Trening klikerowy służy jako technika pozytywnego wzmocnienia dla myszoskoczków laboratoryjnych. Metoda ta ma na celu zmniejszenie stresu i poprawę wydajności obchodzenia się z nimi poprzez pozytywne wzmocnienie, przyczyniając się w ten sposób do dobrostanu zwierząt doświadczalnych.
Artykuł metodologiczny
Poprawa dobrostanu myszoskoczków poprzez pozytywny trening wzmacniający w środowiskach badawczych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Poprawa dobrostanu zwierząt laboratoryjnych poprzez minimalizację stresu i promowanie odpowiedniego dla gatunku postępowania jest głównym celem współczesnych badań biomedycznych na całym świecie. Trening klikerowy, powszechnie uznawana forma treningu pozytywnego wzmocnienia, wykorzystuje dźwięk kliknięcia jako warunkowy wzmacniacz, aby połączyć pożądane zachowanie i nagrodę, umożliwiając zwierzętom szybsze uczenie się i przy zmniejszonym stresie. Nasza grupa badawcza wykazała wcześniej, że trening klikerowy działa jako forma wzbogacenia poznawczego u myszy i szczurów. W niniejszym badaniu z powodzeniem dostosowaliśmy to podejście do szkolenia myszoskoczków mongolskich (Meriones unguiculatus), dostosowując protokół do specyficznych dla gatunku cech behawioralnych myszoskoczków. Kohorta 43 wsobnych myszoskoczków (27 samic i 16 samców) przeszła standaryzowany 10-dniowy protokół treningu klikerowego, podczas którego nauczyły się dobrowolnie zbliżać się i wchodzić w interakcje z ręką eksperymentatora w zamian za nagrodę w postaci jedzenia. Po okresie szkolenia zwierzęta poddano ocenom behawioralnym, w tym testowi otwartego pola i standaryzowanemu testowi interakcji międzyludzkiej, w celu oceny wpływu treningu na zachowania eksploracyjne i interakcję człowiek-zwierzę. Z naszych ustaleń wynika, że wdrożenie treningu klikerowego u myszoskoczków jest szybkie, skuteczne i dobrze tolerowane. Wyszkolone zwierzęta, zwłaszcza samice, wykazywały zwiększoną dobrowolną interakcję z ręką eksperymentatora i zmniejszone zachowania podobne do lęku. Wyniki te sugerują, że dostosowane do gatunku protokoły treningu klikerowego mogą ułatwić rozwój zaufania między eksperymentatorem a zwierzęciem, ostatecznie zmniejszając stres i poprawiając zarówno dobrostan zwierząt, jak i wiarygodność wyników eksperymentalnych.
Wprowadzenie
Udoskonalenie wykorzystania zwierząt w badaniach biomedycznych w celu zmniejszenia stresu i poprawy dobrostanu jest powszechnie uznawanym międzynarodowym celem1,2,3. W 2022 roku Komisja Europejska poinformowała, że spośród 838 539 zwierząt wykorzystanych w Unii Europejskiej (Alures), 3 440 to myszoskoczki4. W Niemczech w 2023 r. około 1,46 mln kręgowców i głowonogów wykorzystano w doświadczeniach na zwierzętach zgodnie z § 7 ust. 2 ustawy o dobrostanie zwierząt (TierSchG)5. W połączeniu ze zwierzętami uśmierconymi do celów naukowych, łączna liczba zwierząt laboratoryjnych wykorzystanych w Niemczech w 2023 roku osiągnęła około 2,1 miliona6. Liczby te podkreślają znaczenie wykorzystania myszoskoczków w badaniach biomedycznych, podkreślając potrzebę ciągłego doskonalenia protokołów dotyczących dobrostanu zwierząt.
Potrzeby behawioralne zwierząt laboratoryjnych oraz znaczenie strategii zarządzania, które wspierają dobrostan specyficzny dla gatunku, zostały powszechnie uznane za niezbędne dla praktyki etycznej i naukowej7. Interakcje między człowiekiem a zwierzęciem w hodowli często ograniczają się do podstawowego zadania, jakim jest przenoszenie zwierząt z brudnych do czystych klatek, bez wzmacniania więzi między opiekunem a zwierzęciem. Ten brak interakcji społecznych może prowadzić do stresu, który negatywnie wpływa na zachowanie i fizjologię zwierząt, ostatecznie wpływając na wyniki eksperymentów8. Niewłaściwe obchodzenie się z danymi jest dobrze znanym źródłem zmienności danych badawczych9. Na przykład podnoszenie myszy za ogon zwiększa niepokój i stres, podczas gdy metody tunelowe lub otwarte dłonie promują dobrowolne podejście i zmniejszają zachowania podobne do lęku10,11. Obchodzenie się z nim jest nawet stosowane jako standaryzowany ostry stresor w badaniach na małych ssakach ze względu na jego konsekwentny wpływ na markery fizjologiczne, takie jak poziom glukokortykosteroidów12. Wyniki te podkreślają istotny wpływ krótkich interakcji międzyludzkich i potrzebę udoskonalenia technik obsługi o niskim poziomie stresu13.
Udoskonalanie oparte na szkoleniu zyskuje coraz większe uznanie jako skuteczna metoda poprawy zarówno dobrostanu zwierząt, jak i jakości badań10,14. Jedną z najskuteczniejszych metod treningu stosowanych w badaniach na zwierzętach jest trening z klikerem, który często jest połączony z nagrodami w postaci jedzenia15,16. W ciągu ostatnich dziesięcioleci opublikowano 34 badania dotyczące treningu z klikerem, co odzwierciedla rosnące zainteresowanie naukowców tym podejściem do treningu17. Badania pokazują, że psy (47%) i konie (30%) są najczęściej szkolonymi zwierzętami laboratoryjnymi, a następnie koty, bydło, ryby, kozy i małpy (po 3%)17. Wyszkolone zwierzęta mogą dobrowolnie uczestniczyć w procedurach, zmniejszając stres i minimalizując potrzebę fizycznego przymusu18.
Protokoły pozytywnego wzmocnienia zostały również zastosowane w odniesieniu do małych ssaków. Ostatnie badania donoszą o udanym szkoleniu królików do procedur hodowlanych, a myszoskoczków do badań behawioralnych19,20. W niektórych poprzednich pracach wykazaliśmy, że myszy wyszkolone w klikerach wykazywały zwiększony kontakt z eksperymentatorami i mniej wskaźników behawioralnych związanych ze stresem, takich jak oddawanie moczu, defekacja, wokalizacja i zachowanie unoszące się21,22,23. Jest to zgodne z odkryciami z dziedziny weterynarii, gdzie wykazano, że szkolenie małych ssaków – takich jak króliki, gryzonie i fretki – zmniejsza reakcje strachu i ułatwia radzenie sobie z nimi za pomocą technik pozytywnego wzmacniania24. Warto zauważyć, że zaobserwowaliśmy również specyficzną dla płci różnicę w wydajności treningowej: samice myszy wykazywały większą motywację i wyższą częstotliwość odpowiedzi niż samce podczas sesji treningowych. Sugeruje to, że samice myszy mogą chętniej angażować się w dobrowolne zadania szkoleniowe w standardowych warunkach21.
