Poprawa dobrostanu myszoskoczków poprzez pozytywny trening wzmacniający w środowiskach badawczych

Podsumowanie

Trening klikerowy służy jako technika pozytywnego wzmocnienia dla myszoskoczków laboratoryjnych. Metoda ta ma na celu zmniejszenie stresu i poprawę wydajności obchodzenia się z nimi poprzez pozytywne wzmocnienie, przyczyniając się w ten sposób do dobrostanu zwierząt doświadczalnych.

Streszczenie

Poprawa dobrostanu zwierząt laboratoryjnych poprzez minimalizację stresu i promowanie odpowiedniego dla gatunku postępowania jest głównym celem współczesnych badań biomedycznych na całym świecie. Trening klikerowy, powszechnie uznawana forma treningu pozytywnego wzmocnienia, wykorzystuje dźwięk kliknięcia jako warunkowy wzmacniacz, aby połączyć pożądane zachowanie i nagrodę, umożliwiając zwierzętom szybsze uczenie się i przy zmniejszonym stresie. Nasza grupa badawcza wykazała wcześniej, że trening klikerowy działa jako forma wzbogacenia poznawczego u myszy i szczurów. W niniejszym badaniu z powodzeniem dostosowaliśmy to podejście do szkolenia myszoskoczków mongolskich (Meriones unguiculatus), dostosowując protokół do specyficznych dla gatunku cech behawioralnych myszoskoczków. Kohorta 43 wsobnych myszoskoczków (27 samic i 16 samców) przeszła standaryzowany 10-dniowy protokół treningu klikerowego, podczas którego nauczyły się dobrowolnie zbliżać się i wchodzić w interakcje z ręką eksperymentatora w zamian za nagrodę w postaci jedzenia. Po okresie szkolenia zwierzęta poddano ocenom behawioralnym, w tym testowi otwartego pola i standaryzowanemu testowi interakcji międzyludzkiej, w celu oceny wpływu treningu na zachowania eksploracyjne i interakcję człowiek-zwierzę. Z naszych ustaleń wynika, że wdrożenie treningu klikerowego u myszoskoczków jest szybkie, skuteczne i dobrze tolerowane. Wyszkolone zwierzęta, zwłaszcza samice, wykazywały zwiększoną dobrowolną interakcję z ręką eksperymentatora i zmniejszone zachowania podobne do lęku. Wyniki te sugerują, że dostosowane do gatunku protokoły treningu klikerowego mogą ułatwić rozwój zaufania między eksperymentatorem a zwierzęciem, ostatecznie zmniejszając stres i poprawiając zarówno dobrostan zwierząt, jak i wiarygodność wyników eksperymentalnych.

Wprowadzenie

Udoskonalenie wykorzystania zwierząt w badaniach biomedycznych w celu zmniejszenia stresu i poprawy dobrostanu jest powszechnie uznawanym międzynarodowym celem^1,2,3. W 2022 roku Komisja Europejska poinformowała, że spośród 838 539 zwierząt wykorzystanych w Unii Europejskiej (Alures), 3 440 to myszoskoczki⁴. W Niemczech w 2023 r. około 1,46 mln kręgowców i głowonogów wykorzystano w doświadczeniach na zwierzętach zgodnie z § 7 ust. 2 ustawy o dobrostanie zwierząt (TierSchG)⁵. W połączeniu ze zwierzętami uśmierconymi do celów naukowych, łączna liczba zwierząt laboratoryjnych wykorzystanych w Niemczech w 2023 roku osiągnęła około 2,1 miliona⁶. Liczby te podkreślają znaczenie wykorzystania myszoskoczków w badaniach biomedycznych, podkreślając potrzebę ciągłego doskonalenia protokołów dotyczących dobrostanu zwierząt.

Potrzeby behawioralne zwierząt laboratoryjnych oraz znaczenie strategii zarządzania, które wspierają dobrostan specyficzny dla gatunku, zostały powszechnie uznane za niezbędne dla praktyki etycznej i naukowej⁷. Interakcje między człowiekiem a zwierzęciem w hodowli często ograniczają się do podstawowego zadania, jakim jest przenoszenie zwierząt z brudnych do czystych klatek, bez wzmacniania więzi między opiekunem a zwierzęciem. Ten brak interakcji społecznych może prowadzić do stresu, który negatywnie wpływa na zachowanie i fizjologię zwierząt, ostatecznie wpływając na wyniki eksperymentów⁸. Niewłaściwe obchodzenie się z danymi jest dobrze znanym źródłem zmienności danych badawczych⁹. Na przykład podnoszenie myszy za ogon zwiększa niepokój i stres, podczas gdy metody tunelowe lub otwarte dłonie promują dobrowolne podejście i zmniejszają zachowania podobne do lęku^10,11. Obchodzenie się z nim jest nawet stosowane jako standaryzowany ostry stresor w badaniach na małych ssakach ze względu na jego konsekwentny wpływ na markery fizjologiczne, takie jak poziom glukokortykosteroidów¹². Wyniki te podkreślają istotny wpływ krótkich interakcji międzyludzkich i potrzebę udoskonalenia technik obsługi o niskim poziomie stresu¹³.

Udoskonalanie oparte na szkoleniu zyskuje coraz większe uznanie jako skuteczna metoda poprawy zarówno dobrostanu zwierząt, jak i jakości badań^10,14. Jedną z najskuteczniejszych metod treningu stosowanych w badaniach na zwierzętach jest trening z klikerem, który często jest połączony z nagrodami w postaci jedzenia^15,16. W ciągu ostatnich dziesięcioleci opublikowano 34 badania dotyczące treningu z klikerem, co odzwierciedla rosnące zainteresowanie naukowców tym podejściem do treningu¹⁷. Badania pokazują, że psy (47%) i konie (30%) są najczęściej szkolonymi zwierzętami laboratoryjnymi, a następnie koty, bydło, ryby, kozy i małpy (po 3%)¹⁷. Wyszkolone zwierzęta mogą dobrowolnie uczestniczyć w procedurach, zmniejszając stres i minimalizując potrzebę fizycznego przymusu¹⁸.

