Method Article

Ochronna rola bupleurum w szczurzym modelu osteoporozy pomenopauzalnej

DOI:

10.3791/68675

⸱

August 22nd, 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1YouJiang Medical University for Nationalities, 2Affiliated Hospital of YouJiang Medical University for Nationalities, 3ShenZhen International Travel Health Care Center (ShenZhen Customs Port Clinic)

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym badaniu wykorzystaliśmy szczurzy model osteoporozy pomenopauzalnej po owariektomii, aby wykazać, że płyn doustny Bupleurum (Chai hu) poprawia mikrostrukturę kości poprzez tłumienie czynników prozapalnych i wzmacnianie przeciwzapalnych. Sugeruje to, że jego mechanizm przeciwzapalny częściowo łagodzi osteoporozę wywołaną niedoborem estrogenów.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ma na celu zbadanie wpływu podawania Chai hu na osteoporozę pomenopauzalną u szczurów po owariektomii (OVX). Ośmiotygodniowe samice szczurów Sprague-Dawley przeszły obustronną owariektomię przy użyciu dostępu grzbietowego w celu ustalenia modelu osteoporozy po menopauzie. Różne dawki płynu doustnego Chai hu podawano przez zgłębnik doustny przez 12 kolejnych tygodni, a następnie oceniano mikrostrukturę kości i mierzono poziomy cytokin zapalnych. Leczenie Chai hu w średnich i wysokich dawkach częściowo hamowało utratę masy kostnej, zmniejszało ekspresję cytokin prozapalnych i zwiększało poziom cytokin przeciwzapalnych u szczurów OVX. Stwierdzono znaczne zmniejszenie nasilenia destrukcji kości od małych do wysokich dawek i zaobserwowano poprawę odbudowy mikrostrukturalnej kości w zależności od dawki. Chai hu łagodził utratę masy kostnej spowodowaną niedoborem estrogenów i pogorszenie mikrostruktury, hamując w ten sposób progresję OP w tym modelu OVX. Było to prawdopodobnie wynikiem przeciwzapalnego działania zaangażowanych szlaków.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Osteoporoza (OP) jest powszechną metaboliczną chorobą kości charakteryzującą się zmniejszeniem masy kostnej, zmniejszoną wytrzymałością kości i zniszczeniem mikroarchitektury kości1. OP może objawiać się jako pierwotny lub wtórny, a pierwotny OP jest klasyfikowany jako OP pomenopauzalny (PMOP), OP starczy i OP idiopatyczny (który często występuje u nastolatków). Wśród nich PMOP typu I występuje przede wszystkim u kobiet z PM, gdzie po menopauzie dochodzi do wyraźnego spadku gęstości kości z powodu obniżonego poziomu krążącego estrogenu2. Jest to ogólnoustrojowa choroba metaboliczna kości, która powoduje zwiększoną aktywność osteoklastów i intensywne różnicowanie3. Ponadto intensywność resorpcji kości jest znacznie większa niż jej powstawanie, co skutkuje zmniejszeniem masy kostnej, a także zwiększoną łamliwością kości i ryzykiem złamań4.

Obecne badania wykazały, że wiele przewlekłych chorób zapalnych, takich jak choroba zwyrodnieniowa stawów i zapalenie przyzębia, wiąże się ze znaczną utratą masy kostnej, co sugeruje, że stan zapalny może być ściśle związany z OP5. Wraz z wiekiem kobiet z PM, oprócz zmian endokrynologicznych, pogarszają się funkcje fizjologiczne i odpornościowe, a organizm pozostaje w stanie przewlekłego stanu zapalnego przez długi czas. Wiele z tych czynników sprzyjających stanowi zapalnemu i cytokin pochodzących z limfocytów T odgrywa ważną rolę w utracie masy kostnej. Dlatego PMOP jest również uznawany za przewlekłą chorobę zapalną 6,7.

Tradycyjna medycyna chińska (TCM) ma długą historię i bogate doświadczenie kliniczne w zapobieganiu i leczeniu PMOP, koncentrując się na holistycznym postępowaniu oraz zindywidualizowanej diagnozie i leczeniu, a także może jednocześnie regulować układ hormonalny i odpornościowy, co jest błogosławieństwemdla kobiet po menopauzie. Umożliwia ona dużej części kobiet dostęp do leczenia. Nowoczesne badania farmakologiczne i kliniczne wykazały, że TCM ma zalety wielokierunkowości, niską toksyczność i skutki uboczne oraz jest tani. Ryzyko powikłań można znacznie zmniejszyć w leczeniu TCM PMOP9.

Sam Chai hu ma właściwości przeciwzapalne10 i przeciwdepresyjne11i może regulować wydzielanie hormonów w organizmie12, a także wspomagać dobre zdrowie13. Chai hu jest głównym składnikiem, który odgrywa główną rolę w formule związku TCM, Xiaoyao Pills, który ma działanie kojące emocje, wspomaga trawienie i wchłanianie w żołądku i jelitach. Znany jest również z uzupełniania qi i energii krwi, a także regulowania objawów cyklu menstruacyjnego i związanego z nim dyskomfortu14. Głównym składnikiem Chai hu jest saponina Chai hu, która ma silne działanie przeciwzapalne, przejawiające się głównie w hamowaniu ekspresji cytokin prozapalnych, takich jak czynnik martwicy nowotworu α (TNF-α), interleukina 1β i IL-615. Ponadto zwiększa ekspresję cytokiny przeciwzapalnej IL-10, łagodząc w ten sposób stany zapalne, takie jak zapalenie jelita grubego, zapalenie błony śluzowej macicy i zapalenie wątrobytypu 16.