Chociaż obiecujące, istniejące podejścia do szkolenia myszoskoczków są zazwyczaj związane z konkretnymi paradygmatami behawioralnymi i nie są przeznaczone do ogólnego użytku w codziennych procedurach hodowlanych25. Szeroko stosowany, ustandaryzowany protokół dla myszoskoczków mongolskich (Meriones unguiculatus) – niezależny od konkretnego układu doświadczalnego – nie został jeszcze ustalony. Aby wypełnić tę lukę, niniejsze badanie miało na celu opracowanie i walidację prostego protokołu szkolenia z użyciem klikera, dostosowanego do specyficznych dla gatunku cech myszoskoczków. Protokół koncentruje się na redukcji stresu poprzez delikatne obchodzenie się z nim i dobrowolne zaangażowanie eksperymentatora. Stawiamy hipotezę, że takie podejście poprawi dobrostan zwierząt, ustanowi bardziej spójne behawioralne punkty odniesienia i zwiększy wiarygodność wyników eksperymentalnych. Ze względu na swoją prostotę i elastyczność można go łatwo wdrożyć w szerokim zakresie warunków laboratoryjnych.
Aby ocenić skuteczność i możliwość zastosowania proponowanego protokołu treningowego, sformułowaliśmy następujące szczegółowe, testowalne prognozy:
Wytresowane myszoskoczki niezawodnie wykonywałyby docelowe zachowanie – dobrowolnie siadając na dłoni eksperymentatora – w ciągu 10-dniowego okresu treningu.
Wyszkolone zwierzęta wykazywałyby zwiększoną dobrowolną interakcję z eksperymentatorem w standardowym teście, w porównaniu z niewyszkolonymi zwierzętami kontrolnymi.
Wytresowane zwierzęta wykazywałyby wskaźniki behawioralne zgodne ze zmniejszonymi zachowaniami podobnymi do lęku, w szczególności poprzez spędzanie większej ilości czasu w środkowej strefie testu na otwartym polu.
Samice myszoskoczków mogą wykazywać silniejsze reakcje behawioralne na trening niż samce, co może odzwierciedlać różnice płci w adaptacji do interakcji międzyludzkich.
Przewidywania te posłużyły do zaprojektowania ocen behawioralnych i dostarczyły informacji na temat kryteriów oceny protokołu.
Protokół
Postępowanie z gerbilami oraz procedury eksperymentalne były prowadzone zgodnie z europejskimi, krajowymi i instytucjonalnymi wytycznymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami. Procedury zostały zatwierdzone przez lokalne organy nadzorcze na podstawie licencji G 21-1-100. Protokół obejmuje 10 dni treningu (od poniedziałku do piątku), z przerwami w weekendy (sobota i niedziela). Protokół można łatwo dostosować do konkretnych potrzeb. Wszystkie wymagane materiały są wymienione w Tabeli materiałów.
1. Przygotowanie zwierząt
- Pobrać wymaganą liczbę zwierząt z instytucjonalnej hodowli. Utrzymywać zwierzęta w 12-godzinnym cyklu światło/ciemność w otwartym systemie klatkowym.
- Odsadzić potomstwo w 5. tygodniu życia. Po odsadzeniu oznaczyć zwierzęta kolczykami w uszach i umieścić w grupach jednopłciowych po 2-3 osobniki w klatce.
- Hodować i utrzymywać wszystkie gerboły w klatkach typu 4 (590 x 380 x 200 mm; 1,815 m2). Wyposażyć każdą klatkę w co najmniej trzy tunele oraz drewno do gryzienia w celu wzbogacenia środowiska. Zapewnić dostęp do pożywienia i wody ad libitum (patrz Tabela materiałów).
- Losowo przydzielić zwierzęta do grup trenowanych (samice: n=27; samce: n=16) i nietrenowanych (samice: n=16; samce: n=5), aby zminimalizować błąd selekcji i zapewnić porównywalne warunki wyjściowe dla wszystkich grup badawczych. Oswoić zwierzęta zarówno z nagrodą pokarmową, jak i z ręką eksperymentatora w środowisku klatki hodowlanej, zgodnie z opisem w punkcie 2.2. protokołu. W momencie rozpoczęcia treningu zwierzęta (samice i samce) miały około 8 tygodni.
2. Oswajanie zwierząt
UWAGA: Jeśli gerbile nie były transportowane, czas habituacji może zostać skrócony. Graficzny przegląd protokołu przedstawiono na Rysunku 1. W przypadku zwierząt hodowanych wewnątrz placówki, okres habituacji dla osobników młodocianych może zostać drastycznie skrócony, jeśli zwierzęta rodzicielskie są dobrze habituowane, a habituacja z wykorzystaniem kontaktu ręcznego jest kontynuowana co najmniej raz w tygodniu od momentu, gdy młode stają się mobilne. Ta faza przygotowawcza ma na celu zmniejszenie neofobii i ustanowienie pozytywnego skojarzenia z podawaniem pokarmu, co zapewnia płynne przejście do treningu z użyciem klikera.
Rycina 1: Przegląd protokołu habituacji i treningu dla zwierząt pozyskanych z zewnątrz oraz hodowanych wewnętrznie: Na tej rycinie przedstawiono oś czasu i kluczowe kroki proceduralne protokołu habituacji i treningu stosowanego u gerbilów pozyskanych z zewnątrz oraz gerbilów hodowanych wewnętrznie. Protokół obejmuje wstępne oswajanie, habituację do pokarmu, wprowadzenie klikera oraz trening z klikerem, dostosowane do pochodzenia i wcześniejszej ekspozycji zwierząt. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
- Tydzień 1: Habituacja zwierząt pozyskanych z zewnątrz
- Po przyjeździe zakwaterować gerboły w grupach jednopłciowych po 2-3 zwierzęta na klatkę. Dodać materiał gniazdowy i ściółkę z pudełka transportowego wraz z niewielką ilością znanych granulek pokarmowych, aby wspomóc aklimatyzację.
- Wyposażyć każdą klatkę w co najmniej 3-4 tunele (np. tekturowe rurki lub plastikowe schronienia) i wysypać ściółkę na głębokość około 8-10 cm, aby umożliwić typowe dla tego gatunku zachowania kopania.
- Unikać podnoszenia gerbołów za ogon, ponieważ może to powodować stres i ryzyko urazu ogona26. Zamiast tego, w razie potrzeby, delikatnie przenosić zwierzęta, trzymając je w zagłębieniu dłoni (patrz Rycina 2A).
- Niezwłocznie rozpocząć habituację opartą na pokarmie, rozsypując ~5 g nasion dyni lub słonecznika w ściółce (patrz Tabela materiałów). Zachęca to do kopania i oswaja zwierzęta z nagrodą.
- Następnego dnia wprowadzić do klatki dłoń z ~10 nasionami nagrody na 2-3 min. Jeśli zwierzęta nie biorą nasion bezpośrednio, umieścić ~5 g nasion w ściółce.
