Badanie interakcji białko-glikan: postępy w magnetycznym rezonansie jądrowym

Interakcje białko-glikan mają fundamentalne znaczenie dla szerokiego zakresu procesów biologicznych, w tym rozpoznawania komórka-komórka, modulacji odpowiedzi immunologicznej i interakcji patogen-gospodarz ^1,2. Te oddziaływania molekularne są wysoce specyficzne i dynamiczne oraz odgrywają kluczową rolę zarówno w mechanizmach fizjologicznych, jak i patologicznych ^3,4,5. Klasycznym przykładem takich interakcji są lektyny, białka, które specyficznie rozpoznają glikany i wiążą się z nimi. Na przykład cyjanowiryna-N (CVN) była szeroko badana jako model eksperymentalny ze względu na jej zdolność do interakcji w wysokim powinowactwie z oligosacharydami^o wysokim powinowactwie ^5,6,7.

Oprócz lektyn wiele glikozylowanych białek, takich jak integryny, odgrywa również istotną rolę w rozpoznawaniu i sygnalizacji komórkowej. Integryny są receptorami transbłonowymi, które często ulegają glikozylacji swoich podjednostek, co wpływa na ich stabilność i powinowactwo do ligandów, w tym glikanów 5,8,9,10. Jednak strukturalna charakterystyka tych interakcji pozostaje wyzwaniem ze względu na wewnętrzną heterogeniczność i elastyczność glikanów, co komplikuje tradycyjne podejścia biologii strukturalnej. W tym kontekście, rozwój zaawansowanych metodologii zdolnych do uchwycenia tych interakcji w roztworze ma ogromną wartość dla tej dziedziny, szczególnie dla glikobiologii^11,12.

Spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) stała się potężnym narzędziem do badania oddziaływań białko-ligand na poziomie atomowym. W przeciwieństwie do innych technik, takich jak krystalografia rentgenowska i mikroskopia krioelektronowa, NMR umożliwia badanie interakcji biomolekularnych w warunkach zbliżonych do fizjologicznych, zapewniając wgląd zarówno w strukturę, jak i dynamikę. Ta elastyczność umożliwia naukowcom modulowanie parametrów środowiskowych, takich jak pH (zwykle w zakresie 4,0-8,0), siła jonowa (np. 0-500 mM NaCl) i temperatura (zwykle 273-330 K), dostosowując w ten sposób warunki do specyfiki kompleksów białkowo-glikanowych. Ponadto NMR jest szczególnie korzystny do analizy oddziaływań przejściowych i słabych, które są często charakterystyczne dla zdarzeń rozpoznawania białka i glikanów^13,14.

Do zbadania interakcji białko-glikan zastosowano kilka technik NMR, wykorzystując zarówno podejścia oparte na białkach, jak i ligandach. Z punktu widzenia białek, miareczkowanie heterojądrowej koherencji pojedynczej koherencji kwantowej (HSQC) jest szeroko stosowane do mapowania miejsc wiązania poprzez monitorowanie perturbacji przesunięć chemicznych po dodaniu liganda. Eksperymenty dyspersji relaksacyjnej umożliwiają wykrycie procesów konformacyjnych i wymiany chemicznej zachodzących w skali czasowej od mikro do milisekund, dostarczając wglądu w dynamiczne aspekty rozpoznawania glikanów^15,16. Te techniki oparte na białkach zazwyczaj wymagają stężeń próbki w zakresie od 50 μM do 2 mM, w zależności od stabilności białka i skuteczności znakowania ^17,18.

Techniki NMR oparte na ligandach oferują informacje uzupełniające, koncentrując się na zmianach glikanów podczas wiązania. Różnica w przenoszeniu nasycenia (STD-NMR) jest szczególnie przydatna do identyfikacji epitopów glikanów zaangażowanych w rozpoznawanie, ponieważ selektywnie nasyca sygnały NMR regionów ligandów w bliskim kontakcie z białkiem^19,20. Ligandy wodne obserwowane za pomocą spektroskopii gradientowej (WaterLOGSY)^21,22 i spektroskopii z przeniesionym jądrowym efektem overhausera (Tr-NOESY) dostarczają dodatkowych środków do oceny wiązania ligandów i zmian konformacyjnych podczas interakcji²³. Co więcej, eksperymenty relaksacyjne Carra-Purcella-Meibooma-Gilla (CPMG) pomagają w identyfikacji słabych i przejściowych oddziaływań, które są trudne do wykrycia konwencjonalnymi metodami²⁴. Eksperymenty na bazie ligandów są często przeprowadzane przy stężeniach białek 10-50 μM i mogą wymagać optymalizacji czasów mieszania i parametrów nasycenia²⁵. Warto zauważyć, że metody te mogą być ograniczone przez niską rozpuszczalność glikanów lub słaby stosunek sygnału do szumu podczas pracy z małymi ligandami.

Razem te metody NMR zapewniają kompleksowe ramy do wyjaśnienia strukturalnych i dynamicznych właściwości interakcji białko-glikan. Dzięki ciągłym postępom w zakresie czułości i strategii znakowania izotopowego, technika ta staje się coraz bardziej istotna w glikobiologii, oferując nowe perspektywy na mechanizmy rozpoznawania molekularnego z potencjalnymi zastosowaniami w opracowywaniu leków i odkrywaniu biomarkerów. Niemniej jednak sukces tych podejść zależy od takich czynników, jak jednorodność próbki, złożoność glikanów oraz obecność elastycznych lub nieuporządkowanych regionów, które mogą poszerzać sygnały NMR lub utrudniać interpretację²⁶. NMR to potężna metoda badania zdarzeń przejściowych, która jest głównym wyzwaniem w biologii strukturalnej.

CVN rozpoznaje reszty mannozylowe połączone z α(1,2) obecne w oligosacharydach o wysokiej zawartości mannozy o powinowactwie nanomolowym 27,28,29. Jednak słabo rozpoznaje monosacharyd D-mannozę. W niniejszej pracy badaliśmy interakcję CVN z D-mannozą jako sposób na zilustrowanie, w jaki sposób NMR jest potężny w zrozumieniu interakcji przejściowych.

