w ten sposób badania przedkliniczne i ułatwiając postęp w ramach terapii genowej.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W ostatnich latach rekombinowane wektory wirusowe związane z adenowirusem (rAAV) stały się wiodącą platformą do zastosowań w terapii genowej. Uciążliwe procesy produkcji i oczyszczania pozostają jednak istotnymi wąskimi gardłami w opracowywaniu leków. Wysokowydajna produkcja rAAV na małą skalę bez pracochłonnych i czasochłonnych procedur oczyszczania stanowi cenną alternatywną strategię przyspieszającą badania przedkliniczne i przesiewowe badania terapeutyczne na wczesnym etapie. Podejście to umożliwia szybkie generowanie różnorodnych wariantów rAAV lub konstruktów terapeutycznych o jakości wystarczającej do wstępnej oceny in vitro i in vivo . Protokół ten wprowadza dwie metody rozróżniane ze względu na typ komórki i skalę produkcji: produkcję rAAV w mikroskali i w miniskali. Produkcja w mikroskali odbywa się w formacie 6-dołkowym przy użyciu przylegających ludzkich komórek 293T embrionalnych nerek (HEK) (mikro-6-dołkowych), podczas gdy produkcja w miniskali wykorzystuje komórki zawiesinowe w płytkach 24-dołkowych (mini-HT24). Wektory wygenerowane za pomocą tych metod są poddawane dalszym analizom w celu optymalizacji warunków hodowli komórek i/lub są wykorzystywane do oceny aktywności biologicznej transgenów. Kluczowe odczyty analityczne obejmują miareczkowanie genomu wektora (vg/mL), oznaczanie miana kapsydu (vp/mL), analizę western blot i testy transdukcji komórek. Dodatkowo wektory wytworzone w miniskali i częściowo oczyszczone przy użyciu żywic powinowactwa są porównywane z preparatami midiscale oczyszczonymi za pomocą gradientów gęstości chlorku cezu. Opisane tutaj uproszczone metody wykazują znaczny potencjał w zakresie udoskonalania parametrów hodowli komórkowych, identyfikowania głównych kandydatów podczas badań przesiewowych (tj. zoptymalizowanych kaset transgenowych lub lepszych kapsydów AAV) oraz zwiększania ekspresji transgenu. Reasumując, przedstawione przepływy pracy wspierają ustanowienie solidnej i wydajnej platformy do iteracyjnego rozwoju w procesie terapii genowej, którą można łatwo wdrożyć w dowolnym laboratorium badawczym.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opracowywanie leków to złożony i wymagający dużych zasobów proces, który wymaga integracji wysokiej jakości danych z różnych etapów, w tym identyfikacji celu, walidacji przedklinicznej i badań klinicznych1. W odpowiedzi na rosnące zapotrzebowanie na krótsze terminy i niższe koszty2 przemysł farmaceutyczny coraz częściej przyjmuje wysokoprzepustowe (HT) testy na małą skalę w połączeniu z zaawansowaną sztuczną inteligencją (AI) jako podstawę nowoczesnych strategii rozwoju 3,4,5. Testy HT pozwalają na szybkie badanie przesiewowe i ocenę dużej liczby kandydatów na leki lub zmiennych testowych przy ułamku czasu i kosztów w porównaniu z tradycyjnymi metodami 5,6.

W zastosowaniach terapii genowej, szczególnie tych wykorzystujących wektory wirusowe związane z adenowirusem (AAV), wysokie koszty towarów i długie terminy produkcji stanowią poważne wyzwania7. Proces rozwoju rozpoczyna się od wytworzenia materiału plazmidowego wymaganego do transfekcji, po którym następuje wzrost komórek do wysokiej gęstości wystarczającej do produkcji wektora wirusowego. Po transfekcji, przed zbiorem potrzebny jest okres inkubacji wynoszący od dwóch do pięciu dni, a proces kończy się oczyszczaniem i charakteryzacją partii 8,9. Łącznie ten przepływ pracy może trwać do miesiąca i jest zwykle ograniczony do ograniczonej liczby przygotowań, które mogą przebiegać równolegle w przypadku korzystania z kolumn powinowactwa lub ultrawirowania gradientowego 9,10,11,12.

Uznając potrzebę opracowania małych, mini- lub mikroskalowych protokołów produkcji AAV, naukowcy dostosowali kilka podejść do produkcji rekombinowanego AAV (rAAV) w małych konfiguracjach laboratoryjnych. Podejścia te zazwyczaj polegają na użyciu wielu 15-centymetrowych szalek dla przylegających komórek,13,14 lub kolb do wstrząsania 50-2000 ml15 do hodowli zawiesinowych. W przeszłości stosowano metody oczyszczania AAV, takie jak ultrawirowanie gradientowe (np. jodiksanol16, chlorek cezu (CsCl)17 lub gradienty sacharozy18). Ta niedroga i niezależna od serotypów metoda była wysoce odpowiednia do produkcji rAAV w skali laboratoryjnej, ale jej pracochłonny charakter i ograniczona wydajność ultrawirówek sprawiają, że jest mniej sprzyjająca aplikacjom o wysokiej przepustowości19,20.

Ciągłe zapotrzebowanie na większą przepustowość doprowadziło do zbadania alternatywnych podejść do zmniejszenia skali produkcji rAAV. Za pomocą komórek adherentnych zbadano formaty takie jak płytki 6-dołkowe 13,21,22, 96-dołkowe23, a nawet 384-dołkowe24. Ostatnio zastosowano komórki zawiesinowe, ze względu na ich lepszą skalowalność i porównywalną, a nawet lepszą siłę działania preparatów wektorowych8.

Jednak wysokoprzepustowa produkcja rAAV w komórkach zawiesinowych o objętości hodowli mniejszej niż 15 ml pozostaje wyspecjalizowanym obszarem, z ograniczoną liczbą opublikowanych protokołów 7,25,26. Większość badań koncentruje się na większych ilościach, aby osiągnąć wystarczającą wydajność do dalszych zastosowań 8,9,27, ale podobnie jak w przypadku ogniw przylegających, formaty miniscale oferują znaczne zmniejszenie zużycia zasobów i czasu przetwarzania, zaspokajając w ten sposób krytyczną potrzebę w terenie. Co ważne, protokoły w skali mini i mikro często wykorzystują "surowe lizaty", czyli nieoczyszczone zbiory kultur komórkowych zawierające cząstki wektorów, do dalszej charakterystyki i analizy.

W badaniu tym przedstawiono dwa protokoły wykorzystujące zarówno przylegające, jak i zawiesinowe komórki produkcyjne (ryc. 1). Surowe lizaty rAAV wytwarzane z przylegających komórek HEK293T są wykorzystywane bezpośrednio do kolejnych zastosowań, takich jak transdukcja komórek docelowych. Natomiast rAAV powstające w komórkach zawiesinowych poddawane są dalszemu przetwarzaniu poprzez wysokoprzepustowe oczyszczanie żywicy o powinowactwie. Metody te zostały specjalnie opracowane w celu poprawy wydajności, oceny jakości wektorów i monitorowania ekspresji transgenów, a wszystko to przy jednoczesnej minimalizacji zużycia drogich odczynników i materiałów. Przedstawione wyniki pokazują, że w zależności od zakresu zastosowania odpowiednie są zarówno surowe lizaty (z komórek przylegających), jak i materiał oczyszczony powinowactwem (z komórek zawiesinowych). Co więcej, rAAV uzyskany przy użyciu żywic powinowactwa porównano bezpośrednio z odpowiednikami oczyszczonymi przy użyciu tradycyjnego ultrawirowania chlorku cezu pod względem wydajności, czystości i skuteczności transdukcji w kokulturach neuronalnych pochodzenia ludzkiego.

Zastosowanie wysokoprzepustowych testów na małą skalę w opracowywaniu leków terapii genowej stanowi niezbędny postęp, przyspieszający innowacje i wypełniający lukę między odkryciami naukowymi a rzeczywistością terapeutyczną. Metody te nie tylko obniżają koszty i skracają czas, ale także umożliwiają równoległe testowanie wielu schorzeń, co ostatecznie przyczynia się do efektywnego rozwoju terapii transformacyjnych.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Mikro-6-dołkowa produkcja wektorów rAAV w komórkach przylegających

UWAGA: Produkcja rAAV w mikro-6 dołkach jest zaadaptowaną wersją wcześniej opublikowanego protokołu przez Fakhiri i wsp.21.