- Powtarzać tę procedurę raz dziennie, aż zwierzęta zaczną brać pokarm z dłoni. Zazwyczaj zajmuje to około tygodnia. W przypadku wcześniejszego sukcesu przejść do treningu z klikerem (patrz krok 3).
- Podczas habituacji ocenić preferencje pokarmowe, oferując w dłoni różne rodzaje nasion i licząc pozostałe nasiona po 2-3 min.
UWAGA: Podawać pokarm w niewielkich porcjach wyłącznie jako nagrodę w celu wzmocnienia pożądanego zachowania. Należy upewnić się, że nagroda pokarmowa jest zgodna z wytycznymi żywieniowymi dla zwierząt laboratoryjnych. Choć w niniejszym protokole stosuje się nasiona dyni i słonecznika, można użyć innych odpowiednich nagród, o ile spełniają one wymogi higieniczne placówki. Dopuszczalne są również dostępne w handlu przysmaki przeznaczone dla zwierząt laboratoryjnych.
- Tydzień 1: Habituacja zwierząt hodowanych wewnątrz placówki
- Rozpocząć habituację do nagrody pokarmowej bezpośrednio w klatce hodowlanej, umieszczając ~5 g nasion dyni lub słonecznika w ściółce, zgodnie z opisem w kroku 2.1.3. Krok ten należy wprowadzić u pary hodowlanej przed porodem, aby oswoić je z nagrodą.
- Gdy zwierzęta hodowlane będą niezawodnie spożywać nasiona ze ściółki, oferować nagrodę z dłoni eksperymentatora zgodnie z procedurą opisaną w kroku 2.1.4. Pozwolić zwierzętom na eksplorację i dobrowolne przyjmowanie nagrody przez 2-3 min dziennie.
- Po urodzeniu młodych zawiesić habituację z dłoni na minimum 1 tydzień. W tym czasie nadal podawać nagrody pokarmowe bezpośrednio do ściółki w klatce 1-5 razy w tygodniu, aby utrzymać ekspozycję.
- Wznowić habituację z dłoni, gdy młode staną się mobilne (około 18-21 dnia po porodzie). Pozwolić zwierzętom eksplorować dłoń z nagrodą przez 2-3 min na sesję. Wspomaga to wczesne oswojenie potomstwa z kontekstem treningowym.
- W wieku 5 tygodni odsadzić młodociane osobniki i zakwaterować je w grupach jednopłciowych po 2-3 zwierzęta na klatkę. Kontynuować habituację, umieszczając nagrodę pokarmową w ściółce nowej klatki w dniu przeniesienia.
- W dniu następującym po odsadzeniu ponownie wprowadzić podawanie pokarmu z dłoni, jak opisano powyżej (kroki 2.1.4 i 2.1.5).
- Powtarzać tę procedurę raz dziennie, aż zwierzęta zaczną brać pokarm z dłoni.
- Gdy osobniki młodociane będą konsekwentnie przyjmować nagrodę z dłoni, przejść do protokołu treningowego (patrz krok 3). Zazwyczaj zajmuje to około 1 tygodnia. W przypadku wcześniejszego sukcesu przejść do treningu z klikerem (patrz krok 3).
Rysunek 2: Obchodzenie się z gerbilem i jego habituacja z wykorzystaniem pozytywnego wzmocnienia. (A) Chwytanie gerbila w zagłębionych dłoniach: Gerbil jest delikatnie nabierany obiema dłońmi ułożonymi w kształt miseczki, aby zminimalizować stres. (B) Rozpoczęcie treningu: Dłoń eksperymentatora jest umieszczona na dnie klatki z nagrodami w postaci pokarmu wewnątrz dłoni. Gerbil pobiera nagrodę, a klikacz jest używany do oznaczenia tego zachowania. (C) Gerbil dobrowolnie siada na dłoni eksperymentatora, co świadczy o pomyślnym przebiegu treningu. Nagroda pokarmowa jest widocznie umieszczona w dłoni. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
3. Trening z klikerem
UWAGA: Rozpocznij trening tylko wtedy, gdy gerbil przyjmuje pokarm z ręki eksperymentatora. W przeciwnym razie wydłuż fazę habituacji z pokarmem ponad czas opisany w kroku 2.1. lub 2.2.
- Przegląd szkolenia
- Przeprowadzać jedną sesję treningową dziennie dla każdego gerbila, trwającą 4 min. Trening należy przeprowadzać bezpośrednio w klatce domowej zwierzęcia, aby zredukować stres i zachować znane mu środowisko. Nie ma konieczności usuwania wszystkich elementów wzbogacających, jednak należy upewnić się, że w klatce pozostaje przynajmniej jedna rura lub tunel oraz że na dnie klatki jest wystarczająco dużo miejsca dla dłoni eksperymentatora.
UWAGA: W idealnych warunkach szkolenie powinno być przeprowadzane w wydzielonym, cichym pomieszczeniu. Jeśli nie jest to możliwe, można wykorzystać szafkę wyciszeniową w obrębie pomieszczenia dla zwierząt, pod warunkiem, że skutecznie ogranicza ona ekspozycję na hałas i zakłócenia z otoczenia. - Aby zapobiec przekształceniu się wskazówek słuchowych w zmienne zakłócające, należy ściśle unikać komunikacji werbalnej lub dźwięków wokalnych podczas sesji treningowych. Wszelkie interakcje wokalne ze zwierzętami należy ograniczyć do okresów poza kontekstem treningowym.
- Powtarzanie docelowego zachowania (np. dobrowolne siadanie na dłoni eksperymentatora) należy traktować jako praktyczny wskaźnik udanej habituacji i nauki podczas treningu. Trening uznaje się za udany, gdy zachowanie to jest obserwowane co najmniej 5 razy na sesję przez trzy kolejne dni (patrz krok 3.4.4).
- Przeprowadzać jedną sesję treningową dziennie dla każdego gerbila, trwającą 4 min. Trening należy przeprowadzać bezpośrednio w klatce domowej zwierzęcia, aby zredukować stres i zachować znane mu środowisko. Nie ma konieczności usuwania wszystkich elementów wzbogacających, jednak należy upewnić się, że w klatce pozostaje przynajmniej jedna rura lub tunel oraz że na dnie klatki jest wystarczająco dużo miejsca dla dłoni eksperymentatora.
- Przygotowanie do szkolenia
- Przygotuj wszystkie wymagane materiały: jako nagrody przygotuj nasiona słonecznika przekrojone na pół lub nasiona dyni podzielone na trzy części. Zapewnij kliker do treningu, aplikację z timerem wykorzystującą sygnały kolorystyczne (bez dźwięku) lub inny cichy timer (cyfrowy lub analogowy) oraz czystą klatkę pomocniczą (patrz Tabela materiałów).
- Przenieś klatkę domową w ciche miejsce, wolne od rozpraszaczy, w którym odbędzie się trening, aby zminimalizować stresory środowiskowe. Podczas sesji unikaj nagłych lub głośnych dźwięków, takich jak rozmowy, trzaskanie drzwiami czy hałas urządzeń, ponieważ gerboły są bardzo wrażliwe na bodźce słuchowe.
