Method Article

Produkcja komórek stromalnych zależnych od kotwiczenia mezenchymalnych opartych na mikrobioreaktorze, przygotowanych do ostrego zespołu niedociągania oddechowego

DOI:

10.3791/68650

⸱

December 12th, 2025

 ,  ,  , 
1Harvard-MIT Health Sciences and Technology, Massachusetts Institute of Technology, 2Departments of Materials Science & Engineering and Biomedical Engineering, Cornell University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisano protokół produkcji komórek zależnych od kotwiczenia mikronośnikowo-mikrobioreaktorowymi jako potencjalne terapie oparte na komórkach. Ukierunkowane na ostry zespół niedociągania oddechowego ilustruje porównywalną wydajność komórek i korzystną ekspresję genów w porównaniu do warunków procesów opartych na kolbach. Protokół ten jest rozszerzalny na inne komórki zależne od kotwiczenia oraz wskazania celowe.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Terapia oparta na komórkach to nowe podejście terapeutyczne dla różnych schorzeń. Jednak produkcja wystarczającej ilości wysokiej jakości komórek pozostaje aktywnym wyzwaniem naukowym i technicznym. Końcowy produkt komórkowy nie może być sterylizowany; Dlatego sterylność i jakość przez projekt są kluczowe. Dla komórek zależnych od kotwiczenia, ekspansja oparta na kolbach jest nadal wykorzystywana na skali rozwojowej i przemysłowej, co wymaga dużych fizycznych śladów, ogranicza kontrolę nad środowiskiem biochemicznym (pH,CO2 iO2, dyfuzyjne gradienty składników odżywczych i metabolitów) oraz dostarcza sygnałów fizycznych wpływających na ostateczną jakość komórek. Te wyzwania skłoniły do przyjęcia podejść opartych na produkcji bioreaktorów, jednak takie podejścia zazwyczaj odbywają się na skalę objętościową, co wiąże się z wyzwaniami i może być zbyt kosztowne dla badań laboratoryjnych lub rozwoju procesów. Produkcja terapii mikrobioreaktorowo-mikronośnikowej wykazała biochemiczną kontrolę podczas hodowli dla przypadku testowego typu źródłowego komórki – komórek stromalnych mezenchymalnych. Do wstępnej oceny jakości komórek in vitro rozważano zespół ostrego niedogodności oddechowego jako potencjalny przypadek zastosowania. Podejście przedstawione tutaj umożliwia szybki rozwój procesów na skalę laboratoryjną dzięki małej objętości (2 mL) i ścisłej kontroli biochemicznej w mikrobioreaktorze. Aby to osiągnąć dla typu komórek zależnych od kotwicy, takich jak komórki stromalne mezenchymalne, wymagały znaczne modyfikacje procesu mikrobioreaktora i wykorzystano platformę mikronośnikową żelatyny, produkowaną wewnętrznie w procesie mikrofluidowym. Tutaj przedstawiono dodatkowe szczegóły dotyczące metody i parametrów procesu stosowanych do hodowli takich komórek zależnych od kotwiczenia w mikrobioreaktorze, aby umożliwić innym badaczom dostosowanie tych praktyk do własnych zastosowań i typów źródeł komórek.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wykorzystanie żywych komórek jako produktu terapeutycznego niedawno stało się obiecującą nową opcją leczenia wielu wyzwań zdrowotnych. Na przykład limfocyty T receptorów antygenowych chimerycznych (CAR) przyniosły trwałą remisji u osób z tzw. nowotworami płynnymi — białaczką, chłoniakiem i szpiczakiem mnogim — które były oporne na wszystkie wcześniej dostępne metody leczenia1. Niedawno zatwierdzono produkt mezenchymalnych komórek macierzystych/stromalnych (MSC) (Ryoncil) do leczenia dzieci cierpiących na ostrą chorobę przeszczepu przeciw gospodarzowi (SR-aGvHD), chorobę ośmiertelności > 50%. Jednak rozszerzenie innych niezaspokojonych potrzeb klinicznych wymaga intensywnego opracowania zarówno terapii, jak i środków do opracowania i produkcji tego produktu.

Jedną z takich niezaspokojonych potrzeb klinicznych można znaleźć u osób cierpiących na zespół ostrego niedociągania oddechowego (ARDS). ARDS jest tutaj omawiany, aby przedstawić konkretny przypadek użycia ilustrujący metodę, wyniki oraz dyskusję na temat możliwych rozszerzeń na inne cele chorobowe. Krytyczny (progresja w ciągu kilku godzin do dni), powszechny (> 200 000 przypadków rocznie w USA) i śmiertelny wskaźnik (27%-46% śmiertelności, w zależności od nasilenia objawienia), ARDS wzbudził nową i szeroką uwagę podczas pandemii COVID-19 jako typowy mechanizm śmierci pacjentów zakażonych SARS-CoV-2 3,4. ARDS charakteryzuje się zwiększoną przepuszczalnością naczyń płucnych, prowadzącą do obrzęku śródmiąższowego, zalania pęcherzyków oraz infiltracji składników komórkowych, w tym neutrofilów i czerwonych krwinek, do przedziału pęcherzyka pęcherzyka5. W początkowej fazie wyrzutowej ARDS wrodzone zapalenie komórek odpornościowych powoduje te patogenne efekty poprzez uszkodzenie integralności śródbłonka i bariery nabłonkowej oraz wspieranie rekrutacji i aktywacji komórek odpornościowych poprzez wydzielanie prozapalnych cytokin; Skuteczne rozwiązanie odpowiedzi zapalnej, naprawa integralności bariery oraz uniknięcie nadmiernego włóknienia są kluczowe dla przeżycia3. Chociaż terapie przeciwwirusowe, takie jak Remdesivir, wykazują obiecujące wyniki w zwalczaniu ARDS pośredniczonego przez SARS-CoV-2, w innych przypadkach obecnie nie ma zatwierdzonych interwencji farmakologicznych zmniejszających śmiertelność5.