UWAGA: Wszystkie kroki związane z kulturami bakteryjnymi i preparatami buforowymi należy wykonywać zgodnie z instytucjonalnymi protokołami bezpieczeństwa biologicznego. Używaj środków ochrony osobistej (PPE), a w przypadku pracy z otwartymi kulturami lub chemikaliami pracuj w komorze bezpieczeństwa biologicznego lub okapie oparów chemicznych, jeśli jest to wymagane.

1. Ekspresja cyjanowiryny-N

1. Przekształć komórki BL21 E. coli za pomocą plazmidu kodującego gen CVN wstawiony do wektora pET26a.
2. Hoduj komórki w 1 L Super Bulionu (32 g tryptonu, 20 g ekstraktu drożdżowego, 5 g NaCl na L), uzupełnionym kanamycyną (50 μg/mL), 0,5% (w/v) glukozy i 1,6 mM_MgSO4. Inkubować w ciągłym mieszaniu przy ~250 obr./min w temperaturze 37 °C.
3. W celu wytworzenia ¹⁵CVN znakowanych N należy hodować komórki w zmodyfikowanym minimalnym pożywce M9, używając ¹⁵NH₄Cl jako jedynego źródła azotu.
   1. Przygotować 1 l minimalnej pożywki M9 przez zmieszanie 200 ml sterylnego roztworu 5 soli M9 zawierającego 64 g/L Na₂HPO₄, 15 g/L KH₂PO₄, 2,5 g/L NaCl, 5 g/L NH₄Cl.
   2. Dodać 2 ml 1 M MgSO₄ (0,22 μm sterylizowane przez filtr), 0,1 ml 1 M CaCl₂ (sterylizowane przez filtr 0,22 μm) i 4 g glukozy (stężenie końcowe 0,4%, rozpuszczone w sterylnej wodzie destylowanej i 0,22 μm sterylizowane przez filtr).
   3. Doprowadzić ostateczną objętość do 1 l sterylną wodą destylowaną.
      UWAGA: W razie potrzeby można dodawać suplementy, takie jak aminokwasy lub witaminy.
4. Monitorować hodowlę, aż osiągnie gęstość optyczną (OD₆₀₀) około 1,2. Następnie dodać izopropylo-beta-D-tiogalaktopiranozyd (IPTG) do końcowego stężenia 1,0 mM w celu indukcji ekspresji białka.
5. Inkubować przez 20 godzin po indukcji w temperaturze 37 °C.
6. Zebrać komórki przez odwirowanie w temperaturze 7 000 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
7. Wyizoluj frakcję peryplazmatyczną w następujący sposób:
   1. Zawiesić osady komórkowe w 0,4 objętości 30 mM buforu Tris-HCl (pH 8,0) zawierającego 20% sacharozy i 1 mM EDTA i inkubować w temperaturze pokojowej z wytrząsaniem przez 10 minut.
   2. Wirować przy 10 000 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
   3. Powstałe granulki zawiesić ponownie w 0,4 objętości lodowatej wody destylowanej i inkubować na lodzie z wytrząsaniem przez 10 minut.
   4. Ponownie odwirować w temperaturze 10 000 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
   5. Zebrać supernatant, który odpowiada frakcji peryplazmatycznej, do ekstrakcji białka.
      UWAGA: Wszystkie muszą zawierać koktajl inhibitorów proteazy, aby zapobiec degradacji białek.

2. Eksperymenty NMR

UWAGA: Wszystkie eksperymenty zostały uzyskane przy 14,1 T przy użyciu sondy ¹H/¹⁵N/¹³C z potrójnym rezonansem odwróconym (patrz tabela materiałów) w temperaturze 298K.

1. Eksperymenty oparte na ligandach
   1. Przygotowanie próbki
      1. Przygotować dwie próbki: jedną zawierającą CVN i jedną bez CVN (kontrola tylko ligandem). Każda próbka zawiera 600 μl 80 μM CVN w buforze fosforanu sodu (pH 7,4) zawierającym 50 mM NaCl.
      2. Dodać D-mannozę do końcowego stężenia 4 mM.
      3. Dodać 5% (v/v)_D2O do każdej próbki.
      4. Przenieść próbkę do probówki NMR o średnicy 5 mm.
      5. Użyj 50-krotnego molowego nadmiaru liganda w stosunku do białka.
         UWAGA: Zazwyczaj zaleca się nadmiar liganda w zakresie od 10 do 1000 razy, przy czym mniejsze nadmiary są preferowane dla małych białek.
   2. Akwizycja spektralna do przypisania D-mannozy
      1. Uzyskaj widma 2D TOCSY i 2D ^{1 H-13}C HMBC przy użyciu standardowych sekwencji impulsów:
         2D TOCSY: Czuła na fazę spektroskopia korelacji całkowitej (TOCSY) z rzeźbieniem wzbudzenia w celu tłumienia wody (DIPSI2ESGPPH).
         2D HMBC: ^{1 H-13}C Heterojądrowa korelacja wielu wiązań z selekcją gradientu i akwizycją niesprzężoną (HMBCGPNDQF).
         UWAGA: Eksperymenty te zostały przeprowadzone w celu przypisania D-mannozy, ale nie są pokazane, ponieważ przypisanie przesunięcia chemicznego nie wchodzi w zakres tego badania.
   3. Mapowanie wiązania liganda poprzez perturbację przesunięcia chemicznego (CSP) liganda
      1. W celu przygotowania próbki i uzyskania widma ¹H-¹³C HSQC, należy przygotować 4 mM roztwór D-mannozy w buforze fosforanu sodu (pH 7,4) z 50 mM NaCl i 5% D₂O. Podzielić roztwór na dwie próbki: jedną z 80 μM CVN i jedną bez CVN (odniesienie tylko ligand).
         UWAGA: Widma te zostaną wykorzystane do określenia CSP D-mannozy po interakcji z CVN.
      2. Do ustawienia parametrów akwizycji ^{1 H-13}C HSQC należy użyć standardowej sekwencji impulsów HSQCETGPSI (wybór gradientu i zwiększona czułość ^{1 H-13}C HSQC). Ustaw następujące parametry pozyskiwania:
         Dziedzina czasu (TD): 1024 × 128 punktów zespolonych (wymiary ¹H × ¹³C)
         Szerokość spektralna (SW): 10,0171 ppm (6009,615 Hz) dla ¹H, 80 ppm (12069,106 Hz) dla ¹³C
         Częstotliwości nośne: 4,7 ppm dla ¹H, 75 ppm dla ¹³C
         - Liczba skanów: 448.
      3. Oblicz CSP, korzystając z następującego równania:
         
