Artykuł metodologiczny

Badanie interakcji białko-glikan: postępy w magnetycznym rezonansie jądrowym

849 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/68674

⸱

26 sierpnia 2025

 ,  , 
1Institute of Medical Biochemistry Leopoldo de Meis (IBqM), Federal University of Rio de Janeiro (UFRJ), 2National Center for Structural Biology and Bioimaging (CENABIO), Federal University of Rio de Janeiro (UFRJ), 3Laboratory of Connective Tissue, Clementino Fraga Filho University Hospital

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół oparty na NMR bada słabe interakcje białko-glikan przy użyciu cyjanowiryny-N i D-mannozy. Łącząc metody wykrywania ligandów i białek, mapuje miejsca wiązania, wykrywa efekty allosteryczne i identyfikuje kompleksy spotkań. Podejście to obejmuje przygotowanie próbek i analizę danych, oferując strukturalne i dynamiczne spostrzeżenia cenne dla mechanizmów diagnostyki i rozpoznawania specyficznych dla glikanów.

Streszczenie

Interakcje białko-glikany mają kluczowe znaczenie dla wielu procesów biologicznych i są coraz częściej uznawane za obiecujące cele strategii diagnostycznych w chorobach zakaźnych, zapalnych i nowotworowych. Jednak scharakteryzowanie tych oddziaływań, zwłaszcza gdy są one słabe i przejściowe, pozostaje wyzwaniem technicznym. Spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) oferuje wyjątkowe korzyści w badaniu takich oddziaływań w warunkach zbliżonych do fizjologicznych, zapewniając wgląd w rozdzielczości atomowej zarówno w aspekty strukturalne, jak i dynamiczne. W tym badaniu przedstawiamy zintegrowany protokół NMR przeznaczony do badania interakcji białko-glikan o niskim powinowactwie przy użyciu specyficznej dla mannozy lektyny cyjanowiryny-N i monosacharydowej D-mannozy jako układu modelowego. Protokół łączy podejścia NMR oparte na ligandach i białkach, aby kompleksowo mapować miejsca wiązania i wykrywać subtelne zdarzenia wiązania, w tym potencjalne efekty allosteryczne lub kompleksy spotkań. Kluczowe etapy protokołu obejmują staranne przygotowanie próbki, precyzyjną kontrolę stężeń i standaryzację spektralną w celu zapewnienia odtwarzalności i wiarygodności danych. NMR w roztworze umożliwia wykrywanie oddziaływań przejściowych, które często są niedostępne za pomocą innych technik. Chociaż słabe oddziaływania są niezbędne do życia, w literaturze istnieje tendencja w kierunku kompleksów o wyższym powinowactwie, mimo że kompleksy o niskim powinowactwie są istotne w wielu ważnych funkcjach biologicznych, takich jak transdukcja sygnału i komunikacja komórka-komórka. Technika ta stanowi potężną platformę do badania rozpoznawania glikanów białkowych i może służyć jako cenne narzędzie do identyfikacji nowych markerów diagnostycznych na podstawie interakcji specyficznych dla glikanów.

Wprowadzenie

Interakcje białko-glikan mają fundamentalne znaczenie dla szerokiego zakresu procesów biologicznych, w tym rozpoznawania komórka-komórka, modulacji odpowiedzi immunologicznej i interakcji patogen-gospodarz 1,2. Te oddziaływania molekularne są wysoce specyficzne i dynamiczne oraz odgrywają kluczową rolę zarówno w mechanizmach fizjologicznych, jak i patologicznych 3,4,5. Klasycznym przykładem takich interakcji są lektyny, białka, które specyficznie rozpoznają glikany i wiążą się z nimi. Na przykład cyjanowiryna-N (CVN) była szeroko badana jako model eksperymentalny ze względu na jej zdolność do interakcji w wysokim powinowactwie z oligosacharydamio wysokim powinowactwie 5,6,7.

Oprócz lektyn wiele glikozylowanych białek, takich jak integryny, odgrywa również istotną rolę w rozpoznawaniu i sygnalizacji komórkowej. Integryny są receptorami transbłonowymi, które często ulegają glikozylacji swoich podjednostek, co wpływa na ich stabilność i powinowactwo do ligandów, w tym glikanów 5,8,9,10. Jednak strukturalna charakterystyka tych interakcji pozostaje wyzwaniem ze względu na wewnętrzną heterogeniczność i elastyczność glikanów, co komplikuje tradycyjne podejścia biologii strukturalnej. W tym kontekście, rozwój zaawansowanych metodologii zdolnych do uchwycenia tych interakcji w roztworze ma ogromną wartość dla tej dziedziny, szczególnie dla glikobiologii11,12.

Spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) stała się potężnym narzędziem do badania oddziaływań białko-ligand na poziomie atomowym. W przeciwieństwie do innych technik, takich jak krystalografia rentgenowska i mikroskopia krioelektronowa, NMR umożliwia badanie interakcji biomolekularnych w warunkach zbliżonych do fizjologicznych, zapewniając wgląd zarówno w strukturę, jak i dynamikę. Ta elastyczność umożliwia naukowcom modulowanie parametrów środowiskowych, takich jak pH (zwykle w zakresie 4,0-8,0), siła jonowa (np. 0-500 mM NaCl) i temperatura (zwykle 273-330 K), dostosowując w ten sposób warunki do specyfiki kompleksów białkowo-glikanowych. Ponadto NMR jest szczególnie korzystny do analizy oddziaływań przejściowych i słabych, które są często charakterystyczne dla zdarzeń rozpoznawania białka i glikanów13,14.

Do zbadania interakcji białko-glikan zastosowano kilka technik NMR, wykorzystując zarówno podejścia oparte na białkach, jak i ligandach. Z punktu widzenia białek, miareczkowanie heterojądrowej koherencji pojedynczej koherencji kwantowej (HSQC) jest szeroko stosowane do mapowania miejsc wiązania poprzez monitorowanie perturbacji przesunięć chemicznych po dodaniu liganda. Eksperymenty dyspersji relaksacyjnej umożliwiają wykrycie procesów konformacyjnych i wymiany chemicznej zachodzących w skali czasowej od mikro do milisekund, dostarczając wglądu w dynamiczne aspekty rozpoznawania glikanów15,16. Te techniki oparte na białkach zazwyczaj wymagają stężeń próbki w zakresie od 50 μM do 2 mM, w zależności od stabilności białka i skuteczności znakowania 17,18.