  1. Wysiew i transfekcja komórek HEK293T
    1. Rozmrozić fiolkę z HEK293T komórkami28 w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
    2. Przenieść komórki do 30 ml przylegającej pożywki do hodowli komórkowych w kolbach T175 i utrzymać w zmodyfikowanym pożywce Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco + 10% płodowej surowicy cielęcej (FCS), w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
    3. Podziel HEK293T co 2-3 dni: Odessać pożywkę do hodowli komórkowych i ostrożnie dodać 10 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), aby przepłukać komórki.
      UWAGA: W tym protokole użyto tylko przejść komórkowych poniżej pasażu numer 15, aby zapewnić integralność i zdrowie komórek, co bezpośrednio wpływa na produkcję rAAV.
    4. Dodać 2 ml 0,025% trypsyny/kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) do komórek i inkubować przez 2 minuty w temperaturze 37 °C (lub do momentu odłączenia komórek).
    5. Zatrzymaj reakcję, dodając 20 ml świeżej pożywki i zawieszając komórki w pożywce za pomocą pipety o pojemności 25 ml. W zależności od konfluencji, komórki można rozcieńczyć 1:10 lub 1:20 w 24 ml pożywki DMEM o wysokiej zawartości glukozy. Aby uzyskać gęstość komórek wystarczającą do transfekcji, nasiona 7 ×10 6 HEK293T komórek w kolbie T175.
    6. Po 72 godzinach w temperaturze 37 °C zebrać komórki przez trypsynizację (jak opisano w kroku 1.1.3-1.1.5), ponownie zawiesić w 20 ml pożywki i policzyć komórki.
      UWAGA: Ogniwa można zliczać różnymi metodami, w zależności od pożądanej dokładności, przepustowości i dostępnego sprzętu. Głównie stosuje się dwa podejścia: ręczne liczenie (komora Neubauera) i automatyczne liczenie komórek. Protokół ten wykorzystuje w pełni zautomatyzowany, oparty na obrazie analizator komórek do pomiaru krytycznych parametrów komórek, takich jak żywotność, gęstość komórek i szybkość agregacji.
    7. Komórki nasienne o gęstości 0,5 × 106 komórek/dołek w płytce 6-dołkowej. Aby równomiernie rozprowadzić komórki, delikatnie potrząśnij płytką i umieść ją w inkubatorze CO2 .
    8. Po 24 godzinach komórki osiągają konfluencję 60-70% i mogą być trzykrotnie transfekowane.
    9. Dla każdej studzienki wymieszaj 90 μl pożywki wolnej od surowicy z łączną ilością 2,6 μg plazmidowego DNA, w tym pTransgene, pRep/Cap i pHelper w stosunku molowym 1:1:1.
    10. W drugiej probówce dodaj 5 μl polietyleniminy (PEI) do 90 μl pożywki wolnej od surowicy tuż przed transfekcją.
    11. Po połączeniu dwóch roztworów zwirować mieszaninę i inkubować w temperaturze pokojowej (RT) przez 10 minut.
    12. Dodaj mieszankę transfekcji kroplami do każdej studzienki. Delikatnie potrząśnij płytkami przed ponownym umieszczeniem ich w inkubatorze.
      UWAGA: Można przeprowadzić zmianę pożywki po transfekcji, ale nie było to stosowane jako standardowa praktyka, ponieważ komórki utrzymywały dobrą żywotność przez cały czas trwania eksperymentu.
  2. Pobieranie i liza komórek
    1. 72 godziny po transfekcji ostrożnie odessać pożywkę komórkową z płytki (płytek).
    2. Odłącz komórki, dodając 500 μl PBS do każdego dołka i ostrożnie pipetuj w górę iw dół.
    3. Przenieść zawiesinę komórkową do probówek mikrowirówkowych o pojemności 1,5 ml.
    4. Zmierz żywotność i gęstość komórek ręcznie lub automatycznie, postępując zgodnie z instrukcjami producenta.
    5. Przenieść 50 μl z zawiesiny na dolną płytkę 96 U, aby określić skuteczność transfekcji poprzez ilościowe określenie populacji reporter-dodatnich za pomocą cytometrii przepływowej.
      UWAGA: Zawsze zaleca się równoległe przeprowadzanie kontroli transfekcji, tj. transfekcji 1-2 dołków z transgenem przenoszącym białko fluorescencyjne (np. białko zielonej fluorescencji (GFP), mCherry itp.) w celu monitorowania skuteczności transfekcji na płytce. Studzienki z komórkami nietransdukowanymi służą jako kontrola negatywna.
    6. Pozostałą zawiesinę komórkową o masie 800 × g przez 10 minut w temperaturze pokojowej należy odwirować w celu osadzenia komórek, które zawierają główną część wytworzonych wektorów.
    7. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić komórki w 100 μl PBS. Zawiesina komórek może być przechowywana w temperaturze -80 °C.
      UWAGA: Aby uzyskać surowy lizat z zebranych komórek, należy zastosować jedno z dwóch podejść opisanych poniżej.
    8. W pierwszym podejściu komórki można poddać pięciu cyklom zamrażania i rozmrażania, każdy z 5 minut, przy użyciu wstępnie podgrzanej łaźni wodnej o temperaturze 37 °C i ciekłego azotu. Krótko wirować próbki między cyklami przez 2-3 s.
    9. Drugą i głównie stosowaną opcją w tym protokole jest sonikacja. Tutaj przenieś zawiesinę komórkową na cienkościenne płytki lub probówki reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) i umieść w temperaturze 4 °C w sonikatorze łaźni wodnej.
      1. Sonizuj próbki łącznie przez 3 minuty z 30-sekundowymi przyrostami on-off przy 25% amplitudzie (intensywności).
    10. Po sonikacji osadzać komórki za pomocą wirówki stołowej (16 100 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C) w celu usunięcia resztek komórek i uzyskania bezkomórkowej zawiesiny wektorowej.
    11. Przenieść supernatanty do probówek o pojemności 1,5 ml i odpipetować 10 μl każdej próbki do 96-dołkowej płytki o niskim stopniu wiązania w celu cyfrowej analizy kropelkowej (dd)PCR lub cyfrowej (d)PCR.
    12. Przechowywać probówki i płytki 96-dołkowe w temperaturze -80 °C do czasu dalszego użycia.
  3. Transdukcja komórek HEK293A za pomocą surowych lizatów
    UWAGA: HEK293A komórki mogą nie być odpowiednie dla wszystkich serotypów AAV. Aby zidentyfikować odpowiednią linię komórkową, należy zapoznać się z bazami danych, takimi jak SPIRIT29 (link do bazy danych SPIRIT znajduje się w Tabeli materiałów) lub odpowiednimi oryginalnymi artykułami naukowymi30,31.
    1. Wysiewaj HEK293A komórki na trzech 96-dołkowych płytkach na jeden dzień przed transdukcją w gęstości 1,5 × 106 komórek na płytkę.
    2. Następnego dnia wymieszaj 10 μl wytworzonych wektorów z różnymi objętościami PBS, aby uzyskać rozcieńczenia 1:2, 1:10 i 1:100.
    3. Za pomocą pipety wielokanałowej przenieś komórki na 96-dołkowe płytki w technicznych trzech próbkach.
    4. Inkubować komórki z rAAV bez wymiany pożywki przez 72 godziny. Następnie należy przeprowadzić dalsze eksperymenty w zależności od ekspresji transgenu, takie jak pomiary poziomu białka, analiza cytometrii przepływowej pod kątem ekspresji białek fluorescencyjnych, analizy knockdown/knockout itp.
    5. W przypadku standardowej cytometrii przepływowej, jak przeprowadza się w tym protokole, odessać pożywkę i odłączyć komórki, dodając 25 μl 0,025% trypsyny/EDTA.
    6. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 3 minuty.
    7. Zatrzymaj reakcję, dodając 175 μl 1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w PBS do każdej studzienki.
    8. Do analizy metodą cytometrii przepływowej należy użyć 100 μl zawiesiny komórek.

2. Produkcja wektorów rAAV w komórkach zawiesinowych przez Mini-HT24

UWAGA: W konfiguracji mini-HT24, w przeciwieństwie do opisanej wcześniej produkcji mikro-6-dołkowej, oczyszczone preparaty wektorów rAAV są generowane przy użyciu komórek zawiesinowych. Hodowle zawiesinowe dają większe ilości rAAV ze względu na zwiększoną gęstość komórek, którą można osiągnąć w tej samej objętości hodowli. W protokole tym zastosowano format odwiertu o głębokości 24. Surowe lizaty komórkowe są oczyszczane w wysokiej przepustowości przy użyciu żywic o powinowactwie AAVX w celu wytworzenia czystszych produktów wymaganych do niektórych zastosowań, w których surowe lizaty nie są odpowiednie (patrz sekcja Dyskusja).