- Usuń wszystkie elementy wzbogacenia środowiskowego z wyjątkiem jednego tunelu. Upewnij się, że pozostały tunel nie blokuje dostępu do obszaru treningowego. Upewnij się, że pozostało wystarczająco dużo miejsca, aby pomieścić dłoń.
- Przenieś dowolne zwierzę towarzyszące do czystej klatki wtórnej, dołączając niewielką ilość ściółki i wzbogaceń z klatki macierzystej, aby zredukować stres podczas separacji.
- Umieść klikacz nożny (urządzenie mechaniczne, które wydaje dźwięk kliknięcia po naciśnięciu stopą; patrz Tabela materiałów) pod stołem lub powierzchnią treningową. Pozwala to trenerowi na zaznaczenie pożądanego zachowania bez użycia rąk, co zapewnia spójność czasową, przy jednoczesnym zachowaniu obu rąk do interakcji ze zwierzęciem.
- Dzień treningowy 1–5: Wprowadzenie klikera
- Uruchom timer: dotknij Start w aplikacji lub naciśnij przycisk na timerze bezdźwięcznym.
- Stanąć lub usiąść przed klatką. Umieścić pięć ziaren wybranego nasiona na dłoni i położyć dłoń płasko na podłożu w jednym z narożników klatki.
- Kliknij w momencie, gdy gerbil bierze nasiono z ręki (Rysunek 2B). Jeśli pobiera się wiele nasion sekwencyjnie, należy kliknąć po każdym z nich. Dźwięk kliknięcia służy do skojarzenia nagrody pokarmowej z zachowaniem żerowania z ręki.
- Zakończ trening, gdy zwierzę wykona pożądane zachowanie 5 razy lub gdy czasomierz osiągnie zero (po 4 min).
- Od 3. dnia, w zależności od zachowania gerbila, należy zacząć podawać nasiona pojedynczo. Rękę należy trzymać tuż nad dnem klatki, aby zachęcić zwierzę do wyciągania się lub krótkiego kontaktu przednimi łapami (Rysunek 2C). Pomaga to w stopniowym kształtowaniu zachowania i przygotowuje zwierzę do kolejnego etapu treningu (patrz krok 3.4).
- Dzień treningu 6–10
UWAGA: Opcjonalna wskazówka treningowa: Jeśli gerbil nie chce wejść na dłoń, należy podzielić to zadanie na mniejsze etapy budujące pewność zwierzęcia. W pierwszej kolejności należy wzmacniać zachowanie polegające na dotykaniu dłoni, zanim zacznie się oczekiwać, że zwierzę na nią wejdzie. Należy zastosować tę strategię kształtowania zachowań, aby zredukować stres i wesprzeć zwierzęta, które wymagają więcej czasu na habituację do manipulacji.- Podawaj tylko jedno ziarno na raz. Trzymaj dłoń lekko uniesioną nad podłożem, aby zachęcić gerbila do całkowitego wejścia na dłoń w celu uzyskania nagrody. Krok ten opiera się na poprzednim procesie kształtowania i stanowi przejście do końcowego zachowania docelowego.
- Gdy gerbil zacznie konsekwentnie wchodzić na dłoń, należy użyć klikera, aby wzmocnić to zachowanie. Następnie należy zacząć podawać ziarno drugą ręką (patrz Rysunek 3). Utrzymuj dłoń treningową nad dnem klatki w taki sposób, aby gerbil musiał całkowicie na nią wejść. Jedną ręką trzymaj ziarno między kciukiem a palcem wskazującym (Rycina 3A) lub jedną ręką podać nagrodę nad dłonią drugiej ręki, na którą zwierzę jest zachęcane do wejścia (Rycina 3B).
- Sukces treningu ocenia się jako dobrowolne siadanie gerbila na dłoni eksperymentatora 5 razy na sesję oraz przyjmowanie nagrody z wnętrza dłoni lub z drugiej ręki.
- Zakończyć trening po maksymalnym czasie trwania wynoszącym 3 tygodnie (5 dni w tygodniu) lub w momencie, gdy cel treningowy jest konsekwentnie osiągany przez okres 3 kolejnych dni.
UWAGA: Chociaż protokół definiuje ustrukturyzowaną fazę treningu trwającą do 3 tygodni, sesje wzmacniające można kontynuować po tym okresie, jeśli jest to konieczne, szczególnie w przypadku przewidywanej przerwy między zakończeniem treningu a rozpoczęciem procedur eksperymentalnych. Dalsze pozytywne wzmacnianie może pomóc w utrzymaniu wyuczonego zachowania i zapewnić niezawodność wyników w czasie. Zalecamy kontynuowanie wzmacniania raz w tygodniu po pomyślnym zakończeniu fazy treningu. Jednakże, aby zapewnić spójność i porównywalność między zwierzętami, przed przejściem do zadań eksperymentalnych należy udokumentować wyraźny punkt końcowy treningu, zdefiniowany jako stabilne i powtarzalne wykonywanie docelowego zachowania.
Rycina 3: Przykłady ułożenia dłoni podczas podawania nagrody. (A) Nagroda jest trzymana między kciukiem a palcem wskazującym tej samej dłoni, podczas gdy zwierzę spoczywa na dłoni. (B) Nagroda jest trzymana palcem środkowym i wskazującym, podczas gdy zwierzę spoczywa na dłoni drugiej ręki. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
4. Przeprowadzanie testów behawioralnych po treningu (dzień 10+)
- Test interakcji
UWAGA: Zmienne zależne: Główną zmienną zależną jest czas trwania dobrowolnej interakcji między zwierzęciem a dłonią eksperymentatora podczas drugiej minuty testu. Interakcję definiuje się jako bezpośredni kontakt fizyczny, taki jak wąchanie, wspinanie się lub dotykanie dłoni przednimi łapami10. Ocena behawioralna opiera się na nagraniach wideo i może być przeprowadzona ręcznie lub przy użyciu oprogramowania do analizy behawioralnej.- Ustaw kamerę zamontowaną na statywie nad stołem, na którym przeprowadzany będzie test interakcji.
- Jeśli zwierzęta są utrzymywane w grupach, przenieś je do czystej klatki pomocniczej zawierającej garść ściółki z klatki macierzystej.
- Usuń wszystkie tunele lub schronienia z klatki macierzystej i umieść je w czystej klatce. W klatce testowej (=klatce macierzystej) pozostaw tylko ściółkę. Umieść klatkę macierzystą, zawierającą obecnie tylko ściółkę, pod kamerą.
- Używając metody chwytania w zagłębieniu dłoni (cupped handling), delikatnie przenieś zwierzę testowe do klatki macierzystej.
- Rozpocznij nagrywanie. Pozostań w bezruchu przed klatką przez 1 min. Po 1 min włóż jedną dłoń w rękawiczce do klatki, blisko przedniej krawędzi, na kolejne 1 min.