Protokoły pozytywnego wzmocnienia zostały również zastosowane w odniesieniu do małych ssaków. Ostatnie badania donoszą o udanym szkoleniu królików do procedur hodowlanych, a myszoskoczków do badań behawioralnych^19,20. W niektórych poprzednich pracach wykazaliśmy, że myszy wyszkolone w klikerach wykazywały zwiększony kontakt z eksperymentatorami i mniej wskaźników behawioralnych związanych ze stresem, takich jak oddawanie moczu, defekacja, wokalizacja i zachowanie unoszące się^21,22,23. Jest to zgodne z odkryciami z dziedziny weterynarii, gdzie wykazano, że szkolenie małych ssaków – takich jak króliki, gryzonie i fretki – zmniejsza reakcje strachu i ułatwia radzenie sobie z nimi za pomocą technik pozytywnego wzmacniania²⁴. Warto zauważyć, że zaobserwowaliśmy również specyficzną dla płci różnicę w wydajności treningowej: samice myszy wykazywały większą motywację i wyższą częstotliwość odpowiedzi niż samce podczas sesji treningowych. Sugeruje to, że samice myszy mogą chętniej angażować się w dobrowolne zadania szkoleniowe w standardowych warunkach²¹.

Chociaż obiecujące, istniejące podejścia do szkolenia myszoskoczków są zazwyczaj związane z konkretnymi paradygmatami behawioralnymi i nie są przeznaczone do ogólnego użytku w codziennych procedurach hodowlanych²⁵. Szeroko stosowany, ustandaryzowany protokół dla myszoskoczków mongolskich (Meriones unguiculatus) – niezależny od konkretnego układu doświadczalnego – nie został jeszcze ustalony. Aby wypełnić tę lukę, niniejsze badanie miało na celu opracowanie i walidację prostego protokołu szkolenia z użyciem klikera, dostosowanego do specyficznych dla gatunku cech myszoskoczków. Protokół koncentruje się na redukcji stresu poprzez delikatne obchodzenie się z nim i dobrowolne zaangażowanie eksperymentatora. Stawiamy hipotezę, że takie podejście poprawi dobrostan zwierząt, ustanowi bardziej spójne behawioralne punkty odniesienia i zwiększy wiarygodność wyników eksperymentalnych. Ze względu na swoją prostotę i elastyczność można go łatwo wdrożyć w szerokim zakresie warunków laboratoryjnych.

Aby ocenić skuteczność i możliwość zastosowania proponowanego protokołu treningowego, sformułowaliśmy następujące szczegółowe, testowalne prognozy:
Wytresowane myszoskoczki niezawodnie wykonywałyby docelowe zachowanie – dobrowolnie siadając na dłoni eksperymentatora – w ciągu 10-dniowego okresu treningu.
Wyszkolone zwierzęta wykazywałyby zwiększoną dobrowolną interakcję z eksperymentatorem w standardowym teście, w porównaniu z niewyszkolonymi zwierzętami kontrolnymi.
Wytresowane zwierzęta wykazywałyby wskaźniki behawioralne zgodne ze zmniejszonymi zachowaniami podobnymi do lęku, w szczególności poprzez spędzanie większej ilości czasu w środkowej strefie testu na otwartym polu.
Samice myszoskoczków mogą wykazywać silniejsze reakcje behawioralne na trening niż samce, co może odzwierciedlać różnice płci w adaptacji do interakcji międzyludzkich.
Przewidywania te posłużyły do zaprojektowania ocen behawioralnych i dostarczyły informacji na temat kryteriów oceny protokołu.

Protokół

Postępowanie z myszoskoczkami i procedury eksperymentalne były prowadzone zgodnie z europejskimi, krajowymi i instytucjonalnymi wytycznymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami. Zatwierdzony przez licencję władz lokalnych G 21-1-100. Protokół obejmuje 10 dni szkolenia (od poniedziałku do piątku), z przerwami w weekendy (sobota i niedziela). Protokół można łatwo dostosować do konkretnych potrzeb. Wszystkie wymagane materiały są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Przygotowanie zwierząt

1. Pozyskać wymaganą liczbę zwierząt z instytucjonalnego zakładu hodowlanego. Zwierzęta należy utrzymywać w 12-godzinnym cyklu światła/ciemności w otwartym systemie pomieszczeń inwentarskich.
2. Odsadz potomstwo w wieku 5 tygodni. Kolczykuj uszy zwierzętom po odsadzeniu i trzymaj je w grupach tej samej płci po 2-3 osobniki w klatce.
3. Z tyłu i w pomieszczeniach dla wszystkich myszoskoczków w klatkach typu 4 (590 x 380 x 200 mm; 1.815 m²). Wyposaż każdą klatkę w co najmniej trzy tunele i żuj drewno dla wzbogacenia. Zapewnij jedzenie i wodę ad libitum (patrz Tabela Materiałów).
4. Losowo przydziel zwierzęta do grup wyszkolonych (samice: n = 27; samce: n = 16) i niewyszkolonych (samice: n = 16; samce: n = 5) w celu zminimalizowania błędu selekcji i zapewnienia porównywalnych warunków wyjściowych między terapiami. Przyzwyczaj zwierzęta zarówno do nagrody w postaci pokarmu, jak i ręki eksperymentatora w środowisku klatki hodowlanej, jak opisano w kroku 2.2. protokołu. Na początku treningu zwierzęta (samice i samce) miały około 8 tygodni
.

2. Przyzwyczajenie zwierząt

UWAGA: Jeśli myszoskoczki nie były transportowane, czas przyzwyczajenia może zostać skrócony. Graficzny przegląd protokołu jest przedstawiony w Rysunek 1. W przypadku zwierząt hodowanych w gospodarstwie okres przyzwyczajenia u młodych osobników może zostać drastycznie skrócony, jeśli zwierzęta rodzicielskie są dobrze przyzwyczajone, a przyzwyczajenie ręczne jest kontynuowane co najmniej raz w tygodniu od momentu, gdy młode stają się mobilne. Ta faza przygotowawcza ma na celu zmniejszenie neofobii i ustanowienie pozytywnego skojarzenia z obchodzeniem się z żywnością, zapewniając płynne przejście do szkolenia opartego na klikerach.