Techniki NMR oparte na ligandach oferują informacje uzupełniające, koncentrując się na zmianach glikanów podczas wiązania. Różnica w przenoszeniu nasycenia (STD-NMR) jest szczególnie przydatna do identyfikacji epitopów glikanów zaangażowanych w rozpoznawanie, ponieważ selektywnie nasyca sygnały NMR regionów ligandów w bliskim kontakcie z białkiem19,20. Ligandy wodne obserwowane za pomocą spektroskopii gradientowej (WaterLOGSY)21,22 i spektroskopii z przeniesionym jądrowym efektem overhausera (Tr-NOESY) dostarczają dodatkowych środków do oceny wiązania ligandów i zmian konformacyjnych podczas interakcji23. Co więcej, eksperymenty relaksacyjne Carra-Purcella-Meibooma-Gilla (CPMG) pomagają w identyfikacji słabych i przejściowych oddziaływań, które są trudne do wykrycia konwencjonalnymi metodami24. Eksperymenty na bazie ligandów są często przeprowadzane przy stężeniach białek 10-50 μM i mogą wymagać optymalizacji czasów mieszania i parametrów nasycenia25. Warto zauważyć, że metody te mogą być ograniczone przez niską rozpuszczalność glikanów lub słaby stosunek sygnału do szumu podczas pracy z małymi ligandami.

Razem te metody NMR zapewniają kompleksowe ramy do wyjaśnienia strukturalnych i dynamicznych właściwości interakcji białko-glikan. Dzięki ciągłym postępom w zakresie czułości i strategii znakowania izotopowego, technika ta staje się coraz bardziej istotna w glikobiologii, oferując nowe perspektywy na mechanizmy rozpoznawania molekularnego z potencjalnymi zastosowaniami w opracowywaniu leków i odkrywaniu biomarkerów. Niemniej jednak sukces tych podejść zależy od takich czynników, jak jednorodność próbki, złożoność glikanów oraz obecność elastycznych lub nieuporządkowanych regionów, które mogą poszerzać sygnały NMR lub utrudniać interpretację26. NMR to potężna metoda badania zdarzeń przejściowych, która jest głównym wyzwaniem w biologii strukturalnej.

CVN rozpoznaje reszty mannozylowe połączone z α(1,2) obecne w oligosacharydach o wysokiej zawartości mannozy o powinowactwie nanomolowym 27,28,29. Jednak słabo rozpoznaje monosacharyd D-mannozę. W niniejszej pracy badaliśmy interakcję CVN z D-mannozą jako sposób na zilustrowanie, w jaki sposób NMR jest potężny w zrozumieniu interakcji przejściowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

UWAGA: Wszystkie kroki związane z kulturami bakteryjnymi i preparatami buforowymi należy wykonywać zgodnie z instytucjonalnymi protokołami bezpieczeństwa biologicznego. Używaj środków ochrony osobistej (PPE), a w przypadku pracy z otwartymi kulturami lub chemikaliami pracuj w komorze bezpieczeństwa biologicznego lub okapie oparów chemicznych, jeśli jest to wymagane.

1. Ekspresja cyjanowiryny-N

  1. Przekształć komórki BL21 E. coli za pomocą plazmidu kodującego gen CVN wstawiony do wektora pET26a.
  2. Hoduj komórki w 1 L Super Bulionu (32 g tryptonu, 20 g ekstraktu drożdżowego, 5 g NaCl na L), uzupełnionym kanamycyną (50 μg/mL), 0,5% (w/v) glukozy i 1,6 mMMgSO4. Inkubować w ciągłym mieszaniu przy ~250 obr./min w temperaturze 37 °C.
  3. W celu wytworzenia 15CVN znakowanych N należy hodować komórki w zmodyfikowanym minimalnym pożywce M9, używając 15NH4Cl jako jedynego źródła azotu.
    1. Przygotować 1 l minimalnej pożywki M9 przez zmieszanie 200 ml sterylnego roztworu 5 soli M9 zawierającego 64 g/L Na2HPO4, 15 g/L KH2PO4, 2,5 g/L NaCl, 5 g/L NH4Cl.
    2. Dodać 2 ml 1 M MgSO4 (0,22 μm sterylizowane przez filtr), 0,1 ml 1 M CaCl2 (sterylizowane przez filtr 0,22 μm) i 4 g glukozy (stężenie końcowe 0,4%, rozpuszczone w sterylnej wodzie destylowanej i 0,22 μm sterylizowane przez filtr).
    3. Doprowadzić ostateczną objętość do 1 l sterylną wodą destylowaną.
      UWAGA: W razie potrzeby można dodawać suplementy, takie jak aminokwasy lub witaminy.
  4. Monitorować hodowlę, aż osiągnie gęstość optyczną (OD600) około 1,2. Następnie dodać izopropylo-beta-D-tiogalaktopiranozyd (IPTG) do końcowego stężenia 1,0 mM w celu indukcji ekspresji białka.
  5. Inkubować przez 20 godzin po indukcji w temperaturze 37 °C.
  6. Zebrać komórki przez odwirowanie w temperaturze 7 000 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
  7. Wyizoluj frakcję peryplazmatyczną w następujący sposób:
    1. Zawiesić osady komórkowe w 0,4 objętości 30 mM buforu Tris-HCl (pH 8,0) zawierającego 20% sacharozy i 1 mM EDTA i inkubować w temperaturze pokojowej z wytrząsaniem przez 10 minut.
    2. Wirować przy 10 000 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
    3. Powstałe granulki zawiesić ponownie w 0,4 objętości lodowatej wody destylowanej i inkubować na lodzie z wytrząsaniem przez 10 minut.
    4. Ponownie odwirować w temperaturze 10 000 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
    5. Zebrać supernatant, który odpowiada frakcji peryplazmatycznej, do ekstrakcji białka.
      UWAGA: Wszystkie muszą zawierać koktajl inhibitorów proteazy, aby zapobiec degradacji białek.