MSC mogą stanowić obiecujące podejście do leczenia ARDS, biorąc pod uwagę specyficzny tropizm płucny po podaniu systemowego oraz zdolność do wydzielania immunomodulacyjnych sygnałów parakrynologicznych do otaczającego mikrośrodowiska 6,7. Badania mechanistyczne wykazały ekspresję takich czynników parakrynicznych jak interleukina-10 (IL-10)8, indoleamina 2,3-dioksygenaza 1 (IDO1)9, prostaglandyna E2 (PGE2)10 oraz inne w wywoływaniu domniemanej terapeutycznej skuteczności MSC dla wielu wskazań, w tym ostrych urazów płuc (ALI)/ARDS11; dlatego poziomy ekspresji tych produktów genowych stanowią potencjalne krytyczne cechy jakości (pCQA), które mogą przewidywać skuteczność kliniczną, zapewniając możliwe kryteria uwalniania końcowego produktu komórkowego podczas produkcji. Jednak wyprodukowanie wystarczającej ilości komórek, aby osiągnąć skuteczną dawkę terapeutyczną, jest wyzwaniem; Ryoncil, na przykład, jest wskazany do dawkowania w dawce 2 x 106 komórek/kg masy pacjenta, podawanej dwa razy w tygodniu przez 4 tygodniei 12. Dla pacjenta ważącego 80 kg oznacza to > 1,2 miliarda MSC na jeden cykl leczenia, co wymaga dużej powierzchni fizycznej, aby pomieścić odpowiednią powierzchnię dla tego dwuwymiarowego stanu wzrostu. Ponieważ tego produktu z żywych komórek nie można wysterylizować przed podaniam pacjentowi bez uszkadzania potencjału terapeutycznego komórek, stosowanie obecnych wytycznych Dobrych Praktyk Produkcyjnych dla produkcji w sterylny sposób jest kluczowe, co zwiększa złożoność logistyczną produkcji komórek, a tym samym koszt towarów13.

Ponadto wcześniejsze badania wykazały dowody na to, że typowa produkcja MSC w kolbach polistyrenu do hodowli tkankowej (TCPS) przyczynia się do powstawania niejednorodności fenotypowej wewnątrzpopulacji. W niektórych zastosowaniach końcowych utrudnia to kontrolę jakości między partiami w badaniach i w tłumaczeniu klinicznym 14,15,16,17. Spekuluje się, że ograniczona kontrola biochemiczna dostępna w kolbach TCPS, w tym gradienty dyfuzyjne gazów, składników odżywczych i produktów metabolicznych, słaba regulacja pH itp., przyczynia się do tych wyzwań.

Te kwestie motywują do przyjęcia hodowli opartej na bioreaktorach, aby wykorzystać wyższą regulację biochemiczną i gęstość komórek dostępne w kontrolowanym trójwymiarowym formacie wzrostu z dynamicznym mieszaniem18. Jednak przetwarzanie lub produkcja oparta na bioreaktorach wiąże się z własnym zestawem wyzwań: jako typ komórek zależny od kotwiczenia, MSC wymagają jakiegoś rodzaju substratu do wzrostu w bioreaktorze, co wymaga dodania mikronośników. Dodatkowo, wiele komercyjnie dostępnych bioreaktorów pracuje na skalach objętościowych, które są zbyt zasobochłonne (> 3 litry podłoża wzrostowego) dla badań laboratoryjnych niezbędnych do identyfikacji i udoskonalenia nieznanych parametrów procesu wpływających na ekspresję mierzalnych wskaźników jakości komórek. Te cechy określa się jako potencjalne atrybuty krytycznej jakości, czyli pCQA19.

Krupczak i in. wcześniej opisali podejście mikronośnik-mikrobioreaktor, które doprowadziło do uzyskania MSC z poprawą ekspresji pCQA dla ARDS, ograniczonego do ocen in vitro 20. Podejście to łączyło wykorzystanie rozpuszczalnej platformy mikronośników żelatyny, produkowanej na miejscu, z komercyjnie dostępną platformą mikrobioreaktorową, mikrobioreaktorem Mobius Breez21. Ten mikrobioreaktor wykorzystuje jednorazowe komory reaktora o pojemności 2 mL i zawiera wiele pożądanych funkcji poprawiających kontrolę biochemiczną, w tym regulację temperatury, pH,CO2 iO2 w dynamicznie mieszanym, zamkniętym systemie zasilanym perfuzją, ale nie został zaprojektowany z myślą o komórkach zależnych od kotwiczenia, takich jak MSC. Rzeczywiście, standardowe kanały mikrofluidyczne używane do wtrysku zawartości reaktora są zbyt małe, by umożliwić przepuszczenie mikronośników, co wymaga znacznej adaptacji, aby umożliwić skuteczną produkcję MSC na tej platformie.