         gdzie i reprezentują różnice przesunięć chemicznych między D-mannozą w obecności CVN (rysunek 1A, oznaczony na czerwono) a wolną D-mannozą (rysunek 1B).
   4. Mapowanie wiązania liganda poprzez różnicę transferu nasycenia (STD)
      1. Utwórz nowy zestaw danych i skonfiguruj parametry dla eksperymentów STD-NMR. Można zastosować dwie strategie eksperymentalne: (i) badanie przesiewowe o różnych częstotliwościach nasycenia w celu optymalizacji stosunku sygnału do szumu; (ii) ustalenie częstotliwości nasycenia i zróżnicowanie czasu nasycenia w celu oceny narastania.
      2. Skonfiguruj eksperymenty 1D ¹H NMR przy użyciu sekwencji impulsów zgpr. Nastaw spektrometr na ¹H, wykonaj podkładkowanie i zmierz twardy impuls 90° (np. ~10 μs przy tłumieniu -10,6 dB, co odpowiada ~11,482 W).
      3. Wyśrodkuj częstotliwość nośną ¹H na około 4,7 ppm, co odpowiada sygnałowi wody.
      4. Wybierz sekwencję impulsów STDDIFFESGP.3 i skonfiguruj parametry akwizycji w następujący sposób:
         Ustaw szerokość widmową zgodnie z wymaganiami próbki.
         Ustaw opóźnienie między skanowaniami (d1) na 4 s.
         Zdefiniuj czas nasycenia (d20) na podstawie żądanego eksperymentu.
         Załaduj FQ2LIST zawierającą częstotliwość nasycenia poza rezonansem (-40 ppm) i częstotliwości rezonansowe, aby nasycić tylko sygnał białkowy.
         UWAGA: Częstotliwości rezonansowe muszą odpowiadać protonom białkowym i muszą znajdować się co najmniej 1000 Hz od dowolnego sygnału liganda, aby uniknąć bezpośredniego nasycenia.
      5. Przetestuj następujące częstotliwości nasycenia rezonansu, aby określić optymalne warunki: -0,59 ppm, 0,73 ppm i 8,1 ppm (patrz rysunek 2A).
         UWAGA: 0,73 ppm zostało wybrane jako częstotliwość nasycenia rezonansu, ponieważ zapewnia najlepszy stosunek sygnału do szumu. Korzystając z tej częstotliwości, współczynnik wzmocnienia_{STD (A STD}) określono ilościowo jako funkcję czasu nasycenia. W tym celu uzyskano widma chorób przenoszonych drogą płciową w różnych czasach nasycenia (0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3 i 4 s), aby skonstruować krzywą narastania chorób przenoszonych drogą płciową (rysunek 2B). Odpowiednie wartości_{A STD} zostały następnie wykreślone jako funkcja czasu nasycenia (rysunek 2C), co pozwoliło na ocenę efektywności transferu nasycenia, która jest proporcjonalna do czasu i bliskości wodoru liganda do białka. Współczynnik_STD definiuje się jako:
         
