Regulacja przejścia nabłonkowo-mezenchymalnego w raku jajnika przez LncRNA MALAT1 przez SNAI2 i MiR-200c-3p

Podsumowanie

Protokół ten opisuje metody oceny roli MALAT1 w promowaniu przejścia nabłonkowo-mezenchymalnego w nabłonkowym raku jajnika poprzez jego regulację osi miR-200c-3p/SNAI2.

Streszczenie

Długie, niekodujące RNA MALAT1 reguluje przejście nabłonkowo-mezenchymalne (EMT) i przerzuty w nabłonkowym raku jajnika (EOC) poprzez konkurencyjny mechanizm endogennego RNA (ceRNA) obejmujący modulację miRNA. Badanie to miało na celu wyjaśnienie szlaku molekularnego, za pomocą którego MALAT1 wpływa na EMT i zachowanie przerzutowe poprzez interakcję z miR-200c-3p i SNAI2. Ekspresja MALAT1 była genetycznie manipulowana w linii komórkowej EOC SK-OV-3 przez nadekspresję lub knockdown. Wpływ funkcjonalny na poziomy białek związanych z EMT, migrację komórek i inwazję oceniano odpowiednio za pomocą testów Western blot, gojenia się ran i Transwell. Analiza bioinformatyczna zidentyfikowała miR-200c-3p jako częsty cel MALAT1 i SNAI2. Oś MALAT1/miR-200c-3p/SNAI2 została następnie zwalidowana za pomocą testów reporterowych z podwójną lucyferazy i barwienia immunofluorescencyjnego w celu potwierdzenia bezpośrednich interakcji molekularnych. Nadekspresja MALAT1 zwiększyła migrację komórek SK-OV-3 o 20% i inwazję o 5%, czemu towarzyszył znaczny wzrost ekspresji SNAI2 (P < 0,01). I odwrotnie, knockdown MALAT1 stłumił te fenotypy. Testy podwójnej lucyferazy potwierdziły, że miR-200c-3p bezpośrednio wiąże się zarówno z MALAT1 , jak i SNAI2 (P < 0,001). Nadekspresja miR-200c-3p zmniejszyła EMT napędzany przez MALAT1 poprzez obniżenie SNAI2 (P < 0,05), podczas gdy przywrócenie SNAI2 odwróciło hamujące działanie wyciszania MALAT1 na przerzuty. Protokół ten pokazuje, że MALAT1 promuje EMT i przerzuty do EOC, działając jako ceRNA, które sekwestruje miR-200c-3p, prowadząc do derepresji SNAI2. Odkrycia dostarczają nowych informacji mechanistycznych i identyfikują oś MALAT1/miR-200c-3p/SNAI2 jako potencjalny cel terapeutyczny w celu zahamowania przerzutów raka jajnika.

Wprowadzenie

Rak jajnika (OvCa) jest wysoce podstępnym i późno zdiagnozowanym nowotworem złośliwym. Zwykle postępuje bezobjawowo, aż do osiągnięcia późniejszych etapów, charakteryzujących się agresywnym wzrostem głównie w obrębie jamy otrzewnej. Ten patologiczny proces zwykle objawia się wodobrzuszem, zmniejszoną reakcją terapeutyczną i złym rokowaniem¹. Statystyki epidemiologiczne z 2018 r. ujawniły około 295 000 nowo zdiagnozowanych przypadków na całym świecie, z 185 000 przypadków śmiertelności, co odzwierciedla utrzymującą się trajektorię wzrostu obciążenia chorobą². Chociaż nowoczesne protokoły leczenia obejmują interwencję chirurgiczną i schematy farmakologiczne, utrzymujące się ograniczenia we wczesnym wykrywaniu w połączeniu z przerzutami i opornością na leczenie utrzymują długoterminowe wskaźniki przeżycia poniżej 45%³. Nawrót w ciągu 12-18 miesięcy jest często obserwowany u wielu pacjentów z zaawansowaną chorobą⁴. Te realia kliniczne podkreślają pilną potrzebę identyfikacji klinicznie istotnych markerów diagnostycznych i strategii monitorowania terapeutycznego. Dlatego jest cenny dla identyfikacji klinicznie istotnych markerów diagnostycznych.