  1. Hodowla i potrójna transfekcja komórek zawiesinowych w płytkach z 24 dołkami
    1. Rozmrozić fiolkę z zawiesiną komórek produkujących wirusa (VPC) w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C. Komórki pasażujące mniej niż 30 razy, aby zagwarantować stałą jakość wytworzonych wektorów.
    2. Przenieść komórki do 30 ml zawiesinowej pożywki hodowlanej w kolbie wstrząsającej i hodować je przez 2-3 dni w warunkach hodowli podtrzymującej: 37 °C, 8% CO2, 95% wilgotności i 140 obr./min (promień platformy wytrząsającej 25 mm).
    3. Określ gęstość żywotnych komórek po 2-3 dniach (patrz UWAGA w kroku 1.1.6). Kontynuuj subhodowlę i ekspansję, aż zostanie osiągnięta pożądana liczba żywotnych komórek wymaganych do produkcji AAV.
      UWAGA: Subkultura komórek o gęstości żywotnej > 4 × 106 komórek/ml i < 6 × 106 komórek/ml lub zgodnie z instrukcjami producenta w oparciu o użytą pojedynczą linię komórkową. Wysiew o żywotnej gęstości 6 × 105 komórek/ml przez 3 dni, podzielony lub 3 × 105 komórek/ml przez 4 dni. Podziel zgodnie z instrukcjami producenta.
    4. Wysiew 3 × 106 komórek/ml w 2,5 ml każdego dołka płytki o głębokości 24 i przykryj płytkę sterylną pokrywką membranową.
    5. Przygotuj mieszankę potrójnej transfekcji dla każdego konstruktu rAAV w następujący sposób:
      1. Przygotować mieszankę DNA plazmidów produkcyjnych (pHelper, pRep/Capsid, pTransgene) w stosunku molowym 1:1:1 przy końcowej masie 600 ng DNA na 1 × 106 żywotnych komórek.
      2. Przygotować mieszaninę w pożywce do hodowli zawiesinowych w końcowej objętości 2,5% objętości kultury, która ma być transfekowana.
      3. Przygotować mieszaninę PEI w pożywce do hodowli zawiesinowych w końcowej objętości 2,5% objętości kultury przeznaczonej do transfekcji. Użyć końcowej masy 1 ng PEI na 1 ng DNA.
      4. Połącz zarówno DNA-Mix, jak i PEI-Mix, przenosząc całą objętość pojedynczego PEI-Mix do odpowiedniego DNA-Mix, co daje objętość mieszanki transfekcyjnej wynoszącą 5% objętości hodowli.
      5. Wymieszać, pipetując w górę i w dół 10 razy.
        UWAGA: Nie należy wirować mieszanki transfekcyjnej po czasie inkubacji, aby uniknąć rozerwania kompleksów PEI-DNA, które powstały podczas inkubacji32.
      6. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
    6. Dodawać mieszanki transfekcyjne kroplami do odpowiednich dołków, ostrożnie potrząsając płytką z głębokim dołkiem.
    7. Uszczelnij płytkę za pomocą sterylnej, oddychającej folii ze sztucznego jedwabiu i przykryj ją dodatkowo odpowiednią pokrywką membrany, aby zminimalizować parowanie.
    8. Upewnij się, że płytka jest umieszczona na odpowiedniej tacy do wytrząsania głębokiej studni i mocno ją zamocuj.
    9. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C, 8% CO2 , wilgotności 95% i 225 obr./min przez 72 godziny.
      UWAGA: Różne formaty płytek głębinowych wymagają indywidualnej oceny prędkości wytrząsania, aby umożliwić efektywną wymianę gazową i hodowlę komórek w jednorodnej zawiesinie, bez osiadania komórek na dnie w miarę upływu czasu. Wymaga to wstępnych testów w zależności od indywidualnego sprzętu laboratoryjnego i konfiguracji, a także linii komórkowych używanych do produkcji. W szczególności należy wziąć pod uwagę promień wytrząsania, format płytki i kształt dna studni, aby zawiesina komórek była jednorodna i aby uniknąć osiadania komórek na dnie.
  2. Żniwa i liza
    1. Zebrać komórki, przenosząc pełną objętość kultury z każdej studzienki do indywidualnie oznakowanych probówek o pojemności 5 ml i odwirować przy 800 × g przez 20 minut w temperaturze 4 °C.
    2. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 550 μl (D)PBS firmy Dulbecco i przenieść zawiesinę do probówki z nakrętką o pojemności 1,8-2,0 ml, aby uniknąć powstawania aerozoli i kropli podczas otwierania probówek.
      UWAGA: W tym momencie można również przechowywać pelety, aby później kontynuować proces oczyszczania. Zawieszone granulki soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (DPBS) firmy Dulbecco należy przechowywać w temperaturze -80 °C i należy wziąć to pod uwagę podczas etapów cyklu zamrażania i rozmrażania.
    3. Przygotuj lizaty, umieszczając probówki w ciekłym azocie na około 2 minuty, a następnie rozmrażając je w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Powtórz ten cykl 3-5 razy.
    4. Odwirowywać lizaty przez 5 minut w temperaturze 1000 × g w temperaturze 4 °C. Przykryć wiadra wirówki pokrywkami szczelnymi dla aerozoli.
    5. Ostrożnie wyjmij probówki z wirówki.
      UWAGA: Lizaty muszą być klarowne i wolne od widocznych zanieczyszczeń lub zmętnienia, aby uniknąć zatkania żywicy używanej w procesie oczyszczania. Unikaj potrząsania lub naruszania granulek. Powtórzyć etap wirowania w przypadku, gdy supernatanty nie są klarowne. Należy rozważyć większą prędkość wirowania lub dłuższy czas trwania w przypadku próbek o wysokim stężeniu lub próbek zawierających duże ilości zanieczyszczeń.
  3. Wysokoprzepustowe oczyszczanie rAAV na bazie żywicy Affinity
    1. W zlewce przygotować bufor elucyjny, dodając 720 mg kwasu cytrynowego do 50 ml ultraczystej wody, aby osiągnąć końcowe stężenie 75 mM kwasu cytrynowego.
    2. Mieszaj bufor, aż proszek całkowicie się rozpuści.
      UWAGA: Upewnij się, że objętość studzienki jest wystarczająca, aby pomieścić objętości bufora i końcówki pipet bez rozlania lub ryzyka zanieczyszczenia krzyżowego sąsiednich studzienek.
    3. Dostosuj pH do 3,0, dodając kroplami 1 M kwas solny (HCl), ciągle mieszając bufor i mierząc za pomocą elektrody pH.
    4. Przeprowadź sterylną filtrację w buforze przy wielkości porów 0,22 μm.
    5. Przygotować kolumny z 96 płytkami głębinowymi o objętości studzienki 2-2,2 ml do oczyszczania zgodnie ze schematem opisanym w tabeli 1.
      UWAGA: Próbki tutaj zostały oczyszczone przy użyciu elektronicznej pipety wielokanałowej. Proces jest kompatybilny ze zautomatyzowanymi systemami obsługi cieczy i może być skalowany w celu zwiększenia przepustowości próbek.
    6. Uruchomić oczyszczanie w komorze bezpieczeństwa biologicznego na RT, korzystając z parametrów pokazanych w schemacie oczyszczania (patrz tabela 1) lub zoptymalizować parametry zgodnie z indywidualnymi wymaganiami, w zależności od objętości żywicy lub próbki, oczekiwanego miana itp.
    7. Po elucji dodać 1/4 objętości elucji buforu neutralizacyjnego do każdej próbki.
    8. Mieszać, pipetując 80% objętości 10 razy w górę i w dół.
    9. Przygotować płytki dializacyjne, wyjmując kasety membranowe i dodając 1600 μl buforu dializacyjnego do każdej studzienki.
      UWAGA: Upewnij się, że membrany nie mają kontaktu z cieczą przed wykonaniem dializy, ponieważ ponowne suszenie może pogorszyć integralność i funkcję membrany.
    10. Przenieść pełną objętość próbki (maksymalnie 300 μl) do kasety dializacyjnej o odpowiednim formacie objętości i wielkości porów membrany (≥ 20 000 mas cząsteczkowych (MWCO)). Upewnij się, że membrany są jednorodnie obciążone i nie ma pęcherzyków powietrza.
    11. Umieścić kasety w zagłębieniach załadowanych płytką dializacyjną i uszczelnić płytkę folią uszczelniającą.
    12. Przenieść płytkę dializacyjną na platformę wytrząsającą i inkubować z prędkością 300 obr./min, 4 °C przez 30 minut.
    13. Wymienić bufor dializacyjny i powtórzyć inkubację przy 300 obr./min, 4 °C przez 30 min.
    14. Powtórz wymianę bufora i inkubację łącznie 3x.
    15. Przenieść pełną objętość dializowanych próbek do oznakowanych probówek do przechowywania i przechowywać je w temperaturze 4 °C, jeżeli są następnie wykorzystywane do charakterystyki lub innych doświadczeń.
    16. Przechowywać w temperaturze -80 °C do długotrwałego przechowywania. Unikaj cykli zamrażania i rozmrażania, ponieważ może to wpłynąć na moc AAV, i w razie potrzeby przygotuj porcje o małej objętości.
  4. Miareczkowanie miana genomowego rAAV z surowych lizatów i oczyszczanie na bazie żywicy za pomocą cyfrowego PCR (dPCR)
    1. Aby określić miano genomowe surowych lizatów, tj. genomów wirusów na ml (vg/ml), należy rozmrozić zebrane próbki wektorów w temperaturze pokojowej, a następnie pipetować 10 μl do probówki.
      UWAGA: Dostępnych jest kilka metod określania miana genomu wirusa (vg/mL) preparatu wektorowego, przy czym bezwzględna kwantyfikacja zwykle opiera się na dwóch głównych podejściach: metodzie kropelkowej lub emulsyjnej (ddPCR) oraz metodzie opartej na mikropłytkach, reprezentowanej przez cyfrowy PCR (dPCR)33,34. Oprócz tych metod cyfrowych, bezwzględną kwantyfikację można również osiągnąć za pomocą ilościowego PCR (qPCR). Chociaż qPCR jest tradycyjnie względną metodą kwantyfikacji, można ją dostosować do bezwzględnej kwantyfikacji przy użyciu standardowej krzywej plazmidu. Obejmuje to plazmid zawierający sekwencję docelową w znanym stężeniu, który służy jako odniesienie do ekstrapolacji miana genomu wirusa21,33. Chociaż qPCR jest szybszy i tańszy niż ddPCR lub dPCR, jest mniej precyzyjny i w dużej mierze opiera się na dokładności standardu plazmidu16. Niezależnie od metody kwantyfikacji, próbki muszą zostać poddane wstępnej obróbce, aby uwolnić genomy wirusa z cząstek. Protokół ten jest zgodny z wcześniej opisaną metodą przez Dobnika, D. i wsp.35.
    2. Próbki rAAV należy traktować nukleazą w temperaturze 37 °C przez 30 minut w celu degradacji wolnego plazmidowego DNA z procesu transfekcji.
      UWAGA: Opcjonalnie, w zależności od użytego enzymu: podgrzewać próbki do 95 °C przez 15 minut w celu dezaktywacji enzymu i lizy kapsydu wektora.
    3. Po schłodzeniu do RT dodaj proteinazę K przez 15 minut, aby strawić fragmenty kapsydu.
    4. W celu inaktywacji proteinazy K ponownie podgrzewać próbki do temperatury 95 °C przez 15 minut.
    5. Przygotuj mieszanki główne ddPCR lub dPCR, postępując zgodnie z instrukcjami producenta.
    6. Używaj znakowanych sond DNA, ponieważ dostarczają one bardziej specyficzny sygnał niż barwniki interkalacyjne. Zaprojektuj sondy, które wiążą się "centralnie" w genomie wirusa, tj. w transgenie (patrz UWAGA), a nie w promotorze lub ogonie poliA, i wybierz fluorofor, taki jak heksachloro-6-karboksyfluoresceina (HEX) lub 6-karboksyfluoresceina (FAM), który jest kompatybilny z odpowiednim systemem PCR.
      UWAGA: Ostatnio zastosowano multipleksowy ddPCR lub dPCR, wykorzystujący zestawy starterów / sond ukierunkowane na różne regiony genomu wirusa, w celu zwiększenia dokładności określania miana36,37. Podejście to umożliwia kwantyfikację nienaruszonych genomów poprzez zastosowanie formuł opisanych w cytowanych badaniach lub przy użyciu zintegrowanych rozwiązań programowych.
    7. Przeprowadzić 10-krotne seryjne rozcieńczenie próbek przetworzonych po obróbce w ddH2O przy użyciu 96-dołkowych płytek o niskim poziomie wiązania DNA. Na koniec przenieś 5,5 μl (dla ddPCR) lub 2 μl (dla dPCR) z matrycy (rozcieńczenia 10,4- i 10:5) na 96-dołkową płytkę ddPCR, która zawiera już ddPCR/dPCR Master Mix, w tym starter/sondy. Dostosuj zakres rozcieńczania w oparciu o wydajność produkcji poszczególnych konstrukcji, aby upewnić się, że pomiary mieszczą się w liniowym zakresie wykrywania.
      UWAGA: Ponieważ oznaczanie ilościowe dPCR/ddPCR jest metodą bardzo czułą, konieczne jest 104 i10 5 rozcieńczeń próbek.
    8. Postępuj zgodnie z instrukcjami opisanymi poniżej dla ddPCR.
      1. W przypadku amplifikacji PCR należy postępować zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi optymalizacji warunków testu, w tym dostosowań czasów wyżarzania i amplifikacji w oparciu o zastosowany zestaw starterów/sond. Standardowy protokół cykliczny zastosowany w tym badaniu był następujący: początkowa denaturacja w temperaturze 9 °C przez 10 minut (narastanie °C/s); 35 cykli denaturacji w temperaturze 9 °C przez 30 s i amplifikacji w temperaturze 6 °C przez 60 s; po którym następuje końcowy etap wydłużania w temperaturze 9 °C przez 10 minut (narastanie °C/s).
      2. Po amplifikacji PCR docelowych genomów wirusa rAAV, przenieś płytkę do czytnika kropelek i postępuj zgodnie z instrukcjami producenta, aby zmierzyć intensywność fluorescencji w każdym dołku. Czytnik kropelkowy umożliwia bezwzględne określenie ilościowe liczby kopii genomu wirusa w reakcji μL.
    9. Postępuj zgodnie z instrukcjami opisanymi poniżej dla dPCR.
      1. Zgodnie z opisem dla kwantyfikacji opartej na ddPCR postępuj zgodnie z instrukcjami producenta dotyczącymi optymalizacji warunków testu.
      2. Jako punkt wyjścia należy postępować zgodnie z profilem termicznym ustawionym na urządzeniu dPCR, który obejmuje początkowy etap denaturacji w temperaturze 9 °C przez 2 minuty, a następnie 40 cykli denaturacji w temperaturze 9 °C przez 15 s i wyżarzanie/przedłużanie w temperaturze 5 °C przez 30 s.
        UWAGA: Protokół ten został przeprowadzony przy użyciu zalecanych szybkości narastania i objętości reakcji określonych przez producenta.
    10. Analizuj dane ddPCR i dPCR za pomocą różnych rozwiązań programowych, zwykle dostarczanych przez producenta urządzenia (np. odpowiednio QX Manager i QIAcuity Software Suite 1.2). Dla obu metod należy wybrać tylko rozcieńczenia próbki o odpowiednim stosunku dodatnich do ujemnych przegród/kropel do oceny ilościowej.
      UWAGA: Do oznaczania miana cząstek rAAV (vp/mL; vp = cząstki wirusa) z surowych lizatów i materiału oczyszczonego żywicą AAVX, można zastosować test immunoenzymatyczny (ELISA), Dostępne są różne dostępne na rynku standardowe zestawy ELISA typu sandwich do kwantyfikacji AAV (zestawy użyte w tej pracy są wymienione w Tabeli materiałów). Wykonaj test zgodnie z instrukcją lub instrukcjami producenta. Upewnij się, że używany zestaw ELISA jest zgodny z produkowanym serotypem AAV.
  5. Analiza współczynnika VP z oczyszczonych rAAV
    UWAGA: Aby określić stosunek białka kapsydu wirusa (VP) w każdej próbce z poszczególnych studzienek konfiguracji 24 głębokich dołków, można wykonać standardowe protokoły western blot lub automatyczne protokoły kapilarne.
    1. Aby wykryć białka kapsydu AAV2 VP1, VP2 i VP3, należy użyć pierwszorzędowego przeciwciała monoklonalnego anty-AAV VP1/VP2/VP3. Upewnij się, że przeciwciało pierwszorzędowe działa z odpowiednim wariantem serotypu lub kapsydu.
    2. Stosować odpowiednie kontrole dodatnie, takie jak rekombinowany VP1, VP2 i VP3 lub wzorzec referencyjny AAV.
    3. Przygotować kontrolę pozytywną w stosunku molekularnym 1:1:10 (VP1:VP2:VP3), aby naśladować oczekiwany stosunek VP. Służy to również jako odniesienie do kwantyfikacji współczynnika VP za pomocą integracji obszaru sygnału.
    4. Wybierz zestaw kapilarny z odpowiednim zakresem, który obejmuje białka kapsydu, które mają być wykrywane, w tym najmniejsze (VP3 o ~ 60 kDa) i największe (VP1 o ~ 82 kDa). Może się to różnić w zależności od zastosowanego serotypu i wariantu kapsydu.
    5. Odczynniki i drabinkę biotynylową dołączoną do zestawu należy przygotować zgodnie z instrukcją producenta.
    6. Przygotować serię rozcieńczeń próbek (w oparciu o miano genomowe rozpoczynające się od 1 ×10 12 vg/ml do 1 ×10 10 vg/ml lub rozcieńczenia 1:2, zaczynając od próbki nierozcieńczonej do 1:64) w przewidzianym buforze do rozcieńczania zestawu, aby zapewnić dobry zakres wykrywania dla każdej próbki.
    7. Rozcieńczyć przeciwciało pierwszorzędowe w dostarczonym buforze do rozcieńczania przeciwciał zgodnie z instrukcjami producenta lub w zależności od wcześniejszych testów. Zacznij od 1:100.
    8. Należy użyć odpowiedniego zestawu do wykrywania w zależności od źródła przeciwciała pierwszorzędowego.
    9. Załaduj płytę zgodnie ze schematem dostarczonym z zestawem.
    10. Upewnij się, że wypełniłeś puste kolumny wodą lub buforem do rozcieńczania próbki, aby nie uszkodzić kapilar instrumentu przez suchość.
    11. Przykryć płytkę folią uszczelniającą i odwirować w temperaturze 1200 × g, 5 minut, w temperaturze 4 °C.
    12. Przenieś płytkę i kapilary do urządzenia i użyj wstępnie ustawionych standardowych warunków biegu.
    13. Przeanalizuj przebieg za pomocą oprogramowania do analizy danych, takiego jak Compass (wersja 6.3.0)38.
      UWAGA: Do analizy integralności cząstek, monodyspersji i czystości zaleca się transmisyjną mikroskopię elektronową z ujemnym barwieniem (ns-TEM). Analizę TEM można przeprowadzić zgodnie z opisem Steiningera i innych. AL25. Jednak inne metody, takie jak fotometria masowa39, SEC-MALS40 i barwienie taśmowe41 , mogą również dostarczyć uzupełniających odczytów w celu oceny jakości preparatów rAAV.
  6. Transdukcja z oczyszczonymi cząstkami wirusa
    UWAGA: Aby transdukować komórki za pomocą oczyszczonych wektorów wirusowych, należy określić wielokrotność infekcji (MOI). MOI definiuje się jako liczbę genomów zawierających cząstki dodanych do komórki. Należy zauważyć, że jest to wartość teoretyczna; rzeczywista liczba genomów rAAV dostarczonych na komórkę zależy od zdolności kapsydu do skutecznej transdukcji komórek docelowych. Dlatego optymalny MOI musi być zawsze określany doświadczalnie. W tej sekcji celem było porównanie dwóch wektorów wirusowych, które zostały wyprodukowane przy użyciu różnych metod oczyszczania (ultrawirowanie chlorku cezu i żywica powinowactwa do AAVX). W tym celu za pomocą obu preparatów transdukowano kokultury neuronów pochodzenia ludzkiego, a skuteczność transdukcji oceniono za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.
    1. Pokryć 96-dołkową czarną optyczną płytkę dolną 0,1% (poli-L-ornityną) PLO przez noc w temperaturze 4 °C lub inkubować w temperaturze 37 °C przez ≥ 1 godzinę.
    2. W dniu wysiewu odessać odczynnik powlekający PLO i pokryć go matrycą błony podstawnej o zredukowanym współczynniku wzrostu i inkubować w temperaturze 37 °C przez ≥1 godzinę.
    3. Hodowla neuronów ruchowych z astrocytami w stosunku 1:6 lub zgodnie z zaleceniem dostawcy.
    4. Po 2 dniach in vitro (DIV) transdukuj kokulturę przy MOI 50 000.
    5. Rozmrozić podwielokrotności wirusa w temperaturze 4 °C.
    6. Przygotuj pożywki transdukcyjne (wektory wirusowe o pożądanym MOI na podstawie genomów wirusowych na komórkę + pożywki do hodowli komórkowych w odpowiednich ilościach, aby zastąpić 50% pożywki hodowlanej na studzienkę).
    7. Wykonaj 50% wymianę mediów z mediami transdukcyjnymi.
    8. W 5 DIV wykonaj pełną wymianę pożywek ze zwykłymi pożywkami hodowlanymi.
    9. Utrzymuj komórki z regularną wymianą pożywek hodowlanych co 2-3 dni lub zgodnie z zaleceniami dostawcy.
    10. Monitoruj poziomy ekspresji za pomocą mikroskopu do obrazowania na żywo, wyposażonego w prawidłowe wzbudzenie dla transgenu reporterowego. W przypadku neuronów pochodzenia ludzkiego ekspresję plateau obserwuje się między 10-14 dniem po transdukcji (patrz ryc. 4A).
KrokBufor/MateriałObjętość studzienki [μL]Objętość robocza [μL]CykliPrzepływ
[μl/min]
1. RównowagaRównowagi/
Bufor do mycia I		11009502500
2. Ładowanie/
Przechwytywanie		Próbka Supernatant5505004
3. Umyj IRównowagi/
Bufor do mycia I		11009502
4. Myjnia IIBufor do mycia II11009502
5. ElucjaBufor elucyjny70 μL (20 μL końcówki żywiczne)
250 μL (80 μL końcówki żywiczne)		60 μL (20 μL końcówki żywiczne)
240 μL (80 μL końcówek żywicznych)		4
6. NeutralizacjaBufor neutralizacyjnyDodaj 1/4 objętości elucji bezpośrednio do każdej próbki
70 μl eluowanej próbki → Dodać 17,5 μl
250 μl eluowanej próbki → Dodać 62,5 μl		--