- Zmieniaj rękawiczki pomiędzy zwierzętami różnych płci.
- Test otwartego pola
UWAGA: Zmienne zależne: Mierzone zmienne obejmują całkowity przebyty dystans, czas spędzony w strefie centralnej w porównaniu do peryferyjnej, liczbę wejść do centrum oraz liczbę zdarzeń wznoszenia się (rearing). Wskaźniki te odzwierciedlają ogólną aktywność lokomocyjną oraz zachowania lękowe. Zwiększony czas spędzony w centrum jest zazwyczaj interpretowany jako zmniejszony lęk. Zachowanie jest rejestrowane wideo i analizowane przy użyciu zautomatyzowanego oprogramowania do śledzenia (patrz Tabela materiałów).- Ustaw kamerę nad areną otwartego pola (100 cm x 100 cm x 40 cm).
- Rozpocznij nagrywanie wideo, a następnie delikatnie umieść zwierzę w centrum areny, stosując metodę chwytania w zagłębieniu dłoni. Rejestruj zachowanie przez 7 min.
- Po teście zwróć zwierzę do jego klatki macierzystej. Po każdym zwierzęciu oczyść pudełko i ścianki pola otwartego 70% etanolem. Odczekaj do całkowitego odparowania etanolu przed umieszczeniem kolejnego zwierzęcia w arenie.
5. Analiza statystyczna
- Ze względu na charakter bezpośredniej interakcji ze zwierzętami całkowite zaślepienie eksperymentatora podczas sesji treningowych nie było możliwe, dlatego analizę danych behawioralnych należy przeprowadzić w sposób zaślepiony, aby zminimalizować błąd obserwatora.
- W przypadku testu interakcji oraz testu otwartego pola wszystkie sesje należy zarejestrować w formie wideo. Zmienne zależne należy zbierać albo ręcznie za pomocą przeszkolonych obserwatorów (test interakcji), albo automatycznie przy użyciu oprogramowania do analizy behawioralnej (patrz Tabela materiałów) w przypadku nagrań z testu otwartego pola (czas spędzony w strefie centralnej).
- Przed analizą statystyczną należy sprawdzić wszystkie dane pod kątem rozkładu normalnego za pomocą testu Shapiro-Wilka. Wartości odstające należy zidentyfikować i wykluczyć metodą Robust Regression and Outlier Removal (ROUT), przyjmując wskaźnik fałszywych odkryć (Q) na poziomie 10%. Aby przeanalizować wpływ treningu i płci na wyniki behawioralne, należy przeprowadzić dwuczynnikową analizę wariancji z powtarzanymi pomiarami (two-way repeated measures ANOVA) dla testu interakcji oraz mieszaną analizę wariancji dwuczynnikowej (mixed two-way ANOVA) w celu oceny czasu spędzonego w centrum podczas testu otwartego pola.
- Test interakcji oraz skumulowany czas spędzony w strefie centralnej otwartego pola należy skategoryzować jako główne zmienne zależne. Porównania post hoc należy przeprowadzić za pomocą testu Tukey's Honest Significant Difference (HSD). Wartość p < 0,05 uznano za istotną statystycznie. Wszystkie analizy statystyczne wykonano przy użyciu oprogramowania statystycznego (patrz Tabela materiałów).
Wyniki
Wszystkie przeszkolone njerbo nauczyły się przydzielonego zadania w ciągu 10 dni, co dowodzi wykonalności treningu z użyciem klikera u tego gatunku. Rysunek 4 przedstawia sukces szkolenia samic (n=27) i samców (n=16) njerbów od dnia 1 do dnia 10. ANOVA z powtarzanymi pomiarami, analizująca wyniki w 1. dniu treningu w porównaniu z 10. dniem u samców i samic njerbów, nie wykazała istotnego efektu interakcji między czasem a płcią (F(1, 41) = 0.003; p = 0.955), co wskazuje, że poprawa w czasie była podobna dla obu płci. Zaobserwowano wysoce istotny efekt czasu (F(1, 41) = 38.83, p < 0.0001), co pokazuje, że njerbo obu płci w pełni dostosowały się do protokołu szkoleniowego do 10. dnia.
Fakt, że przeszkolone gerbile opanowały przypisane im zadanie w ciągu 10 dni, potwierdza skuteczność metodologii treningu z klikerem u tego gatunku. Taki wskaźnik sukcesu jest zgodny z podstawowymi zasadami warunkowania instrumentalnego, w którym kliker pełni funkcję wtórnego wzmocnienia, łączącego pożądane zachowanie z nagrodą pierwotną (ziarna słonecznika/dyni). Kliker służy jako pomost między zachowaniem a nagrodą, umożliwiając trenerowi precyzyjne zaznaczenie dokładnego momentu wystąpienia pożądanego zachowania. Pomaga to stworzyć jasne i natychmiastowe skojarzenie między działaniem a jego pozytywną konsekwencją.
Testy behawioralne przeprowadzono po zakończeniu protokołu treningowego, a konkretnie po 10. dniu treningu. Analiza dwuczynnikowa ANOVA z pomiarami powtarzanymi wykazała, że przeszkolone gerboły zwiększyły dobrowolną interakcję z dłonią eksperymentatora (Rycina 5A). Stwierdzono istotny efekt treningu (F (1, 60) = 22.89; p < 0.0001), przy czym zwierzęta przeszkolone częściej wchodziły w interakcję z eksperymentatorem. Analiza post hoc ujawniła konkretne różnice wynikające z treningu u samic (p < 0.0001, n = 27) oraz samców (p = 0.049, n = 16). Nie zaobserwowano efektu płci (F(1, 60) = 0.621, p = 0.434), co sugeruje, że gerboły samce i samice radziły sobie ogólnie podobnie. Analiza nie wykazała istotnej interakcji między płcią a treningiem (F(1, 60) = 0.078, p = 0.781).
Zwiększona dobrowolna interakcja ze strony gerbili wskazuje, że trening z wykorzystaniem klikera skutecznie zredukował wrodzone reakcje lękowe poprzez pozytywne wzmocnienie. Może to pomóc w zminimalizowaniu stresu podczas manipulacji i procedur eksperymentalnych, poprawiając zarówno dobrostan zwierząt, jak i jakość danych.
Ocenę zachowań przypominających lęk po treningu przeprowadzono za pomocą testu otwartego pola (Open Field Test). Rycina 5B przedstawia skumulowany czas spędzony w strefie centralnej. W teście otwartego pola nie zaobserwowano interakcji między płcią a treningiem w odniesieniu do skumulowanego czasu spędzonego w strefie centralnej (F(1, 60) = 0.101, p = 0.751). Ponadto nie stwierdzono istotnego głównego efektu płci (F(1, 60) = 0.001, p = 0.969). Odnotowano wysoce istotny główny efekt treningu (F(1, 60) = 17.26, p < 0.0001; test HSD Tukeya: p = 0.003 u samic i p = 0.052 u samców), co wskazuje, że trenowane świstaki spędzały w centrum znacznie więcej czasu w porównaniu z osobnikami nietrenowanymi. Wyniki te odzwierciedlają reakcje behawioralne zmierzone po zakończeniu przez zwierzęta 10-dniowego okresu treningowego.