2. Eksperymenty NMR

UWAGA: Wszystkie eksperymenty zostały uzyskane przy 14,1 T przy użyciu sondy 1H/15N/13C z potrójnym rezonansem odwróconym (patrz tabela materiałów) w temperaturze 298K.

  1. Eksperymenty oparte na ligandach
    1. Przygotowanie próbki
      1. Przygotować dwie próbki: jedną zawierającą CVN i jedną bez CVN (kontrola tylko ligandem). Każda próbka zawiera 600 μl 80 μM CVN w buforze fosforanu sodu (pH 7,4) zawierającym 50 mM NaCl.
      2. Dodać D-mannozę do końcowego stężenia 4 mM.
      3. Dodać 5% (v/v)D2O do każdej próbki.
      4. Przenieść próbkę do probówki NMR o średnicy 5 mm.
      5. Użyj 50-krotnego molowego nadmiaru liganda w stosunku do białka.
        UWAGA: Zazwyczaj zaleca się nadmiar liganda w zakresie od 10 do 1000 razy, przy czym mniejsze nadmiary są preferowane dla małych białek.
    2. Akwizycja spektralna do przypisania D-mannozy
      1. Uzyskaj widma 2D TOCSY i 2D 1 H-13C HMBC przy użyciu standardowych sekwencji impulsów:
        2D TOCSY: Czuła na fazę spektroskopia korelacji całkowitej (TOCSY) z rzeźbieniem wzbudzenia w celu tłumienia wody (DIPSI2ESGPPH).
        2D HMBC: 1 H-13C Heterojądrowa korelacja wielu wiązań z selekcją gradientu i akwizycją niesprzężoną (HMBCGPNDQF).
        UWAGA: Eksperymenty te zostały przeprowadzone w celu przypisania D-mannozy, ale nie są pokazane, ponieważ przypisanie przesunięcia chemicznego nie wchodzi w zakres tego badania.
    3. Mapowanie wiązania liganda poprzez perturbację przesunięcia chemicznego (CSP) liganda
      1. W celu przygotowania próbki i uzyskania widma ¹H-¹³C HSQC, należy przygotować 4 mM roztwór D-mannozy w buforze fosforanu sodu (pH 7,4) z 50 mM NaCl i 5% D2O. Podzielić roztwór na dwie próbki: jedną z 80 μM CVN i jedną bez CVN (odniesienie tylko ligand).
        UWAGA: Widma te zostaną wykorzystane do określenia CSP D-mannozy po interakcji z CVN.
      2. Do ustawienia parametrów akwizycji 1 H-13C HSQC należy użyć standardowej sekwencji impulsów HSQCETGPSI (wybór gradientu i zwiększona czułość 1 H-13C HSQC). Ustaw następujące parametry pozyskiwania:
        Dziedzina czasu (TD): 1024 × 128 punktów zespolonych (wymiary ¹H × ¹³C)
        Szerokość spektralna (SW): 10,0171 ppm (6009,615 Hz) dla ¹H, 80 ppm (12069,106 Hz) dla ¹³C
        Częstotliwości nośne: 4,7 ppm dla ¹H, 75 ppm dla ¹³C
        - Liczba skanów: 448.
      3. Oblicz CSP, korzystając z następującego równania:
        figure-protocol-1
        gdzie figure-protocol-2 i figure-protocol-3 reprezentują różnice przesunięć chemicznych między D-mannozą w obecności CVN (rysunek 1A, oznaczony na czerwono) a wolną D-mannozą (rysunek 1B).
    4. Mapowanie wiązania liganda poprzez różnicę transferu nasycenia (STD)
      1. Utwórz nowy zestaw danych i skonfiguruj parametry dla eksperymentów STD-NMR. Można zastosować dwie strategie eksperymentalne: (i) badanie przesiewowe o różnych częstotliwościach nasycenia w celu optymalizacji stosunku sygnału do szumu; (ii) ustalenie częstotliwości nasycenia i zróżnicowanie czasu nasycenia w celu oceny narastania.
      2. Skonfiguruj eksperymenty 1D ¹H NMR przy użyciu sekwencji impulsów zgpr. Nastaw spektrometr na ¹H, wykonaj podkładkowanie i zmierz twardy impuls 90° (np. ~10 μs przy tłumieniu -10,6 dB, co odpowiada ~11,482 W).
      3. Wyśrodkuj częstotliwość nośną ¹H na około 4,7 ppm, co odpowiada sygnałowi wody.
      4. Wybierz sekwencję impulsów STDDIFFESGP.3 i skonfiguruj parametry akwizycji w następujący sposób:
        Ustaw szerokość widmową zgodnie z wymaganiami próbki.
        Ustaw opóźnienie między skanowaniami (d1) na 4 s.
        Zdefiniuj czas nasycenia (d20) na podstawie żądanego eksperymentu.
        Załaduj FQ2LIST zawierającą częstotliwość nasycenia poza rezonansem (-40 ppm) i częstotliwości rezonansowe, aby nasycić tylko sygnał białkowy.
        UWAGA: Częstotliwości rezonansowe muszą odpowiadać protonom białkowym i muszą znajdować się co najmniej 1000 Hz od dowolnego sygnału liganda, aby uniknąć bezpośredniego nasycenia.
      5. Przetestuj następujące częstotliwości nasycenia rezonansu, aby określić optymalne warunki: -0,59 ppm, 0,73 ppm i 8,1 ppm (patrz rysunek 2A).