W porównaniu ze standardowymi metodami leczenia OP (w tym zastosowaniem bisfosfonianów17, selektywnych modulatorów receptora estrogenowego18 i denosumabu19), Chai hu, jako powszechnie stosowany TCM, ma potencjalną przewagę w postaci wieloskładnikowego, wielokierunkowego mechanizmu działania. Standardowe terapie zwykle są ukierunkowane na określone szlaki metaboliczne kości20 (hamowanie aktywności osteoklastów), które mogą wiązać się z pewnymi skutkami ubocznymi, takimi jak dyskomfort żołądkowo-jelitowy, zwiększone ryzyko martwicy kości szczęk i objawów grypopodobnych, a także wysokie długoterminowe koszty leków21.

Przegląd odnośnej literatury wykazał, że stosowanie Chai hu w celu interwencji u szczurów z PM z OP może mieć terapeutyczne działanie łagodzące22. Tak więc, opierając się na analizie bioinformatycznej i farmakologicznej, a także symulacji dokowania molekularnego w celu przewidywania miejsc dokowania23, postawiliśmy hipotezę, że Chai hu może interweniować w proces zapalny, modulować stan immunologiczny organizmu i przywracać homeostazę immunologiczną kości. Będą one sprzyjać stabilności stanu odbudowy kości i osiągnięciu pożądanego efektu terapeutycznego w postaci złagodzenia OP.

W badaniu tym stosowano płyn doustny Chai hu (stężenie: 1 g/ml) przez 12 kolejnych tygodni. Schemat dawkowania został opracowany w oparciu o klinicznie powszechne dawki w badaniach TCM i farmakokinetycznych24.

Ogólnym celem tej metody podawania jest ustalenie stabilnego i klinicznie istotnego protokołu dawkowania, a tym samym systematyczna ocena trwałego efektu interwencji Chai hu w modelu docelowym (szczurzym modelu osteoporozy pomenopauzalnej). Takie podejście do podawania zapewnia, że lek utrzymuje efektywne stężenie w osoczu przez cały okres eksperymentalny, zapewniając wiarygodną podstawę interwencji do późniejszych ocen (takich jak wskaźniki metabolizmu kości i poziomy czynników zapalnych). Co więcej, pomaga wyjaśnić rolę Chai hu w powiązanych chorobach, a także jego zależność między dawką a skutkiem, oferując jednocześnie paradygmat odniesienia dla standaryzowanego podawania tradycyjnych leków chińskich w badaniach eksperymentalnych.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury eksperymentalne na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z Przewodnikiem NIH dotyczącym opieki i wykorzystania zwierząt laboratoryjnych (wydanie 8) i zostały specjalnie zatwierdzone przez Komisję Etyki Zwierząt Uniwersytetu Medycznego Youjiang dla Narodowości (Zatwierdzenie nr 2024071001).

1. Analiza farmakologii sieciowej

UWAGA: Cyberfarmakologia to podejście, które łączy biologię systemową, biologię obliczeniową i farmakologię i ma na celu zrozumienie mechanizmu działania leków i interakcji lek-lek poprzez analizę sieci biomolekularnych25.