Test otwartego pola (OFT) wykorzystuje naturalny konflikt między chęcią zbliżenia się a unikaniem, którego doświadczają gryzonie podczas eksploracji nowego środowiska27. Gerbile mogą równoważyć swój wrodzony popęd do eksploracji z naturalną tendencją do unikania potencjalnie niebezpiecznych, otwartych przestrzeni. W związku z tym fakt, że przeszkolone gerbile spędzały więcej czasu w wywołującej lęk strefie centralnej, wskazuje, że trening z klikerem zwiększył ich ogólną behawioralną skłonność do eksploracji, co może świadczyć o poprawie ogólnego dobrostanu zwierząt.
Rycina 4: Walidacja treningu z klikerem. Skuteczność treningu w dniu 1. w porównaniu z dniem 10. u osobników płci męskiej i żeńskiej: Skuteczność treningu oceniano u samic (białe słupki, n = 27) i samców (szare słupki, n = 16) norników w dniu 1. i dniu 10. protokołu treningowego. Dwuczynnikowa ANOVA z powtarzanymi pomiarami wykazała istotny główny efekt dnia treningu (p < 0.0001). Porównania wielokrotne z użyciem testu Tukey's HSD wykazały istotny wzrost skuteczności treningu od dnia 1. do dnia 10. zarówno u samic (p < 0.0001, n = 27), jak i u samców (p < 0.0001, n = 16). Dane przedstawiono jako średnia ± SD. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
Rycina 5: Ocena behawioralna. (A) Test interakcji: Czas trwania interakcji z dłonią eksperymentatora (w s) mierzono u trenowanych (szare słupki) i nietrenowanych (białe słupki) samic i samców myszy gerbila po zakończeniu przez zwierzęta 10-dniowego okresu treningu. Dwuczynnikowa analiza wariancji (ANOVA) z pomiarem mieszanym wykazała istotny główny efekt treningu (p < 0.05) oraz istotny efekt interakcji (p < 0.05). Analiza post hoc z użyciem testu HSD Tukeya wykazała, że myszy trenowane wchodziły w interakcję z dłonią eksperymentatora istotnie dłużej niż myszy nietrenowane (samice: p < 0.0001, samce: p = 0.0497). Dane przedstawiono jako średnia ± SD. Samice trenowane: n= 27; samice nietrenowane: n =16; samce trenowane: n = 16; samce nietrenowane: n = 5. (B) Test otwartego pola: Test przeprowadzono po zakończeniu protokołu treningowego, konkretnie po 10. dniu treningu. Skumulowany czas spędzony w strefie centralnej (s) mierzono u trenowanych (szare słupki) i nietrenowanych (białe słupki) samic i samców myszy gerbila. Przeprowadzono dwuczynnikową analizę wariancji (ANOVA) z pomiarem mieszanym w celu analizy wpływu treningu na eksplorację strefy centralnej. Porównania wielokrotne z użyciem testu HSD Tukeya wykazały, że trenowane samice spędzały istotnie więcej czasu w strefie centralnej w porównaniu z samicami nietrenowanymi (p = 0.003). Dane przedstawiono jako średnia ± SD. Samice trenowane: n= 27; samice nietrenowane: n =16; samce trenowane: n = 16; samce nietrenowane: n = 5. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.
Dyskusja
Wyniki pokazują skuteczność proponowanego protokołu w przyzwyczajaniu myszoskoczków do interakcji z ludźmi w środowiskach eksperymentalnych. Zdolność wszystkich wyszkolonych zwierząt do wykonania żądanego zadania w ciągu 10 dni podkreśla skuteczność tej metody.
Jednym z krytycznych kroków w protokole jest stopniowe przyzwyczajanie się do ręki eksperymentatora, upewniając się, że myszoskoczki kojarzą interakcję z człowiekiem z pozytywnym bodźcem. Stosowanie nagród specyficznych dla gatunku dodatkowo optymalizuje proces treningu. Modyfikacje, takie jak dostosowanie czasu trwania sesji treningowych lub zmiana rodzaju nagrody, mogą jeszcze bardziej dostosować protokół do indywidualnych różnic między myszoskoczkami i zoptymalizować go pod kątem konkretnych wymagań eksperymentu.
Skupiamy się na zauważalnych specyficznych dla gatunku różnicach w zachowaniu i dynamice uczenia się między myszami a myszoskoczkami mongolskimi. Takie różnice należy wziąć pod uwagę przy projektowaniu protokołów treningowych. Na przykład myszy są zwykle bardziej neofobiczne i wrażliwe na stres, często potrzebują więcej czasu, aby przyzwyczaić się do nowego środowiskai interakcji międzyludzkich. Natomiast myszoskoczki wykazują większy popęd eksploracyjny i ciekawość społeczną, co może ułatwić szybsze zaangażowanie w zadania szkoleniowe29. W niniejszym badaniu myszoskoczki chętnie zbliżyły się do ręki eksperymentatora i nauczyły się kojarzyć kliker z nagrodą w mniejszej liczbie sesji niż zwykle zgłaszano u myszy21,22. Jednak myszoskoczki wykazywały również większą zmienność osobniczą, szczególnie u samców, co może odzwierciedlać stres specyficzny dla płci lub czynniki motywacyjne, które są mniej wyraźne w modelach mysich. Różnice te podkreślają znaczenie strategii treningowych dostosowanych do gatunku i sugerują, że myszoskoczki mogą czerpać korzyści z krótszych, skoncentrowanych na nagrodzie sesji z większym naciskiem na dobrowolne interakcje, podczas gdy myszy mogą wymagać bardziej stopniowego odczulania i konsekwentnego powtarzania. Zrozumienie tych różnic behawioralnych i poznawczych ma kluczowe znaczenie dla udoskonalenia protokołów treningowych i maksymalizacji ich skuteczności u różnych gatunków.
Myszoskoczki mongolskie mogą odnieść znaczne korzyści z niespecyficznego lub uogólnionego treningu klikerowego, który koncentruje się na pozytywnej interakcji człowiek-zwierzę i podstawowym warunkowaniu behawioralnym, a nie na przygotowaniu do konkretnej konfiguracji eksperymentalnej. Takie uogólnione szkolenie zwiększa tolerancję na obchodzenie się z piłką, zmniejsza podstawowy poziom stresu i promuje bardziej przewidywalne czynniki wyjściowe zachowania, które są cenne w szerokim zakresie kontekstów eksperymentalnych. Trening niespecyficzny promuje elastyczność behawioralną i konsekwentną, dobrowolną interakcję z eksperymentatorem, dzięki czemu zwierzęta są bardziej zdolne do przystosowania się do różnych środowisk, konfiguracji lub paradygmatów testowania 16,31,32. Jest to szczególnie korzystne w badaniach długoterminowych lub eksperymentach wielofazowych, w których zwierzęta są poddawane różnorodnym procedurom. W niniejszym badaniu, mimo że trening nie był bezpośrednio związany z pojedynczym protokołem testowym, myszoskoczki wykazały lepszą interakcję z eksperymentatorem i zmniejszone zachowania związane ze stresem, wspierając ideę, że ogólne przyzwyczajenie poprzez pozytywne wzmocnienie może poprawić ogólną odporność eksperymentalną i dobrostan zwierząt.