Rysunek 1: Przegląd protokołu habituacji i szkolenia dla zwierząt pochodzących z zewnątrz i hodowanych w domu: Ten rysunek przedstawia harmonogram i kluczowe kroki proceduralne protokołu habituacji i szkolenia stosowanego dla myszoskoczków pochodzących z zewnątrz i myszoskoczków hodowanych wewnętrznie. Protokół obejmuje wstępne obchodzenie się, przyzwyczajenie do jedzenia, wprowadzenie do klikera i szkolenie z klikera, dostosowane w zależności od pochodzenia i wstępnej ekspozycji zwierząt. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

1. Tydzień 1: Przyzwyczajenie do zwierząt pochodzących z zewnątrz
   1. Po przyjeździe myszoskoczki trzymają się w grupach tej samej płci po 2-3 zwierzęta w klatce. Dodaj materiał do gniazdowania i ściółki z pudełka transportowego wraz z niewielką ilością znanych granulek żywności, aby wspomóc aklimatyzację.
   2. Wyposaż każdą klatkę w co najmniej 3-4 tunele (np. tekturowe tuby lub plastikowe schronienia) i wypełnij ściółkę na głębokość około 8-10 cm, aby umożliwić typowe dla gatunku zachowanie podczas kopania.
   3. Unikaj podnoszenia myszoskoczków za ogon, ponieważ może to spowodować stres i ryzyko zranienia ogona²⁶. Zamiast tego używaj miseczek, aby delikatnie przenosić zwierzęta, gdy jest to konieczne (patrz Rysunek 2A).
   4. Natychmiast rozpocznij habituację opartą na jedzeniu, rozsypując ~5 g pestek dyni lub słonecznika do ściółki (patrz Tabela Materiałów). Zachęca to do kopania i zapoznaje zwierzęta z nagrodą.
   5. Następnego dnia wprowadź jedną rękę zawierającą ~10 nasion nagrody do klatki na 2-3 minuty. Jeśli zwierzęta nie pobierają nasion bezpośrednio, umieść ~5 g nasion w ściółce.
   6. Powtarzaj tę procedurę raz dziennie, aż zwierzęta wezmą pokarm z ręki. Zwykle trwa to około tygodnia. Jeśli uda się wcześniej, przejdź do treningu klikerowego (patrz krok 3).
   7. Podczas habituacji oceń preferencje żywieniowe, podając różne rodzaje nasion w dłoni i licząc pozostałe nasiona po 2-3 min.
      UWAGA: Podawaj jedzenie w małych porcjach wyłącznie jako nagrodę, aby wzmocnić pożądane zachowanie. Upewnij się, że nagroda w postaci jedzenia jest zgodna z wytycznymi żywieniowymi dla zwierząt laboratoryjnych. Chociaż w tym protokole wykorzystuje się pestki dyni i słonecznika, można zastosować inne odpowiednie nagrody, jeśli spełniają one wymagania higieny obiektu. Dopuszczalne są również dostępne w handlu przysmaki przeznaczone dla zwierząt laboratoryjnych.
2. Tydzień 1: Przyzwyczajenie do zwierząt hodowanych w domu
   1. Rozpocznij przyzwyczajanie się do nagrody w postaci pokarmu bezpośrednio w klatce hodowlanej, umieszczając ~5 g pestek dyni lub słonecznika w ściółce, jak opisano w kroku 2.1.3. Ten krok należy rozpocząć z parą hodowlaną przed porodem, aby zapoznać się z nagrodą.
   2. Gdy zwierzęta hodowlane niezawodnie spożyją nasiona z ściółki, zaoferuj nagrodę z ręki eksperymentatora, postępując zgodnie z procedurą opisaną w kroku 2.1.4. Pozwól zwierzętom odkrywać i dobrowolnie odbierać nagrodę przez 2-3 minuty dziennie.
   3. Po porodzie samicy należy zawiesić habituację ręczną na co najmniej 1 tydzień. W tym czasie kontynuuj dostarczanie nagród żywieniowych bezpośrednio do ściółki klatki 1-5 razy w tygodniu, aby utrzymać ekspozycję.
   4. Wznów habituację ręczną, gdy szczenięta staną się mobilne (około 18-21 dnia po porodzie). Pozwól zwierzętom badać rękę z nagrodą przez 2-3 minuty na sesję. Wspiera to wczesne zaznajomienie potomstwa z kontekstem treningowym.
   5. W wieku 5 tygodni odsadz młode osobniki od piersi i umieść je w grupach tej samej płci po 2-3 zwierzęta w klatce. Kontynuuj habituację, umieszczając nagrodę w postaci jedzenia w nowej klatce w dniu przeniesienia.
   6. Następnego dnia po odsadzeniu należy ponownie wprowadzić ręczne podawanie pokarmu, jak opisano powyżej (kroki 2.1.4 i 2.1.5).
   7. Powtarzaj tę procedurę raz dziennie, aż zwierzęta wezmą pokarm z ręki.
   8. Gdy młode osobniki konsekwentnie pobierają nagrodę z ręki, postępuj zgodnie z protokołem treningowym (patrz krok 3). Zwykle trwa to około 1 tygodnia. Jeśli uda się wcześniej, przejdź do treningu klikerowego (patrz krok 3).

Rysunek 2: Obchodzenie się i przyzwyczajanie myszoskoczka za pomocą pozytywnego wzmocnienia. (A) Obchodzenie się z myszoskoczkiem w miseczce: Myszoskoczek jest delikatnie nabierany obiema rękami w miseczkach, aby zminimalizować stres. (B) Początek treningu: Ręka eksperymentatora jest umieszczana na podłodze klatki, a nagrody w postaci jedzenia znajdują się na dłoni. Myszoskoczek bierze nagrodę, a kliknięcie służy do oznaczenia zachowania. (C) Myszoskoczek dobrowolnie siada na dłoni eksperymentatora, co wskazuje na udany trening. Nagroda w postaci jedzenia jest w widoczny sposób umieszczona na dłoni. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

3. Trening z klikerem

UWAGA: Rozpocznij trening tylko wtedy, gdy myszoskoczek przyjmie jedzenie z ręki eksperymentatora. Jeśli nie, przedłuż fazę przyzwyczajania się do jedzenia poza czas opisany w kroku 2.1. lub 2.2.