  1. Badania przesiewowe związków czynnych o dobrej biodostępności po podaniu doustnym (OB) i podobieństwie do leku (DL) przy użyciu narzędzi takich jak Baza Danych i Analiza Systemów Farmakologii Tradycyjnej Medycyny Chińskiej (TCMSP: http://ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php). Ustaw OB na ≥30%, a DL na ≥0.1826. Wyszukaj Chai hu i kliknij Szczegóły ziół i pobierz wszystkie dane dotyczące związku. Nazwij pobrany plik Chaihu.
  2. Uzyskaj nazwę docelową podstawowego składnika, wklejając identyfikator MOL głównego składnika do bazy danych TCMSP. Wklej do wyszukiwania wsadowego TCMSP i wybierz opcję Przewidywanie celu, a następnie kliknij przycisk Prześlij.
  3. Otwórz bazę danych UniProtsh, skopiuj kolumnę Nazwa docelowa do wyszukiwania i znajdź pogrubioną nazwę białka, która jest dokładnie taka sama, jak wklejona nazwa białka docelowego. Po znalezieniu odpowiedniej nazwy białka zbierz odpowiednie nazwy genów w kolumnie po niej.
  4. Przefiltruj geny związane z osteoporozą w bazie danych GeneCards (https://www.genecards.org) zgodnie z wynikiem trafności ≥ 1 i uzyskaj wszystkie (5741) geny27.
    UWAGA: Powody wyboru genów z wynikiem trafności ≥ 1 z bazy danych GeneCards są następujące: Wynik ≥ 1 wskazuje, że gen ma udokumentowane powiązania z chorobą docelową, wyraźnie odróżniając go od genów bez zgłoszonych powiązań (wynik = 0). Próg ten zapewnia zachowanie genów o wiarygodnym znaczeniu dla choroby, przy jednoczesnym uniknięciu nadmiernej ingerencji ze strony niepowiązanych genów. Niższy próg (<1) może obejmować geny bez potwierdzonych powiązań, zwiększając w ten sposób liczbę wyników fałszywie dodatnich.
  5. Uzyskaj przecinające się geny po połączeniu zestawów genów związanych z chorobą z celami leków do przecięcia. Opierając się na interakcjach między celami choroby a składnikami aktywnymi leków, zbuduj tradycyjną sieć krzyżową medycyny chińskiej - składnik aktywny - cel - choroba za pomocą oprogramowania Cytoscape.
  6. Uzyskaj informacje o interakcjach białko-białko (PPI) za pośrednictwem bazy danych String (https://cn.string-db.org/) i zbuduj sieć PPI. Otwórz Cytoscape (https://www.cytoscape.org), załaduj pobrany plik TSV do sieci przesyłania, a następnie wybierz opcję Oblicz > TOP10 lub TOP20 i kliknij Prześlij.
  7. Utwórz dwie tabele do zaimportowania do Cytoscape. Utwórz plik elektronicznego arkusza kalkulacyjnego o nazwie Sieć. W kolumnie A wprowadź te same identyfikatory MOL (CH1, CH2...), które zostały zastąpione skrótem tradycyjnej medycyny chińskiej. Oznacz kolumnę B jako identyfikator MOL i posortuj ją w kolejności rosnącej według identyfikatorów MOL. Oznacz kolumnę C jako symbol. Skopiuj identyfikatory komponentów (identyfikatory MOL) i nazwy genów z plików związanych z Chaihu odpowiednio do kolumn B i C. Następnie usuń kolumnę B i zmień nazwę kolumny A na MOL ID.
  8. Rozciągnij tabelę do końca tekstu. W kolumnie Symbol wprowadź identyfikatory MOL (CH1, CH2...), zastąpione skrótem tradycyjnej medycyny chińskiej. W kolumnie MOL ID wprowadź skrót tradycyjnej medycyny chińskiej: CH. Powyższymi krokami zakończono uzupełnianie informacji i budowę sieci Tradycyjna Medycyna Chińska - Komponent - Docel.
  9. Następnie wykonaj drugi formularz, plik TYPE. Utwórz nowy arkusz kalkulacyjny i nadaj mu nazwę TYPE. Oznacz kolumnę A jako Termin, a kolumnę B jako TYP. Skopiuj nazwę genu do kolumny terminu i nadaj jej atrybut genu w kolumnie typu (celem jest wyszukanie genu; wszystkie nazwy genów zostaną wybrane, aby było łatwe w obsłudze). Wprowadź składniki do kolumny Term i nadaj składnikowi atrybut drug1.
  10. Zaimportuj do oprogramowania Cytoscape. Importuj sieć, aby przesłać plik sieciowy i importuj tabelę, aby przesłać plik typu. W polu wyszukiwania wpisz gene, naciśnij Enter, aby wszystkie geny zostały wybrane, przeciągnij wybrane geny w lewo, a następnie kliknij pozycję Układ > Atrybut() > Wybrane (w nawiasach wybierz opcję okrągłe lub kwadratowe).
  11. Połącz wyniki sieciowej analizy farmakologicznej z danymi eksperymentalnymi w celu zidentyfikowania kluczowych związków i molekularnych mechanizmów działania leków.

2. Dokowanie molekularne

UWAGA: Dokowanie molekularne to technika obliczeniowa służąca do przewidywania optymalnego trybu wiązania i powinowactwa między małą cząsteczką (ligandem) a docelowym białkiem lub biomolekułą28.