Oprócz zwiększonej interakcji z eksperymentatorem, wyszkolone samice spędzały znacznie więcej czasu w środkowej strefie testu na otwartym polu. Ten wzorzec behawioralny jest powszechnie interpretowany jako zmniejszenie zachowań podobnych do lęku u gryzoni, szczególnie w odpowiedzi na nowe lub łagodnie awersyjne środowiska33. Odkrycia te sugerują, że trening klikerowy może przyczyniać się do obniżenia behawioralnych wskaźników lęku, zwiększając w ten sposób zdolność zwierząt do radzenia sobie z procedurami eksperymentalnymi. Potwierdza to szerszy wniosek, że protokoły habituacji oparte na pozytywnym wzmocnieniu mogą poprawić odporność na stres i stabilność behawioralną u myszoskoczków laboratoryjnych. Poza redukcją stresu, trening klikerowy ma szersze implikacje dla wyników eksperymentów34. Wytresowane myszoskoczki wykazały większą tolerancję na obchodzenie się z nimi, co minimalizuje zmiany fizjologiczne wywołane stresem, które mogłyby zakłócić wyniki badań. Podobne odkrycia odnotowano u innych gatunków, w tym królików i myszy laboratoryjnych, gdzie zwierzęta wyszkolone za pomocą klikera wykazywały zwiększoną interakcję z eksperymentatorem i mniej zachowań związanych z lękiem i depresją, takich jak zmniejszone oddawanie moczu, defekacja, wokalizacja i unoszenie się w powietrzu19,21.
Wyniki te podkreślają potencjał treningu klikerowego w zakresie poprawy zarówno dobrostanu zwierząt, jak i spójności danych behawioralnych poprzez zmniejszenie zmienności reakcji związanych ze stresem. Ważne jest, aby wyjaśnić, że celem tego protokołu nie jest warunkowanie zwierząt do kojarzenia z natury awersyjnych procedur – takich jak pobieranie krwi – z pozytywnymi bodźcami, takimi jak kliker. Celem jest raczej zmniejszenie stresu wyjściowego, przyzwyczajenie zwierząt do interakcji z ludźmi i promowanie dobrowolnego udziału w neutralnych lub łagodnie trudnych zadaniach. Podczas gdy niektóre badania badały zastosowanie pozytywnego wzmocnienia w celu przygotowania zwierząt do bardziej inwazyjnych procedur35, wymaga to starannie ustrukturyzowanego procesu odczulania i wykracza poza zakres obecnego protokołu. Niewłaściwe zastosowanie wskazówek klikerowych w kontekstach związanych z dyskomfortem może rzeczywiście skutkować niezamierzonymi negatywnymi skojarzeniami. Jednakże, przy prawidłowym stosowaniu, techniki pozytywnego wzmocnienia mogą pomóc zwierzętom radzić sobie z potencjalnie awersyjnymi procedurami, zwiększając przewidywalność i umożliwiając pewien stopień kontroli36. Potrzebne są dalsze badania, aby ustalić, czy myszoskoczki mogą być niezawodnie szkolone w takich kontekstach, jak to z powodzeniem wykazano u innych gatunków, takich jak psy i naczelne37,38.
Pomimo swojego sukcesu, metoda ma ograniczenia. Niektóre myszoskoczki wymagały dłuższych okresów przyzwyczajenia, co wskazuje na indywidualną zmienność szybkości uczenia się. Dodatkowo stosunkowo niewielka liczba niewyszkolonych samców myszoskoczków ogranicza moc statystyczną analizy, co utrudnia wyciągnięcie solidnych wniosków. Zwiększenie wielkości próby w tej grupie prawdopodobnie poprawiłoby wiarygodność i możliwość interpretacji wyników. Dalsze badania powinny zbadać potencjalne różnice płci w reakcjach na stres i mechanizmach uczenia się.
Szersze implikacje tego badania wykraczają poza redukcję stresu. Wdrożenie ustrukturyzowanych protokołów treningowych w ramach standardowej hodowli może zmniejszyć zmienność spowodowaną reakcjami fizjologicznymi wywołanymi stresem i poprawić wiarygodność wyników eksperymentalnych39,40. Jest to szczególnie istotne w dyscyplinach takich jak neurobiologia lub badania metaboliczne, w których stres jest krytycznym czynnikiem zakłócającym. Staranne raportowanie i standaryzacja procedur szkoleniowych są niezbędne, aby uniknąć niezamierzonych efektów wzbogacenia.
Idąc dalej, przyszłe badania powinny dotyczyć alternatywnych harmonogramów wzmacniania, automatyzacji procedur treningowych i długoterminowych skutków dla różnych gatunków. Wraz z rosnącym wsparciem naukowym, szkolenie klikerowe stanowi cenną strategię udoskonalania, która może poprawić zarówno jakość danych, jak i dobrostan zwierząt. Standaryzacja protokołów szkolenia i postępowania w laboratoriach może pomóc w poprawie odtwarzalności i wesprzeć szersze przyjęcie humanitarnych i skutecznych praktyk w badaniach biomedycznych.
Oświadczenia
Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.
Podziękowania
Ta praca była wspierana przez Centrum Badań nad Zwierzętami Uniwersyteckiego Centrum Medycznego Uniwersytetu Jana Gutenberga w Moguncji.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Klatki | Zoonlab GmbH | 3010006 | 590 x 380 x 200 mm; 1.815 m2 |
| Kamera | Sony | HDR-CX240E | cyfrowa kamera wideo HD Rejestrator |
| Granulki spożywcze | Ssniff | V1644-000 | Art. Nr I-Clicker-Blau |
| Foot Clicker | https://www.hundeschulen.com | ||
| GraphPad Prism | GraphPad Software, Inc | https://www.graphpad.com/features | Wersja 10 dla systemu Windows |
| Pudełko otwarte | Noldus | MXO1S-M001 | opal 100 x 100 x 40 cm |
| Pestki dyni | REWE | 8820911 | REWE |
| Bio Przeglądarka pylonów | Basler | https://www.baslerweb.com/de-de/software/pylon/ | |
| Nasiona słonecznika | Seeberger | 4744292 | |
| Statyw | Manfrotto | GT- mkbfra4gtxp bh | Befree GT |
| Tunele | Plexx | 14179 | 152 x 76 x 3 mm |
Bibliografia
- Animal Use Alternatives (3Rs). , National Agricultural Library. Accessed May 21, 2025 https://www.nal.usda.gov/animal-health-and-welfare/animal-use-alternatives (2025).
- The 3Rs. , NC3Rsy. Accessed May 21, 2025 https://nc3rs.org.uk/who-we-are/3rs (2025).