         I_STD to różnica w intensywności sygnału między widmami rezonansowymi i wyłączonymi, I₀ to intensywność sygnału w widmie poza rezonansem, [L]_T to całkowite stężenie liganda, a [P] to stężenie białka. Ta normalizacja uwzględnia wpływ koncentracji i pozwala na porównanie w różnych warunkach eksperymentalnych. Choroba przenoszona drogą płciową opiera się na dyfuzji spinowej i powolnym wirowaniu molekularnym, aby skutecznie przenieść nasycenie z białka do związanego liganda. Większe białka (powolne bębnienie) pozwalają na bardziej efektywne nasycenie i rozprzestrzenianie się magnetyzacji w białku 19,30,31,32.
      6. Ustaw liczbę skanów (ns) na 64 i uśrednij eksperyment l4 (pętla 4) razy.
      7. Oblicz łączną liczbę skanów jako: Łączna liczba skanów = ns × l4. Użyj 32 768 punktów zespolonych w wymiarze bezpośrednim (TD) o szerokości widmowej (SW) 10,0171 ppm (6,009,615 Hz).
      8. Ustaw opóźnienie między skanowaniami (d1) na 4 s, a czas akwizycji (AQ) na 2,7262976 s. Całkowite opóźnienie relaksacji wynosi d1 + AQ.
      9. Skonfiguruj impuls nasycenia w następujący sposób: czas trwania 50 ms; kształt Gaussa (p42); sterowany za pomocą programu kształtowego 9 (SP9).
      10. Użyj wariantu sekwencji impulsów STD, który zawiera filtr T₁ρ, aby stłumić resztkowe sygnały białkowe. Ustaw czas blokady wirowania (d29) w oparciu o masę cząsteczkową białka. W przypadku większych białek należy stosować krótsze czasy wirowania (~20 ms), a w przypadku mniejszych białek większe (> 40 ms).
          UWAGA: Wszystkie widma chorób przenoszonych drogą płciową zostały uzyskane na częstotliwości 599,93 MHz (BF1). Regulacja d29 ma kluczowe znaczenie dla zminimalizowania tła białka przy jednoczesnym zachowaniu integralności sygnału liganda. W razie potrzeby zoptymalizuj ten parametr empirycznie.
   5. Mapowanie wiązania liganda za pomocą ¹H-R₂
      1. Wybierz program impulsowy CPMG_ESGP2D ze standardowej biblioteki firmy Bruker. Sekwencja ta jest oparta na eksperymencie Carra-Purcella-Meibooma-Gilla (CPMG), obejmującym rzeźbienie wzbudzenia w celu tłumienia wody³³.
      2. Ustaw eksperyment jako akwizycję 2D.
         UWAGA: Jest to eksperyment pseudo-2D, w którym tylko wymiar bezpośredni jest używany do informacji o przesunięciu chemicznym.
      3. Skonfiguruj parametry akwizycji w następujący sposób:
         Dziedzina czasu (TD): 32 768 punktów zespolonych w bezpośrednim wymiarze ¹H.
         (TD1): 2 punkty.
         Szerokość widmowa (SW): 7,9932 ppm (4,795,396 Hz).
         Opóźnienie przerwania skanowania (d1): 4 s.
         Częstotliwość nośna (o1): 4,7 ppm (wyśrodkowana na sygnale wodnym).
         Liczba skanów (ns): 8.
         Liczba skanów pozorowanych (ds): 4.
         Opóźnienie CPMG (d20): ≤1 ms (tj. krócej niż 1⁄3 J_HH).
         Liczba średnich (TDav): 200.
      4. Uruchom eksperyment dla 200 cykli po 8 skanów każdy, co daje łączną akumulację 1 600 skanów. Dostosuj listę liczników zmiennych (vclist) zgodnie z żądanym całkowitym czasem cyklu CPMG (T_CPMG). W tym przypadku wybrano 2 cykle dla T_CPMG = 8 ms i 200 cykli dla T_CPMG = 800 ms.
      5. Przeprowadź dwa eksperymenty ¹H-CPMG, jedno dla próbki zawierającej białko (4 mM D-mannoza i 80 μM CVN), a drugie dla wolnej D-mannozy (4 mM D-mannoza).
      6. Wykreślić widma ¹H dla każdego_{T CPMG}za pomocą polecenia efp (mnożenie wykładnicze, po którym następuje transformacja Fouriera i korekcja fazy) lub sinm (mnożenie sinusoidalne przesunięte o 90°, SSB=2), a następnie fp (transformacja Fouriera i korekcja fazowa). Dostosuj funkcję okna zgodnie z najlepszą strategią przetwarzania.
         UWAGA: W tym eksperymencie użyto sinm i fp. Pierwsza^{seria będzie} widmem o T_CPMG wynoszącym 8 ms (pierwsza w vclist), a^{druga seria będzie} miała 800 ms (druga w vclist). Przetworzone ¹widma H przedstawiono na rysunku 3.
      7. Oblicz iloraz CPMG (Q) za pomocą równania 3.
         ​
2. Eksperymenty oparte na białkach
   1. Przygotowanie próbki
      1. Przygotować 600 μl próbki zawierającej 436 μM równomiernie ¹⁵N-znakowanych CVN w buforze fosforanu sodu (pH 7,4) uzupełnionego 50 mM NaCl i 5% tlenku deuteru (_D2O). Miareczkować D-mannozę do próbki do końcowego stężenia 60 mM. Do miareczkowania należy użyć probówki NMR o średnicy 5 mm.
   2. Przypisanie rezonansu (opcjonalny krok walidacji)
      1. Potwierdź przypisanie wolnego CVN w roztworze, używając wcześniej zgłoszonych wartości przesunięcia chemicznego³⁴. Uzyskaj następujące widma potrójnego rezonansu: HNCO, HNCA, HNCACB i CBCACONH 35,36,37.
         UWAGA: Eksperymenty te służą jedynie do walidacji przypisania i nie są pokazane, ponieważ przypisanie przesunięcia chemicznego nie jest głównym celem tego protokołu.
   3. Mapowanie wiązania D-mannozy z CVN przez zaburzenia przesunięcia chemicznego białka
      1. Uzyskaj ¹widmo ^H-15N HSQC ¹⁵N-znakowanego CVN w temperaturze 298 K. Wykonaj miareczkowanie, dodając D-mannozę, aby osiągnąć następujące stężenia końcowe: 0, 1, 2, 5, 10, 20, 40 i 60 mM.
      2. Skonfiguruj eksperyment ^{1 H-15}N Fast-HSQC, używając czułej na fazę sekwencji impulsów FHSQCF3GPPH ze standardowej biblioteki Bruker. Użyj następujących parametrów:
         Dziedzina czasu (TD): 1024 × 140 punktów zespolonych w wymiarach ¹H i ¹⁵N.
         Szerokość spektralna (SW): 16,0274 ppm (9615,385 Hz) w wymiarze ¹H i 34 ppm (2067,119 Hz) w wymiarze ¹⁵N.
         Częstotliwość nośna: 4,7 ppm (¹H) i 119 ppm (¹⁵N).
         Liczba skanów: 128.
      3. Obliczyć perturbację przesunięcia chemicznego (Δδ) za pomocą następującego równania:
         