  1. Przygotowanie receptorów i ligandów
    1. Źródło receptora (białka): Uzyskaj plik PDB białek docelowych z Banku Danych o Białkach RCSB (https://www.rcsb.org). Wyszukaj 3Q4B (przykład receptora IL-6), kliknij Pobierz pliki > formacie PDB.
    2. Usuń krystalograficzne cząsteczki wody, klikając Edytuj > Usuń > Woda, obce jony i nieistotne ligandy (zachowują krytyczne kofaktory, takie jak jony metali), klikając Edytuj > Usuń > Heteroatomy. Dodaj brakujące atomy wodoru, klikając Edytuj > Wodory > Dodaj. Zapisz jako białko.pdbqt. klikając Edytuj > Opłaty > Compute Gasteiger, a następnie Siatka > Makrocząsteczka > Wybierz > Zapisz jako PDBQT.
    3. Ligand (mała cząsteczka) źródło: Pobierz strukturę liganda z PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov). Wyszukaj Saikosaponin A (CID:6443568), kliknij 3D Conformer > Download SDF.
    4. Użyj oprogramowania Open Babel, aby przekonwertować plik Saikosaponin A w formacie SDF na plik w formacie PDB z niskoenergetycznymi trójwymiarowymi konformacjami i nazwij go saikosaponinA.
  2. Konfiguracja parametrów dokowania (narzędzia AutoDock)
    1. Załaduj pliki receptora i liganda. Zaimportuj plik małych cząsteczek saikosaponiny A i zapisz go jako plik PDBQT. Następnie załaduj receptor i ligand: kliknij Dokowanie > Makrocząsteczka > Otwórz wybierz IL6_receptor.pdbqt; następnie kliknij Docking > Ligand > Otwórz, wybierz saikosaponinA.pdbqt.
    2. Skonfiguruj pole siatki: Kliknij Siatka > Pole siatki, dostosuj rozmiar pola, aby w pełni objąć aktywną witrynę (użyj pokrętła sterującego na lewym panelu, aby dostosować), a następnie zapisz bieżące ustawienia, klikając Plik > Zamknij Zapisywanie bieżącego i nazwij plik grid.gpf.
    3. Konfigurowanie uruchomionego programu AutoGrid: Kliknij przycisk Uruchom AutoGrid, wybierz plik grid.gpf, a następnie kliknij przycisk Uruchom. Następnie skonfiguruj parametry dokowania: Po kolei, w menu Dokowanie, kliknij Makrocząsteczka i wybierz plik białka IL6_receptor.pdbqt; kliknij Ligand i wybierz plik małych cząsteczek saikosaponin A.pdbqt; ustaw algorytm genetyczny i potwierdź go; dostosuj parametry dokowania i potwierdź je. Na koniec w obszarze Dane wyjściowe wybierz algorytm Lamarckowski (4,2), nazwij plik dock.dpf i zapisz go.
    4. Uruchom AutoGrid i zapisz wyniki: Kliknij przycisk Uruchom AutoDock, wybierz plik dock.dpf i uruchom symulację. Po zakończeniu kliknij przycisk Zapisz złożony, nazwij złożoną strukturę i zapisz ją w formacie PDBQT.
  3. Analiza wyników za pomocą PyMOL
    1. Przekonwertuj plik w formacie PDBQT uzyskany w poprzednim kroku dokowania molekularnego na format PDB za pomocą oprogramowania Open Babel. Następnie zaimportuj plik w formacie PDB do oprogramowania PyMOL w celu przeprowadzenia kolejnych operacji wizualizacji.
    2. Zlokalizuj ligand i oddziel go pojedynczo: Po wybraniu liganda zmień jego kolor, klikając Sele , a następnie wybierając Kolor z Koloru. W kolumnie Sele kliknij pozycję Wyodrębnij obiekt w obszarze Akcja, aby wyodrębnić ligand jako nowy niezależny obiekt.
    3. Pomiar odległości wiązań wodorowych: W kolumnie sele kliknij Działanie, znajdź Kontakty biegunowe i kliknij Do innych atomów w obiekcie; Wiązania wodorowe będą wyświetlane jako żółte linie. Kliknij opcję Pomiar w kolumnie Kreator, kliknij kolejno atomy na obu końcach wiązania wodorowego , a następnie kliknij przycisk Gotowe , aby zakończyć pomiar.
  4. Eksportuj obraz: Kliknij Eksportuj obraz jako PNG w Plik. Jeśli wymagane jest renderowanie w wysokiej rozdzielczości, wprowadź promień 300 (regulowane piksele) i naciśnij Enter.

3. Analiza mikro-tomografii komputerowej

  1. Samice szczurów SD (32 tygodnie, 320-350 g) wstrzyknąć dootrzewnowo sodu pentobarbitalu (40 mg / kg) w celu głębokiego znieczulenia, potwierdzonego brakiem odruchu rogówkowego (brak mrugania po dotknięciu wacika) i odruchu bólowego (brak skurczu kończyn tylnych do szczypania kleszczy).
    1. Wykonaj operację izolacji kończyn tylnych. Szczury należy poddać eutanazji przez dootrzewnowe wstrzyknięcie pentobarbitalu sodu w dawce 3-5 razy większej niż dawka znieczulenia chirurgicznego (40 mg / kg), umieścić je na wznak i wykonać 3 cm nacięcie poprzeczne, 1 cm powyżej spojenia łonowego wzdłuż więzadła pachwinowego. Dosadnie rozetnij szczelinę między mięśniami gracilis i sartorius, aby odsłonić tętnicę udową (pulsacyjna struktura rurkowa). Podwiązać oba końce tętnicy udowej za pomocą szwów 4-0, pozostawiając niepodwiązany odcinek pomiędzy nimi, a następnie obciąć naczynie nożyczkami okulistycznymi i przeciąć je.
    2. Obróć kończynę dolną wewnętrznie, aby zwichnąć głowę kości udowej z panewki i przeciąć torebkę stawową i więzadło okrągłe, zachowując integralność głowy kości udowej. Zanurz nienaruszoną tylną kończynę we wstępnie schłodzonej soli fizjologicznej, a następnie utrwal w 4% roztworze formaldehydu na 24-48 godzin.
  2. Konfiguracja obrazowania: Dostarcz stałą kość udową do placówki w celu wykonania mikrotomografii komputerowej. Włącz urządzenie Micro-CT i wybierz wstępnie ustawiony program skanowania kości małych zwierząt . Użyj następujących parametrów skanowania: napięcie promieniowania rentgenowskiego = 90 kV, prąd promieniowania rentgenowskiego = 80 μA, pole widzenia (FOV) = 36 mm, rozmiar piksela = 72,0 μm, obrót = 360°, czas skanowania = 14 min.
  3. Umieść nieruchomą kość udową lewej nogi szczura w uchwycie na próbkę, zamocuj nasadę kości udowej do sfotografowania, uruchom urządzenie i poczekaj na zakończenie autotestu maszyny. Rozpocznij skanowanie podglądu (szybkie skanowanie o niskiej rozdzielczości), aby potwierdzić, że próbka jest wyśrodkowana, a następnie dostosuj obszar zainteresowania, aby pokryć całą kość udową.
  4. Po zakończeniu skanowania i fotografowania źródło światła rentgenowskiego zostanie automatycznie wyłączone. W tym czasie wartość promieniowania wewnątrz maszyny przekracza normę i absolutnie zabrania się wyjmowania próbki bez wyposażenia ochronnego.
  5. Analiza obrazu: Analizuj parametry kości (gęstość mineralna kości [BMD], liczba beleczkowa) za pomocą wbudowanego oprogramowania skanera. Zapisuj i eksportuj zrekonstruowane obrazy w celu dalszej oceny.