1. Przegląd szkoleń
   1. Przeprowadź jedną sesję treningową na myszoskoczka dziennie, z których każda trwa 4 minuty. Przeprowadź trening bezpośrednio w domowej klatce zwierzęcia, aby zmniejszyć stres i utrzymać znajome środowisko. Nie jest konieczne usuwanie wszystkich elementów wzbogacających, ale upewnij się, że w klatce pozostała co najmniej jedna rurka lub tunel oraz że jest wystarczająco dużo miejsca na rękę eksperymentatora na podłodze klatki.
      UWAGA: Idealnie byłoby, gdyby szkolenie odbywało się w dedykowanym pomieszczeniu ciszy. Jeśli nie jest to wykonalne, można zastosować dźwiękoszczelną szafę w pomieszczeniu dla zwierząt, pod warunkiem, że skutecznie zmniejsza ona narażenie na hałas i zakłócenia otoczenia.
   2. Aby zapobiec sytuacji, w której sygnały słuchowe staną się zmiennymi zakłócającymi, należy bezwzględnie unikać komunikacji werbalnej lub dźwięków wokalnych podczas sesji treningowych. Ogranicz wszelkie interakcje głosowe ze zwierzętami do okresów poza kontekstem treningu.
   3. Wykorzystaj powtarzanie docelowego zachowania (np. dobrowolne siedzenie na dłoni eksperymentatora) jako praktyczny wskaźnik udanego przyzwyczajenia i uczenia się podczas treningu. Uznaj, że trening jest udany, gdy to zachowanie jest obserwowane co najmniej 5 razy na sesję przez trzy kolejne dni (patrz krok 3.4.4).
2. Przygotowanie do treningu
   1. Przygotuj wszystkie potrzebne materiały: pokrój pestki słonecznika na pół lub pestki dyni na trzy części jako nagrody. Zapewnij kliker nożny, aplikację timera, która wykorzystuje wskazówki kolorystyczne (brak dźwięku) lub dowolny inny cichy timer (cyfrowy lub analogowy) oraz czystą klatkę wtórną (patrz Tabela materiałów).
   2. Przenieś klatkę domową do cichego, wolnego od zakłóceń miejsca, w którym odbędzie się trening, aby zminimalizować stresory środowiskowe. Unikaj nagłych lub głośnych dźwięków, takich jak rozmowa, trzaskanie drzwiami lub odgłosy sprzętu podczas sesji, ponieważ myszoskoczki są bardzo wrażliwe na bodźce słuchowe.
   3. Usuń wszystkie elementy wzbogacające z wyjątkiem jednego tunelu. Upewnij się, że pozostały tunel nie utrudnia dostępu do obszaru treningowego. Upewnij się, że jest wystarczająco dużo miejsca, aby pomieścić dłoń.
   4. Przenieś dowolne zwierzę towarzyszące do czystej klatki dodatkowej, w tym niewielką ilość ściółki w klatce domowej i wzbogacenie, aby zmniejszyć stres podczas separacji.
   5. Umieść zatrzask stopy (urządzenie mechaniczne, które wydaje dźwięk kliknięcia po naciśnięciu stopą; patrz Tabela materiałów) pod stołem lub powierzchnią treningową. Dzięki temu trener może zaznaczyć pożądane zachowanie bez użycia rąk, zapewniając stałe wyczucie czasu, jednocześnie pozostawiając obie ręce dostępne do interakcji ze zwierzęciem.
3. Dzień szkolenia 1-5: Wprowadzenie do klikera
   1. Uruchom minutnik: dotknij Start w aplikacji lub naciśnij przycisk na cichym timerze.
   2. Stań lub usiądź przed klatką. Umieść pięć kawałków wybranego nasiona na dłoni i połóż dłoń płasko na podłożu w jednym rogu klatki.
   3. Kliknij w momencie, gdy myszoskoczek weźmie nasiono z ręki (Rysunek 2B). Jeśli w sekwencji pobieranych jest wiele nasion, kliknij po każdym z nich. Użyj dźwięku kliknięcia, aby skojarzyć nagrodę w postaci jedzenia z zachowaniem karmienia z ręki.
   4. Zakończ trening, gdy zwierzę wykona pożądane zachowanie 5x lub gdy zegar osiągnie zero (po 4 minutach).
   5. Począwszy od 3 dnia, w zależności od zachowania myszoskoczka, zacznij oferować nasiona pojedynczo. Trzymaj rękę tuż nad podłogą klatki, aby zachęcić zwierzę do rozciągnięcia się lub nawiązania krótkiego kontaktu z przednimi łapami (Rysunek 2C). Pomaga to stopniowo kształtować zachowanie i przygotowuje zwierzę do następnej fazy treningu (patrz krok 3.4).
4. Dzień treningowy 6-10
   UWAGA: Opcjonalna wskazówka treningowa: Jeśli myszoskoczek niechętnie wspina się na rękę, podziel zadanie na mniejsze, budujące pewność siebie kroki. Po pierwsze, wzmocnij zachowanie polegające na dotykaniu dłoni, zanim spodziewasz się, że zwierzę się wspina. Użyj tej strategii kształtowania, aby zmniejszyć stres i wesprzeć zwierzęta, które potrzebują więcej czasu, aby przyzwyczaić się do obchodzenia się z nimi.
   1. Oferuj tylko jedno ziarno na raz. Trzymaj rękę lekko uniesioną nad podłożem, aby zachęcić myszoskoczka do pełnego wspięcia się na rękę, aby uzyskać dostęp do nagrody. Ten krok opiera się na poprzednim procesie kształtowania i reprezentuje przejście do ostatecznego zachowania docelowego.
   2. Gdy myszoskoczek konsekwentnie wspina się na rękę, kliknij, aby wzmocnić zachowanie. Zacznij oferować nasiona za pomocą drugiej ręki (patrz Rysunek 3). Utrzymuj rękę treningową nad podłogą klatki, tak aby myszoskoczek musiał się na nią całkowicie wspiąć. Użyj jednej ręki, aby trzymać ziarno między kciukiem a palcem wskazującym (Rysunek 3A) lub użyj jednej ręki, aby pokazać nagrodę nad dłonią drugiej ręki, na którą zwierzę jest zachęcane do wspinania się (Rysunek 3B).
   3. Oceń sukces treningu jako myszoskoczek dobrowolnie siadający na ręce eksperymentatora 5 razy na sesję i przyjmujący nagrodę z dłoni lub z drugiej ręki.
   4. Zakończ szkolenie po maksymalnie 3 tygodniach (5 dni w tygodniu) lub gdy cel treningowy jest konsekwentnie demonstrowany przez 3 kolejne dni.
      UWAGA: Chociaż protokół określa ustrukturyzowaną fazę treningu trwającą do 3 tygodni, sesje wzmacniające mogą być kontynuowane po tym okresie, jeśli zajdzie taka potrzeba, szczególnie gdy spodziewane jest opóźnienie między końcem treningu a rozpoczęciem procedur eksperymentalnych. Ciągłe pozytywne wzmacnianie może pomóc w utrzymaniu wyuczonego zachowania i zapewnić niezawodność w czasie. Zalecamy kontynuowanie wzmacniania raz w tygodniu po pomyślnym zakończeniu fazy treningowej. Jednakże, aby zapewnić spójność i porównywalność między zwierzętami, przed przejściem do zadań doświadczalnych należy udokumentować wyraźny punkt końcowy szkolenia – zdefiniowany przez stabilną i powtarzalną wydajność zachowania docelowego.