Tutaj opisano i zilustrowano szczegółowy protokół w celu dostosowania tego mikrobioreaktora do hodowli zależnej od kotwiczenia u MSC. Parametry procesu przedstawione tutaj zostały zidentyfikowane z zamiarem informowania o rozwoju procesu i produkcji MSC do przedklinicznej, in vitro oceny skuteczności terapeutycznej dla ARDS. Jednak w zasadzie protokół ten może być dostosowany do innych zastosowań końcowych, innych stanów zapalnych lub immunomodulacyjnych oraz innych typów komórek zależnych od kotwiczenia, które mogłyby skorzystać na lepszej kontroli biochemicznej w warunkach laboratoryjnych. Rysunek 1 schematyzuje protokół opisany w dołączonym filmie, a Rysunek 2, Rysunek 3 i Rysunek 4 ilustrują kluczowe wyniki.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Konfiguracja i przygotowanie mikrobioreaktora

  1. Przygotowanie wymaganej liczby materiałów zużywalnych do mikrobioreaktorów
    1. Upewnij się, że szafka bezpieczeństwa biologicznego (BSC) jest założona i sterylna. Usuń foliową torbę pokrywającą nowy materiał jednorazowy, przebijając górę worka i trzymając worek foliowy aż do zakończenia tego eksperymentu (aby zanotować szczegóły partii # w przypadku wady). Otwórz zewnętrzne opakowanie blisterowe i wyrzuć zawarty w nim zestaw nawadniający. Wyrzuć zewnętrzne opakowanie blisterowe.
    2. Spryskaj wewnętrzne opakowanie blistera 70% etanolem i włóż do BSC. Otwórz wewnętrzne opakowanie blisterowe i wyrzuć je.
    3. Używając sterylnej strzykawki, wyjmij tłok i podłącz dyszę do filtra sterylnego o pojemności 0,22 μm. Wlej 50 ml niesterylizowanej ultraczystej wody do beczki strzykawki. Trzymając strzykawkę nad oczekującą, sterylną probówką 50 mL, ponownie włóż tłok do strzykawki i wstrzyknij sterylnie przefiltrowaną wodę do oczekującej probówki zbiorczej.
    4. Zdejmij przezroczystą plastikową kapsułkę łączącą się z Bottle LL w stojaku na butelki. Używając nowej sterylnej strzykawki 50 mL, wyjmij tłok i podłącz dyszę do butelki LL. Wlej sterylną filtrowaną wodę do lufy strzykawki i wstrzyknij ją do butelki LL.
      UWAGA: Gniazda bezigłowe mogą się zaciąć podczas procedury sterylizacji producenta, więc może być konieczne wielokrotne łączenie i odłączanie strzykawki, aby przerwać szczelność butelki i skutecznie wstrzyknąć zawartość. Alternatywnie możesz użyć spawaczki rurowej, aby połączyć butelkę źródłową z rurką spawalną w sterylny sposób dla odpowiedniej butelki.
    5. Stosując tę samą procedurę, napełnij butelkę L 25 mL nie-uzupełnionym przez FBS DMEM o niskiej zawartości glukozy, butelkę R 25 mL sterylnego PBS, a butelkę RR 8 mL płynu antyadherencyjnego. Do każdej cieczy używaj nowej sterylnej strzykawki.
    6. Powtórz tę procedurę dla tylu materiałów zużywalnych, ile wymaga eksperyment.
  2. Wykonaj samotest POD w każdym POD używanym w tym eksperymencie.
    UWAGA: Samotest powinien przejść bez problemów; Jeśli jakiś element testu samowystarczy, należy rozwiązać tę porażkę przed kontynuacją.
  3. Wyjmij kasety samotestowe do worków zabezpieczonych przed światłem.
  4. Zamontuj materiał spalny do bioreaktora, jak opisano poniżej.
    1. Usuń zieloną taśmę z zaworów materiału eksploatackiego i zamontuj go w POD. Zamontuj zaciski ponownie i upewnij się, że nie słychać syczenia gazu lub powietrza podczas ucieczki.
    2. Podłącz linię czujnika ciśnienia białej stoki, czerwoną linię ciśnienia powietrza oraz niebieską linię próżniową między materiałami zużywalnymi a stacją bazową/POD. Upewnij się, że boczny port wtryskowy jest zacisnięty białą zaciskką w kształcie łez.
    3. Postępuj zgodnie z instrukcjami oprogramowania, aby rozpocząć nowy eksperyment. Kulminacją jest funkcja autoprime i kalibracji, która trwa ~4-5 godzin i może działać przez całą noc.
  5. Oznacz każdą stojakę na butelki lokalizacją POD, aby łatwo było rozpoznać, do którego POD-u zwrócić materiał zużywalny po jego wyjęciu z bioreaktora. Użyj kolorowej taśmy do wskazywania pozycji: Pod0 = czerwony, Pod1 = pomarańczowy, Pod2 = żółty, Pod3 = zielony. Napisz nazwę eksperymentu i datę na taśmie.
  6. Zostaw materiały do kalibracji przez noc. Upewnij się, że medium może dostać się do reaktora i wydostać się do linii odpadów.
  7. Jeśli planujesz używać komórek przechowywanych w ciekłym azocie, rozmroz i połóż płytkę, aby miały > 24 godziny na regenerację z kriogenicznego magazynowania przed wstrzyknięciem.