- Locke, P., Romanchik, R., Kincaid, B., Golden, E. The 3RS and non-human animals in biomedical research: the next 65 years. , https://www.ufaw.org.uk/ (2025).
- Number of animals used in experiments in 2022. , European Commission. https://webgate.ec.europa.eu/envdataportal/content/alures/section1_number-of-animals.html (2022).
- Tierschutzgesetz TierSchG, 2022. , Bundesministerium der Justiz. https://www.gesetze-im-internet.de/tierschg/BJNR012770972.html (2022).
- Verwendung von Versuchstieren im Berichtsjahr 2023. , Bundesinstitut für Risikobewertung (BfR). https://www.bf3r.de/de/verwendung_von_versuchstieren_im_berichtsjahr_2023-318066.html (2022).
- Mulholland, M. M., Neal Webb, S. J., Schapiro, S. J. Behavioral Needs and Management of Laboratory Animals. Handbook Lab Animal Sci. 4, 14(2021).
- Gärtner, K., et al. Stress response of rats to handling and experimental procedures. Lab Anim. 14 (3), 267-274 (1980).
- Marcotte, M., et al. Handling Techniques to Reduce Stress in Mice. J Vis Exp. (175), e62593(2021).
- Hurst, J. L., West, R. S. Taming anxiety in laboratory mice. Nat Meth. 7, 825-826 (2010).
- Gouveia, K., Hurst, J. L. Reducing Mouse Anxiety during Handling: Effect of Experience with Handling Tunnels. PLoS One. 8 (6), e66401(2013).
- Ryabinin, A. E., Wang, Y. M., Finn, D. A. Different levels of Fos immunoreactivity after repeated handling and injection stress in two inbred strains of mice. Pharmacol Biochem Behav. 63 (1), 143-151 (1999).
- Balcombe, J. P., Barnard, N. D., Sandusky, C. Laboratory routines cause animal stress. Contemp Top Lab Anim Sci. 43 (6), 42-51 (2004).
- Rinwa, P., Eriksson, M., Cotgreave, I., Bäckberg, M. 3R-Refinement principles: elevating rodent well-being and research quality. Lab Anim Res. 40 (1), 1-11 (2024).
- Skinner, B. F. Operant behavior. Ame Psychol. 18 (8), 503-515 (1963).
- Leidinger, C. S., Kaiser, N., Baumgart, N., Baumgart, J. Using Clicker Training and Social Observation to Teach Rats to Voluntarily Change Cages. J Vis Exp. (140), e58511(2018).
- Pfaller-Sadovsky, N., Hurtado-Parrado, C., Cardillo, D., Medina, L. G., Friedman, S. G. What's in a Click? The Efficacy of Conditioned Reinforcement in Applied Animal Training: A Systematic Review and Meta-Analysis. Animals. 10, 1757(2020).
- Prescott, M. J., Buchanan-Smith, H. M. Training laboratory-housed non-human primates, part 1: a UK survey. Animal Welfare. 16, 21-36 (2007).
- Hohlbaum, K., Kahnau, P., Wilzopolski, J., Fischer-Tenhagen, C. Training Laboratory Rabbits to Refine Routine Husbandry Procedures. J Vis Exp. (204), e66008(2024).
- Jüchter, C., Beutelmann, R., Klump, G. M. Speech sound discrimination by Mongolian gerbils. Hear Res. 418, 108472(2022).
- Leidinger, C., Herrmann, F., Thöne-Reineke, C., Baumgart, N., Baumgart, J. Introducing clicker training as a cognitive enrichment for laboratory mice. J Vis Exp. , e55415(2017).
- Dickmann, J., et al. Clicker training mice for improved compliance in the catwalk test. Animals. 12 (24), 3545(2022).
- Leidinger, C. Refinement Strategies in Breeding and Keeping of Laboratory Mice. , https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/2088 (2018).
- Brown, S. A. Small mammal training in the veterinary practice. Vet Clin North Am Exotic Animal Pract. 15 (3), 469-485 (2012).
- Mankin, E. A., et al. The hippocampal code for space in Mongolian gerbils. Hippocampus. 29 (9), 787(2019).
- Busch, M., et al. Tiergerechte Haltung von Mongolischen Wüstenrennmäusen (Meriones unguiculatus). , gv-solas.de. (2021).
- Bridges, N. J., Starkey, N. J. Sex differences in Mongolian gerbils in four tests of anxiety. Physiol Behav. 83, 119-127 (2004).
- Walker, M. D., Mason, G. Female C57BL/6 mice show consistent individual differences in spontaneous interaction with environmental enrichment that are predicted by neophobia. Behav Brain Res. 224 (1), 207-212 (2011).
- Anselme, P. Animal Behavior and Cognition Exploratory Search: Information Matters More than Primary Reward. Animal Behav Cogni. 10 (4), 366-383 (2023).
- Tejedor-Real, P., Sahagún, M., Biguet, N. F., Mallet, J. Neonatal Handling Prevents the Effects of Phencyclidine in an Animal Model of Negative Symptoms of Schizophrenia. Biol Psychiatry. 61 (7), 865-872 (2007).
- Chen, K., et al. Exercise training improves motor skill learning via selective activation of mTOR. Sci Adv. 5 (7), eaaw1888(2019).
- Codita, A., et al. Effects of spatial and cognitive enrichment on activity pattern and learning performance in three strains of mice in the IntelliMaze. Behav Genet. 42 (3), 449-460 (2012).
- Wang, S., et al. The different baseline characteristics of cognitive behavior test between Mongolian gerbils and rats. Behav Brain Res. 352, 28-34 (2018).
- Baumans, V., Van Loo, P. L. P. How to improve housing conditions of laboratory animals: The possibilities of environmental refinement. Vet J. 195 (1), 24-32 (2012).
- Fiderer, D., Thoene-Reineke, C., Wiegard, M. Clicker Training in Minipigs to Reduce Stress during Blood Collection-An Example of Applied Refinement. Animals. 14 (19), 2819(2024).
- Layton, R., et al. A Positive-Reinforcement Training Regimen for Refined Sample Collection in Laboratory Pigs. Animals. 15 (4), 471(2025).
- Schapiro, S. J., Bloomsmith, M. A., Laule, G. E. Positive reinforcement training as a technique to alter nonhuman primate behavior: Quantitative assessments of effectiveness. J Appl Animal Welfare Sci. 6 (3), 175-187 (2003).
- Meunier, L. V. D. Selection, Acclimation, Training, and Preparation of Dogs for the Research Setting. ILAR J. 47 (4), 326-347 (2006).
- Golbidi, S., Frisbee, J. C., Laher, I. X. Chronic stress impacts the cardiovascular system: Animal models and clinical outcomes. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 308 (12), H1476-H1498 (2015).
- Liu, X., Zheng, X., Liu, Y., Du, X., Chen, Z. Effects of adaptation to handling on the circadian rhythmicity of blood solutes in Mongolian gerbils. Animal Model Exp Med. 2 (2), 127-131 (2019).
Przedruki i uprawnienia
Ten artykuł został opublikowany
Film wkrótce dostępny