Rysunek 3: Przykłady ułożenia ręki podczas wręczania nagrody. (A) Nagroda jest trzymana między kciukiem a palcem wskazującym tej samej ręki, podczas gdy zwierzę siedzi na dłoni. (B) Nagroda jest trzymana drugim i wskazującym palcem, podczas gdy zwierzę siedzi na dłoni drugiej ręki. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

4. Przeprowadzanie testów behawioralnych po treningu (dzień 10+)

1. Test interakcji
   UWAGA: Zmienne zależne: Podstawową zmienną zależną jest czas trwania dobrowolnej interakcji między zwierzęciem a ręką eksperymentatora w drugiej minucie testu. Interakcja jest definiowana jako bezpośredni kontakt fizyczny, taki jak wąchanie, wspinanie się lub dotykanie dłoni przednimi łapami¹⁰. Scoring behawioralny opiera się na nagraniach wideo i może być wykonywany ręcznie lub za pomocą oprogramowania do analizy behawioralnej.
   1. Ustaw kamerę zamontowaną na statywie nad stołem, na którym zostanie przeprowadzony test interakcji.
   2. Jeśli zwierzęta są trzymane w grupach, należy je przenieść do czystej klatki wtórnej zawierającej garść ściółki z klatki domowej.
   3. Usuń wszystkie tunele lub schronienia z klatki domowej i umieść je w czystej klatce. Pozostaw tylko ściółkę w klatce testowej (=klatce domowej). Umieść klatkę domową, teraz zawierającą tylko pościel, pod kamerą.
   4. Stosuj czynności polegające na przenoszeniu miseczek, aby delikatnie przywrócić zwierzę testowe do klatki domowej.
   5. Rozpocznij nagrywanie. Pozostań nieruchomo przed klatką przez 1 minutę. Po 1 minucie umieść jedną rękę w rękawiczce w klatce w pobliżu przedniej krawędzi na dodatkowy 1 minutę.
   6. Zmieniaj rękawiczki między zwierzętami różnej płci.
2. Test w terenie otwartym
   UWAGA: Zmienne zależne: Mierzone zmienne obejmują całkowity przebyty dystans, czas spędzony w strefie środkowej w porównaniu z peryferiami, liczbę wejść do środka i zdarzenia związane z odchowem. Wskaźniki te odzwierciedlają ogólną aktywność lokomotoryczną i zachowania podobne do lęku. Zwiększony czas centrum jest zwykle interpretowany jako zmniejszony niepokój. Zachowanie jest rejestrowane za pomocą wideo i analizowane za pomocą automatycznego oprogramowania śledzącego (patrz Spis materiałów).
   1. Umieść kamerę nad areną na otwartym polu (100 cm x 100 cm x 40 cm).
   2. Rozpocznij nagrywanie wideo, a następnie delikatnie umieść zwierzę na środku areny, używając chwytania za miseczki. Nagrywaj zachowanie przez 7 minut.
   3. Po badaniu należy umieścić zwierzę z powrotem w klatce domowej. Oczyść pudełko i ściany na otwartym polu 70% etanolem po każdym zwierzęciu. Poczekaj, aż etanol całkowicie wyparuje, zanim umieścisz następne zwierzę na arenie.

5. Analiza statystyczna

1. Podczas gdy pełne zaślepienie eksperymentatora nie było możliwe podczas sesji treningowych ze względu na charakter bezpośredniej interakcji ze zwierzętami, przeprowadź analizę danych behawioralnych w sposób zaślepiony, aby zmniejszyć stronniczość obserwatora.
2. Zarówno w przypadku interakcji, jak i testów w terenie otwartym, nagrywaj wszystkie sesje na wideo. Zbieraj zmienne zależne ręcznie przez przeszkolonych obserwatorów (test interakcji) lub automatycznie za pomocą oprogramowania do analizy behawioralnej (patrz tabela materiałów) w przypadku otwartych nagrań terenowych (czas spędzony w strefie środkowej).
3. Przed analizą statystyczną przetestuj wszystkie dane pod kątem rozkładu normalnego za pomocą testu Shapiro-Wilka. Identyfikuj wartości odstające i wykluczaj je przy użyciu metody ROUT (Robust Regression and Outlier Removal) ze współczynnikiem fałszywych wykryć (Q) ustawionym na 10%. Aby przeanalizować wpływ treningu i seksu na wyniki behawioralne, przeprowadź dwukierunkową ANOVA powtarzanych pomiarów dla testu interakcji oraz mieszaną dwukierunkową ANOVA w celu oceny czasu spędzonego w centrum testu na otwartym polu.
4. Skategoryzuj test interakcji i skumulowany czas spędzony w środkowej strefie otwartego pola jako główne zmienne zależne. Przeprowadzaj porównania post hoc za pomocą testu Tukey's Honest Significant Difference (HSD). Wartość p wynosząca < 0,05 została uznana za statystycznie istotną. Wszystkie analizy statystyczne zostały wykonane przy użyciu oprogramowania statystycznego (patrz tabela materiałów).