2. Rekalibracja i przygotowanie mikronośników

  1. Upewnij się, że etapy automatycznego gruntowania i kalibracji zostały pomyślnie zakończone.
    1. Jeśli kalibracja nie została pomyślnie wykonana, zidentyfikuj i napraw wszelkie podstawowe problemy, a następnie spróbuj ponownej kalibracji. Typowe problemy to zaniedbanie usunięcia białej zaciski na butelki, zaniedbanie usunięcia zielonej taśmy z materiału zużywalnego przed umieszczeniem go w POD-ie oraz niewystarczająca objętość nośnika w butelce z nośnikiem.
  2. Upewnij się, że czujniki tlenu rozpuszczonego są stabilne.
    1. Prawie 10% materiałów eksploatacyjnych wykazuje dryf czujnika w czujniku DO po kalibracji. Wykonaj preferowaną poprawkę, czyli ponowne przeprowadzenie pełnej kalibracji. Jeśli jest to konieczne, wykonaj jeden z następujących zabiegów.
      1. Upewnij się, że w kasecie nie ma powietrza, potem odznacz pole Display Plots , aby pokazać kontrolkę, a następnie kliknij Autokalibruj DO i pH.
        1. Jeśli powietrze było obecne w reaktorze podczas potrzeby kalibracji, wróć do pierwszej strony pulpitu MBS, klikając niebieską strzałkę w lewym górnym rogu okna dla konkretnego POD. Kliknij przycisk , aby uruchomić operacje manualne. Zaznacz pole gotowości do odrzutów i wpisz W w polu tekstowym, aby wybrać butelkę odpadową. Kliknij przycisk Eject-wash , a następnie kliknij Tak w oknie wyskakującym (OK). To opróżni komory reaktora i napełni je mediem z butelki źródłowej mediów.
  3. Przygotuj odpowiednią liczbę mikronośników w stożkowych rurkach o pojemności 15 mL, po jednym dla każdego warunku.
    UWAGA: Liczba mikronośników, łączna powierzchnia i gęstość siewów komórek zależą od Twojego zastosowania. W tym protokole zaleca się wstrzyknięcie bezwzględnej liczby mikronośników, co daje 75cm2 dostępnej powierzchni wzrostu mikronośników dla porównania z kolbą T75.
  4. Pozwól mikronośnikom osiąść w tubie; Aspiruj jak najwięcej supernatantu bez usuwania mikronośników, aby zrobić miejsce na komórki i świeże media.