Tabela 1: Układ płytek i parametry oczyszczania dla oczyszczania żywicy powinowactwa rAAV.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W ostatnich latach znacznie wzrosło zapotrzebowanie na produkcję wektorów AAV na skalę laboratoryjną, co doprowadziło do powstania licznych organizacji badawczych na zlecenie, oferujących to jako usługę42. Biorąc pod uwagę wysokie koszty i opóźnienia w realizacji opóźnień, które często wiążą się z outsourcingiem, własna produkcja rAAV pozostaje atrakcyjną opcją. W szczególności protokoły o wysokiej przepustowości, które minimalizują zużycie materiału i godziny pracy przy jednoczesnej integracji etapów oczyszczania, są bardzo korzystne w procesie opracowywania leków.

Protokół ten przedstawia dwie wysokoprzepustowe konfiguracje do produkcji rAAV: podejście mikro-6-dołkowe z wykorzystaniem komórek adherentnych oraz protokół mini-HT24 do komórek zawiesinowych (patrz przegląd na rysunku 1). Konfiguracja mikro-6-dołkowa wykorzystuje przylegające HEK293T komórki do produkcji rAAV w formacie 6-dołkowym. Materiał ten wykorzystano do oceny wpływu dwóch dostępnych na rynku odczynników do transfekcji PEI i chlorku sodu (NaCl) na produkcję rAAV2 (Figura 2A). W tym przypadku monitorowano jednocześnie różne parametry: (i) żywotność komórki produkcyjnej i skuteczność transfekcji przy użyciu transgenu GFP (ryc. 2B i rysunek uzupełniający 1) oraz (iii) odsetek komórek GFP-dodatnich (GFP+) po transdukcji surowymi lizatami (ryc. 2C). Eksperyment z transdukcją posłużył jako niedrogi i szybki pośredni odczyt mian wektorów i funkcji. Co ciekawe, niższe proporcje odczynnika do transfekcji do DNA były wystarczające, aby promować wydajną produkcję wektorów (Figura 2B) przy jednoczesnym utrzymaniu dobrej żywotności komórek. Co więcej, dodatek 150 mM NaCl okazał się korzystny, szczególnie w przypadku stosowania odczynnika PEIpro. Przeprowadzenie tego eksperymentu w mikroskali przyniosło kilka korzyści: (i) szybki przepływ pracy, z wysiewem komórek, transfekcją i zbieraniem wektorów zakończonymi w ciągu jednego tygodnia; (ii) zgodność ze standardowymi dalszymi testami analitycznymi; oraz (iii) szerokie zastosowanie do wszystkich serotypów AAV.