4. Ilościowy PCR w czasie rzeczywistym do ekstrakcji RNA z tkanki kostnej szczura

  1. Usuń przylegające mięśnie i powięź z prawej kości udowej. Pokrój 100-200 mg tkanki kostnej na małe kawałki. Dodaj 2-3 kulki mielące i 500 μl buforu do ekstrakcji RNA. Homogenizować za pomocą młynka do tkanek o częstotliwości 70 Hz przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  2. Separacja faz: Po odwirowaniu roztwór rozdziela się na górną fazę wodną (zawiera RNA) i dolny ciemny osad (zawiera białka, DNA i polisacharydy). Ostrożnie przenieść 500 μl supernatantu do nowej probówki o pojemności 1,5 ml wolnej od RNaz.
  3. Górny roztwór otrzymany z izolacji przetworzyć do całkowitej ekstrakcji RNA zgodnie z instrukcjami producenta.
  4. Po dodaniu izopropanolu do roztworu do lizy, delikatnie odwróć probówkę, aby wymieszać roztwór i odstaw w temperaturze pokojowej na 10 minut. W tym momencie przeprowadź kontrolę wzrokową; jeśli zaobserwuje się białe kłaczkowate osady RNA (przylegające do ścianki rurki), oznacza to, że RNA zostało skutecznie wytrącone.
  5. Użyj końcówki pipety o pojemności 200 μl, aby zassać resztki cieczy. Zachowaj biały osad RNA na dnie/ściance probówki. Zawiesić RNA w 50-100 μl wody wolnej od RNaz i przechowywać w temperaturze -80 °C.
  6. Wymieszaj 2 μl matrycy RNA, 10 μl mieszanki głównej, 2 μl DNazy i 5 μl wody wolnej od nukleaz w probówce bez nukleaz. Delikatnie wymieszać, pipetując.
  7. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 2 minuty w celu usunięcia zanieczyszczenia genomowego DNA. Inkubować w temperaturze 55 °C przez 15 minut. Pod koniec reakcji inkubować w temperaturze 85 °C przez 5 minut w celu przerwania reakcji.
  8. Skonfiguruj ilościowy system fluorescencji PCR w czasie rzeczywistym, umieszczając DNA z odwrotną transkrypcją na lodzie. Wstępnie wymieszaj wszystkie składniki: 10 μl qPCR SYBR Green Master Mix (No Rox), po 0,4 μl Forward Primer i Reverse Primer oraz 8,2 μl wody wolnej od RNaz, podziel i dodaj 1 μl DNA, manipuluj na lodzie i chroń przed światłem.
  9. Uruchom program qPCR w następujący sposób: wstępna denaturacja w temperaturze 95 °C przez 5 minut, 1 cykl, a następnie denaturacja w temperaturze 95 °C przez 10 s przez 40 cykli. Wyżarzanie, przedłużanie, akwizycję fluorescencji w temperaturze 60 °C przez 30 s przez 40 cykli w kanale zielonym SYBR. Uzyskać krzywą topnienia dla temperatury od 65 do 95 °C z przyrostem 0,5 °C na stopień i 5 s/krok. Stosowane podkłady przedstawiono w tabeli 1.

5. Przygotowanie zwierząt

  1. Pozyskaj 48 samic nieródek szczurów SD (stopień SPF, w wieku 8 tygodni, masa ciała 200-220 g).
  2. Przed procedurami eksperymentalnymi należy zaaklimatyzować wszystkie szczury z 7-dniowym okresem kwarantanny w izolatce klasy SPF i w pomieszczeniu w środowisku laboratoryjnym kontrolowanym przez SPF (temperatura: 22-24 °C, wilgotność: 45%-55%).

6. Przygotowanie badanego leku

  1. Uzyskaj płyn doustny Chai hu (chińskie krajowe zatwierdzenie produktu medycznego nr Z41021539). Preparat zawiera Chai hu (źródło północne) jako składnik aktywny, z substancjami pomocniczymi, w tym środkiem aromatyzującym, sacharozą i glikolem propylenowym. Każda fiolka o pojemności 10 ml zawiera ekstrakt odpowiadający 10 g surowego zioła.