3. Iniekcja komórek i mikronośników

  1. Upewnij się, że funkcje autoprime i kalibracji zostały pomyślnie zakończone.
  2. Klikaj przez okno oprogramowania, jakby reaktor był zaszczepiany zgodnie ze standardowym workflow z ogniwami zawiesinowymi.
  3. Wpisz notatkę w oknie wyskakującym wskazującą, że na tym etapie nie doszło do wstrzyknięcia komórek.
  4. Włącz manualne operacje, aby wstrzymać mieszanie reaktora i dodaj biały zacisk C do przewodów stojaków butelkowych.
  5. Usuń każdy materiał zużywalny i przenieś go do BSC. Wyjmij zużyte medium z butelek z odpadów i perfuzji i wyrzuć je.
    1. Upewnij się, że usuwasz wszystkie odpady z dużej butelki perfuzyjnej oraz z mniejszej probówki 1,5 mL zawartej w butelce, jeśli planujesz pobierać podłoże kondycjonowane w dowolnym momencie badania.
  6. Usuń podłoże wzrostu bez surowicy z butelki L i wyrzuć go. Przepłucz butelkę L z ~20 mL sterylnego PBS i wyrzuć. Dodaj 25 ml podłoża wzrostu uzupełnionego surowicą do butelki L.
  7. Zwróć materiały jednorazowe do odpowiednich POD-ów. Butelki z nośnikiem na czas trwania eksperymentu zamrożone na resztę eksperymentu. Odświeżaj lód codziennie.
    UWAGA: Mokry lód można uzupełnić paczunkami zamrażającymi, aby wydłużyć czas kontroli temperatury.
  8. Płucz reaktory PBS i przepłukaj przewody.
    1. Kliknij przycisk Płucz butelki , włącz przycisk Radio dla Butelki L, wybierz Wyjście do Odpadów, a następnie kliknij Start Flush MSCserum.
      UWAGA: To przepłuka nowo dodane media hMSC przez linię, aby zapewnić, że do reaktora nie dostanie się więcej medium nieuzupełniającego FBS.
    2. Kliknij ponownie przycisk Spłucz butelki , wybierz przycisk Radio dla Bottle RR i zacznij spłukiwać. To przepłuka płyn antyadherencyjny przez linię i zapewni jej przygotowanie do wejścia do reaktora.
    3. W oknie Zawartość butelki wskaż w oprogramowaniu, że MSCserum znajduje się w Butelce R, która faktycznie zawiera PBS.
    4. Przejdź do obsługi manualnej i wykonaj trzy cykle wyrzucania i mycia na butle na odpady.
  9. Dodaj do reaktora roztwór antyadherencyjny.
    1. Wróć do okna Zawartość butelki i wskaz, że MSCserum znajduje się w Bottle RR, który faktycznie zawiera płyn antyadherencyjny.
    2. Przejdź do obsługi manualnej i wykonaj jeden cykl wyrzucania i mycia na butle na odpady.
      UWAGA: Poprzednie mycie PBS miało zapobiec zakłóceniom komponentów DMEM z myciem antyadherencyjnym; teraz reaktor powinien być wypełniony płynem antyadherencyjnym z śladowym PBS.
  10. Po upływie 30 minut obecności roztworu przeciwprzywierającego, przepłucz produkt spożywczy za pomocą PBS.
    1. W oknie Zawartość butelki wskaż w oprogramowaniu, że MSCserum znajduje się w Butelce R, która faktycznie zawiera PBS.
    2. Przejdź do obsługi manualnej i wykonaj trzy cykle wyrzucania i mycia na butle na odpady.
    3. Wróć do okna Zawartość butelki i zaznacz w oprogramowaniu, że MSCserum znajduje się w Butelce L, która zawiera nośniki hMSC.
  11. Opróżnić reaktor, aby oczekiwać na wtrysk komórki i mikronośników. W panelu manualnych operacji kliknij "Ponowne inoinokulacja " i zostaw system na etapie, gdzie panel wskazuje na zaszczepienie reaktora.
    UWAGA: Tutaj termin inokulować oznacza po prostu wstrzyknięcie komórek przeznaczonych do ekspansji w mikrobioreaktorze.
  12. Dodaj dodatkowe rezystory, aby modulować prędkość miksowania zgodnie z domyślnym rezystorem R0.
  13. Wyjmij komórki z kolby i policz je na hemocytometrze. Wszystkie operacje otwarte wykonuj w BSC, aby zapewnić sterylność.
    1. Wssaj podłoże, a następnie myj 5-10 ml podgrzanego PBS. Aspiruj PBS i dodaj 5 ml trypsyny + EDTA do kolby.
    2. Inkubuj w temperaturze 37 °C przez 5 minut lub do momentu, aż wszystkie komórki wyraźnie oderwą się od powierzchni kolby.
    3. Dodaj 10 ml podgrzanego medium hMSC, aby zneutralizować aktywność trypsyny. Wyjmij zawartość płynu i umieść ją w rurce wirówki o pojemności 15 mL.
    4. Wiruj ogniwa w 300 x g przez 5 minut. Usuń supernatant i ponownie zawiesij granulkę komórkową w odpowiedniej objętości nośnika hMSC do liczenia. Dla w pełni zbiegającej kolby T75 odpowiednia objętość wynosi zazwyczaj 2-4 mL, co daje stężenie komórek ~1-2E6 na mL.
    5. Wymieszaj próbkę komórek zawieszonych z równą dawką barwnika żywotności Trypan Blue i załaduj mieszankę do hemocytometru do liczenia. Policz komórki zgodnie z instrukcjami producenta.
  14. Oblicz objętość roztworu komórkowego potrzebną do osiągnięcia 150 000 komórek i podaj tę ilość pipetą do oczekującej stożkowej rurki o pojemności 15 mL zawierającej mikronośniki dla każdego warunku. Uzupełnij objętość w tubie do 2,2–2,5 mL świeżym, ciepłym medium hMSC.
    UWAGA: Objętość każdego stożkowego zbiornika 15 mL powinna być nieco większa niż 2 mL, tak aby wtrysk spowodował lekko przepełniony reaktor, aby uniknąć powstawania pęcherzyków, które zostaną wyrównane w późniejszym etapie.
  15. Dodaj odpowiednią objętość komórek do kontroli kolby T75.
  16. Pracując z jednym lub dwoma przedmiotami eksploatacyjnymi naraz, usuń je z POD i wprowadź je do BSC.
  17. Wyjmij komórki i mikronośniki do strzykawki 5 mL za pomocą zielonych 4-calowych igieł. Wstrzyknij komórki i mikronośniki do reaktora.
  18. Zwróć materiał zużywalny do stacji bazowej i powtarzaj to, aż wszystkie materiały zostaną wstrzyknięte.
  19. Kliknij przez okna oprogramowania , aby potwierdzić, że szczepienie zostało przeprowadzone. Gdy oprogramowanie wróci do normalnej strony głównej, usuń biały zacisk z linii wyjściowych do zużycia materiału.
  20. Wejdź w operacje manualne i wykonaj funkcję Eject Excess z portem wyjściowym ustawionym na P dla perfuzji. Włącz statyczny tryb miksowania, używając 1680 s włączonych i 120 s wyłączonych. Utrzymuj częstotliwość miksowania na 5 Hz dla statycznego miksowania.
  21. Wyłącz pomiar referencyjnej gęstości optycznej.
    1. Otwórz klienta MBS i kliknij Połącz. Wprowadź następujące polecenie zawarte w cudzysłowie: "dmem_write 0,1,2,3 F_measure_ODref_skip 1"
    2. Kliknij Wyślij, poczekaj na potwierdzenie, że polecenie zostało pomyślnie wysłane, i zamknij klienta MBS.
  22. Po 24 godzinach wyłącz statyczny tryb miksowania i ponownie włącz normalne miksowanie. Zmniejsz częstotliwość mieszania do 1,5 Hz.