W przypadku zastosowań wymagających większej ilości wektorów rAAV, takich jak eksperymenty in vivo lub badania kinetyczne in vitro (gdzie stosuje się wyższy lub szerszy zakres MOI), konieczne jest zwiększenie skali. Aby ustanowić protokół mini-HT24, który zapewnia wystarczającą ilość materiału do oczyszczania o wysokiej przepustowości, wykorzystano ogniwa zawiesinowe. W porównaniu z komórkami przylegającymi, hodowle zawiesinowe oferują lepszą skalowalność i są bardziej wydajne przestrzennie, ponieważ nie są ograniczone powierzchnią. Ponieważ komórki zawiesinowe rosną swobodnie w pożywce, mogą zajmować całą objętość hodowli, co upraszcza skalowanie w trzech wymiarach. Umożliwia to osiągnięcie większej gęstości komórek w porównaniu z kulturami warstwowymi. Ponadto systemy zawieszenia są łatwiejsze w utrzymaniu i obróbce, ponieważ podczas pasażowania lub zbioru nie są wymagane żadne etapy odłączania. Jednorodność produkcji rAAV w formacie 24-dołkowym oceniono, analizując trzy kluczowe parametry na płytce (ryc. 3): (A) miano cząstek (vp/mL); B) współczynnik VP w kapsydzie; (C) Miano genomowe (vg/ml) i (D) Stosunek pustego do pełnego.

Chociaż zaobserwowano pewną zmienność tych parametrów, pozostała ona w dużej mierze w podwójnym zakresie, czyli w granicach błędu pomiaru. Ekspresję białka VP oceniano również za pomocą automatycznej analizy western blot (Figura 3E). Na koniec przedstawiono porównanie całkowitej wydajności uzyskanej z produkcji mikro-6-dołkowej, mini-HT24 i średniej skali (kolba wstrząsająca), aby ułatwić wybór odpowiedniej skali w oparciu o wymagania doświadczalne i dalsze potrzeby analityczne (rysunek 3F).

Krytycznym aspektem każdego protokołu oczyszczania AAV jest ocena czystości i siły działania wektora. W tym przypadku wektory oczyszczone żywicą porównano obok tych oczyszczonych za pomocą dwuetapowej metody ultrawirowania (UC) opartej na chlorku cezu (CsCl) (ryc. 4). Porównywalną siłę działania między tymi dwoma preparatami zaobserwowano za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, co wykazano udaną transdukcją neuronów ruchowych i astrocytów (ryc. 4A). Analiza pod mikroskopem elektronowym nie wykazała istotnych różnic w kształcie cząstek ani stanie agregacji. Istniała jednak niewielka tendencja wskazująca, że oczyszczanie CsCl bardziej konsekwentnie dawało czystsze preparaty (ryc. 4B).

figure-results-1
Rysunek 1: Przegląd podejść do produkcji i przygotowania rAAV. Rysunek ten ilustruje metody produkcji rAAV, począwszy od kolb wstrząsowych w średniej skali, a skończywszy na kulturach zawiesinowych mini-HT24 i kulturach przylegających do mikro-6 dołków. Podejścia te umożliwiają generowanie rAAV w różnych skalach, wykorzystując różne strategie lizy komórek i oczyszczania wektorów. Ostateczna charakterystyka rAAV zazwyczaj obejmuje qPCR/dPCR do oznaczania ilościowego genomu wirusa (vg/mL), ELISA do oznaczania miana kapsydu (vp/mL) oraz testy transdukcji komórek w celu oceny aktywności biologicznej. Stworzony w BioRender. Ohland, P. (2025) https://BioRender.com/x3sfbdd. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Optymalizacja protokołu transfekcji dla produkcji mikro-6-dołkowego rAAV. (A) Schematyczny przegląd eksperymentu z badanymi parametrami i odczytami analitycznymi. (B) HEK293T komórki wysiewano na płytkach 6-dołkowych o gęstości 0,5 × 106 komórek/basenik 24 godziny przed transfekcją. Badano różne ilości DNA, typy PEI (Pro lub Max), proporcje i stężenia NaCl. (C) Odsetek komórek HEK293A dodatnim wynikiem GFP (GFP+) 72 godziny po transdukcji z równymi objętościami lizatów z panelu A (po 10 μl każdy). Dla uproszczenia pokazany jest tylko warunek DNA, który spowodował najwyższą wydajność wektora (2650 ng). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Charakterystyka analityczna rAAV wytworzonego w konfiguracji mini-HT24 i porównanie miana w różnych skalach. (A) Analiza ELISA oczyszczonych mian kapsydu rAAV w każdym basenie. Wartości są przedstawiane jako zmiany powyżej średniego miana cząstek na płytce po oczyszczeniu. Oczekiwane miana zależą od zastosowanego kapsydu AAV i upakowanego transgenu. Miana cząstek dla różnych wektorów AAV wahały się od niskich 1011 do wysokich 1012 VP/ml. (B) Analiza współczynnika VP za pomocą WES oczyszczonego rAAV ze wskazanych odwiertów. Rekombinowane AAV2 VP1, VP2 i VP3 zastosowano jako kontrole pozytywne w stosunku molowym 1:1:10. (C) analiza dPCR oczyszczonego rAAV z każdej studzienki. Wartości są pokazane jako zmiany powyżej średniego miana genomowego płytki po oczyszczeniu. Oczekiwane miana zależą od zastosowanego kapsydu AAV i upakowanego transgenu. Miana genomowe dla różnych wektorów AAV wahały się od niskich 1010 (rAAV2) do wysokich 1011 vg / ml (rAAV9, nie pokazano tutaj). (D) Stosunek pustego do pełnego (E/F) wskazanych studzienek, w oparciu o wyniki genomu i miana cząstek z paneli A i C. Wartości są znormalizowane do średniej płytowej. Pokazana średnia E/F w formacie mini-HT24 dla rAAV2 wynosi 10,6% ± 3,0% po oczyszczeniu żywicy o powinowactwie AAVX. (E) Kapilarna analiza western blot białek VP w oczyszczonych próbkach rAAV2 z każdej studzienki. (F) Porównanie całkowitej wydajności genomu wirusa z uwzględnieniem końcowej objętości próbki i stężenia każdej metody. Dane są pokazane jako średnia różnica krotności w najmniejszym formacie (mikro-6-dołkowym), ze słupkami błędów wskazującymi odchylenie standardowe (SD) od kontrprób biologicznych. Do wysokoprzepustowej produkcji z 24 głębokich odwiertów z oczyszczaniem żywicy o powinowactwie AAVX, SD = ±0,176 (n = 24); do ultrasonizacji mikro-6-dołkowej; SD = ±0,349 (n = 6); a dla standardowej produkcji na średnią skalę z oczyszczaniem gradientowym CsCl, SD = ±134,70 (n = 2). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Porównanie siły działania i czystości między wysokoprzepustowymi próbkami rAAV oczyszczonymi żywicą (HT) a standardowymi próbkami oczyszczonymi CsCl. (A) Neurony ruchowe i astrocyty pochodzenia ludzkiego były transdukowane tym samym konstruktem rAAV eksprymującym reporter fluorescencji mRuby3 pod ludzkim promotorem synapsyny jako reporter przy MOI 50 000. Obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej zostały uchwycone pod mikroskopem obrazowania na żywo siedem dni po transdukcji (DPT). rAAV oczyszczono przy użyciu standardowej metody gradientu CsCl (na górze) lub podejścia opartego na końcówce żywicy powinowactwa HT AAVX (na dole). Próbki oczyszczone CsCl poddano jednemu dodatkowemu cyklowi zamrażania i rozmrażania przed przeprowadzeniem transdukcji i porównano z rAAV oczyszczonymi żywicą. (B) Analiza transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM) wariantów opartych na serotypie rAAV2 oczyszczonych za pomocą gradientu CsCl (na górze) i metody końcówki żywicy HT (na dole). Dwie partie próbek rAAV2 oczyszczonych z żywicy HT można porównać bez dializy (na dole po lewej) i z dializą (na dole po prawej). Stosunek pustego do pełnego (E/F) określono za pomocą TEM tak, aby był > 90% pełny dla próbek oczyszczonych ultrawirówkowo w gradiacji CsCl i < 40% pełny dla próbek oczyszczonych żywicą AAX. Podziałka = 100 nm. Panel B przedstawia reprezentatywne zdjęcia oczyszczonych partii przy użyciu wskazanych metod. Proszę zauważyć, że obrazy te nie należą do tych samych preparatów, które są używane w eksperymentach z transdukcją pokazanych w panelu A. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek uzupełniający 1: Transfekcja komórek HEK293T do produkcji rAAV2-GFP przy użyciu konfiguracji mikro-6-dołkowej. Do transfekcji wykorzystano różne ilości DNA, stężenia NaCl (w mM), produkty PEI i stosunki PEI do DNA (jak opisano na rysunku 2). Zdjęcia zostały wykonane 72 godziny po transfekcji przy użyciu tego samego czasu naświetlania (320 ms). Reprezentatywne obrazy z mikroskopii jasnego pola i mikroskopii fluorescencyjnej pokazano na tym rysunku. Powiększenie: 10X. Pasek skali nie jest wyświetlany; Zdjęcie służy wyłącznie do celów ilustracyjnych i oceny jakościowej. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W niniejszym dokumencie przedstawiono skuteczne metody wytwarzania rAAV w warunkach o wysokiej przepustowości na małą skalę, wykorzystujących zarówno ogniwa przylegające, jak i zawiesinowe. Metodologie te są odpowiedzią na rosnące zapotrzebowanie na skalowalne i elastyczne procesy produkcji rAAV, które wspierają badania przedkliniczne, jednocześnie minimalizując czas, koszty i zużycie zasobów.

Zarówno systemy komórek adherentnych, jak i zawiesinowych oferują wyraźne korzyści i wyzwania dla produkcji rAAV na małą skalę. Adherentne systemy komórkowe, takie jak komórki HEK293T28 hodowane na płytkach wielodołkowych, szczególnie dobrze nadają się do projektowania wektorów na wczesnym etapie i badań porównawczych. Ich kompatybilność z ustalonymi protokołami hodowli i transfekcji umożliwia proste wdrożenie w większości laboratoriów. Na przykład Grosse i wsp. Wykorzystano produkcję na małą skalę na płytkach 6-dołkowych w celu zbadania funkcjonalności AAP, białka kluczowego dla składania kapsyduwirusa 22. Drittanti i wsp. wyprodukowali wektory rAAV na 96-dołkowych płytkach, aby ocenić kinetykę replikacji rAAV i przetestować wpływ różnych pomocników adenowirusa na produkcję rAAV23. Warto zauważyć, że w tym ostatnim badaniu opisano test replikacji z wykorzystaniem wyspecjalizowanych komórek HeLa eksprymujących AAV Rep i Cap w celu dalszego wzmocnienia sygnału. Niedawno Quan i in. zastosowali 384-dołkowy protokół produkcji o wysokiej przepustowości w kontekście badania przesiewowego siRNA, podając względne miana24. Jednak biorąc pod uwagę ograniczoną ilość materiału, nadal nie ma pewności, ile testów i odczytów można przeprowadzić, ani czy można osiągnąć wystarczające MOI w eksperymentach z transdukcją komórkową poza pomiarem białek fluorescencyjnych, co może mieć wpływ na odtwarzalność.