         gdzie i są różnicami przesunięć chemicznych między CVN w obecności i braku D-mannozy (ryc. 4A).
         UWAGA: Współczynnik 10 uwzględnia różnicę w szerokościach widmowych między wymiarami protonu i azotu.
      4. Obliczyć stałą dysocjacji (K_{, D}), wykreślając wartości CSP dla każdej pozostałości w funkcji stężenia D-mannozy. Dopasuj uzyskane dane do izotermy wiązania w jednym miejscu, korzystając z następującego równania (5).
         równanie 5
         gdzie [P_T] jest stężeniem białka używanym w miareczkowaniu (CVN), [P_T] jest stężeniem liganda (D-mannoza), a CSPmax jest CSP przy stężeniu nasycenia liganda i CSPmin przy braku liganda.
   4. Mapowanie wiązania D-mannozy z CVN poprzez pozycję ¹⁵N-R₂ białka.
      1. Zmierzyć ¹⁵wartości N-R₂ poszczególnych pozostałości CVN pod nieobecność i w obecności 60 mM D-mannozy. Wykonuj wszystkie eksperymenty w temperaturze 298 K.
      2. Skonfiguruj eksperyment ¹⁵N-R₂ przy użyciu czułej na fazę sekwencji impulsów opartej na CPMG HSQCT2ETF3GPSI3D ze standardowej biblioteki Bruker. Użyj następujących parametrów:
         Dziedzina czasu (TD): 1024 × 128 punktów zespolonych w wymiarach ¹H i ¹⁵N, z 8 punktami w pseudowymiarze.
         Szerokość spektralna (SW): 16,0274 ppm (¹H; 9615,385 Hz) i 34 ppm (¹⁵N; 2067,119 Hz).
         Częstotliwość nośna: 4,7 ppm (¹H) i 119 ppm (¹⁵N).
         Liczba skanów: 32. (v) Lista liczników zmiennych: 1, 8, 2, 6, 3, 5, 4 i 7, odpowiadające opóźnieniom relaksacji (T_relax) wynoszącym odpowiednio 16,96, 135,68, 33,92, 101,76, 50,88, 84,96, 67,84 i 118,72 ms.
      3. Przetwarzaj widma pseudo3D jako serię widm relaksacyjnych korelacji podobnych do HSQC ¹H/¹⁵N za pomocą NMRPipe³⁸, postępując zgodnie z samouczkiem oprogramowania (patrz Spis materiałów , aby uzyskać link do samouczka).
      4. Zaimportuj przetworzone widma do odpowiedniej platformy analizy NMR (np. CCPNMR³⁹). Zaznacz wszystkie widma i zastosuj narzędzie "Śledź zmiany intensywności". Wykreślić intensywność każdego piku krzyżowego w funkcji_relaksu T i dopasować rozpad do funkcji monowykładniczej, aby wyodrębnić ¹⁵wartości N-R₂ dla każdej pozostałości.
      5. Obliczyć błąd eksperymentalny na podstawie stosunku sygnału do szumu widm podobnych do HSQC przy 67,84 ms. Przetwórz obszar widma zawierający tylko szum i przekonwertuj go na plik tekstowy za pomocą następującego polecenia:
         pipe2txt.tcl ./PROCs/ft/R2_67_84.ft2 > noise67_84.txt"
      6. Określ odchylenie standardowe obszaru szumu za pomocą oprogramowania statystycznego (np. Origin(Pro), wersja 2021). Zdefiniuj tę wartość jako natężenie hałasu I_szum.
      7. Obliczyć błąd doświadczalny dla każdej pozostałości, stosując następujące równanie:
         
         UWAGA: Ważne jest, aby użyć błędu eksperymentalnego, a nie błędu dopasowania. Błąd doświadczalny określa granice interpretacji przy porównaniu ¹⁵N-R₂ pod nieobecność i obecność D-mannozy.

Rysunek 1: Zaburzenia przesunięcia chemicznego D-mannozy w obecności CVN. (A) ¹widmo ^H-13C-HSQC D-mannozy w obecności CVN. (B) ¹widmo ^H-13C-HSQC wolnej D-mannozy. Etykiety w widmach pokazują każde z przypisań przesunięć chemicznych i odpowiednią konfigurację anomeryczną (α lub β). Etykiety w kolorze czerwonym to etykiety przypisane do konformacji związanej, a te w kolorze czarnym to etykiety przypisane do konformacji swobodnej. (C) Superpozycja ^{widm 1 H-13}C-HSQC w obecności (kolor zielony) i braku (kolor niebieski) CVN. (D) Struktura chemiczna α- i β-D-mannozy z podkreśleniem obserwowanego CSP, która została obliczona zgodnie z równaniem (1). Wartości CSP są przedstawione poniżej zielonych kółek. Czerwony okrąg reprezentuje β-anomeryczny wodór, który zniknął w obecności CVN. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Widma różnicy nasycenia (STD) D-mannozy w obecności CVN. (A) Choroby przenoszone drogą płciową nabyte przy różnych częstotliwościach nasycenia: -0,59, 0,73 i 8,1 ppm. (B) Choroba przenoszona drogą płciową nabyta w różnych czasach nasycenia: 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3 i 4 s. (C) Współczynnik amplifikacji_{STD (A STD}) obliczony zgodnie z równaniem 2 w funkcji czasu nasycenia. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: ¹H-R₂ D-mannozy w obecności i bez CVN. (A) Przedstawienie oczekiwanych widm D-mannozy ¹H-CPMG dla spoiwa i niespoiwa uzyskanych przy czasach relaksacji R₂ wynoszących 8 i 800 ms przy braku (na dole) i obecności (na górze) CVN. Q obliczono zgodnie z równaniem 3. W przypadku braku interakcji (Q ≈ 1) intensywność sygnału pozostaje podobna w obu czasach relaksacji liganda z białkiem lub bez niego. Po związaniu (Q < 1) intensywność sygnału zmniejsza się wraz ze wzrostem relaksacji próbki zawierającej białko. (B) Schematyczne przedstawienie wymiany chemicznej pomiędzy stanami swobodnymi i związanymi D-mannozy. W zależności od względnych wartości różnicy przesunięcia chemicznego (Δω) i stałej kursu walutowego (k_ex = k_wł. + k_wył.), układ wpada w reżim powolnej, pośredniej lub szybkiej wymiany. oraz¹Widma H NMR wolnej D-mannozy i D-mannozy w obecności CVN, wykazujące różnice w natężeniach sygnału przy czasach relaksacji 8 ms i 800 ms. Pokazano obliczone współczynniki Q dla określonych wodorów (H_6β, H_3β, H_5α, H_4β), przy czym niższe wartości Q wskazują na silniejsze interakcje z CVN i identyfikują regiony cukru biorące udział w wiązaniu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Analiza zakłóceń przesunięcia chemicznego (CSP) ujawniająca pozostałości CVN biorące udział w wiązaniu D-mannozy. (A) Wykresy słupkowe przedstawiające amidowe (^{15 N-1}H) CSP szkieletu CVN po miareczkowaniu D-mannozą w stężeniach 10 mM (góra) i 60 mM (dół). Linie poziome wskazują średnią CSP plus jedno lub dwa odchylenia standardowe (av + sd, av + 2 sd), które zostały wykorzystane jako progi do identyfikacji znacznie zaburzonych pozostałości. (B) Mapowanie znacznie zaburzonych reszt na strukturę CVN skompleksowaną z disacharydem Manα1-2Manα (PDB ID: 1IIY⁴⁰). Pozostałości z CSP powyżej progu av + 2 sd są podświetlone na czerwono, a te między av + sd a av + 2 sd są pokazane na niebiesko. Cząsteczki disacharydu Manα1-2Manα są wyświetlane na pomarańczowo, aby wskazać ich miejsce wiązania. (C) Wybrane krzywe wiązania reprezentujące CSP w funkcji stężenia D-mannozy. Dane dopasowano zgodnie z równaniem 5 jako model wiązania w jednym miejscu w celu oszacowania K_D, ujawniając zakres powinowactw, przy czym D44 wykazuje najsilniejszą interakcję (K_D = 1,1 ± 0,35 mM), a E41 najsłabszą (K_D = 35 ± 29 mM). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Analiza ¹⁵N-R2 pod kątem CVN wolnych i związanych z D-mannozą. (A, B) Szybkości relaksacji poprzecznej (¹⁵N-R₂) mierzone dla każdej reszty CVN w jej stanie (A) wolnym i (B) związanym z D-mannozą. (C) Różnica w wartościach R₂ (ΔR₂ = R₂^związany − R₂^wolny) wykreślonych dla każdej pozostałości. Niebieskie i czerwone linie reprezentują odpowiednio jedno i dwa odchylenia standardowe od średniej (av ± sd i av ± 2 sd). Pozostałości o znaczących wartościach ΔR₂ są oznakowane. (D) Mapowanie wartości ΔR₂ dla struktury CVN skompleksowanej z disacharydem Manα1-2Manα (PDB ID: 1IIY⁴⁰). Pozostałości o ΔR₂ powyżej lub poniżej av± 2 sd są pokazane na czerwono; Te pomiędzy AV± SD i AV± 2 SD są pokazane na niebiesko. Cząsteczki D-mannozy są wyświetlane na pomarańczowo, aby wskazać ich miejsce wiązania. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

