Opracowywanie, charakteryzacja i ocena systemów jonowych cieczy opartych na CAGE do dostarczania transdermalnego

Podsumowanie

Protokół ten omawia standaryzację przygotowania systemów jonowych cieczy opartych na CAGE, aby zapewnić powtarzalność i usprawnić ogólny przepływ pracy w różnych laboratoriach naukowych.

Streszczenie

Ciecze jonowe zyskały ostatnio znaczące uznanie za swoje zastosowania w dostarczaniu leków, w szczególności za potencjał umożliwiający penetrację leków przez skórę i zwiększanie przenikania leków. Oprócz poprawy przepuszczalności bariery, ciecze jonowe mają doskonałe właściwości rozpuszczalne, co odpowiada na wyzwanie rozpuszczania leków słabo rozpuszczalnych. Ze względu na dużą asymetrię między kationami organicznymi a anionami, te funkcjonalne sole pozostają ciekłe w temperaturze pokojowej. Z perspektywy zastosowania ciecze jonowe stanowią obiecujące i wysoce regulowane podejście do obsługi wielu obszarów terapeutycznych. Biokompatybilna ciecz jonowa składająca się z choliny i kwasu geranowego (CAGE), w stosunku jonów stechiometrycznych 1:2, posiada ogromny potencjał do transdermalnego dostarczania szerokiego zakresu aktywnych składników farmaceutycznych, w tym małych cząsteczek, peptydów, białek i kwasów nukleinowych. Ma to minimalny wpływ na funkcjonowanie bariery skórnej. Tutaj przedstawiamy nasze metody przygotowania, charakteryzacji i oceny CAGE. Reprezentatywne wyniki przedstawiono dla charakterystyki CAGE za pomocą spektroskopii NMR, różnicowej kalorymetrii skaningowej, miareczkowania Karla-Fischera do analizy zawartości wody oraz badań interakcji barierowych ex vivo na skórze wieprzowej.

Wprowadzenie

Skóra jest największym i najważniejszym organem organizmu, pełniącym funkcję bariery ochronnej przed szkodliwymi substancjami, a jednocześnie zapobiegającym utracie wody¹. Jednocześnie stosowanie leków na skórę i przez nią przynosi szeroki zakres korzyści. W porównaniu z podawaniem w zastrzykach i doustnie, podanie skórne zwiększa zgodność pacjentów i zapobiega metabolizmowi pierwszego przejścia w wątrobie². Szczególnie w przypadku chorób skóry, preparaty podawane skórnie doskonale wywołują efekt lokalizacyjny, zmniejszając ogólnoustrojową ekspozycję³. Jednak niemal nieprzepuszczalna natura skóry znacznie utrudnia skuteczne skórne użycie⁴. Ludzka skóra składa się z trzech warstw: naskórka, skórka i podskórka⁴. Epidermis to zewnętrzna warstwa skóry, którą można dalej dzielić na różne podwarstwy, przy czym warstwa rogówka jest najbardziej zewnętrzną warstwą, składającą się głównie z keratynocytów. Warstwa rogówki pełni rolę wyraźnej bariery przenikliwej dla większości cząsteczek, hamując ich transport do głębszych^{warstw skóry.} Ta funkcja bariery wynika z obecności korneocytów osadzonych w gęsto upakowanym układzie lipidowym, składającym się głównie z fosfolipidów, steroli i ceramidów, często określanych^{jako struktura} cegły-zaprawa. Aby pokonać tę barierę skórną, zastosowano chemiczne wzmacniacze przenikliwości (CPE), które dostarczają makrocząsteczki, ponieważ zakłócają one strukturę warstwy rogówki poprzez interakcję z lipidami i białkami w niej zawartymi⁷.

Ciecze jonowe (IL) stały się nową generacją CPE⁸. Składają się one z masywnych kationów organicznych i anionów, ułożonych asymetrycznie i skoordynowanych przez słabe, niekierunkowe oddziaływania jonowe⁹. Z powodu tych słabych sił międzycząsteczkowych IL występują jako ciecze poniżej 100 °C i nie są w stanie upakować się w dobrze zdefiniowaną strukturę krystaliczną¹⁰. IL-y są bardzo podatne na regulację, ponieważ ich skuteczność zależy od wyboru kationów lub anionów oraz stosunku stechiometrycznego między tymi jonami. W związku z tym mają wysoką zdolność rozpuszczalności i stabilizacji leków o zróżnicowanej hydrofobiczności¹¹. IL spełniają unikalne właściwości zarówno lipidów, jak i polimerów, zapewniając długotrwałe uwalnianie i enkapsulację makrocząsteczek, odpowiednio¹².