W tej pracy produkcja oparta na mikro-6 dołkach w przylegających komórkach HEK293T została wykorzystana do optymalizacji warunków hodowli dla rAAV2 (Figura 1 i Figura 2). Zgodnie z wcześniejszymi badaniami i raportami technicznymi43,44, niższy stosunek PEI do DNA oraz dodatek NaCl podczas transfekcji pozytywnie wpłynęły na produkcję rAAV. Pośrednio znalazło to odzwierciedlenie w wydajności transdukcji wytworzonych wektorów w HEK293A komórkach. Uderzające różnice zaobserwowane przy niższych proporcjach PEI:DNA przypisywano głównie stresowi komórkowemu, na co wskazuje niska żywotność komórek, szczególnie w przypadku PEIpro. Chociaż efekty były mniej widoczne w warunkach PEImax, obrazy mikroskopowe ujawniły obszary wolne od komórek w warstwie komórkowej, wskazujące na stres lub oderwanie komórki (rysunek uzupełniający 1).

Co ważne, odkrycia te nie miały bezpośredniego zastosowania do produkcji wektorów w hodowlach zawiesinowych, podkreślając, że warunki eksperymentalne zwiększające produkcję rAAV w przylegających komórkach HEK293T mogą nie zawsze przekładać się na komórki zawiesinowe, nawet jeśli podstawowy typ komórki pozostaje taki sam. Ta rozbieżność może być przypisana różnicom na poziomie transkryptomicznym i proteomicznym między tymi dwoma systemami45. W związku z tym ściślejsze dostosowanie do klinicznych procesów produkcyjnych może wymagać stosowania kultur zawiesinowych we wczesnych fazach rozwoju. Opierając się na tych obserwacjach i korzyściach płynących z osiągnięcia większej gęstości komórek w zawiesinie, zastosowano system 24 głębokich dołków do produkcji rAAV w miniskalowych kulturach zawiesinowych (mini-HT24). System ten przeszedł obszerną walidację, wykazując spójne miana vg / ml i vp / mL na całej płytce, wraz z jednolitą ekspresją i proporcjami białka VP (Figura 3A-E). Rzeczywiście, wyższe gęstości komórek osiągnięte w konfiguracji mini-HT24 (3 × 106 komórek / ml) w porównaniu z formatem mikro-6-dołkowym (5 × 105 komórek na dołek) skutkowały wyższymi mianami rAAV, jak pokazano na rysunku 3F. Podkreśla to kluczową zaletę systemów opartych na zawiesinie, które nie są ograniczone powierzchnią naczynia hodowlanego. Wdrożenie takich systemów wymaga jednak specjalistycznego sprzętu, który może nie być dostępny we wszystkich laboratoriach. Wreszcie, zaleca się dalszą walidację zidentyfikowanych cząsteczek ołowiu lub lepszych warunków hodowli z systemu mini-HT24 przy użyciu systemów minibioreaktorów, takich jak AMBR15 lub AMBR250, ponieważ wykazano, że systemy te bardziej naśladują warunki produkcji w dużych bioreaktorach 46,47.

Wybór poziomu oczyszczania odgrywa kluczową rolę w określaniu przydatności preparatów rAAV do określonych zastosowań końcowych. Surowe lizaty, pochodzące zarówno z kultur przylegających (mikro-6-dołkowych), jak i zawiesinowych (mini-HT24), stanowią szybką i zasobooszczędną opcję dla wstępnych testów przesiewowych. Lizaty te zawierają mieszaninę cząstek wirusa, szczątków komórkowych i składników pożywki, która jest akceptowalna w zastosowaniach takich jak miano genomu/cząstki wektora, badanie przesiewowe wydajności transdukcji i analiza western blot. Ma to szczególne zastosowanie w badaniach dotyczących podstawowych zagadnień biologicznych (jak pokazano powyżej w badaniu funkcjonalności AAP), optymalizacji warunków hodowli komórkowych oraz przedklinicznych badań przesiewowych i selekcji kandydatów. Jednak obecność zanieczyszczeń może wymagać większych rozcieńczeń, co skutkuje niższą czułością testu. Ponadto zanieczyszczenia mogą negatywnie wpływać na żywotność wrażliwych typów komórek, takich jak komórki pierwotne.

W przeciwieństwie do surowych lizatów, preparaty oczyszczone żywicą AAVX affinity, stosowane wyłącznie w protokole opartym na zawiesinie, osiągają wyższy poziom czystości poprzez selektywne izolowanie nienaruszonych kapsydów. Pozwala to przezwyciężyć ograniczenia surowych lizatów komórkowych, dzięki czemu preparaty te są bardziej odpowiednie do zastosowań takich jak badania in vivo , a także szczegółowe analizy in vitro kinetyki ekspresji transgenów oraz precyzyjne odczyty funkcjonalne, które często wymagają większych ilości materiału (patrz porównanie wydajności na rysunku 3F). W przypadku zastosowań in vitro wydajność wektorów rAAV wytworzonych w warunkach mini-HT24 była zwykle wystarczająca dla większości odczytów, w zależności od liczby komórek i wymaganych MOI. W przeciwieństwie do tego, zastosowania in vivo zazwyczaj wymagają produkcji w skali kolby midi-shake lub większej, w zależności od dawki, drogi podania i modelu zwierzęcego. Pomimo zwiększonych kosztów i czasu potrzebnego do oczyszczenia, spójność i niezawodność uzyskanego materiału często uzasadniają inwestycję w krytycznych przypadkach użycia. Warto zauważyć, że wyniki przedstawione na rysunku 4 pokazują, że wektory rAAV oczyszczone metodami żywicy powinowactwa działają porównywalnie do tych oczyszczonych za pomocą tradycyjnego ultrawirowania chlorku cezu (CsCl). Jest to zgodne z wcześniejszymi obserwacjami, że puste kapsydy albo nie mają wpływu na transdukcję, albo mogą ją nawet wzmacniać, w zależności od obecnych gatunkówAAV 48. Należy jednak zauważyć, że w tym eksperymencie użyto tylko jednego MOI i jednego punktu czasowego, a optymalne warunki muszą być określone indywidualnie dla każdego typu komórki. Podczas gdy oczyszczanie CsCl na ogół daje czystsze tło, AAV oczyszczone końcówką z żywicy HT wykazują większą zmienność czystości (patrz obrazy TEM na rysunku 4). Podsumowując, wyniki te dodatkowo wspierają wdrażanie przepływów pracy o wysokiej przepustowości i małej skali.

Zastosowanie małych końcówek wypełnionych żywicą affinity w wysokoprzepustowym oczyszczaniu stanowi praktyczne rozwiązanie do szybkiego badania przesiewowego rAAV, ale kilka aspektów technicznych wymaga uwagi, aby zapewnić wiarygodne wyniki. Ze względu na ograniczoną objętość złoża żywicy, końcówki te są szczególnie podatne na zapychanie, zwłaszcza podczas przetwarzania surowych lizatów. W związku z tym klarowanie lizatów za pomocą wirowania z dużą prędkością jest niezbędne do usunięcia resztek komórkowych przed załadowaniem, ponieważ niewystarczające klarowanie może zmniejszyć natężenie przepływu i pogorszyć wydajność. W przypadku konfiguracji mini-HT24 zaleca się optymalizację protokołów transfekcji i utrzymanie maksymalnej objętości roboczej 2,5-3 ml na studzienkę. Podczas pracy z różnymi bibliotekami serotypów lub kapsydów zaleca się testowanie różnych typów żywic o powinowactwie, ponieważ skuteczność wiązania i odzyskiwanie mogą się różnić w zależności od struktury kapsydu49. Ręczny elektroniczny system pipetowania wielokanałowego umożliwia łatwą integrację tego przepływu pracy w małych laboratoriach, oferując elastyczność bez konieczności automatyzacji. Jednak ręczna obsługa może powodować zmienność i różnice między partiami. Aby uzyskać większą spójność, korzystne mogą być zautomatyzowane platformy do obsługi cieczy. Należy zwrócić szczególną uwagę, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego podczas dodawania próbki i buforu, a stosowanie odpowiednich formatów płytek o odpowiedniej objętości studzienki jest niezbędne, aby zapobiec przepełnieniu. Biorąc pod uwagę te kwestie, w tym klarowanie próbek, optymalizację protokołu, dobór żywicy i staranne pipetowanie, naukowcy mogą zminimalizować problemy techniczne oraz zwiększyć niezawodność i odtwarzalność przepływów pracy oczyszczania o wysokiej przepustowości i małej skali.