W niniejszej pracy przedstawiono eksperymenty NMR mające na celu zbadanie oddziaływań białko-glikan. Rozpoznawanie molekularne glikanów białkowych leży u podstaw wielu procesów biologicznych obejmujących macierz zewnątrzkomórkową (ECM), w tym regulację adhezji komórek, migrację, proliferację i różne inne formy komunikacji komórkowej.

Tutaj zdecydowaliśmy się na pracę z monosacharydem D-mannozą, który jest opisywany jako słabe spoiwo. Celem było opisanie metod pomiaru interakcji przejściowych i podkreślenie ich znaczenia w wyjaśnianiu mechanizmów wiązania. Zastosowano trzy różne podejścia NMR oparte na ligandach w celu scharakteryzowania miejsc interakcji ligandu.

Pierwsza metoda polegała na ocenie zaburzeń przesunięcia chemicznego (CSP) D-mannozy w obecności CVN. W tym celu zarejestrowaliśmy 1widmo H-13C-HSQC próbki zawierającej 50-krotny nadmiar D-mannozy w stosunku do CVN (Rysunek 1A) i wolnej D-mannozy w identycznych warunkach buforowych (Figura 1B). Zaobserwowano zmiany przesunięć chemicznych dla obu konfiguracji anomerycznych (ryc. 1C). Warto zauważyć, że większe perturbacje wykryto w przypadku β-D-mannozy, co sugeruje preferencyjne wiązanie z CVN.

Dla większości wodorów D-mannozy zaobserwowano dwa wyraźne piki w widmach w obecności CVN, odpowiadające stanom wolnym (niebieskim) i związanym (zielonym) (rysunek 1C). To zachowanie jest charakterystyczne dla reżimu powolnej wymiany (rysunek 3B), co wskazuje, że różnica przesunięcia chemicznego między stanem swobodnym i związanym dla każdego protonu (Δω, w Hz) przekracza kurs wymiany (kₑₓ = kon + koff). Tylko jeden wodór (H5β) wykazywał reżim szybkiej wymiany. Dodatkowo nie zaobserwowano CSP dla anomerycznego protonu α-D-mannozy. W przeciwieństwie do tego, nie wykryto piku krzyżowego odpowiadającego anomerycznemu protonowi β-D-mannozy, co może odzwierciedlać wymianę pośrednią spowodowaną wiązaniem. Wodory biorące udział w wiązaniu obu form anomerycznych podsumowano na rysunku 1D.

Drugim eksperymentem opartym na ligandach, który przeprowadziliśmy, był NMR różnicy transferu nasycenia (STD), który dobrze nadaje się do ligandów, które wymieniają się między stanami związanymi i swobodnymi w skali czasowej mikrosekund. Ten reżim wymiany pozwala na przeprowadzanie eksperymentów z dużym nadmiarem liganda w stosunku do białka. W naszym przypadku zastosowaliśmy 4 mM D-mannozę i 80 μM CVN, co odpowiada 50-krotnemu nadmiarowi molowemu.

Wyniki badań nad chorobami przenoszonymi drogą płciową uzupełniły dane dotyczące mannozy CSP. Jądra wodoru wykazujące najwyższe wartościA STD były związane z β-D-mannozą (ryc. 2C), zgodnie z analizą CSP, która wykazała wyraźne zaburzenia w H2β, H3β, H4β i H6β (ryc. 1D). Choroba przenoszona drogą płciową odzwierciedla efektywność przenoszenia namagnesowania z nasyconego białka (CVN) do liganda (D-mannozy), w którym pośredniczą oddziaływania dipolarne między spinami jądrowymi ¹H obu cząsteczek. Ponieważ transfer ten zależy od bliskości przestrzennej, oczekuje się wyższych wartościA STD dla protonów D-mannozy w bliskim kontakcie z miejscem wiązania CVN.