Biokompatybilne ILs oparte na cholinie i kwasie geranowym (CAGE), obecne w stechiometrycznym stosunku molowym 1:2, mają istotne zastosowania w transdermalnym dostarczaniu zarówno związków hydrofilowych, jak i hydrofobowych. Zgłaszano, że CAGE znacząco zwiększa transdermalne dostarczanie białek (insulina¹³) oraz kwasów nukleinowych (siRNA¹⁴). CAGE powstaje w reakcji metatezy soli pomiędzy wodorowęglanem choliny a kwasem geranowim, przy czym CO₂ jest produktem ubocznym¹⁵. Reakcja metatezy soli umożliwia powstawanie nowych związków poprzez wymianę jonową w łagodnych warunkach w sposób bezpośredni, szybki i wysoce selektywny. Ogólnie brakuje łatwych do śledzenia workflow dotyczących rozwoju i oceny CAGE IL. Dlatego tutaj przedstawiamy jeden z takich przepływów pracy, szczegółowo opisujący każdy etap przygotowań do CAGE, aby umożliwić badaczom z różnych dziedzin wejścia do tej dziedziny badawczej.

Protokół

Wszystkie procedury eksperymentalne były przeprowadzane zgodnie z Dyrektywą Unii Europejskiej 2010/63 i zatwierdzone przez Duńską Administrację Weterynarii i Żywności (Licencja nr DK-13-oth-931833).

1. Przygotowanie klatki przez reakcję metatezy soli

1. Rekrystalizacja kwasu geranowego (85% czystości, mol masa 168,23 g/mol)
   1. Weź kolbę o pojemności 500 mL z okrągłym dnem i zmierz jej wagę.
   2. Waż 40,0 g kwasu geranowego w kolbie. Odpowiada to 0,2 mol kwasu geranowego.
   3. Rekrystalizuj kwas geranowy w kwas geranowy 70:30% (w/w): aceton: Dodaj (40 g*0,85*0,30)/(0,70*0,784 g/mL) = 18,42 mL acetonu do kolby z okrągłym dnem.
   4. Weź zlewkę 5 L i przygotuj około 0,5 L suchego lodu i etanolu.
   5. Umieść kolbę z okrągłym dnem w zimnej mieszance suchego lodu i etanolu bez wirowania, aby umożliwić chłodzenie z zewnątrz. Deckantuj aceton i zanieczyszczenia z kwasu stałego/rekrystalizowanego geranowego, gdy krystalizacja osiągnie równowagę (odpowiadającą mniej więcej objętości dodanego acetonu, zazwyczaj w ciągu 0,5-2 godzin). Powtarzaj ten krok 5–6 razy, aby zapewnić odpowiednią czystość.
   6. Usuwać pozostały aceton przez rotacyjne odparowanie pod próżnią przy 40 obr./min przez co najmniej 20 minut lub do momentu, aż kolba z okrągłym dnem przestanie być zimna przy dotyku (aceton ma ciśnienie pary 240 mbar przy 20 °C).
   7. Zważ i zanotuj masę kolby oraz zrekrystalizowanego kwasu geranowego. Oblicz wydajność na podstawie początkowej pustej wagi kolby. Oczekiwany zakres rentowności wynosi 60-80%.
2. Reakcja metatezy soli
   1. Dla stosunku molowego 2:1 kwasu geranowego:cholina oblicz liczbę molów choliny, uwzględniając wydajność rekrystalizacji kwasu geranowego. Na przykład, przy wydajności 70% należy dodać 0,07 mola choliny (0,2*70/100=0,14, 0,14/2 = 0,07).
   2. Wodorowęglan choliny ma czystość 80% i masę cząsteczkową 165,19 g/mol. W związku z tym należy dodać 14,45 g (0,07*165,19 = 11,56 g; 100/80*11,56 g = 14,45 g) wodorowęglanu choliny krople, aby zapobiec rozlewaniu się.
   3. Mieszaj próbkę przez noc z prędkością 300 obr./min (lub odpowiednią) w temperaturze pokojowej (18 ± 3 godziny) lub do momentu zatrzymania parowania_CO2 .
   4. Susz próbkę przez odparowanie obrotowe w temperaturze 60 °C, 30 mbar przez 40 minut. Najpierw podnieś temperaturę, a następnie stopniowo zmniejszaj ciśnienie, aby uniknąć powstawania piany.
   5. Umieść CAGE w szklanych fiolkach w objętościach odpowiednich do zamierzonego zastosowania (np. 2 mL CAGE w 4 mL szklanych fiolkach).
   6. Susz fiolki pod próżnią w 60 °C przez 48 godzin.