        UWAGA: 0,73 ppm zostało wybrane jako częstotliwość nasycenia rezonansu, ponieważ zapewnia najlepszy stosunek sygnału do szumu. Korzystając z tej częstotliwości, współczynnik wzmocnieniaSTD (A STD) określono ilościowo jako funkcję czasu nasycenia. W tym celu uzyskano widma chorób przenoszonych drogą płciową w różnych czasach nasycenia (0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3 i 4 s), aby skonstruować krzywą narastania chorób przenoszonych drogą płciową (rysunek 2B). Odpowiednie wartościA STD zostały następnie wykreślone jako funkcja czasu nasycenia (rysunek 2C), co pozwoliło na ocenę efektywności transferu nasycenia, która jest proporcjonalna do czasu i bliskości wodoru liganda do białka. WspółczynnikSTD definiuje się jako:
        figure-protocol-4
        ISTD to różnica w intensywności sygnału między widmami rezonansowymi i wyłączonymi, I0 to intensywność sygnału w widmie poza rezonansem, [L]T to całkowite stężenie liganda, a [P] to stężenie białka. Ta normalizacja uwzględnia wpływ koncentracji i pozwala na porównanie w różnych warunkach eksperymentalnych. Choroba przenoszona drogą płciową opiera się na dyfuzji spinowej i powolnym wirowaniu molekularnym, aby skutecznie przenieść nasycenie z białka do związanego liganda. Większe białka (powolne bębnienie) pozwalają na bardziej efektywne nasycenie i rozprzestrzenianie się magnetyzacji w białku 19,30,31,32.
      6. Ustaw liczbę skanów (ns) na 64 i uśrednij eksperyment l4 (pętla 4) razy.
      7. Oblicz łączną liczbę skanów jako: Łączna liczba skanów = ns × l4. Użyj 32 768 punktów zespolonych w wymiarze bezpośrednim (TD) o szerokości widmowej (SW) 10,0171 ppm (6,009,615 Hz).
      8. Ustaw opóźnienie między skanowaniami (d1) na 4 s, a czas akwizycji (AQ) na 2,7262976 s. Całkowite opóźnienie relaksacji wynosi d1 + AQ.
      9. Skonfiguruj impuls nasycenia w następujący sposób: czas trwania 50 ms; kształt Gaussa (p42); sterowany za pomocą programu kształtowego 9 (SP9).
      10. Użyj wariantu sekwencji impulsów STD, który zawiera filtr T1ρ, aby stłumić resztkowe sygnały białkowe. Ustaw czas blokady wirowania (d29) w oparciu o masę cząsteczkową białka. W przypadku większych białek należy stosować krótsze czasy wirowania (~20 ms), a w przypadku mniejszych białek większe (> 40 ms).
        UWAGA: Wszystkie widma chorób przenoszonych drogą płciową zostały uzyskane na częstotliwości 599,93 MHz (BF1). Regulacja d29 ma kluczowe znaczenie dla zminimalizowania tła białka przy jednoczesnym zachowaniu integralności sygnału liganda. W razie potrzeby zoptymalizuj ten parametr empirycznie.
    5. Mapowanie wiązania liganda za pomocą 1H-R2
      1. Wybierz program impulsowy CPMG_ESGP2D ze standardowej biblioteki firmy Bruker. Sekwencja ta jest oparta na eksperymencie Carra-Purcella-Meibooma-Gilla (CPMG), obejmującym rzeźbienie wzbudzenia w celu tłumienia wody33.
      2. Ustaw eksperyment jako akwizycję 2D.
        UWAGA: Jest to eksperyment pseudo-2D, w którym tylko wymiar bezpośredni jest używany do informacji o przesunięciu chemicznym.
      3. Skonfiguruj parametry akwizycji w następujący sposób:
        Dziedzina czasu (TD): 32 768 punktów zespolonych w bezpośrednim wymiarze ¹H.
        (TD1): 2 punkty.
        Szerokość widmowa (SW): 7,9932 ppm (4,795,396 Hz).
        Opóźnienie przerwania skanowania (d1): 4 s.
        Częstotliwość nośna (o1): 4,7 ppm (wyśrodkowana na sygnale wodnym).
        Liczba skanów (ns): 8.
        Liczba skanów pozorowanych (ds): 4.
        Opóźnienie CPMG (d20): ≤1 ms (tj. krócej niż 1⁄3 J_HH).
        Liczba średnich (TDav): 200.
      4. Uruchom eksperyment dla 200 cykli po 8 skanów każdy, co daje łączną akumulację 1 600 skanów. Dostosuj listę liczników zmiennych (vclist) zgodnie z żądanym całkowitym czasem cyklu CPMG (TCPMG). W tym przypadku wybrano 2 cykle dla TCPMG = 8 ms i 200 cykli dla TCPMG = 800 ms.
      5. Przeprowadź dwa eksperymenty 1H-CPMG, jedno dla próbki zawierającej białko (4 mM D-mannoza i 80 μM CVN), a drugie dla wolnej D-mannozy (4 mM D-mannoza).
      6. Wykreślić widma 1H dla każdegoT CPMGza pomocą polecenia efp (mnożenie wykładnicze, po którym następuje transformacja Fouriera i korekcja fazy) lub sinm (mnożenie sinusoidalne przesunięte o 90°, SSB=2), a następnie fp (transformacja Fouriera i korekcja fazowa). Dostosuj funkcję okna zgodnie z najlepszą strategią przetwarzania.
        UWAGA: W tym eksperymencie użyto sinm i fp. Pierwszaseria będzie widmem o TCPMG wynoszącym 8 ms (pierwsza w vclist), adruga seria będzie miała 800 ms (druga w vclist). Przetworzone 1widma H przedstawiono na rysunku 3.
      7. Oblicz iloraz CPMG (Q) za pomocą równania 3.
        ​figure-protocol-5
  2. Eksperymenty oparte na białkach
    1. Przygotowanie próbki