Obecnie naukowcy odkryli, że znaczna część ludzkiego genomu generuje długie, niekodujące RNA (lncRNA)⁵. LncRNA nie kodują białek, występują wyłącznie w postaci RNA i pełnią role regulacyjne w różnych funkcjach biologicznych komórek. LncRNA wykazują brak konserwacji i wykazują wysoce specyficzne tkankowo wzorce ekspresji⁶. Warto zauważyć, że specyficzną nadekspresję lncRNA zaobserwowano w wielu tkankach nowotworowych⁷. Konkurencyjny mechanizm endogennego RNA (ceRNA) ujawnił nowy sposób interakcji RNA. Powszechnie wiadomo, że mikroRNA (miRNA) mogą wyciszać geny poprzez specyficzne dla sekwencji interakcje z regionami 3'nieulegającymi translacji (UTR) mRNA. Tymczasem niekodujące RNA (ncRNA) mogą konkurencyjnie wiązać się z miRNA, utrudniając w ten sposób ich zdolność do przyłączania się do docelowych genów i wpływając na ekspresję genów⁸. Mechanizm ceRNA jest obecnie najszerzej akceptowaną hipotezą dotyczącą regulacyjnej roli lncRNA. Trójstronny przesłuch między kodującymi transkryptami, miRNA i regulatorowymi RNA konstruuje skomplikowane sieci molekularne, które wpływają na inicjację i progresję nowotworu⁹.

Po raz pierwszy zidentyfikowany w przerzutach do niedrobnokomórkowego raka płuca, MALAT1 pojawił się jako szeroko eksprymowany lncRNA w wielu nowotworach złośliwych¹⁰. W naszych poprzednich badaniach zidentyfikowaliśmy zwiększoną ekspresję MALAT1 w tkankach OvCa, która bezpośrednio wiąże się z stadium OvCa¹¹. Tutaj przedstawiamy protokół genetycznej modulacji ekspresji MALAT1 w nabłonkowej linii komórkowej OvCa (EOC) SK-OV-3 i oceniamy jego wpływ na ekspresję białek związanych z przejściem nabłonkowo-mezenchymalnym (EMT), zdolność migracyjną i potencjał inwazyjny za pomocą testów molekularnych, takich jak qPCR, western blotting, testy reporterowe podwójnej lucyferazy i testy funkcjonalne, takie jak testy gojenia się ran i testy Transwell. Celem jest wyjaśnienie mechanizmu molekularnego, za pomocą którego MALAT1 reguluje EMT i rozsiewanie przerzutów w EOC poprzez interakcje z miR-200c-3p i SNAI2.

Istniejące metody badania oddziaływań lncRNA-miRNA często wykorzystują same narzędzia do przewidywania in silico , które mogą nie mieć walidacji eksperymentalnej. W przypadku badań nad regulacją EMT tradycyjne metody histologiczne mogą nie dostarczać szczegółowych informacji molekularnych. Stosując testy reporterowe z podwójną lucyferazy do walidacji eksperymentalnej, nasze badanie pokonuje te ograniczenia, oferując bardziej wiarygodne potwierdzenie przewidywanych interakcji. Co więcej, połączenie wielu testów funkcjonalnych, takich jak testy scratch i Transwell, wraz z technikami molekularnymi, umożliwia kompleksowe zrozumienie EMT zarówno na poziomie komórkowym, jak i molekularnym, przewyższając głębię zapewnianą przez podejścia oparte na pojedynczym teście.

Protokół

Hodowla komórkowa i transfekcja

Ludzka linia komórkowa OvCa SK-OV-3 była hodowana w standardowych warunkach. Komórki utrzymywano w pożywce hodowlanej zawierającej 89% 5A McCoya, 10% płodowej surowicy bydlęcej i 1% roztworu penicyliny i streptomycyny, w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ . Pożywkę wymieniano co 2-3 dni, a komórki pasażowano po osiągnięciu 80-90% konfluencji przy użyciu 0,25% trypsyny-EDTA. Konstrukty lentiwirusowe dla nadekspresji MALAT1 i knockdownu MALAT1 (shRNA), a także mimików, inhibitorów i kontroli negatywnych miR-200c-3p, wraz z siRNA ukierunkowanym na SNAI2 i odpowiadającym mu kontrolnym siRNA, uzyskano ze źródeł komercyjnych. W celu transfekcji komórki SK-OV-3 wysiewano na płytkach 24-dołkowych o gęstości 5 × 10⁴ komórek/basenik w 500 μl kompletnej pożywki i pozostawiono do przylegania na noc. Transfekcję wykonano przy użyciu odczynnika do transfekcji na bazie lipidów (RRID: AB_2548650) zgodnie z instrukcjami producenta. Krótko mówiąc, kwasy nukleinowe (miRNA naśladujące/inhibitory lub siRNA) i odczynnik do transfekcji na bazie lipidów rozcieńczano oddzielnie w pożywce o zredukowanej surowicy, inkubowano przez 5 minut, a następnie mieszano razem i inkubowano przez dodatkowe 15 minut w temperaturze pokojowej, aby umożliwić kompleksowanie. Kompleksy dodawano kroplami do komórek. Po 6 godzinach pożywkę zastąpiono świeżą, kompletną pożywką. Komórki pobrano 24-48 godzin po transfekcji w celu przeprowadzenia dalszych analiz.