2. Charakterystyka CAGE

1. Spektroskopia rezonansu magnetycznego jądrowego (NMR)
   1. Rozpuszcz CAGE do stężenia 25 mg/mL w deuterowanym dimetylosulfoksydzie (d-DMSO), zapewniając końcową objętość co najmniej 500 μL.
      UWAGA: Rozpuszczalniki deuterowane są niezbędne w NMR, aby uniknąć interferencji z atomami wodoru w rozpuszczalniku.
   2. Przelej 500 μL przygotowanego roztworu do czystej, suchej rurki NMR (zazwyczaj o średnicy 5 mm, w zależności od instrumentu). Zamknij tubkę zakrętką, aby zapobiec parowaniu i zanieczyszczeniu.
      UWAGA: Unikaj wprowadzania pęcherzyków powietrza, ponieważ mogą one wpływać na jednorodność pola magnetycznego.
   3. Użyj spektrometru NMR (np. 400 MHz) o następujących parametrach:
      -Liczba skanów: 8-16 dla ¹H NMR; 1 000-5 000 dla ¹³C NMR (w zależności od stężenia i pożądanego stosunku sygnału do szumu (S/N)).
      -Opóźnienie relaksacyjne (D1): 1-2 s dla ¹H i ¹³C NMR.
   4. Przetwarzaj dane przy użyciu odpowiedniego oprogramowania.
      1. Dostosuj do optymalnych kształtów szczytów poprzez korektę fazy i bazy.
         UWAGA: Zazwyczaj wykonuje się to w oprogramowaniu NMR w zakładce Processing lub Correction (w zależności od używanego oprogramowania), gdzie dostępne są automatyczne narzędzia do korekcji fazy i korekcji bazowej.
      2. Użyj resztkowego szczytu rozpuszczalnika (d-DMSO) jako odniesienia: ~ około 2,50 ppm dla ¹H, ~ około 39,52 ppm dla ¹³C NMR. Zobacz Fulmer i ^in.15dla odniesień dotyczących zanieczyszczeń.
   5. Całkowanie pików i przypisywanie ich protonom w strukturze (patrz Rysunek 1).
2. Zawartość wody określana przez miareczkowanie Karla Fischera
   1. Rozpuścić 300 mg CAGE w 300 μL metanolu. Włóż do strzykawki o pojemności 1 mL i zważ przed i po wstrzyknięciu.
   2. Określ zawartość wody za pomocą miareczka kulometrycznego Karla Fischera zgodnie z instrukcjami producenta.
      1. Wstrzyknij próbkę do komórki miareczkowej przez przegrodę za pomocą strzykawki, wpisz pusty ciężar strzykawki i naciśnij Enter. Wynik pojawi się jako % w/w.
      2. Uwzględnić zawartość wody w metanolu, aby uzyskać rzeczywistą zawartość wody w CAGE (zazwyczaj 1–2% w/w). (W_próbka = W_{próbka+rozcieńczacz*}(_{m próbka}+m_{rozcieńczalnik}) - (W_{rozcieńczacz*m rozcieńczalnik})/m_próbki).
3. Stabilność termiczna CAGE za pomocą różnicowej kalorymetrii skaningowej (DSC)
   1. Włóż 3-5 mg każdej próbki do aluminiowych patelni Tzero i zapieczętuj hermetyczną pokrywką.
   2. Analizuj próbki za pomocą DSC w zakresie temperatur od 80 °C do - 80 °C z okresem izotermicznym 10 minut przed ochłodzeniem do - 80°C.
   3. Stosuj stałą szybkość ogrzewania/chłodzenia 5 °C/min oraz oczyszczenia azotem o wydajności 50 mL/min.
   4. Przetwarzaj dane za pomocą odpowiedniego oprogramowania.