Podsumowując, połączenie wysokowydajnych, małoskalowych metod produkcji rAAV ze strategiami oczyszczania specyficznymi dla danego zastosowania stanowi wszechstronną platformę do rozwoju badań nad terapią genową. Protokoły te są odpowiedzią na rosnące zapotrzebowanie na opłacalne i wydajne przepływy pracy, zachowując jednocześnie elastyczność pozwalającą spełnić różnorodne wymagania eksperymentalne. Równoważąc kompromisy między czystością, skalowalnością i zużyciem zasobów, naukowcy mogą przyspieszyć rozwój przedkliniczny i ułatwić przejście do zastosowań klinicznych.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Julia Fakhiri z wdzięcznością dziękuje za wsparcie w postaci stypendium podoktorskiego Roche. Dane z mikroskopii elektronowej uzyskano w ośrodku kriogenicznym Nautilus firmy Roche. Dziękujemy firmie Moritz Classen i Lubomir Kovacik za ich wkład w funkcjonowanie i wsparcie obiektu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,9% sól fizjologiczna niebuforowanaB. Braun, Melsungen, Niemcy7647-14-5Bufor Wash II
1 M kwas hydrochlocircMerck Millipore, Burlington, Massachusetts, Stany Zjednoczone1099700050Regulacja pH
10x bufor DNazy IThermo Fisher Scientific, Waltham, Stany ZjednoczoneAM8170GddPCR/dPCR
1M Tris-HCl, pH 9,0Thermo Fisher Scientific, Waltham, Stany ZjednoczoneJ60707. APBufor neutralizacyjny
Mikropłytki z 24 studniami głębinowymiEnzyscreen, Heemstede, HolandiaCR1424clSprzęt do hodowli zawiesiny
Kolba Erlenmeyera z poliwęglanu o pojemności 250 ml z nasadką odpowietrzającąCorning, Nowy Jork, Nowy Jork , Stany Zjednoczone431144Sprzęt do hodowli zawiesiny
Separacja 66 - 440 kDa 8x25 wkłady kapilarneBioTechne, Minneapolis, MN, Stany ZjednoczoneSM-W008Zautomatyzowany zestaw Western blot
96 Well 2,2 ml polipropylen DeepWell Thermo Fisher Scientific, Waltham, Stany ZjednoczoneAB0661 powiedział:Płyta do przetwarzania i przechowywania próbek
96-dołkowa/przezroczysta płyta dolna, powierzchnia TCThermo Fisher Scientific, Waltham, Stany Zjednoczone165305Testy transdukcji
AAV2 VP1, białko rekombinowanePROGEN, Heidelberg, Niemcy640823Odczynnik Wes
AAV2 VP2, białko rekombinowanePROGEN, Heidelberg, Niemcy640824Odczynnik Wes
AAV2 VP3, białko rekombinowanePROGEN, Heidelberg, Niemcy640825Odczynnik Wes
AAV2 Xpress ELISAPROGEN, Heidelberg, NiemcyPRAAV2XPSłuży do próbek oczyszczonych z żywicy HT.
Moduł wykrywania myszy dla WesBioTechne, Minneapolis, MN, Stany ZjednoczoneDM-002 powiedział:Zautomatyzowany zestaw Western blot
Starter do przodu specyficzny dla testu/matrycyZwyczajZwyczajddPCR/dPCR
Test / sonda specyficzna dla matrycyZwyczajZwyczajddPCR/dPCR
Test / Specyficzny dla matrycy odwrócony starterZwyczajZwyczajddPCR/dPCR
BalanCD HEK293 - PłynFUJIFILM IRVINE SCIENTIFIC INC, Santa Ana, CA, Stany ZjednoczoneNC1192689Pożywka do hodowli komórek zawiesinowych
Albumina surowicy bydlęcej SERVA Electrophoresis, Heidelberg, NiemcycAlbumina surowicy bydlęcejSuplement do adherentnej pożywki komórkowej
Oddychająca folia ze sztucznego jedwabiu, sterylna VWR International LLC, Radnor, Pensylwania, Stany Zjednoczone391-1262Sprzęt do hodowli zawiesiny
Termocykler C1000Bio-Rad Laboratories, Hercules, Stany Zjednoczone1851096ddPCR (wirus ddPCR)
Zestaw ELISA do wycieku liganda CaptureSelec AAVXThermo Fisher Scientific, Waltham, Stany Zjednoczone8113522000ELISA
Analizator HiRes Cedex Roche Holding AG, Bazylea, Szwajcaria5650216001Licznik komórek
Mikropłytka do hodowli komórkowych, 96 dołkówGreiner Bio-One, Kremsmü nster, Austria655162Aparatura do hodowli komórkowych z aherentem
Kwas cytrynowySigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, Stany Zjednoczone5949-29-1Odczynnik oczyszczający; OSTROŻNOŚĆ
Kamera TEM oparta na technologii CMOS TVIPS XF416 Tietz Video and Image Processing Systems GmbH, Gilching, NiemcyXF416 System przetwarzania wideo i obrazu
Oprogramowanie Compass (wersja 6.3.0)BioTechne, Minneapolis, MN, Stany ZjednoczoneOprogramowanie WES
Costar 6-dołkowe, przezroczyste, wielodołkowe płytki wielodołkowe poddane działaniu TCCorning, Nowy Jork, Nowy Jork , Stany Zjednoczone    3516Aparatura do hodowli komórkowych z aherentem
Olej generatora kropel ddPCR Bio-Rad Laboratories, Hercules, Stany Zjednoczone#1864110odczynnik ddPCR
Olej do czytnika kropelek ddPCR Bio-Rad Laboratories, Hercules, Stany Zjednoczone#1863004odczynnik ddPCR
ddPCR Supermix dla sond (bez dUTP) Bio-Rad Laboratories, Hercules, Stany Zjednoczone#1863023odczynnik ddPCR
DMEM, wysoki poziom glukozyThermo Fisher Scientific, Waltham, Stany Zjednoczone11960044Pożywka do przylegającej hodowli komórkowej
DMEM, niski poziom glukozyThermo Fisher Scientific, Waltham, Stany Zjednoczone11885084Pożywka do przylegającej hodowli komórkowej
DNA o niskim poziomie wiązania 96-dołkowe płytkiEppendorf, Hamburg, Niemcy30129504ddPCR/dPCR
Rurki o niskim poziomie wiązania DNAEppendorf, Hamburg, Niemcy30108051ddPCR/dPCR
DPBS (Polskie Biuro Obsługi KlientaThermo Fisher Scientific, Waltham, Stany Zjednoczone14190094Bufor do płukania
Siatki EM (T600H-Cu 698 l/cal Siatka sześciokątna Cienki pręt; EMS)Nauki o Mikroskopii Elektronowej, Hatfield, PA, Stany ZjednoczoneFFTH600-Cu-ULAnaliza mikroskopii elektronowej
System obrazowania EVO M5000Thermo Fisher Scientific, Waltham, Stany ZjednoczoneAMF5000Mikroskop obrazowania na żywo do testów transdukcji
EZ Pakiet Standardowy 3BioTechne, Minneapolis, MN, Stany ZjednoczonePS-ST03EZ-8Zautomatyzowany zestaw Western blot
Stożkowe probówki wirówkowe Falcon 15 mlFisher Scientific, Schwerte, Niemcy11507411Przetwarzanie próbek
Stożkowe probówki wirówkowe Falcon 50 mlFisher Scientific, Schwerte, Niemcy10203001Przetwarzanie próbek
Geltrex Matryca membrany podstawnej o zredukowanym współczynniku wzrostu bez LDEVThermo Fisher Scientific, Waltham, Stany Zjednoczone  A1413201Powlekanie płytki hodowlanej
Suplement GlutaMAX (L-alanylo-L-glutamina)Thermo Fisher Scientific, Waltham, Stany Zjednoczone35050061Suplement do adherentnej pożywki komórkowej
HEK293AThermo Fisher Scientific, Waltham, Stany ZjednoczoneSilnik R70507Testy transdukcji (tylko do celów badawczych)
HEK293TATCC, Manassas, Wirginia, Stany ZjednoczoneCRL-3216Aherentna hodowla komórkowa, stosowana do produkcji rAAV (tylko do celów badawczych)
Roztwór HEPES, 1MMerck, Darmstadt, Niemcy#H0887Suplement do adherentnej pożywki komórkowej
Aktywna nukleaza soli HL, SAN (25 U/µ L)ArcticZymes Technologies, Tromsø, Norwegia70910-202ddPCR/dPCR
Myjka do mikropłytek HydroSpeedTecan, Mä nnedorf, Szwajcaria30190101ELISA
Zestaw astrocytów iCell, 01434FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc., Madison, WI, Stany ZjednoczoneCzynnik R1092Testy transdukcji
Zestaw neuronów ruchowych iCell, 01279FUJIFILM Cellular Dynamics, Inc., Madison, WI, Stany ZjednoczoneCzynnik R1051Testy transdukcji
Nieskończony 200 PROTecan, Mä nnedorf, Szwajcaria30213617ELISA
JEM-1400Plus to transmisyjny mikroskop elektronowyJEOL Ltd., Akishima, Tokio, JaponiaJEM-1400Plustransmisyjny mikroskop elektronowy
Pokrowiec warstwowy o niskim parowaniu z kołkamiEnzyscreen, Heemstede, HolandiaCertyfikat CR1224cSprzęt do hodowli zawiesiny
Czytnik mikropłytek  SpectraMax i3Molecular Devices, San Jose, Kalifornia, Stany ZjednoczoneProcesor i3xELISA
Mysie przeciwciało monoklonalne anit-AAV2 VP1/VP2/VP3PROGEN, Heidelberg, Niemcy690058Odczynnik Wes
Woda wolna od nukleaz Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Niemcy3036430103ddPCR/dPCR
Opti-MEM, Obniżona pożywka w surowicy Thermo Fisher Scientific, Waltham, Stany Zjednoczone#31985070Pożywka do tworzenia kompleksu PEI-DNA
PBS Thermo Fisher Scientific, Waltham, Stany Zjednoczone#10010023Bufor do płukania
PEI-MAX, polietylenoimina, zapas 1mg/mlPolysciences Europe,  Hirschberg an der Bergstraß e, Niemcy24765 lub 24765Odczynnik do transfekcji
PEIpro powiedział:Polyplus, Illkirch-Graffenstaden, Francja101000033/10 mlOdczynnik do transfekcji
Płytka do mikrodializy Pierce, 96 dołków, 0,3 mL, 20K MWCOThermo Fisher Scientific, Waltham, Stany ZjednoczoneNumer katalogowy A50472Sprzęt do oczyszczania
Poloxamer 188Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, Stany ZjednoczoneP5556-100 mlOdczynnik do hodowli komórkowych; OSTROŻNOŚĆ
Roztwór poli-L-ornityny (0,01%)Sigma-AldrichA-004-MTesty transdukcji
Roztwór proteinazy K (20 mg/ml)Thermo Fisher Scientific, Waltham, Stany Zjednoczone25530049ddPCR/dPCR
Białko Proste " Wes"BioTechne, Minneapolis, MN, Stany Zjednoczone004-600Urządzenie do automatycznego leczenia Western Blot
System platformy QIAcuity EightQiagen, Hilden, Niemcy911052dPCR (Wirus dPCR)
QIAcuity Nanoplate 8,5 tys. 96 dołkówQiagen, Hilden, Niemcy250021ddPCR/dPCR
Zestaw PCR z sondą QIAcuityQiagen, Hilden, Niemcy250101, 250102 lub 250103ddPCR/dPCR
Pakiet oprogramowania QIAcuity 1.2Qiagen, Hilden, NiemcyOprogramowanie dPCR
Menedżer QX Bio-Rad Laboratories, Hercules, Stany ZjednoczoneOprogramowanie ddPCR
Czytnik kropel QX200Bio-Rad Laboratories, Hercules, Stany Zjednoczone1864003ddPCR (wirus ddPCR)
Mikroprobówka z nakrętką, 1,5 ml, testowana pod kątem wydajności PCRSarstedt, Nü mbrecht, Niemcy72.703.416Sprzęt do hodowli zawiesiny
Zakrętka, DNA LoBind, 5.0 mLEppendorf, Hamburg, Niemcy30122348Sprzęt do hodowli zawiesiny
Inkubator z wytrząsarkąInfors AG, Bottmingen, SzwajcariaWielotronSprzęt do hodowli zawiesiny
Pirogronian sodu (100 mM)Thermo Fisher Scientific, Waltham, Stany Zjednoczone11360070Pożywka do przylegającej hodowli komórkowej
System klaksonu z mikropłytką SonicatorQSonica, Newtown, CT, Stany ZjednoczoneQ700MPXCSonikator używany do wytwarzania surowego lizatu
DUCHLink do bazy danych SPIRIT: https://spirit.cladiac.com/aav.html 
Steriflip-GP Sterylna górna jednostka filtrująca w probówce wirówkowejMerck Millipore, Burlington, Massachusetts, Stany ZjednoczoneSCGP00525Sprzęt do przygotowania
T-175, KOLBA DO HODOWLI KOMÓRKOWYCH, 550 ML, 175 CM&SUP2;Greiner Bio-One, Kremsmü nster, Austria660175Aparatura do hodowli komórkowych z aherentem
Trypsyna/EDTA 0,025%Thermo Fisher Scientific, Waltham, Stany ZjednoczoneR001100Odczynnik do hodowli komórkowych
Komórki produkujące wirusy 2.0 (VPC2.0)Thermo Fisher Scientific, Waltham, Stany ZjednoczoneA49784 lub A51218Produkcja rAAV
J63596. Zobacz materiał K2Rozcieńczyć w stosunku 1:10 dla roztworu roboczego PBST