4. Działanie mikrobioreaktora

  1. Codziennie monitoruj mikrobioreaktor, aby upewnić się, że żadne problemy nie zakłócą eksperymentu. Upewnij się, że butelki z nośnikiem zawierają >5 mL medium, aby skutecznie perfuzować reaktor bez problemów.
  2. Wymieniaj wiadra na lód w razie potrzeby, aby utrzymać kontrolę temperatury w butelce z nośnikiem mediów. Zachowaj osłonę ochronną przed światłem na przodzie mikrobioreaktora, aby zapobiec rozkładowi lotnych komponentów ośrodka przez światło.
  3. Upewnij się, że do reaktora nie zostaną wprowadzone pęcherzyki. Nie zapomnij okresowo zmieniać nośników w sterowaniu TCPS.

5. Zbieranie mikroreaktorów

  1. Upewnij się, że BSC jest sterylny i gotowy do działania.
    1. Podgrzej następujące niezbędne odczynniki w kulce lub kąpieli wodnej do 37 °C: ~25 mL ciepłego medium hMSC, 10 mL ciepłego PBS oraz 1,5 mL pronazy 10 mg/mL potrzebnej do zbioru.
  2. Przygotuj stojak na butelki do zbiorów.
    1. Włącz tryb manualnej operacji dla każdego POD-a w oprogramowaniu.
    2. Zaciskaj linie wejściowe do używania białego zacisku C wzdłuż przezroczystej części przewodu.
    3. Usuń materiały eksploatacyjne do BSC. Wyjmij zawartość butelki na odpady i wyrzuć ją.
    4. Przepłucz butelkę na odpady ~20 mL PBS i wyrzuć. Oceń pozostałą objętość w butelce z mediów i w razie potrzeby uzupełnij świeżą (zimną) warstwę hMSC.
      UWAGA: Tutaj do ukończenia trzech niezbędnych cykli wyrzucania i płukania potrzebne jest > 4 mL materiału.
    5. Wyłóż butelkę na odpady ~5 mL zimnego materiału hMSC, aby amortyzować pobrany płyn.
  3. Pobierz komórki z mikrobioreaktora.
    1. Używając strzykawki o pojemności 1 mL, wciągnij do niej 200 μL Pronazy 10 mg/mL oraz ~300-400 μL powietrza.
    2. Odkręć boczną korek linii wtryskowej i spryskaj złącze zaworu bezigłowego 70% etanolem. Zdejmij taśmę zabezpieczającą zawiązaną boczną linię wtryskową i rozwiąż węzeł. Odpiąć białą zacisk w krople łzy.
    3. Podłącz strzykawkę o pojemności 1 ml i delikatnie wstrzykni Pronazę do reaktora. Ciecz przesuwaj powietrzem wzdłuż linii wtryskowej, aby upewnić się, że cała zawartość cieczy trafi do reaktora.
    4. Ponownie zacznij zacisk w kształcie łezki i ponownie zakręć boczną linię wtryskową. Zwróć materiał zużywalny do POD, podłącz wszystkie przewody, zdejmij biały zacisk C i kontynuuj mieszanie.
    5. Upewnij się, że butelka na odpady i butelka z nośnikiem są przechowywane na lodzie. Uruchom 5-minutowy timer i pozwól Pronazie trawić mikronośniki w reaktorze.
    6. Po 5 minutach sprawdź, czy mikronośniki się nie rozpadły, potwierdzając, że nie są już widoczne w reaktorze. Jeśli mikronośniki są nadal widoczne, daj sobie dodatkową minutę na trawienie. Jeśli mikronośniki nie są widoczne, kontynuuj.
    7. Zbieraj komórki. Włącz tryb manualnych operacji, ustaw # cykli na 3, a port wyjściowy na W dla marnowania i kliknij Eject Wash.
    8. Po zakończeniu cykli płukania wyrzucanego należy wyjmiać materiał zużywalny z powrotem do BSC i wyjmiać zawartość butelki odpadowej za pomocą strzykawki 10- lub 20 mL.
    9. Zawartość butelki odpadów należy wydać do stożkowej rurki wirówki o pojemności 15 mL. Wiruj komórki w 300 x g przez 5 minut, zasysaj supernatant i oceń rozmiar pelletu komórkowego.
    10. Ponownie zawiesij osad komórki w 1-5 mL pożywki wzrostu lub PBS i policz komórki na hemocytometrze. Powtórz ten krok dla wszystkich przedmiotów jednorazowego.
  4. Pobieraj warunki z kolby, stosując standardowe protokoły hodowli komórek. Typowy protokół dla MSC opisany jest w wersji 3.13.

6. Analizować komórki z warunków mikrobioreaktora i kolb do dalszych zastosowań

UWAGA: Metody analityczne użyte do uzyskania wyróżnionych wyników przedstawiono poniżej w skrócie i szczegółowo opisane w Krupczak, Farruggio i Van Vliet (2024)20.