Wyniki

Wszystkie wyszkolone myszoskoczki nauczyły się przydzielonego im zadania w ciągu 10 dni, co dowodzi wykonalności treningu klikerowego u tego gatunku. Rysunek 4 przedstawia sukces szkoleniowy samic (n=27) i samców (n=16) myszoskoczków od dnia 1 do dnia 10. Powtarzające się pomiary ANOVA analizujące wydajność w dniu treningu 1 w porównaniu z dniem 10 u samców i samic myszoskoczków nie wykazały znaczącego wpływu interakcji między czasem a płcią (F_{(1, 41)} = 0,003; p = 0,955), co wskazuje, że poprawa w czasie była podobna dla obu płci. Zaobserwowano bardzo istotny wpływ czasu (F_{(1, 41}) = 38,83, p < 0,0001), co pokazuje, że myszoskoczki obu płci w pełni przestrzegały protokołu treningowego do 10 dnia.

Fakt, że wyszkolone myszoskoczki wykonały przydzielone im zadanie w ciągu 10 dni, potwierdza skuteczność metodologii treningu klikerów u tego gatunku. Ten wskaźnik sukcesu jest zgodny z podstawowymi zasadami warunkowania instrumentalnego, w którym kliker działa jako drugorzędny wzmacniacz, który wypełnia lukę między pożądanym zachowaniem a główną nagrodą (pestki słonecznika / dyni). Kliker służy jako pomost między zachowaniem a nagrodą, pozwalając trenerowi zaznaczyć dokładny moment, w którym pojawia się pożądane zachowanie z precyzyjnym wyczuciem czasu. Pomaga to stworzyć jasny i natychmiastowy związek między działaniem a jego pozytywnymi konsekwencjami.

Testy behawioralne zostały przeprowadzone po zakończeniu protokołu treningowego, a konkretnie po 10 dniu treningu. Dwukierunkowa mieszana analiza ANOVA wykazała, że wyszkolone myszoskoczki zwiększyły dobrowolną interakcję z ręką eksperymentatora (Ryc. 5A). Wykryto istotny efekt treningu (F _{(1, 60)} = 22,89; p < 0,0001), przy czym wyszkolone zwierzęta częściej angażowały się w eksperymentatora. Analiza post hoc ujawniła specyficzne różnice w treningu u kobiet (p < 0,0001, n = 27) i mężczyzn (p = 0,049, n = 16). Nie zaobserwowano wpływu płci (F_{(1, 60)} = 0,621, p = 0,434), co sugeruje, że samce i samice myszoskoczków zachowywały się podobnie. Analiza nie wykazała istotnej interakcji między seksem a treningiem (F_{(1, 60)} = 0,078, p = 0,781).

Zwiększona dobrowolna interakcja myszoskoczków wskazuje, że trening klikerowy skutecznie zmniejszył wrodzone reakcje strachu poprzez pozytywne wzmocnienie. Może to pomóc zminimalizować stres podczas obchodzenia się i procedur eksperymentalnych, poprawiając zarówno dobrostan zwierząt, jak i jakość danych.

Ocena zachowań podobnych do lęku po treningu została przeprowadzona za pomocą Testu Otwartego Pola. Rysunek 5B ilustruje łączny czas spędzony w strefie środkowej. Nie zaobserwowano interakcji między płcią a treningiem w skumulowanym czasie trwania w środkowej strefie testu otwartego (F_{(1, 60)} = 0,101, p = 0,751). Dodatkowo nie stwierdzono istotnego głównego wpływu płci (F_{(1, 60)} = 0,001, p = 0,969. Zaobserwowano bardzo istotny główny efekt treningu (F_{(1, 60)} = 17,26, p < 0,0001; Test HSD Tukeya: p = 0,003 i p = 0,052 odpowiednio u samic i samców), co wskazuje, że wyszkolone myszoskoczki spędzały znacznie więcej czasu w centrum w porównaniu z niewyszkolonymi. Wyniki te odzwierciedlają reakcje behawioralne mierzone po ukończeniu przez zwierzęta 10-dniowego okresu treningowego.

OFT wykorzystuje naturalny konflikt między podejściem a unikaniem, którego doświadczają gryzonie podczas eksploracji nowych środowisk²⁷. Myszoskoczki mogą równoważyć swój wrodzony zapał do eksploracji z naturalną tendencją do unikania potencjalnie niebezpiecznych otwartych przestrzeni. Dlatego fakt, że wyszkolone myszoskoczki spędzały więcej czasu w strefie centrum wywołującego niepokój, wskazuje, że trening klikerowy zwiększył ich ogólną behawioralną gotowość do eksploracji, co może wskazywać na poprawę ogólnego dobrostanu.