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Singh, N. Drug discovery and development: Introduction to the general public and patient groups. Front. Drug Discov. 3, 1201419(2023).
  2. Thakur, G., Mink, S., Bak, H., Tustian, A. D. Improving process efficiency to reduce cost-of-goods per dose in manufacturing of recombinant AAVs. Cell Gene Ther. Insights. 10 (3), 479-499 (2024).
  3. Reid, C. A., Hörer, M., Mandegar, M. A. Advancing AAV production with high-throughput screening and transcriptomics. Cell Gene Ther. Insights. 10 (6), 821-840 (2024).
  4. Matsunaga, R., Tsumoto, K. Accelerating antibody discovery and optimization with high-throughput experimentation and machine learning. J. Biomed. Sci. 32 (1), 46(2025).
  5. Pereira, D. A., Williams, J. A. Origin and evolution of high-throughput screening. Br. J. Pharmacol. 152 (1), 53-61 (2007).
  6. Aldewachi, H., Al-Zidan, R. N., Conner, M. T., Salman, M. M. High-throughput screening platforms in the discovery of novel drugs for neurodegenerative diseases. Bioengineering. 8 (2), 30(2021).
  7. Liu, H., et al. Producing high-quantity and high-quality recombinant adeno-associated virus by low-cis triple transfection. Mol. Ther. Methods Clin. Dev. 32 (2), 101230(2024).
  8. Blessing, D., et al. Scalable production of AAV vectors in orbitally shaken HEK293 cells. Mol. Ther. Methods Clin. Dev. 13, 14-26 (2019).
  9. Grieger, J. C., Soltys, S. M., Samulski, R. J. Production of recombinant adeno-associated virus vectors using suspension HEK293 cells and continuous harvest of vector from the culture media for GMP FIX and FLT1 clinical vector. Mol. Ther. 24 (2), 287-297 (2016).
  10. Strobel, B., Miller, F. D., Rist, W., Lamla, T. Comparative analysis of cesium chloride- and iodixanol-based purification of recombinant adeno-associated viral vectors for preclinical applications. Hum. Gene Ther. Methods. 26 (4), 147-157 (2015).
  11. Fakhiri, J., Nickl, M., Grimm, D. CRISPR gene editing, methods and protocols. Methods Mol. Biol. 1961, 111-126 (2019).
  12. Strobel, B., et al. Standardized, scalable, and timely flexible adeno-associated virus vector production using frozen high-density HEK-293 cell stocks and CELLdiscs. Hum. Gene Ther. Methods. 30 (1), 23-33 (2019).
  13. Rumachik, N. G., et al. Methods matter: Standard production platforms for recombinant AAV produce chemically and functionally distinct vectors. Mol. Ther. Methods Clin. Dev. 18, 98-118 (2020).
  14. Merten, O. W. AAV vector production: State of the art developments and remaining challenges. Cell Gene Ther. Insights. 2 (5), 521-551 (2016).
  15. Trivedi, P. D., et al. Comparison of highly pure rAAV9 vector stocks produced in suspension by PEI transfection or HSV infection reveals striking quantitative and qualitative differences. Mol. Ther. Methods Clin. Dev. 24, 154-170 (2022).
  16. Zolotukhin, S., et al. Recombinant adeno-associated virus purification using novel methods improves infectious titer and yield. Gene Ther. 6 (6), 973-985 (1999).
  17. Wada, M., et al. Large-scale purification of functional AAV particles packaging the full genome using short-term ultracentrifugation with a zonal rotor. Gene Ther. 30 (7-8), 641-648 (2023).
  18. Kronenberg, S., Böttcher, B., von der Lieth, C. W., Bleker, S., Kleinschmidt, J. A. A conformational change in the adeno-associated virus type 2 capsid leads to the exposure of hidden VP1 N termini. J. Virol. 79 (9), 5296-5303 (2005).
  19. Strobel, B., Miller, F. D., Rist, W., Lamla, T. Comparative analysis of cesium chloride- and iodixanol-based purification of recombinant adeno-associated viral vectors for preclinical applications. Hum. Gene Ther. Methods. 26 (4), 147-157 (2015).
  20. Shiraishi, Y., Adachi, T., Cacicedo, J. M., Ido, Y. Development of a high-yield, high-quality purification process for adeno-associated virus vectors that can be used in vivo without ultracentrifugation: Application to a lung endothelial cell-targeted adeno-associated virus. FASEB J. 36 (12), e22653(2022).
  21. Fakhiri, J., Nickl, M., Grimm, D. CRISPR gene editing, methods and protocols. Methods Mol. Biol. 1961, 111-126 (2019).
  22. Grosse, S., et al. Relevance of assembly-activating protein for adeno-associated virus vector production and capsid protein stability in mammalian and insect cells. J. Virol. 91 (20), (2017).
  23. Drittanti, L., Rivet, C., Manceau, P., Danos, O., Vega, M. High throughput production, screening and analysis of adeno-associated viral vectors. Gene Ther. 7 (11), 924-929 (2000).
  24. Quan, D. N., Shiloach, J. rAAV production and titration at the microscale for high-throughput screening. Hum. Gene Ther. 33 (1-2), 94-102 (2022).
  25. Steininger, T., et al. Improved recombinant adeno-associated viral vector production via molecular evolution of the viral Rep protein. Int. J. Mol. Sci. 26 (3), 1319(2025).
  26. Fisher, K., et al. Polo-like kinase inhibitors increase AAV production by halting cell cycle progression. Mol. Ther. Methods Clin. Dev. 33 (1), 101412(2025).
  27. Chen, K., et al. Advanced biomanufacturing and evaluation of adeno-associated virus. J. Biol. Eng. 18 (1), 15(2024).
  28. DuBridge, R. B., et al. Analysis of mutation in human cells by using an Epstein-Barr virus shuttle system. Mol. Cell. Biol. 7 (1), 379-387 (1987).
  29. Börner, K., et al. Pre-arrayed pan-AAV peptide display libraries for rapid single-round screening. Mol. Ther. 28 (4), 1016-1032 (2020).
  30. Weinmann, J., et al. Identification of broadly applicable adeno-associated virus vectors by systematic comparison of commonly used capsid variants in vitro. Hum. Gene Ther. 33 (21-22), 1197-1212 (2022).
  31. Westhaus, A., et al. High-throughput in vitro, ex vivo, and in vivo screen of adeno-associated virus vectors based on physical and functional transduction. Hum. Gene Ther. 31 (9-10), 575-589 (2020).
  32. Yang, S., Shi, H., Chu, X., Zhou, X., Sun, P. A rapid and efficient polyethylenimine-based transfection method to prepare lentiviral or retroviral vectors:useful for making iPS cells and transduction of primary cells. Biotechnol. Lett. 38 (9), 1631-1641 (2016).
  33. Sanmiguel, J., Gao, G., Vandenberghe, L. H. Adeno-associated virus vectors, design and delivery. Methods Mol. Biol. 1950, 51-83 (2019).
  34. Wang, G., et al. Assessment of key factors impacting variability in AAV vector genome titration by digital PCR. Int. J. Mol. Sci. 25 (10), 5149(2024).
  35. Dobnik, D., et al. Accurate quantification and characterization of adeno-associated viral vectors. Front. Microbiol. 10, 1570(2019).
  36. Duong, T., Firmo, M., Li, C. T., Gu, B., Wang, P. Three-dimensional linkage analysis with digital PCR for genome integrity and identity of recombinant adeno-associated virus. Sci. Rep. 15 (1), 2154(2025).
  37. Tereshko, L., et al. A novel method for quantitation of AAV genome integrity using duplex digital PCR. PLOS ONE. 18 (12), e0293277(2023).
  38. Sormunen, A., et al. Comparison of automated and traditional Western blotting methods. Methods Protoc. 6 (2), 43(2023).
  39. Hiemenz, C., et al. Characterization of virus particles and submicron-sized particulate impurities in recombinant adeno-associated virus drug product. J. Pharm. Sci. 112 (8), 2190-2202 (2023).
  40. McIntosh, N. L., et al. Comprehensive characterization and quantification of adeno associated vectors by size exclusion chromatography and multi angle light scattering. Sci. Rep. 11 (1), 3012(2021).
  41. Su, Q., Sena-Esteves, M., Gao, G. Analysis of recombinant adeno-associated virus (rAAV) purity using silver-stained SDS-PAGE. Cold Spring Harb. Protoc. (8), pdb.prot095679(2020).
  42. Capra, E., Gennari, A., Loche, A., Temps, C. Viral-vector therapies at scale: Today's challenges and future opportunities . , McKinsey & Company. https://www.mckinsey.com/industries/life-sciences/our-insights/viral-vector-therapies-at-scale-todays-challenges-and-future-opportunities (2022).
  43. Huang, X., et al. AAV2 production with optimized N/P ratio and PEI-mediated transfection results in low toxicity and high titer for in vitro and in vivo applications. J. Virol. Methods. 193 (2), 270-277 (2013).
  44. Development of a novel cell culture medium for AAV production with multiple HEK293 lineages and process optimization. , Merck. https://www.sigmaaldrich.com/DE/de/technical-documents/technical-article/pharmaceutical-and-biopharmaceutical-manufacturing/gene-therapy-manufacturing/development-of-novel-cell-culture-medium-aav-production (2025).
  45. Malm, M., et al. Evolution from adherent to suspension: Systems biology of HEK293 cell line development. Sci. Rep. 10 (1), 18996(2020).
  46. Warr, S. R. C. Animal cell biotechnology, methods and protocols. Methods Mol. Biol. 2095, 43-67 (2019).
  47. Manahan, M., et al. Scale-down model qualification of ambr 250 high-throughput mini-bioreactor system for two commercial-scale mAb processes. Biotechnol. Prog. 35 (6), e2870(2019).
  48. Wang, Q., et al. Syngeneic AAV pseudo-particles potentiate gene transduction of AAV vectors. Mol. Ther. Methods Clin. Dev. 4, 149-158 (2017).
  49. Florea, M., et al. High-efficiency purification of divergent AAV serotypes using AAVX affinity chromatography. Mol. Ther. Methods Clin. Dev. 28, 146-159 (2023).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Recombinant AAVHigh Throughput ProductionGene TherapyAAV Vector ProductionMicroscale AAVMiniscale AAVHEK 293T CellsCell Transduction AssayVector Genome TitrationWestern Blot

Powiązane artykuły