Innym sposobem mapowania miejsc oddziaływań na ligandzie jest ocena szybkości relaksacji poprzecznej (1H-R2) jego atomów wodoru (ryc. 3B). 1Relaksacja H-R2 zachodzi głównie poprzez oddziaływania dipolarne z sąsiednimi jądrami 1H za pośrednictwem wielu szlaków relaksacyjnych. Po związaniu liganda z białkiem wprowadzane są nowe szlaki relaksacyjne ze względu na bliskość wodorów białkowych do wodorów liganda. Te dodatkowe ścieżki zwiększają efektywność relaksacji, co skutkuje zwiększonymi wartościami 1H-R2 . Dodatkowym czynnikiem przyczyniającym się do wyższych wartości 1H-R2 jest wydłużenie pozornego czasu korelacji rotacyjnej (τc) po związaniu. Kiedy mały, szybko wirujący ligand oddziałuje z większym, wolniej obracającym się białkiem, jego efektywne τc wzrasta (równanie 7), co również sprzyja bardziej efektywnej relaksacji poprzecznej, prowadząc do wyższych obserwowanych wartości 1H-R2 .

(równanie 7)

gdzie jest pozornym czasem korelacji rotacyjnej, a gdzie i odpowiada czasowi korelacji odpowiednio kompleksu i ligandu. Zazwyczaj , w wyniku czego , tak, że ligand zachowuje się jak większa cząsteczka o podwyższonych wartościach 1H-R2. Na pozorny czas korelacji mają wpływ związane fzwiązane i f wolne frakcje molowe liganda. Wraz ze wzrostem f zwiększa, zwiększa się, co prowadzi do zwiększonej relaksacji 1H-R2.

Innym czynnikiem przyczyniającym się do wzrostu 1H-R2 po związaniu jest udział wymiany chemicznej między stanem swobodnym i związanym (Rex), co dodatkowo podnosi pozorną szybkość relaksacji poprzecznej (równanie 8).

Rex zależy od reżimu włączania / wyłączania wymiany chemicznej w następujący sposób (równania 9, 10 i 11):

(równanie 10)

(równanie 11)

Kurs wymiany wynosi kex = kon + koff, gdzie Δω jest różnicą przesunięcia chemicznego między stanem związanym i swobodnym liganda (rad.s-1), a ρF i ρB to odpowiednio populacje stanów swobodnych i związanych liganda (rysunek 3B).

W wynikach mapowania 1H-R2 (ryc. 3C) nie zaobserwowaliśmy istotnych różnic między protonami ligandów. Większość pików pozostała niezmieniona, z ilorazem R2 (Q) bliskim 1, z wyjątkiem Hβ4. Możliwym wyjaśnieniem Q ~ 1 jest niskie powinowactwo wiązania (tj. małe ρB) w połączeniu z faktem, że protony ligandów znajdują się w reżimie powolnej wymiany (rysunek 1A, rysunek 3A). W tych warunkach udział wymiany chemicznej Rex do jest minimalny, ponieważ Rex w reżimie powolnej wymiany nie zależy od składnika drugiego rzędu, takiego jak Δω2 (równanie 9).

Połączenie tych trzech metod NMR jest cenne dla mapowania interakcji ligand-białko, ponieważ dostarcza uzupełniających się informacji poprzez odrębne mechanizmy fizyczne. CSP wykrywa zmiany w lokalnym środowisku chemicznym, odzwierciedlone w perturbacjach zmian chemicznych. Pomiary 1H-R2 oparte na CPMG informują o wpływie swobody obrotowej liganda i wymiany między stanami swobodnym i związanym na relaksację poprzeczną. Choroba przenoszona drogą płciową dostarcza informacji na temat bezpośrednich interakcji dipolarnych między ligandem a białkiem, co skutkuje przeniesieniem namagnesowania z nasyconego białka do liganda. Zintegrowana interpretacja tych trzech podejść oferuje bardziej wszechstronne zrozumienie natury interakcji.

Do tej pory zmapowaliśmy zachowanie wiązania liganda (D-mannozy). Następnie przeprowadzono eksperymenty NMR oparte na białkach w celu zmapowania miejsca wiązania D-mannozy na CVN. Pierwszym wysoce pouczającym podejściem było pozyskanie serii 1widm H-15N HSQC o różnych stężeniach D-mannozy. Perturbacje przesunięcia chemicznego 1H i 15N (CSP, równanie (4)) wywołane dodaniem liganda (D-mannozy) są bardzo wrażliwe na subtelne zmiany w środowisku chemicznym. Największe zaburzenia występowały przy stężeniach D-mannozy do 10 mM (ryc. 4A, u góry); jednak niektóre pozostałości, zwłaszcza Gly2, wykazały znaczącą zmianę w CSP do 60 mM D-mannozy (Figura 4B, na dole).

Aby zrozumieć wiązanie D-mannozy z CVN, przeanalizowaliśmy najważniejsze CSP w strukturze CVN skompleksowanej z disacharydem Manα1-2Manα40 (Figura 4B). Zaobserwowano, że nić β zawierająca reszty I40, E41, N42, V43, D44 i G45 odpowiada wcześniej opisanemu miejscu wiązania Manα1-2Manα o wysokim powinowactwie. Znaczące CSP, w tym reszty L1, G2, E10 i R24, wykryto również w pobliżu miejsca wiązania o niskim powinowactwie. Co ciekawe, żadne ze znanych miejsc wiązania Manα1-2Manα nie zostało w pełni zdefiniowane przez obserwowane CSP. Jedną z możliwych interpretacji jest to, że D-mannoza, która jest mniejsza niż disacharyd Manα1-2Manα lub oligosacharyd o wysokiej zawartości mannozy, nie jest wystarczająco duża, aby zająć pełny zakres miejsca wiązania. W rezultacie jego wiązanie następuje z mniejszym powinowactwem.