3. Ocena ex vivo interakcji bariery skórnej

1. Obróbka dermatometyczną skóry wieprzowej
   1. Przytnij ekspandowany polistyren (EPS) tak, aby pasował do ostrza dermatomu i owiń go taśmą do szczepienia. Wykorzystaj skórę pobraną z okolic biodrowej świń za pomocą skalpela. Tutaj pozyskano skórę od 3,5-miesięcznych samic duńskiej świń Landrace lub Yorkshire (30-40 kg).
   2. Usuń mięśnie i tkankę tłuszczową. Aby ułatwić dermatoming tkanki, ważne jest, aby mieć płaską i równą stronę bazolateralną.
   3. Usuń jak najwięcej włosów ze skóry za pomocą trymera.
   4. Płukaj skórę solą fizjologiczną z buforem fosforanowym (PBS, pH 7,4), aby usunąć krew i luźne włosy.
   5. Pokrój skórę na mniejsze kawałki (5 cm x 15 cm) nożem, aby dopasować bloki EPS.
   6. Przymocuj skórę do bloku EPS igłami.
   7. Ustaw dermatom na grubość 0,5 mm i przeciń skórę.
   8. Przechowuj skórę z dermatomem między dwoma warstwami taśmy przeszczepowej i przechowywaj w temperaturze -70 °C.
2. Utrata wody przez skórę (TEWL)
   1. Przygotuj PBS (pH 7,4), rozpuszczając 1 tabletkę w 200 mL ultraczystej wody. Odgazowanie przez 20 minut w kąpieli ultradźwiękowej.
   2. Włącz kąpiel wodną podłączoną do ogniw dyfuzyjnych Franza. Dodaj około 12 mL odgazowanego PBS oraz magnetyczną kulkę do każdego ogniwa. Włącz mieszanie magnetyczne (np. przy 600 obr./min), zapewniając równomierny rozkład w ośrodku receptorowym bez wywoływania turbulencji. Należy zauważyć, że nie wszystkie układy ogniw Franza pozwalają na precyzyjną kontrolę prędkości mieszania. Reguluj źródło ogrzewania do temperatury 37 °C w ośrodku receptorowym.
   3. Skórę z dermatomem pokrój na kawałki o średnicy około 3 cm (lub odpowiednim rozmiarze) skalpelem i ostrożnie przymocuj skórę z dermatomem na komórkach dyfuzji Franza za pomocą zacisków i pierścieni uszczelniających, z warstwą rogówki skierowaną do góry.
   4. Następnie całkowicie wypełnij komory receptorowe PBS za pomocą szklanej pipety Pasteura, upewniając się, że są wypełnione do poziomu wskazującego znaną objętość ośrodka receptorowego. Usuwając pęcherzyki powietrza, ostrożnie odwracając komórki. Nawadniaj się przez 30 minut.
   5. Włącz urządzenie TEWL i wyrównuj przez 20 minut, aż ustabilizuje się zgodnie z zaleceniami producenta.
   6. Umieść sondę TEWL na każdej komórce Franza i naciśnij Start w programie. Trzymaj ją, aż pojawi się odczyt.
   7. Dodaj 300 μL próbki na skórę (w potrójnych egzemplarzach n=3) i zakryj ją, przykładając taśmę do przeszczepu na komórkę Franza. Inkubuj przez 24 godziny w temperaturze 37 °C (temperatura ośrodka receptorowego).
   8. Usuń próbkę, przetrzeć tkankę chusteczkami bez kłaczków. Wyjedź na 30 minut.
   9. Zmierz TEWL dla każdej komórki, aby zbadać wpływ próbek na barierę skórną. Obliczaj wartości TEWL względem wartości przed ekspozycją i dostosowuj względem kontroli PBS (względny TEWL = (TEWL_po TEWL-pre/TEWL _pre)/(TEWL(PBS)_post-TEWL(PBS_)pre/TEWL(PBS_)pre))*100.

Wyniki

Spektra NMR
Celem tej techniki jest potwierdzenie pomyślnego powstania CAGE poprzez analizę środowisk chemicznych atomów wodoru i węgla za pomocą spektroskopii NMR ¹H i ¹³C. Powstałe widma dostarczają charakterystycznych przesuń chemicznych, wzorców rozszczepienia oraz wartości całkowania, które odzwierciedlają strukturę molekularną i skład syntetyzowanego IL. Widmo NMR protonowych na Rysunku 1 potwierdza stosunek molowy 2:1 kwasu geranowego do choli...

Dyskusja

Metoda przygotowania CAGE opisana w tym dziele została zaczerpnięta z literatury¹⁵. Należy jednak pamiętać, że proces syntezy jest wrażliwy na różne czynniki zewnętrzne, które mogą wpływać na właściwości produktu końcowego. Dlatego po przygotowaniu system CAGE powinien być charakteryzowany za pomocą technik takich jak spektroskopia NMR, aby potwierdzić powstanie CAGE.

Jak pokazano na Rysunku 1, widma protonowe CAGE ilustrują przesunięcia ch...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Lampy NMR 5 mm	Sigma Aldrich	41121705
Aceton	VWR	23L064039
Aluminiowe patelnie Tzero	TA Instruments	90,16,83,901
Urządzenie Aqua Flux	Biox Systems
Bruker Avance III NMR	Bruker		Przyrząd do spektroskopii NMR
Wodorowęglan choliny	Sigma Aldrich	C7519
Dermatomu	Zimmer Biomet
Różnicowy kalorymetr skaningowy	TA Instruments
Etanol	VWR	23J314009
Ekspandowany polistyren	Styropian
Komórki dyfuzyjne Franza	PermeGear
Kwas geranowy	Sigma Aldrich	427764
Taśma do szczepienia	Parafilm
Karl Fischer Titrator	Mettler Toledo	30252662
Metanol	VWR	85681.32
PBS	Fischer Scientific	10388739
Oprogramowanie TA Universal Analysis 2000	TA Instruments		Oprogramowanie do analizy danych DSC
Oprogramowanie TopSpin	Bruker		Oprogramowanie do analizy danych NMR