      1. Przygotować 600 μl próbki zawierającej 436 μM równomiernie 15N-znakowanych CVN w buforze fosforanu sodu (pH 7,4) uzupełnionego 50 mM NaCl i 5% tlenku deuteru (D2O). Miareczkować D-mannozę do próbki do końcowego stężenia 60 mM. Do miareczkowania należy użyć probówki NMR o średnicy 5 mm.
    2. Przypisanie rezonansu (opcjonalny krok walidacji)
      1. Potwierdź przypisanie wolnego CVN w roztworze, używając wcześniej zgłoszonych wartości przesunięcia chemicznego34. Uzyskaj następujące widma potrójnego rezonansu: HNCO, HNCA, HNCACB i CBCACONH 35,36,37.
        UWAGA: Eksperymenty te służą jedynie do walidacji przypisania i nie są pokazane, ponieważ przypisanie przesunięcia chemicznego nie jest głównym celem tego protokołu.
    3. Mapowanie wiązania D-mannozy z CVN przez zaburzenia przesunięcia chemicznego białka
      1. Uzyskaj 1widmo H-15N HSQC 15N-znakowanego CVN w temperaturze 298 K. Wykonaj miareczkowanie, dodając D-mannozę, aby osiągnąć następujące stężenia końcowe: 0, 1, 2, 5, 10, 20, 40 i 60 mM.
      2. Skonfiguruj eksperyment 1 H-15N Fast-HSQC, używając czułej na fazę sekwencji impulsów FHSQCF3GPPH ze standardowej biblioteki Bruker. Użyj następujących parametrów:
        Dziedzina czasu (TD): 1024 × 140 punktów zespolonych w wymiarach 1H i 15N.
        Szerokość spektralna (SW): 16,0274 ppm (9615,385 Hz) w wymiarze 1H i 34 ppm (2067,119 Hz) w wymiarze 15N.
        Częstotliwość nośna: 4,7 ppm (1H) i 119 ppm (15N).
        Liczba skanów: 128.
      3. Obliczyć perturbację przesunięcia chemicznego (Δδ) za pomocą następującego równania:
        figure-protocol-6
        gdzie figure-protocol-7 i figure-protocol-8 są różnicami przesunięć chemicznych między CVN w obecności i braku D-mannozy (ryc. 4A).
        UWAGA: Współczynnik 10 uwzględnia różnicę w szerokościach widmowych między wymiarami protonu i azotu.
      4. Obliczyć stałą dysocjacji (K, D), wykreślając wartości CSP dla każdej pozostałości w funkcji stężenia D-mannozy. Dopasuj uzyskane dane do izotermy wiązania w jednym miejscu, korzystając z następującego równania (5).
        figure-protocol-9równanie 5
        gdzie [PT] jest stężeniem białka używanym w miareczkowaniu (CVN), [PT] jest stężeniem liganda (D-mannoza), a CSPmax jest CSP przy stężeniu nasycenia liganda i CSPmin przy braku liganda.
    4. Mapowanie wiązania D-mannozy z CVN poprzez pozycję 15N-R2 białka.
      1. Zmierzyć 15wartości N-R2 poszczególnych pozostałości CVN pod nieobecność i w obecności 60 mM D-mannozy. Wykonuj wszystkie eksperymenty w temperaturze 298 K.
      2. Skonfiguruj eksperyment 15N-R2 przy użyciu czułej na fazę sekwencji impulsów opartej na CPMG HSQCT2ETF3GPSI3D ze standardowej biblioteki Bruker. Użyj następujących parametrów:
        Dziedzina czasu (TD): 1024 × 128 punktów zespolonych w wymiarach 1H i 15N, z 8 punktami w pseudowymiarze.
        Szerokość spektralna (SW): 16,0274 ppm (1H; 9615,385 Hz) i 34 ppm (15N; 2067,119 Hz).
        Częstotliwość nośna: 4,7 ppm (1H) i 119 ppm (15N).
        Liczba skanów: 32. (v) Lista liczników zmiennych: 1, 8, 2, 6, 3, 5, 4 i 7, odpowiadające opóźnieniom relaksacji (Trelax) wynoszącym odpowiednio 16,96, 135,68, 33,92, 101,76, 50,88, 84,96, 67,84 i 118,72 ms.
      3. Przetwarzaj widma pseudo3D jako serię widm relaksacyjnych korelacji podobnych do HSQC 1H/15N za pomocą NMRPipe38, postępując zgodnie z samouczkiem oprogramowania (patrz Spis materiałów , aby uzyskać link do samouczka).
      4. Zaimportuj przetworzone widma do odpowiedniej platformy analizy NMR (np. CCPNMR39). Zaznacz wszystkie widma i zastosuj narzędzie "Śledź zmiany intensywności". Wykreślić intensywność każdego piku krzyżowego w funkcjirelaksu T i dopasować rozpad do funkcji monowykładniczej, aby wyodrębnić 15wartości N-R2 dla każdej pozostałości.
      5. Obliczyć błąd eksperymentalny na podstawie stosunku sygnału do szumu widm podobnych do HSQC przy 67,84 ms. Przetwórz obszar widma zawierający tylko szum i przekonwertuj go na plik tekstowy za pomocą następującego polecenia:
        pipe2txt.tcl ./PROCs/ft/R2_67_84.ft2 > noise67_84.txt"
      6. Określ odchylenie standardowe obszaru szumu za pomocą oprogramowania statystycznego (np. Origin(Pro), wersja 2021). Zdefiniuj tę wartość jako natężenie hałasu Iszum.
      7. Obliczyć błąd doświadczalny dla każdej pozostałości, stosując następujące równanie:
        figure-protocol-10
        UWAGA: Ważne jest, aby użyć błędu eksperymentalnego, a nie błędu dopasowania. Błąd doświadczalny określa granice interpretacji przy porównaniu 15N-R2 pod nieobecność i obecność D-mannozy.