Ta interpretacja sugeruje, że D-mannoza wiąże się preferencyjnie z resztą nici β (40-44) w miejscu wiązania o wysokim powinowactwie oraz z resztą L1, G2, E10 i R24 w miejscu o niskim powinowactwie, choć tylko przejściowo. Ta przejściowa interakcja zaburza również reszty takie jak H90 i W49, które znajdują się na granicy faz między domenami CVN o niskim powinowactwie (reszty 1-39) i wysokim powinowactwie (reszty 40-90). Obserwacje te sugerują, że wiązanie D-mannozy może indukować perturbacje w resztach odległych od dobrze zdefiniowanych miejsc wiązania, albo poprzez promowanie allosterycznych zmian strukturalnych, albo poprzez tworzenie przejściowych kompleksów spotkań.

Ta ostatnia możliwość podkreśla kluczową zaletę badania interakcji z ligandami o niskim powinowactwie. Spektroskopia NMR jest szczególnie dobrze przystosowana do wykrywania takich przejściowych oddziaływań o niskim powinowactwie, ponieważ może uchwycić subtelne perturbacje przesunięć chemicznych i efekty transferu nasycenia nawet wtedy, gdy populacja w stanie granicznym jest niska. Cechy te umożliwiają wykrywanie kompleksów spotkań i słabych zdarzeń wiązania, które mogą nie być dostępne za pomocą technik wymagających ścisłego lub stabilnego tworzenia kompleksów. W tym kontekście, NMR dostarcza cennych informacji strukturalnych i dynamicznych, które wykraczają poza bezpośrednie miejsce wiązania41,42.

Przeanalizowaliśmy również izotermy wiązania, wykreślając CSP poszczególnych pozostałości w funkcji stężenia D-mannozy (rysunek 4C). Warto zauważyć, że reszty w nici β (40-44), które tworzą miejsce wiązania o wysokim powinowactwie, wykazywały średniK D wynoszący około 7 mM. Wśród nich pozostałość D44 wykazała szczególnie wyższe powinowactwo, z KD wynoszącym 1,1 ± 0,35 mM, co wskazuje na jej istotną rolę w wiązaniu ligandów. Powinowactwo wiązania obserwowane dla D-mannozy jest około 5000 razy niższe niż w przypadku disacharydu Manα1-2Manα, który ma KD 139 nM w miejscu o wysokim powinowactwie i 1,47 μM w miejscu o niskim powinowactwie40.

Innym podejściem zastosowanym do mapowania miejsca wiązania D-mannozy na CVN był pomiar 15współczynników relaksacji N-R2 w przypadku braku (Figura 5A) i obecności (Figura 5B) liganda. Aby podkreślić efekty wiązania, obliczyliśmy wartości ΔR2 (rysunek 5C), zdefiniowane jako , i rozważyliśmy propagację błędu eksperymentalnego z obu warunków. Analiza ta podkreśla znaczenie szacowania niepewności pomiaru podczas interpretacji dynamicznych danych NMR.

Zmiany w 15N-R2 po dodaniu liganda mogą wystąpić z kilku powodów. Wzrost R2 może wynikać albo z wyższego τc kompleksu, albo z udziału w wymianie konformacyjnej i chemicznej (Rex) wynikającej z równowagi on-off z ligandem. I odwrotnie, można również zaobserwować spadek R2 . W przypadkach, gdy wiązanie liganda przebiega zgodnie z konformacyjnym mechanizmem selekcji, Rex często zmniejsza się po dodaniu liganda, odzwierciedlając zmniejszoną dynamikę wymiany.

W związku z tym zarówno dodatnie, jak i ujemne wartości ΔR2 , które przekraczają propagowany błąd eksperymentalny, można wykorzystać do identyfikacji regionów zaangażowanych w wiązanie ligandów.

Stężenie ligandów jest kolejnym krytycznym czynnikiem w interpretacji tych danych. Przy stężeniach nasycenia wiązanie ma tendencję do tłumienia wkładu konformacyjnego i wymiany chemicznej, co prowadzi do zmniejszenia Rex , a w konsekwencji do mniejszych wartości R2 . W tych warunkach CSP zazwyczaj osiągają również swoje maksymalne wartości. Natomiast przy stężeniach podnasyconych występuje znaczna równowaga włączania i wyłączania ligandów, co skutkuje podwyższonym Rex i osiąganiem pośrednich wartości CSP. Te zależne od stężenia skutki muszą być brane pod uwagę podczas analizy zarówno danych ΔR2 , jak i CSP.

Aby lepiej zrozumieć wiązanie D-mannozy z CVN, przeanalizowaliśmy reszty wykazujące najbardziej znaczące zmiany ΔR2 w kontekście struktury kompleksu disacharydowego CVN-Manα1-2Manα (Figura 5D). Reszty C58, R59, K74 i R76 wykazywały wyraźne wartości ΔR2 i odpowiadają miejscu wiązania o wysokim powinowactwie dla Manα1-2Manα. Ponadto reszty F4, C8, R24, G27, G28, A92 i G96 również wykazywały znaczny ΔR2 i są częścią miejsca wiązania o niskim powinowactwie.

Co ciekawe, analiza ΔR2 dostarczyła dodatkowych spostrzeżeń w stosunku do tych uzyskanych z CSP, oferując niezależne dowody na interakcje D-mannozy z obydwoma miejscami wiązania.

Zaobserwowaliśmy również zmiany ΔR2 w innych pozostałościach zlokalizowanych z dala od znanych miejsc wiązania. Reszty te znajdują się głównie w pobliżu centralnego regionu białka, na granicy domen o wysokim i niskim powinowactwie (ryc. 5C). Prawdopodobna interpretacja jest taka, że wiązanie D-mannozy indukuje subtelne allosteryczne przegrupowania strukturalne. Alternatywnie, obserwowane efekty mogą odzwierciedlać przejściowe interakcje, które stanowią część kompleksu początkowego spotkania podczas rozpoznawania ligandów.

Autorzy oświadczają, że nie mają sprzecznych interesów.