Rysunek 4: Walidacja treningu klikera. Sukces treningowy w dniu 1 w porównaniu z dniem 10 dla mężczyzn i kobiet: Sukces treningowy oceniano u myszoskoczków płci żeńskiej (białe paski, n = 27) i męskiej (szare paski, n = 16) w dniu 1 i dniu 10 protokołu treningowego. Dwukierunkowa ANOVA z powtarzanymi pomiarami ujawniła istotny główny efekt dnia treningowego (p < 0,0001). Wielokrotne porównania za pomocą testu HSD Tukeya wykazały znaczny wzrost sukcesu treningowego od 1 do 10 dnia zarówno u kobiet (p < 0,0001, n = 27), jak i mężczyzn (p < 0,0001, n = 16). Dane są prezentowane jako średnia ± SD. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Ocena behawioralna. (A) Test interakcji: Czas interakcji z ręką eksperymentatora (w s) był mierzony w wyszkolonych (szare paski) i niewytrenowanych (białe paski) samicach i samcach myszoskoczków po zakończeniu przez zwierzęta 10-dniowego okresu treningu. Dwukierunkowa mieszana ANOVA ujawniła istotny główny efekt treningu (p < 0,05) i istotny efekt interakcji (p < 0,05). Analiza post hoc przy użyciu testu HSD Tukeya wykazała, że wyszkolone myszy wchodziły w interakcję znacznie dłużej z ręką eksperymentatora w porównaniu z myszami niewyszkolonymi (samice: p < 0,0001, samce: p = 0,0497). Dane przedstawiono jako średnią ± SD. Przeszkolone kobiety: n= 27; samice niewyszkolone: n =16; wyszkolonych mężczyzn: n = 16; Samce niewyszkolone: n = 5. (B) Test w terenie otwartym: Test został przeprowadzony po zakończeniu protokołu treningowego, a konkretnie po 10. dniu treningu. Łączny czas spędzony w strefie środkowej (strefach) mierzono w wyszkolonych (szare paski) i niewytrenowanych (białe paski) samicach i samcach myszoskoczków. Przeprowadzono dwukierunkową mieszaną ANOVA w celu przeanalizowania wpływu treningu na eksplorację strefy centralnej. Wielokrotne porównania za pomocą testu HSD Tukeya wykazały, że wytrenowane kobiety spędzały znacznie więcej czasu w strefie środkowej w porównaniu z samicami niewytrenowanymi (p = 0,003). Dane przedstawiono jako średnią ± SD. Przeszkolone kobiety: n= 27; samice niewyszkolone: n =16; wyszkolonych mężczyzn: n = 16; Samce niewyszkolone: n = 5. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

Wyniki pokazują skuteczność proponowanego protokołu w przyzwyczajaniu myszoskoczków do interakcji z ludźmi w środowiskach eksperymentalnych. Zdolność wszystkich wyszkolonych zwierząt do wykonania żądanego zadania w ciągu 10 dni podkreśla skuteczność tej metody.

Jednym z krytycznych kroków w protokole jest stopniowe przyzwyczajanie się do ręki eksperymentatora, upewniając się, że myszoskoczki kojarzą interakcję z człowiekiem z pozytywnym bodźcem. Stosowanie nagród specyficznych dla gatunku dodatkowo optymalizuje proces treningu. Modyfikacje, takie jak dostosowanie czasu trwania sesji treningowych lub zmiana rodzaju nagrody, mogą jeszcze bardziej dostosować protokół do indywidualnych różnic między myszoskoczkami i zoptymalizować go pod kątem konkretnych wymagań eksperymentu.

Skupiamy się na zauważalnych specyficznych dla gatunku różnicach w zachowaniu i dynamice uczenia się między myszami a myszoskoczkami mongolskimi. Takie różnice należy wziąć pod uwagę przy projektowaniu protokołów treningowych. Na przykład myszy są zwykle bardziej neofobiczne i wrażliwe na stres, często potrzebują więcej czasu, aby przyzwyczaić się do nowego środowiska^{i interakcji} międzyludzkich. Natomiast myszoskoczki wykazują większy popęd eksploracyjny i ciekawość społeczną, co może ułatwić szybsze zaangażowanie w zadania szkoleniowe²⁹. W niniejszym badaniu myszoskoczki chętnie zbliżyły się do ręki eksperymentatora i nauczyły się kojarzyć kliker z nagrodą w mniejszej liczbie sesji niż zwykle zgłaszano u myszy^21,22. Jednak myszoskoczki wykazywały również większą zmienność osobniczą, szczególnie u samców, co może odzwierciedlać stres specyficzny dla płci lub czynniki motywacyjne, które są mniej wyraźne w modelach mysich. Różnice te podkreślają znaczenie strategii treningowych dostosowanych do gatunku i sugerują, że myszoskoczki mogą czerpać korzyści z krótszych, skoncentrowanych na nagrodzie sesji z większym naciskiem na dobrowolne interakcje, podczas gdy myszy mogą wymagać bardziej stopniowego odczulania i konsekwentnego powtarzania. Zrozumienie tych różnic behawioralnych i poznawczych ma kluczowe znaczenie dla udoskonalenia protokołów treningowych i maksymalizacji ich skuteczności u różnych gatunków.

Myszoskoczki mongolskie mogą odnieść znaczne korzyści z niespecyficznego lub uogólnionego treningu klikerowego, który koncentruje się na pozytywnej interakcji człowiek-zwierzę i podstawowym warunkowaniu behawioralnym, a nie na przygotowaniu do konkretnej konfiguracji eksperymentalnej. Takie uogólnione szkolenie zwiększa tolerancję na obchodzenie się z piłką, zmniejsza podstawowy poziom stresu i promuje bardziej przewidywalne czynniki wyjściowe zachowania, które są cenne w szerokim zakresie kontekstów eksperymentalnych^. Trening niespecyficzny promuje elastyczność behawioralną i konsekwentną, dobrowolną interakcję z eksperymentatorem, dzięki czemu zwierzęta są bardziej zdolne do przystosowania się do różnych środowisk, konfiguracji lub paradygmatów testowania 16,31,32. Jest to szczególnie korzystne w badaniach długoterminowych lub eksperymentach wielofazowych, w których zwierzęta są poddawane różnorodnym procedurom. W niniejszym badaniu, mimo że trening nie był bezpośrednio związany z pojedynczym protokołem testowym, myszoskoczki wykazały lepszą interakcję z eksperymentatorem i zmniejszone zachowania związane ze stresem, wspierając ideę, że ogólne przyzwyczajenie poprzez pozytywne wzmocnienie może poprawić ogólną odporność eksperymentalną i dobrostan zwierząt.