figure-protocol-11
Rysunek 1: Zaburzenia przesunięcia chemicznego D-mannozy w obecności CVN. (A) 1widmo H-13C-HSQC D-mannozy w obecności CVN. (B) 1widmo H-13C-HSQC wolnej D-mannozy. Etykiety w widmach pokazują każde z przypisań przesunięć chemicznych i odpowiednią konfigurację anomeryczną (α lub β). Etykiety w kolorze czerwonym to etykiety przypisane do konformacji związanej, a te w kolorze czarnym to etykiety przypisane do konformacji swobodnej. (C) Superpozycja widm 1 H-13C-HSQC w obecności (kolor zielony) i braku (kolor niebieski) CVN. (D) Struktura chemiczna α- i β-D-mannozy z podkreśleniem obserwowanego CSP, która została obliczona zgodnie z równaniem (1). Wartości CSP są przedstawione poniżej zielonych kółek. Czerwony okrąg reprezentuje β-anomeryczny wodór, który zniknął w obecności CVN. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-protocol-12
Rysunek 2: Widma różnicy nasycenia (STD) D-mannozy w obecności CVN. (A) Choroby przenoszone drogą płciową nabyte przy różnych częstotliwościach nasycenia: -0,59, 0,73 i 8,1 ppm. (B) Choroba przenoszona drogą płciową nabyta w różnych czasach nasycenia: 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3 i 4 s. (C) Współczynnik amplifikacjiSTD (A STD) obliczony zgodnie z równaniem 2 w funkcji czasu nasycenia. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-protocol-13
Rysunek 3: 1H-R2 D-mannozy w obecności i bez CVN. (A) Przedstawienie oczekiwanych widm D-mannozy 1H-CPMG dla spoiwa i niespoiwa uzyskanych przy czasach relaksacji R2 wynoszących 8 i 800 ms przy braku (na dole) i obecności (na górze) CVN. Q obliczono zgodnie z równaniem 3. W przypadku braku interakcji (Q ≈ 1) intensywność sygnału pozostaje podobna w obu czasach relaksacji liganda z białkiem lub bez niego. Po związaniu (Q < 1) intensywność sygnału zmniejsza się wraz ze wzrostem relaksacji próbki zawierającej białko. (B) Schematyczne przedstawienie wymiany chemicznej pomiędzy stanami swobodnymi i związanymi D-mannozy. W zależności od względnych wartości różnicy przesunięcia chemicznego (Δω) i stałej kursu walutowego (kex = kwł. + kwył.), układ wpada w reżim powolnej, pośredniej lub szybkiej wymiany. oraz1Widma H NMR wolnej D-mannozy i D-mannozy w obecności CVN, wykazujące różnice w natężeniach sygnału przy czasach relaksacji 8 ms i 800 ms. Pokazano obliczone współczynniki Q dla określonych wodorów (H6β, H3β, H5α, H4β), przy czym niższe wartości Q wskazują na silniejsze interakcje z CVN i identyfikują regiony cukru biorące udział w wiązaniu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-protocol-14
Rysunek 4: Analiza zakłóceń przesunięcia chemicznego (CSP) ujawniająca pozostałości CVN biorące udział w wiązaniu D-mannozy. (A) Wykresy słupkowe przedstawiające amidowe (15 N-1H) CSP szkieletu CVN po miareczkowaniu D-mannozą w stężeniach 10 mM (góra) i 60 mM (dół). Linie poziome wskazują średnią CSP plus jedno lub dwa odchylenia standardowe (av + sd, av + 2 sd), które zostały wykorzystane jako progi do identyfikacji znacznie zaburzonych pozostałości. (B) Mapowanie znacznie zaburzonych reszt na strukturę CVN skompleksowaną z disacharydem Manα1-2Manα (PDB ID: 1IIY40). Pozostałości z CSP powyżej progu av + 2 sd są podświetlone na czerwono, a te między av + sd a av + 2 sd są pokazane na niebiesko. Cząsteczki disacharydu Manα1-2Manα są wyświetlane na pomarańczowo, aby wskazać ich miejsce wiązania. (C) Wybrane krzywe wiązania reprezentujące CSP w funkcji stężenia D-mannozy. Dane dopasowano zgodnie z równaniem 5 jako model wiązania w jednym miejscu w celu oszacowania KD, ujawniając zakres powinowactw, przy czym D44 wykazuje najsilniejszą interakcję (KD = 1,1 ± 0,35 mM), a E41 najsłabszą (KD = 35 ± 29 mM). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-protocol-15
Rysunek 5: Analiza 15N-R2 pod kątem CVN wolnych i związanych z D-mannozą. (A, B) Szybkości relaksacji poprzecznej (15N-R2) mierzone dla każdej reszty CVN w jej stanie (A) wolnym i (B) związanym z D-mannozą. (C) Różnica w wartościach R2 (ΔR2 = R2związany − R2wolny) wykreślonych dla każdej pozostałości. Niebieskie i czerwone linie reprezentują odpowiednio jedno i dwa odchylenia standardowe od średniej (av ± sd i av ± 2 sd). Pozostałości o znaczących wartościach ΔR2 są oznakowane. (D) Mapowanie wartości ΔR2 dla struktury CVN skompleksowanej z disacharydem Manα1-2Manα (PDB ID: 1IIY40). Pozostałości o ΔR2 powyżej lub poniżej av± 2 sd są pokazane na czerwono; Te pomiędzy AV± SD i AV± 2 SD są pokazane na niebiesko. Cząsteczki D-mannozy są wyświetlane na pomarańczowo, aby wskazać ich miejsce wiązania. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W niniejszej pracy przedstawiono eksperymenty NMR mające na celu zbadanie oddziaływań białko-glikan. Rozpoznawanie molekularne glikanów białkowych leży u podstaw wielu procesów biologicznych obejmujących macierz zewnątrzkomórkową (ECM), w tym regulację adhezji komórek, migrację, proliferację i różne inne formy komunikacji komórkowej.