  1. Kontrola środowiska: Korzystaj z graficznego interfejsu użytkownika udostępnionego przez mikrobioreaktor, aby uzyskać dostęp i wyświetlić dane z każdego zintegrowanego czujnika materiału eksploatacyjnego podczas okresu hodowli. Dane te są dostępne w oprogramowaniu Breez Explorer, które jest instalowane w laptopie dołączonym do mikrobioreaktora.
  2. Plon komórek: Zbieraj MSC zgodnie z opisaniem powyżej i wypuszczaj je w granulach 300 x g przez 5 minut. Ostrożnie usuń supernatant i dokładnie ponownie zawiesij osad komórkowy w odpowiedniej objętości nośnika PBS lub hMSC (1-2 mL). Weź próbkę mieszanki zawieszonej na komórki i wymieszaj z równą objętością barwnika Trypan Blue. Mikropipetować zabarwioną mieszankę próbek do układu hemocytometru i mierzyć liczbę komórek oraz żywotność na automatycznym lub manualnym hemocytomerze.
  3. Sprawdź ekspresję genów za pomocą dwuetapowej odwrotnej transkrypcji ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy, jak opisano poniżej.
    1. Oczyszczanie RNA: Użyj zestawu RNeasy Mini, aby izolować i oczyszczać RNA z każdej próbki, zgodnie z instrukcjami producenta. Krótko mówiąc, przelizuj komórki, przenieś zawartość komórkową do probówki spinowej oczyszczającej i przemyj próbki każdym buforem, aby usunąć niepotrzebne składniki komórkowe, kwasy nukleinowe i białka, które mogłyby zakłócać późniejsze PCR.
    2. konwersja cDNA: Użyj zestawu do transkrypcji odwrotnej o dużej pojemności oraz cyklera termicznego, aby przekształcić oczyszczone RNA w DNA komplementarne (cDNA) zgodnie z instrukcjami producenta. Krótko mówiąc, rozmroź komponenty zestawu i stwórz master mix, łącząc składniki w odpowiednich objętościach dla liczby próbek. Do każdego dołku płyty PCR należy załadować równe części oczyszczonego RNA i przygotowanej mieszanki głównej (po 10 μL każda), dbając o śledzenie lokalizacji tożsamości każdej próbki. Należy postępować zgodnie z protokołem producenta w cyklerze termicznym, aby zakończyć reakcję transkrypcji odwrotnej.
    3. qPCR: Używając primerów rozpinających ekson, specyficznych dla sekwencji, zweryfikowanych w celu uniknięcia dimera primeru, załaduj płytkę qPCR z 384 dołkami z podkładem przednim, odwrotnym primerem, szablonem cDNA, wodą wolną od nukleazy oraz mieszanką główną w odpowiednich objętościach (zazwyczaj odpowiednio 1 μL, 1 μL, 1 μL, 7 μL, 10 μL) z wykorzystaniem wielu technicznych dołków replikacyjnych dla każdego genu i próbki. Rozłóż zawartość na kilka płytek, jeśli to konieczne, aby uchwycić wszystkie cele genów. Upewnij się, że wszystkie próbki dla konkretnego celu genu są ładowane na tę samą płytkę, aby uniknąć zmienności wyników między płytami, oraz że każda płytka ma odpowiedni gen do zarządzania i kontrolę bez szablonów. Zmierz intensywność fluorescencji na odpowiedniej maszynie qPCR i użyj metody ΔΔCt do ilościowania względnego, aby obliczyć ekspresję genów.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikrobioreaktor umożliwił monitorowanie i regulację czynników środowiskowych przez około 10 dni w hodowli. Czynniki środowiskowe, takie jak pH (rysunek 2A), temperatura (rysunek 2B), rozpuszczony tlen (rysunek 2C) oraz dwutlenek węgla (rysunek 2D), były precyzyjnie mierzone i utrzymywane w warunkach mikrobioreaktora, ale nie w warunkach kolb, podczas okresu hodowli. Dane...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym protokole opisano metodę rozszerzania, przybierania i pozyskiwania komórek przy użyciu podejścia mikronośnik-mikrobioreaktor. Proces ten umożliwia komórkom zależnym od kotwiczenia, takim jak MSC, zwiększanie liczby komórek pod wyższą biochemiczną kontrolą platformy bioreaktorowej (w porównaniu do konwencjonalnych kolb TCPS) na poziomie laboratoryjnym, odpowiednim do szybkiego rozwoju procesu. Ponadto wykazano, że produkcja MSC przez mikronośniki-mikrobioreaktory skutkuje fenotypem komórek z premedytacją, który może...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy ujawniają umowę o współpracy z producentem mikrobioreaktorów, firmą MilliporeSigma.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy ośrodkowi Genomics Core (Weill Cornell Medicine) za konsultacje dotyczące analizy qPCR i rozwiązywania problemów. Z wdzięcznością dziękujemy Evanowi Gatesowi i Ericu Shiue (MilliporeSigma) w zakresie wsparcia technicznego dla mikrobioreaktora.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Roztwór antyadhezyjne do płukaniaTechnologie komórek mamiennych7010
Szafka bezpieczeństwa biologicznego
Mikrobioreaktor BreezMilliporeSigma
Wirówka
Lampa stożkowa, 15 mL
Lampa stożkowa, 50 mL
Dulbecco's Modified Eagle Medium, niskoglukozowyGibco11885084
Etanol
Serum bydlęce płodoweGibcoA5670701
Hemocytometr
Taśma laboratoryjna
Mikronośniki
Rurka mikrowirówkowa, 1,5 mL
Mikroskop
Iglica,, 4", 18 gaugeAmazonB0D663ZR6D
Fosforanowa sól fizjologicznaCorning21-040-CM
Pronaza, od Streptomyces griseusMilliporeSigma10165921001
Pipetka serologiczna, 10 mLVWR75816-100
Sterylna woda dejonizowana
Filtr strzykawki, 0,22 um, sterylnyProdukty naukowe Celltreat229762
Strzykawka, 1 mLBD309628
Strzykawka, 20 mLBD302830
Strzykawka, 5 mLBD309646
Strzykawka, 50 mLBD309653
Kolba polistyrenowa do hodowli tkankowej, T75Thermo Fisher Scientific130190
Trypan BlueSigmaAldrichT8154-100ML