7. Przygotowanie modelu szczura po owariektomii

  1. Przygotowanie przedoperacyjne: Szybkie szczury przez 12 godzin z dostępem ad libitum do wody. Przeprowadzić sterylizację narzędzi poprzez autoklawowanie wszystkich narzędzi chirurgicznych.
  2. Znieczulenie i przygotowanie: Pentobarbital sodu podawać we wstrzyknięciu dootrzewnowym (40 mg/kg). Sprawdź głębokość znieczulenia, oceniając brak odruchu rogówkowego (brak mrugnięcia przy dotknięciu rogówki wacikiem) i brak odruchu szczypania palców u nóg (brak cofnięcia kończyn tylnych podczas zaciskania). Po 15-20 minutach należy ogolić miejsce operowane, zdezynfekować jodem i przykryć obłożeniem z fenestracją. Podczas operacji należy zastosować maść do oczu z witaminą A (zawierającą 15 000 j.m./g), aby zapobiec wysuszeniu oczu zwierzęcia (Tabela 2).
  3. Model szczura po owariektomii: Wykonaj operację w dedykowanej sterylnej sali operacyjnej. Cały personel miał na sobie fartuchy izolacyjne. Przed zabiegiem przetrzyj blat i otaczający go sprzęt 75% etanolem (Tabela 2) i włącz lampy ultrafioletowe na co najmniej 30 minut, aby wyeliminować drobnoustroje w powietrzu i na powierzchniach.
    1. Wykonaj 1 cm nacięcie na skórze grzbietowej, tępo wypreparuj tkankę podskórną, uszczypnij warstwę mięśniową i wykonaj 1 cm nacięcie. Zlokalizuj poduszeczkę tłuszczową i zewnętrznij ją, aby zidentyfikować jajnik (jaskrawoczerwony kolor). Podwiązać jajowód szwem 4-0, wyciąć tkankę jajnika i umieścić ją w probówce wirówkowej o pojemności 50 ml zawierającej 4% paraformaldehydu (Tabela 2).
  4. Zamykanie rany i dezynfekcja: Przed szyciem wsyp proszek penicyliny do rany. Zszyj warstwę mięśniową szwem niewchłanialnym nr 6 i zamknij skórę szwem nr 2. Zdezynfekuj zamknięte nacięcie jodem i zastosuj miejscowo proszek penicyliny.
  5. Opieka pooperacyjna: Umieść szczury w świeżych klatkach z ciepłymi butelkami z wodą i ręcznikami, aby utrzymać temperaturę ciała. Pościć (dozwolone wody) zwierzęta przez 24 godziny po operacji, aby zapobiec niedrożności jelit. Nakładaj penicylinę w proszku na miejsce nacięcia codziennie przez 3 kolejne dni.
    1. Wstrzyknąć lidokainę (stężenie 1%-2%, maksymalnie 5 mg/kg) wokół nacięcia chirurgicznego, aby zmniejszyć natychmiastowy ból pooperacyjny. Zapewnij ciągłą analgezję przez 3-5 dni, stopniowo zmniejszając dawkę w zależności od nasilenia bólu, aby uniknąć nagłego przerwania leczenia.
    2. Przed przebudzeniem trzymaj zwierzę w pozycji bocznej lub głową w dół, aby zapobiec opadnięciu języka i niedrożności dróg oddechowych; umożliwiają autonomiczne wygodne ustawienie po przebudzeniu. Odizoluj zwierzęta pooperacyjne od innych do czasu pełnego wyzdrowienia, aby uniknąć walki lub zakażenia krzyżowego (ryc. 1).

8. Grupowanie eksperymentalne i podawanie leków

  1. Podział grupowy: Podziel w sumie 40 szczurów SD na pięć grup (n = 8 na grupę), a mianowicie: normalna kontrola, kontrola modelowa, niskie stężenie Chai hu, średnie stężenie Chai hu i wysokie stężenie Chai hu.
  2. W grupie otrzymującej średnią dawkę (5 ml/kg) należy wybrać dawkowanie w oparciu o wytyczne zawarte w29,30. Postępuj zgodnie ze stosunkiem gradientu stężeń 1:2:4 dla grupy o niskim stężeniu: 2,5 ml / kg, grupy o średnim stężeniu: 5 ml / kg i grupy o wysokim stężeniu: 10 ml / kg.
  3. Podawanie leku: Stosować zgłębnik doustny i podawać lek raz dziennie. W przypadku normalnej grupy kontrolnej i modelowej grupy kontrolnej (zwierzęta poddane obustronnej owariektomii) należy wykonać zgłębnik doustny z równą ilością soli fizjologicznej. Leczenie należy rozpocząć w 1. tygodniu po zabiegu i kontynuować przez 12 tygodni.

9. Analiza po eksperymencie i gromadzenie danych

  1. Wykonaj następujące analizy na pięciu grupach zwierząt: mikrotomografia komputerowa struktury kości i określenie ekspresji mRNA cytokin zapalnych w tkankach udowych szczura.
  2. Gromadzenie danych, które obejmują wizualizacje mikrostruktury beleczkowania kości udowej; ilościowe parametry kości (w tym gęstość mineralna kości, frakcja objętości kości, odchylenie standardowe grubości beleczki, odstępy między beleczkami, liczba beleczkowa i gęstość połączeń); oraz względne poziomy ekspresji mRNA cytokin prozapalnych (IL-6, IL-17) i cytokin przeciwzapalnych (IL-4, IL-10) w tkankach udowych.
  3. Wykonuj analizy danych za pomocą oprogramowania GraphPad Prism 10.1.2 za pomocą jednokierunkowej analizy wariancji (ANOVA). Istotność statystyczną dla różnic między grupami w średnich określono jako p < 0,05. Wielokrotne porównania post-hoc przeprowadzono przy użyciu testu Tukeya.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Funkcja GO i analiza wzbogacania szlaku KEGG