Tutaj zdecydowaliśmy się na pracę z monosacharydem D-mannozą, który jest opisywany jako słabe spoiwo. Celem było opisanie metod pomiaru interakcji przejściowych i...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Spektroskopia NMR stanowi wszechstronne podejście do badania interakcji białko-glikan, szczególnie ze względu na jej zdolność do wykrywania słabych i przejściowych interakcji, takich jak te obserwowane między CVN a D-mannozą. Opisany tutaj protokół łączy metody NMR oparte na ligandach i białkach, co pozwala na bardziej kompleksową charakterystykę interfejsu interakcji.

Krytyczne etapy protokołu obejmują staranne przygotowanie próbki z precyzyjną kontrolą stężeń białek i ligandów, standaryzację...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają sprzecznych interesów.

Podziękowania

Dziękujemy Centro Nacional de Ressonância Magnética Nuclear Jiri Jonas (CNRMN) za korzystanie ze spektrometrów NMR. Jesteśmy wdzięczni dr Carole Bewley za podzielenie się z nami zadaniami przesunięcia chemicznego CVN w kompleksie z Manα1-2Manα. Dziękujemy również agencjom finansującym FAPERJ i CNPq.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
13C GlukozaLaboratorium izotopowe Cambrige.Zobacz materiał CLM-481
15N chlorek amonuLaboratorium izotopowe Cambrige.NLM-467 powiedział:
Chlorek wapniaSigma-AldrichZobacz materiał C4901
Coquetel hamuje proteazęSigma-Aldrich4693159001
D2OLaboratorium izotopowe Cambrige.DLM-4
D-MannozaSigma-AldrichM2069-5G
Chlorek magnezuSigma-AldrichZobacz materiał M8266
Protokół NMRPipeLink do samouczka oprogramowania: https://www.ibbr.umd.edu/nmrpipe/demo.html
Chlorek potasu (K2HPO4)Sigma-AldrichZobacz materiał P3786
Chlorek potasu (KCl)Sigma-AldrichZobacz materiał P3911 powiedział:
Chlorek potasu (KH2PO4)Sigma-AldrichZobacz materiał P0662
Rurka ShigemiBrukerZ1Z10684A
Chlorek sodu (NaCl)Sigma-AldrichZobacz materiał S9625 powiedział:
Fosforan sodu (Na2HPO4)Sigma-Aldrich567545
Fosforan sodu (NaH2PO4)Sigma-AldrichNumer katalogowy S97263 powiedział:
Spektrometr Bruker 600 MHzBruker
Spektrometr Bruker 800 MHzBruker
TiaminaSigma-AldrichZobacz materiał T1270
Sonda TXI z potrójnym rezonansemBruker
TryptonSigma-Aldrich93657
Ekstrakt drożdżowySigma-AldrichY1625 powiedział:

Bibliografia

  1. Varki, A. Biological roles of glycans. Glycobiology. 27 (1), 3-49 (2017).
  2. van Kooyk, Y., Rabinovich, G. A. Protein-glycan interactions in the control of innate and adaptive immune responses. Nat. Immunol. 9 (6), 593-601 (2008).
  3. Gagneux, P., Hennet, T., Varki, A. Biological functions of glycans. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor. NY. (2022).
  4. Varki, A. Biological roles of glycans. Glycobiology. 27 (1), 3-49 (2017).
  5. He, M., Zhou, X., Wang, X. Glycosylation: Mechanisms, biological functions and clinical implications. Signal Transduct. Target. Ther. 9 (1), 194(2024).
  6. Maier, I., Kontaxis, G., Zimmermann, C., Steininger, C. Cyanovirin-N binding to N-acetyl-d-glucosamine requires carbohydrate-binding sites on two different protomers. Biochemistry. 63 (10), 1270-1277 (2024).
  7. Muñoz-Basagoiti, J., et al. Cyanovirin-N binds to select SARS-CoV-2 spike oligosaccharides outside of the receptor binding domain and blocks infection by SARS-CoV-2. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 120 (10), e2214561120(2023).
  8. Margraf-Schönfeld, S., Böhm, C., Watzl, C. Glycosylation affects ligand binding and function of the activating natural killer cell receptor 2B4 (CD244) protein. J. Biol. Chem. 286 (27), 24142-24149 (2011).
  9. Thomas, D., Rathinavel, A. K., Radhakrishnan, P. Altered glycosylation in cancer: A promising target for biomarkers and therapeutics. Biochim. Biophys. Acta Rev. Cancer. 1875 (1), 188464(2021).
  10. Vasconcelos, A. A., Estrada, J. C., David, V., Wermelinger, L. S., Almeida, F. C. L., Zingali, R. B. Structure-function relationship of the disintegrin family: Sequence signature and integrin interaction. Front. Mol. Biosci. 8 (December), 1-20 (2021).
  11. Gimeno, A., Valverde, P., Ardá, A., Jiménez-Barbero, J. Glycan structures and their interactions with proteins. A NMR view. Curr. Opin. Struct. Biol. 62, 22-30 (2020).
  12. Haslam, S. M., et al. Essentials of glycobiology. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor. NY. (2022).
  13. Angulo, J., et al. NMR investigations of glycan conformation, dynamics, and interactions. Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectrosc. 144 - 145, 97-152 (2024).
  14. Bewley, C. A., Shahzad-Ul-Hussan, S. Characterizing carbohydrate-protein interactions by nuclear magnetic resonance spectroscopy. Biopolymers. 99 (10), 796-806 (2013).
  15. Quintana, J. I., Atxabal, U., Unione, L., Ardá, A., Jiménez-Barbero, J. Exploring multivalent carbohydrate-protein interactions by NMR. Chem. Soc. Rev. 52 (5), 1591-1613 (2023).
  16. Pomin, V. H., Wang, X. Glycosaminoglycan-protein interactions by nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy. Molecules. 23 (9), 2314(2018).
  17. Walinda, E., Morimoto, D., Sugase, K. Overview of relaxation dispersion NMR spectroscopy to study protein dynamics and protein-ligand interactions. Curr. Protoc. Protein Sci. 92 (1), e57(2018).
  18. Altincekic, N., et al. Large-scale recombinant production of the SARS-CoV-2 proteome for high-throughput and structural biology applications. Front. Mol. Biosci. 8, 89(2021).
  19. Mayer, M., Meyer, B. Characterization of ligand binding by saturation transfer difference NMR spectroscopy. Angew. Chem. Int. Ed. 38 (12), 1784-1788 (1999).
  20. Haselhorst, T., Lamerz, A. C., von Itzstein, M. Saturation transfer difference NMR spectroscopy as a technique to investigate protein-carbohydrate interactions in solution. Methods Mol. Biol. 534, 375-386 (2009).
  21. Dalvit, C., Fogliatto, G. P., Stewart, A., Veronesi, M., Stockman, B. WaterLOGSY as a method for primary NMR screening: Practical aspects and range of applicability. J. Biomol. NMR. 21 (4), 349-359 (2001).
  22. Dalvit, C., Fasolini, M., Flocco, M., Knapp, S., Pevarello, P., Veronesi, M. Spectroscopy experiments: Detection of high-affinity ligands. J. Med. Chem. 45, 2610-2614 (2002).
  23. Lucas, L. H., Yan, J., Larive, C. K., Zartler, E. R., Shapiro, M. J. Transferred nuclear Overhauser effect in nuclear magnetic resonance diffusion measurements of ligand-protein binding. Anal. Chem. 75 (3), 627-634 (2003).
  24. Loria, J. P., Rance, M., Palmer, A. G. A relaxation-compensated Carr−Purcell−Meiboom−Gill sequence for characterizing chemical exchange by NMR spectroscopy. J. Am. Chem. Soc. 121 (10), 2331-2332 (1999).
  25. Di Carluccio, C., et al. Investigation of protein-ligand complexes by ligand-based NMR methods. Carbohydr. Res. 503, 108313(2021).
  26. Mulloy, B., Hart, G. W., Stanley, P. Structural analysis of glycans. Essentials of glycobiology. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor. NY. (2009).
  27. Driessen, N. N., et al. Cyanovirin-N inhibits mannose-dependent Mycobacterium-C-type lectin interactions but does not protect against murine tuberculosis. J. Immunol. 189 (7), 3585-3592 (2012).
  28. Botos, I., et al. Structures of the complexes of a potent anti-HIV protein cyanovirin-N and high mannose oligosaccharides. J. Biol. Chem. 277 (37), 34336-34342 (2002).
  29. Shenoy, S. R., et al. Multisite and multivalent binding between cyanovirin-N and branched oligomannosides: Calorimetric and NMR characterization. Chem. Biol. 9 (10), 1109-1118 (2002).
  30. Mayer, M., Meyer, B. Group epitope mapping by saturation transfer difference NMR to identify segments of a ligand in direct contact with a protein receptor. J. Am. Chem. Soc. 123 (25), 6108-6117 (2001).
  31. Meyer, B., Peters, T. NMR spectroscopy techniques for screening and identifying ligand binding to protein receptors. Angew. Chem. Int. Ed. 42 (8), 864-890 (2003).
  32. Marchetti, R., et al. 34;Rules of engagement" of protein-glycoconjugate interactions: A molecular view achievable by using NMR spectroscopy and molecular modeling. Chem. Open. 5 (4), 274-296 (2016).
  33. Carr, H. Y., Purcell, E. M. Effects of diffusion on free precession in nuclear magnetic resonance experiments. Phys. Rev. 94 (3), 630-638 (1954).
  34. Bewley, C. A. Solution structure of a cyanovirin-N:Manα1-2Manα complex: Structural basis for high-affinity carbohydrate-mediated binding to gp120. Structure. 9 (10), 931-940 (2001).
  35. Weisemann, R., Rüterjans, H., Bermel, W. 3D triple-resonance NMR techniques for the sequential assignment of NH and 15N resonances in 15N- and 13C-labelled proteins. J. Biomol. NMR. 3 (1), 113-120 (1993).
  36. Muhandiram, D. R., Kay, L. E. Gradient-enhanced triple-resonance three-dimensional NMR experiments with improved sensitivity. J. Magn. Reson. B. 103 (3), 203-216 (1994).
  37. Whitehead, B., Craven, C. J., Waltho, J. P. Double and triple resonance NMR methods for protein assignment. Methods Mol. Biol. 60, 29-52 (1997).
  38. Delaglio, F., Grzesiek, S., Vuister, G. W., Zhu, G., Pfeifer, J., Bax, A. NMRPipe: A multidimensional spectral processing system based on UNIX pipes. J. Biomol. NMR. 6 (3), 277-293 (1995).
  39. Skinner, S. P., et al. Structure calculation, refinement and validation using CcpNmr Analysis. Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 71 (Pt 1), 154-161 (2015).
  40. Bewley, C. A. Solution structure of a cyanovirin-N:Manα1-2Manα complex. Structure. 9 (10), 931-940 (2001).
  41. Sanches, K., Caruso, I. P., Almeida, F. C. L., Melo, F. A. The dynamics of free and phosphopeptide-bound Grb2-SH2 reveals two dynamically independent subdomains and an encounter complex with fuzzy interactions. Sci. Rep. 10 (1), 1-13 (2020).
  42. Almeida, F. C. L., Sanches, K., Caruso, I. P., Melo, F. A. NMR relaxation dispersion experiments to study phosphopeptide recognition by SH2 domains:the Grb2-SH2-phosphopeptide encounter complex. SH2 Domains. 2705, 135-151 (2023).
  43. Huang, R., Bonnichon, A., Claridge, T. D. W., Leung, I. K. H. Protein-ligand binding affinity determination by the WaterLOGSY method: An optimised approach considering ligand rebinding. Sci. Rep. 7 (March), 1-6 (2017).
  44. Caruso, I. P., et al. Insights into the specificity for the interaction of the promiscuous SARS-CoV-2 nucleocapsid protein N-terminal domain with deoxyribonucleic acids. Int. J. Biol. Macromol. 203 (January), 466-480 (2022).
  45. Luna, R. E., Akabayov, S. R., Ziarek, J. J., Wagner, G. Examining weak protein-protein interactions in start codon recognition via NMR spectroscopy. FEBS J. 281 (8), 1965-1973 (2014).
  46. Qin, J., Gronenborn, A. M. Weak protein complexes: Challenging to study but essential for life. FEBS J. 281 (8), 1948-1949 (2014).
  47. Perkins, J. R., Diboun, I., Dessailly, B. H., Lees, J. G., Orengo, C. Transient protein-protein interactions: Structural, functional, and network properties. Structure. 18 (10), 1233-1243 (2010).
  48. Ross, J. L. The dark matter of biology. Biophys. J. 111 (5), 909-916 (2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Spektroskopia NMRperturbacja przesuni cia chemicznegor nica transferu saturacjimapowanie wi zania ligand wwi zanie D mannozycyjanowiryna Nanaliza szybko ci relaksacjidynamika strukturalna

Powiązane artykuły