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sin, W. X., et al. A high-density microfluidic bioreactor for the automated manufacturing of CAR T cells. Nat Biomed Eng. 8 (12), 1571-1591 (2024).
  2. US Food and Drug Administration. FDA Approves First Mesenchymal Stromal Cell Therapy to Treat Steroid-refractory Acute Graft-versus-host Disease. , (2024).
  3. Thompson, B. T., Chambers, R. C., Liu, K. D. Acute Respiratory Distress Syndrome. N Engl J Med. 377 (6), 562-572 (2017).
  4. Torres Acosta, M. A., Singer, B. D. Pathogenesis of COVID-19-induced ARDS: implications for an ageing population. Eur Respir J. 56 (3), 200249(2020).
  5. Matthay, M. A., et al. Acute respiratory distress syndrome. Nat Rev Dis Primers. 5 (1), 18(2019).
  6. Kidd, S., et al. Direct evidence of mesenchymal stem cell tropism for tumor and wounding microenvironments using in vivo bioluminescent imaging. Stem Cells. 27 (10), 2614-2623 (2009).
  7. Gnecchi, M., et al. Evidence supporting paracrine hypothesis for Akt-modified mesenchymal stem cell-mediated cardiac protection and functional improvement. FASEB J. 20 (6), 661-669 (2006).
  8. Doron, G., Temenoff, J. S. Culture Substrates for Improved Manufacture of Mesenchymal Stromal Cell Therapies. Adv Healthc Mater. 10 (15), e2100016(2021).
  9. Noronha, N. C., et al. Priming approaches to improve the efficacy of mesenchymal stromal cell-based therapies. Stem Cell Res Ther. 10 (1), 131(2019).
  10. Hezam, K., et al. Superior protective effects of PGE2 priming mesenchymal stem cells against LPS-induced acute lung injury (ALI) through macrophage immunomodulation. Stem Cell Res Ther. 14 (1), 48(2023).
  11. Zhang, X., et al. Mesenchymal stromal cells alleviate acute respiratory distress syndrome through the cholinergic anti-inflammatory pathway. Signal Transduct Target Ther. 7 (1), 307(2022).
  12. Full Prescribing Information - Ryoncil. , https://www.ryoncil.com/pdfs/prescribing-information.pdf (2024).
  13. Kumar, A., Starly, B. Large scale industrialized cell expansion: producing the critical raw material for biofabrication processes. Biofabrication. 7 (4), 044103(2015).
  14. Rennerfeldt, D. A., Raminhos, J. S., Leff, S. M., Manning, P., Van Vliet, K. J. Emergent heterogeneity in putative mesenchymal stem cell colonies: Single-cell time lapsed analysis. PLoS One. 14 (4), e0213452(2019).
  15. Mets, T., Verdonk, G. In Vitro Aging of Human Bone Marrow Derived Stromal Cells. Mech Ageing Dev. 16, 81-89 (1981).
  16. Colter, D. C., Sekiya, I., Prockop, D. J. Identification of a subpopulation of rapidly self-renewing and multipotential adult stem cells in colonies of human marrow stromal cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (14), 7841-7845 (2001).
  17. Tremain, N., et al. MicroSAGE Analysis of 2,353 Expressed Genes in a Single Cell-Derived Colony of Undifferentiated Human Mesenchymal Stem Cells Reveals mRNAs of Multiple Lineages. Stem Cells. 19 (5), 408-418 (2001).
  18. Klein, S. G., et al. A prevalent neglect of environmental control in mammalian cell culture calls for best practices. Nat Biomed Eng. 5 (8), 787-792 (2021).
  19. Bellani, C. F., et al. Scale-Up Technologies for the Manufacture of Adherent Cells. Front Nutr. 7, 575146(2020).
  20. Krupczak, B., Farruggio, C., Van Vliet, K. J. Manufacturing mesenchymal stromal cells in a microcarrier-microbioreactor platform can enhance cell yield and quality attributes: case study for acute respiratory distress syndrome. J Transl Med. 22 (1), 614(2024).
  21. Ng, E. X., et al. Dissolvable Gelatin-Based Microcarriers Generated through Droplet Microfluidics for Expansion and Culture of Mesenchymal Stromal Cells. Biotechnol J. 16 (3), e2000048(2021).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Microbioreactor ProductionMesenchymal Stromal CellsAnchorage Dependent CellsCell Therapy ManufacturingGelatin MicrocarriersAcute Respiratory DistressEnvironmental MonitoringCell HarvestingCell Quality ControlBiochemical Environment Control

Related Articles