Oprócz zwiększonej interakcji z eksperymentatorem, wyszkolone samice spędzały znacznie więcej czasu w środkowej strefie testu na otwartym polu. Ten wzorzec behawioralny jest powszechnie interpretowany jako zmniejszenie zachowań podobnych do lęku u gryzoni, szczególnie w odpowiedzi na nowe lub łagodnie awersyjne środowiska³³. Odkrycia te sugerują, że trening klikerowy może przyczyniać się do obniżenia behawioralnych wskaźników lęku, zwiększając w ten sposób zdolność zwierząt do radzenia sobie z procedurami eksperymentalnymi. Potwierdza to szerszy wniosek, że protokoły habituacji oparte na pozytywnym wzmocnieniu mogą poprawić odporność na stres i stabilność behawioralną u myszoskoczków laboratoryjnych. Poza redukcją stresu, trening klikerowy ma szersze implikacje dla wyników eksperymentów³⁴. Wytresowane myszoskoczki wykazały większą tolerancję na obchodzenie się z nimi, co minimalizuje zmiany fizjologiczne wywołane stresem, które mogłyby zakłócić wyniki badań. Podobne odkrycia odnotowano u innych gatunków, w tym królików i myszy laboratoryjnych, gdzie zwierzęta wyszkolone za pomocą klikera wykazywały zwiększoną interakcję z eksperymentatorem i mniej zachowań związanych z lękiem i depresją, takich jak zmniejszone oddawanie moczu, defekacja, wokalizacja i unoszenie się w powietrzu^19,21.

Wyniki te podkreślają potencjał treningu klikerowego w zakresie poprawy zarówno dobrostanu zwierząt, jak i spójności danych behawioralnych poprzez zmniejszenie zmienności reakcji związanych ze stresem. Ważne jest, aby wyjaśnić, że celem tego protokołu nie jest warunkowanie zwierząt do kojarzenia z natury awersyjnych procedur – takich jak pobieranie krwi – z pozytywnymi bodźcami, takimi jak kliker. Celem jest raczej zmniejszenie stresu wyjściowego, przyzwyczajenie zwierząt do interakcji z ludźmi i promowanie dobrowolnego udziału w neutralnych lub łagodnie trudnych zadaniach. Podczas gdy niektóre badania badały zastosowanie pozytywnego wzmocnienia w celu przygotowania zwierząt do bardziej inwazyjnych procedur³⁵, wymaga to starannie ustrukturyzowanego procesu odczulania i wykracza poza zakres obecnego protokołu. Niewłaściwe zastosowanie wskazówek klikerowych w kontekstach związanych z dyskomfortem może rzeczywiście skutkować niezamierzonymi negatywnymi skojarzeniami. Jednakże, przy prawidłowym stosowaniu, techniki pozytywnego wzmocnienia mogą pomóc zwierzętom radzić sobie z potencjalnie awersyjnymi procedurami, zwiększając przewidywalność i umożliwiając pewien stopień kontroli³⁶. Potrzebne są dalsze badania, aby ustalić, czy myszoskoczki mogą być niezawodnie szkolone w takich kontekstach, jak to z powodzeniem wykazano u innych gatunków, takich jak psy i naczelne^37,38.

Pomimo swojego sukcesu, metoda ma ograniczenia. Niektóre myszoskoczki wymagały dłuższych okresów przyzwyczajenia, co wskazuje na indywidualną zmienność szybkości uczenia się. Dodatkowo stosunkowo niewielka liczba niewyszkolonych samców myszoskoczków ogranicza moc statystyczną analizy, co utrudnia wyciągnięcie solidnych wniosków. Zwiększenie wielkości próby w tej grupie prawdopodobnie poprawiłoby wiarygodność i możliwość interpretacji wyników. Dalsze badania powinny zbadać potencjalne różnice płci w reakcjach na stres i mechanizmach uczenia się.

Szersze implikacje tego badania wykraczają poza redukcję stresu. Wdrożenie ustrukturyzowanych protokołów treningowych w ramach standardowej hodowli może zmniejszyć zmienność spowodowaną reakcjami fizjologicznymi wywołanymi stresem i poprawić wiarygodność wyników eksperymentalnych^39,40. Jest to szczególnie istotne w dyscyplinach takich jak neurobiologia lub badania metaboliczne, w których stres jest krytycznym czynnikiem zakłócającym. Staranne raportowanie i standaryzacja procedur szkoleniowych są niezbędne, aby uniknąć niezamierzonych efektów wzbogacenia.

Idąc dalej, przyszłe badania powinny dotyczyć alternatywnych harmonogramów wzmacniania, automatyzacji procedur treningowych i długoterminowych skutków dla różnych gatunków. Wraz z rosnącym wsparciem naukowym, szkolenie klikerowe stanowi cenną strategię udoskonalania, która może poprawić zarówno jakość danych, jak i dobrostan zwierząt. Standaryzacja protokołów szkolenia i postępowania w laboratoriach może pomóc w poprawie odtwarzalności i wesprzeć szersze przyjęcie humanitarnych i skutecznych praktyk w badaniach biomedycznych.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Klatki	Zoonlab GmbH	3010006	590 x 380 x 200 mm; 1.815 m2
Kamera	Sony	HDR-CX240E	cyfrowa kamera wideo HD Rejestrator
Granulki spożywcze	Ssniff	V1644-000	Art. Nr I-Clicker-Blau
Foot Clicker		https://www.hundeschulen.com
GraphPad Prism	GraphPad Software, Inc	https://www.graphpad.com/features	Wersja 10 dla systemu Windows
Pudełko otwarte	Noldus	MXO1S-M001	opal 100 x 100 x 40 cm
Pestki dyni	REWE	8820911	REWE
Bio Przeglądarka pylonów	Basler	https://www.baslerweb.com/de-de/software/pylon/
Nasiona słonecznika	Seeberger	4744292
Statyw	Manfrotto	GT- mkbfra4gtxp bh	Befree GT
Tunele	Plexx	14179	152 x 76 x 3 mm