Oparliśmy się na analizie wzbogacania GO i KEGG w bioinformatyce, aby przewidzieć potencjalny mechanizm działania Chai Hu na PMOP. Analiza wzbogacenia GO genów docelowych przecinających się z aktywnymi składnikami Chai hu dla chorób przyniosła 2138 istotnych wpisów, a dziesięć najważniejszych istotnych wyników jest wymienionych dla każdej grupy (Figura 2D). W odniesieni...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

PMOP jest ogólnoustrojowym zaburzeniem metabolizmu kości, które często występuje u kobiet z PM i jest spowodowane brakiem estrogenu, który powoduje zakłócenie równowagi osteoblast-osteoklast, co prowadzi do zwiększonej resorpcji kości osteoklastów i zmniejszonej produkcji kości osteoblastów31. Coraz więcej badań wykazało, że poziom czynników zapalnych w organizmie wpływa również na różnicowanie osteoklastów i osteoblastów, a nadekspresja czynników prozapalnych przyczynia się do różnicowania osteok...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują, że nie ma konfliktu interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Praca ta była wspierana przez Program Badań Naukowych i Rozwoju Technologii Miasta Baise oraz Projekt Doskonalenia Podstawowych Umiejętności Młodych i Średnich Nauczycieli Uniwersytetów Guangxi 2025 (nr projektu: 2025KY0549). Autorzy dziękują dr Dev Sooranna z Imperial College London i YMUN za redakcję manuskryptu. ZY i LYR wniosły równy wkład w tę pracę.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0,9% chlorek sodu do wstrzykiwań Huarenpharmaceutical powiedział:H1712059 powiedział:
1 i razy; PBS Rybak termiczny10010023
75% alkoholu NanjingreagentC069156931
95% etanol NanjingreagentC0691520075
Etanol bezwodnyMacklin powiedział:E809056
Bupleurum chinense Henan Baiquan Apteka Co.Z41021539
Roztwór odwapniający Solarbio powiedział:E1171 powiedział:
Maść z erytromycyną Guangzhou Baiyunshan Pharmaceutical Group Company Limited Fabryka farmaceutyczna Baiyunshan HejigongH44023088
Alkohol izopropylowy Jinan Jinrihe Chemical Co.23727-29-9
penicylina V kapsułki potasoweSyczuan FarmaceutycznyH20103156
poliformaldehyd (CH2O)nBeyotimeZobacz materiał P0099
Środek dezynfekujący powidon-jod Guangdong Hengjian Pharmaceutical Co.H44023924
Zestaw do fluorescencji PCR w czasie rzeczywistymBiotechnologia YeasenNumer katalogowy: 11201ES03
Zestaw do ekstrakcji RNAMonadbiotechnologiaMI20201S
Zestaw do odwrotnej transkrypcji RNAYuGongBiotechnologiaEG15123S
Pentobarbital sodu Szanghaj Jixiang Biotechnology Co.JX082085
Trizol Rybak termicznyNumer katalogowy 15596026CN