Fluorescencyjny ilościowy PCR w czasie rzeczywistym (qPCR)

Całkowity RNA wyekstrahowano z hodowanych komórek SK-OV-3 za pomocą odczynnika do ekstrakcji RNA zgodnie z instrukcjami producenta. Krótko mówiąc, komórki poddano lizie w 1 ml odczynnika na dołek 6-dołkowej płytki, a RNA wyizolowano za pomocą komercyjnego zestawu do ekstrakcji RNA zgodnie z dostarczonym protokołem. Stężenie i czystość RNA określono za pomocą spektrofotometru, a próbki o stosunku A₂₆₀/A₂₈₀ między 1,8 a 2,0 wykorzystano do dalszych zastosowań. Odwrotną transkrypcję przeprowadzono przy użyciu RT Master Mix (RRID: SCR_018597) z 500 ng całkowitego RNA w objętości reakcji 20 μl. Warunki cykli termicznych były następujące: 37 °C przez 15 minut, a następnie 85 °C przez 5 s w celu dezaktywacji odwrotnej transkryptazy. Otrzymany cDNA przechowywano w temperaturze -20 °C do momentu użycia. Ilościowy PCR w czasie rzeczywistym przeprowadzono przy użyciu komercyjnego zestawu do wykrywania miRNA qRT-PCR na instrumencie do PCR w czasie rzeczywistym. Każdą reakcję przeprowadzono w objętości 20 μl zawierającej 10 μl 2x qPCR master mix, 1 μl specyficznych starterów (do przodu i do tyłu, 10 μM), 2 μl matrycy cDNA i 7 μl wody wolnej od RNaz. Warunki cykli termicznych wynosiły: 95 °C przez 10 minut, a następnie 40 cykli po 95 °C przez 10 s i 60 °C przez 30 s. Przeprowadzono analizę krzywej topnienia w celu sprawdzenia specyfiki produktu. Poziomy ekspresji obliczono metodą ΔΔCt, z GAPDH (dla mRNA) lub U6 (dla miRNA) jako kontrolą wewnętrzną. Wszystkie reakcje przeprowadzono w trzech egzemplarzach, a dane przedstawiono jako średnią ± SD.
UWAGA: Odczynnik do ekstrakcji RNA jest niebezpieczną substancją chemiczną. Należy się z nim obchodzić pod wyciągiem, ponieważ jest i może powodować podrażnienie skóry i oczu. Odpady zawierające odczynnik należy utylizować zgodnie z lokalnymi przepisami dotyczącymi utylizacji odpadów niebezpiecznych.

Test zarysowania

Komórki SK-OV-3 wysiewano na 24-dołkowe płytki o gęstości 5 × 10⁴ komórek/dołek i hodowano do momentu, aż osiągną około 90-100% konfluencji, tworząc jednolitą monowarstwę. Następnie użyto sterylnej końcówki pipety o pojemności 10 μl, aby utworzyć liniowe zadrapanie przez monowarstwę komórek w środku każdej studzienki. Aby zapewnić spójność, ten sam kąt i nacisk zostały zastosowane podczas tworzenia się zarysowania we wszystkich studzienkach. Po zadrapaniu dodano PBS w celu usunięcia oderwanych komórek za pomocą dwóch delikatnych płukań. Komórki następnie hodowano w pożywce McCoy's 5A bez surowicy, aby zminimalizować efekty proliferacji. Obrazy obszaru rysy zostały wykonane natychmiast (0 h) i ponownie po 24 h i 48 h za pomocą odwróconego mikroskopu przy 10-krotnym powiększeniu. Szerokość zadrapania w każdym punkcie czasowym została zmierzona za pomocą oprogramowania ImageJ, a procent zamknięcia rany w porównaniu z początkową szerokością wykorzystano do obliczenia szybkości migracji.

Test Transwell

Komórki SK-OV-3 wysiewano do górnych komór wkładek Transwell (górna komora zawiera 200 μl 1% kompletnej pożywki, dolna komora zawiera 1 ml 5% kompletnej pożywki) o gęstości 5 × 10³ komórek na wkładkę, inkubowane w temperaturze 37 °C, 5% nawilżone CO₂ przez 24 godziny przed dalszą analizą. Po inkubacji przez 24 godziny wkładki wyjęto i przemyto 3x PBS, a następnie utrwalono w 4% paraformaldehydzie (PFA) przez 15 min. Po umyciu PBS komórki barwiono 1% roztworem fioletu krystalicznego. Po barwieniu komórki przepłukano PBS i obserwowano pod odwróconym mikroskopem.
UWAGA: Fiołek krystaliczny jest plamą biologiczną i może być szkodliwy w przypadku spożycia lub kontaktu ze skórą. Należy obchodzić się z nim ostrożnie, a odpady należy utylizować w odpowiedni sposób, zgodnie z lokalnymi przepisami.

Test reporterowy z podwójną lucyferazy

Transfekowane komórki inkubuje się w standardowych warunkach hodowli (37 °C, 5% CO₂ wilgotne środowisko) przez 48 godzin przed lizą. Po 48 godzinach inkubacji komórki poddano lizie i odwirowano w temperaturze 5 000 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Porcję 50 μl supernatantu przeniesiono do 96-dołkowej płytki, a następnie sekwencyjnie dodano 100 μl odczynnika lucyferazy świetlika i 100 μl odczynnika lucyferazy Renilla do każdej studzienki. Aktywność lucyferazy świetlika i Renilla mierzono za pomocą systemu testów reporterowych podwójnej lucyferazy na luminometrze. Aktywność lucyferazy Renilla została znormalizowana do aktywności lucyferazy świetlika, aby uwzględnić różnice w wydajności transfekcji.

Test immunofluorescencyjny

Komórki SK-OV-3 utrwalono w 4% PFA przez 15 min w temperaturze pokojowej, a następnie przemyto 3x PBS. Aby zablokować niespecyficzne wiązanie, komórki inkubowano z 5% surowicą kozią w PBS przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Po zablokowaniu komórki inkubowano przez noc w temperaturze 4 °C z pierwszorzędowymi przeciwciałami przeciwko E-kadherynie (RRID: AB_2833860), N-kadherynie (RRID: AB_2837725) i wimentynie (RRID: AB_2835318), z których każdy rozcieńczono w stosunku 1:200. Następnego dnia komórki przemyto 3x PBS i inkubowano z odpowiednimi przeciwciałami drugorzędowymi sprzężonymi z fluoroforem [anty-mysie IgG-FITC (RRID: AB_2843438) i anty-królicze IgG-FITC (RRID: AB_2843439)] rozcieńczonymi w stosunku 1:500 przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C w ciemności.
UWAGA: Paraformaldehyd jest toksyczny i potencjalnie rakotwórczy. Należy obchodzić się z nim ostrożnie, nosząc odpowiednie środki ochrony osobistej (PPE), takie jak rękawice i okulary. Odpady zawierające PFA należy utylizować jako odpady niebezpieczne.

Analiza statystyczna

Do porównań między dwiema grupami zastosowano test t, a do porównań wielu grup zastosowano ANOVA. Dane przedstawiono jako średnią ± SD. Istotność statystyczną ustalono na poziomie *p < 0,05, **p < 0,01 i ***p < 0,001. Wszystkie eksperymenty przeprowadzono z trzema powtórzeniami biologicznymi (n = 3).

Wyniki

Zdolności migracyjne i inwazyjne komórek SK-OV-3 modulowane przez MALAT1

Schemat doświadczalny przedstawiono na Rysunku 1. Aby zbadać rolę MALAT1 w migracji i inwazji komórek OvCa, zmodyfikowano jego ekspresję w komórkach SK-OV-3. Po wyciszeniu MALAT1, analiza qPCR potwierdziła znaczące obniżenie poziomu MALAT1 (p < 0,...

Dyskusja

OvCa, piąty najczęstszy nowotwór ginekologiczny, pozostaje poważnym problemem dla zdrowia kobiet². Jednak większość przypadków jest identyfikowana w zaawansowanych stadiach, co znacznie ogranicza skuteczne opcje leczenia, powodując minimalną poprawę wskaźników całkowitego przeżycia¹². Przerzuty nowotworowe wyróżniają się jako główny czynnik przyczyniający się do śmiertelności pacjentów w EOC¹³. Pojawiające się dowody wskazują na to, że lncRNA i miRNA...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
0,22 &m; m Membrany PVDF	Beyotime	Zobacz materiał FFP32
Uniwersalny zestaw do wykrywania miRNA qRT-PCR	FulenGen	Zobacz materiał QP115
Albumina surowicy bydlęcej	Beyotime	Zobacz materiał ST025
Podłoże chemiluminescencyjne	Suzhou Haixing Bioscience Co., Ltd.	TCH-C335
Podłoże chemiluminescencyjne	Milipory	WBKLS0100
Zestaw do oznaczania genów z podwójnym reporterem lucyferazy	Beyotime powiedział:	Zobacz materiał RG027
Surowica bydlęca płodu	Suzhou Haixing Bioscience Co., Ltd.	FBP-C550
Kozia IgG IgG Przeciw Myszom FITC	Powinowactwo	Numer katalogowy S0007 powiedział:
Kozia IgG Anty-Królicza FITC	Powinowactwo	S0008 powiedział:
Lipofektamina 2500	Kanton Yingxin Biotechnologia Co., Ltd.	SJ-LIP-2500
lentiwirus interferencyjny MALAT1	SZANGHAJ GENECHEM Co., Sp. z o.o.	LV-MALAT1-sh
lentiwirus nadekspresji MALAT1	SZANGHAJ GENECHEM Co., Sp. z o.o.	LV-MALAT1-OE
McCoy's 5A	Suzhou Haixing Bioscience Co., Ltd.	GUMD-B305 powiedział:
miR-200c-3p naśladuje	SZANGHAJ GENECHEM Co., Sp. z o.o.	MIC-HAS-200C-3P
Wielofunkcyjny analizator immunoenzymatyczny	Perkin Elmer	Wizja 2100
Roztwór penicyliny i streptomycyny	Suzhou Haixing Bioscience Co., Ltd.	GUSA-R002 powiedział:
Koktajl inhibitorów fosfatazy	GSbioth	GS1439A
Przeciwciało pierwszorzędowe E-kadheryna	Powinowactwo	Zobacz materiał BF0219 powiedział:
Przeciwciało pierwszorzędowe N-kadheryna	Powinowactwo	AF5239 powiedział:
Przeciwciało pierwszorzędowe Vimentin	Powinowactwo	AF7013 powiedział:
PrimeScript RT Master Mix	Takara	Zobacz materiał RR036A
System wykrywania PCR w czasie rzeczywistym	Bio-Rad	Silnik CFX96
Wirówka z chłodzeniem	Eppendorf powiedział:	Zobacz materiał 5810R
Bufor do lizy RIPA	GSbioth	GS504A
SDS-żele poliakryloamidowe	Beyotime	P0012A
Przeciwciało drugorzędowe Kozioł Anty-Mysie IgG FITC	Powinowactwo	Numer katalogowy S0007 powiedział:
Przeciwciało drugorzędowe Kozioł Anty-Królicze IgG FITC	Powinowactwo	S0008 powiedział:
SNAI2 siRNA	Kanton Yingxin Biotechnologia Co., Ltd.	si-has-ślimak2 powiedział:
Baza danych StarBase	Uniwersytet Sun Yat-sena	http://starbase.sysu.edu.cn
Zestaw do oznaczania BCA	Dingguo Biotechnologia	Zobacz materiał BCA02
Inkubator do hodowli komórkowych	Heraeus (Heraeus)	Komórka Hera 150
System analizy obrazowej	Bio-Rad	ŻEL DOC 1000
Mikroskop odwrócony	Mshot powiedział:	MI152-N
Zestaw do ekstrakcji RNA	EKOLOGICZNY	EK-1328-50T
Odczynnik TRIzol	Kanton Yingxin Biotechnologia Co., Ltd.	T751379
Uniwersalny zasilacz do elektroforezy	Wixscientific	WIX-EP600