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. An, H., et al. Hyperoside alleviates postmenopausal osteoporosis via regulating mir-19a-5p/il-17a axis. Am J Reprod Immunol. 90 (1), e13709(2023).
  2. Wang, S., et al. Alginate oligosaccharide alleviates senile osteoporosis via the RANKL-RANK pathway in d-galactose-induced c57bl/6j mice. Chem Biol Drug Des. 99 (1), 46-55 (2021).
  3. Jiang, N., Qi, B., Li, G., Yao, L., Fan, X. Morin improves the bone histomorphology and biochemical markers in an animal model of ovariectomy-induced osteoporosis by suppressing autophagy and apoptosis. Food Sci Nutri. 12 (12), 10099-10109 (2024).
  4. Ramchand, S. K., Leder, B. Z. Sequential therapy for the long-term treatment of postmenopausal osteoporosis. J Clin Endocrinol Metab. 109 (2), 303-311 (2024).
  5. Juluri, R., et al. Association of postmenopausal osteoporosis and periodontal disease: A double-blind case-control study. J Int Oral Health. 7 (9), 119-123 (2015).
  6. Zhang, C., et al. Oxidative stress: A common pathological state in a high-risk population for osteoporosis. Biomed Pharmacother. 163, 114834(2023).
  7. Mansoori, M. N., et al. IL-18bp is decreased in osteoporotic women: Prevents inflammasome-mediated IL-18 activation and reduces Th17 differentiation. Sci Rep. 6, 33680(2016).
  8. Shanshan, J., Baorong, H., Tianyuan, C., Xiaoqiang, H. Research progress of Chinese medicine in treating postmenopausal women with osteoporosis. Front Med Sci Res. 5 (10), 92-98 (2023).
  9. Faiella, E., et al. Percutaneous vertebroplasty: A minimally invasive procedure for the management of vertebral compression fractures. Osteology. 2 (4), 139-151 (2022).
  10. Yue, L. C., et al. Correction: Saikosaponin d exerts an antidepressant effect by regulating Homer1-mGluR5 and mTOR signaling in a rat model of chronic unpredictable mild stress. Chinese Med. 18 (1), 147-147 (2023).
  11. Yue, T., Ge, Z., Ruonan, S., Hanqing, W., Nan, Z. Saikosaponin a activates tet1/dll3/notch1 signalling and promotes hippocampal neurogenesis to improve depression-like behavior in mice. J ethnopharmacol. 319 (P3), 117289-117289 (2023).
  12. Xuedong, A. N., et al. Shugan jieyu capsule improve sleep and emotional disorder in coronavirus disease 2019 convalescence patients: A randomized, double-blind, placebo-controlled trial. J Tradit Chin Med. 42 (5), 803-809 (2022).
  13. Ying, H. S. H. Experience of professor huang ying in treating postmenopausal syndrome by chaihu guizhi decoction. J Trad Chinese Med. 38 (23), 4557-4560 (2023).
  14. Yang, Y. X., et al. Studies on the anti-inflammatory effect of xiaoyao pills in the treatment of postmenopausal osteoporosis in mice. J Vis Exp. (210), e67051(2024).
  15. Wu, S. J., Tam, K. W., Tsai, W. H., Chang, C. C., Chao, J. C. Curcumin and saikosaponin a inhibit chemical-induced liver inflammation and fibrosis in rats. Am J Chin Med. 38 (1), 99-111 (2010).
  16. Zhou, Q. R., Chen, M. Y., Wang, M. D. Treatment of chronic endometritis by penning granule: A clinical randomized controlled trial. Zhongguo Zhong Xi Yi Jie He Za Zhi. 36 (9), 1055-1060 (2016).
  17. Weibing, J., Yankun, D., Jinxin, Z., Suqin, D. Clinical efficacy and safety evaluation of calcitriol combined with bisphosphonates in the therapy of postmenopausal osteoporosis: Based on a retrospective cohort study. BioMed Res Int. 2022, 2711938-2711938 (2022).
  18. Hussain, I., Talaulikar, V. S. A systematic review of randomised clinical trials - the safety of vaginal hormones and selective estrogen receptor modulators for the treatment of genitourinary menopausal symptoms in breast cancer survivors. Post Reprod Health. 29 (4), 222-231 (2023).
  19. Anastasilakis, A. D., et al. Follistatins, activins and inhibins during osteoporosis therapy with denosumab or zoledronate and after their discontinuation. Diabetes Obesity Metab. 27 (4), 2288-2293 (2025).
  20. Si, Y., et al. Curcumin-encapsulated exosomes in bisphosphonate-modified hydrogel microspheres promote bone repair through macrophage polarization and DNA damage mitigation. Materials Today Bio. 32, 101874-101874 (2025).
  21. Shouguo, L. Clinical observation of qiangjin zhuangji decoction combined with denosumab in the treatment of postmenopausal osteoporosis. , (2024).
  22. Yeom, M., Kim, E. Y., Kim, J. H., Jung, H. S., Sohn, Y. High doses of bupleurum falcatum partially prevents estrogen deficiency-induced bone loss with anti-osteoclastogenic activity due to enhanced inos/no signaling. Front Pharmacol. 9, 1314(2018).
  23. Lu, L., Yinliang, X., Liu, Y., Zhenzhong, J., Xiaoyan, L. Analysis of the mechanism of action of euphorbia fischeriana steud on cirrhosis based on network pharmacology. Medicine. 102 (37), e35118(2023).
  24. Nan, L. S. HPLC-UV for the determination of plasma concentration of saikosaponin C in rats' serum. Info Trad Chin Med. 32 (02), 66-68 (2015).
  25. Sakle, N. S., More, S. A., Mokale, S. N. A network pharmacology-based approach to explore potential targets of caesalpinia pulcherima: An updated prototype in drug discovery. Sci Rep. 10 (1), 17217(2020).
  26. Ru, J., et al. Tcmsp: A database of systems pharmacology for drug discovery from herbal medicines. J Cheminformatics. 6, 13(2014).
  27. Bowen, Y., Qiuwen, Z., Xiaodong, W., Jingxin, M., Shuqing, Z. Using network pharmacology and molecular docking verification to explore the mechanism of ursolic acid in the treatment of osteoporosis. Medicine. 101 (49), e32222(2022).
  28. Belghalia, E., et al. In silico research on new sulfonamide derivatives as brd4 inhibitors targeting acute myeloid leukemia using various computational techniques, including 3D-QSAR, HQSAR, molecular docking, ADME/Tox, and molecular dynamics. J Biomol Struct Dyn. 42 (17), 9201-9219 (2023).
  29. Chinese pharmacopoeia Commission. The Pharmacopeia of the People's Republic of China 2020 Edition: Volume I. , CHINA MEDICAL SCIENCE PRESS. (2020).
  30. Chinese pharmacopoeia Commission. The pharmacopoeia of the People's Republic of China 2020 edition: volume IV. , CHINA MEDICAL SCIENCE PRESS. (2020).
  31. Xu, S., et al. Material Basis and Mechanism of Erzhi Pill for Preventing Osteoporosis Based on Network Pharmacology. Chin Pharma J. 53 (22), 1913-1920 (2018).
  32. Lee, D. K., et al. Phospholipase c β4 promotes rankl-dependent osteoclastogenesis by interacting with mkk3 and p38 mapk. Exp Mol Med. 57 (2), 323-334 (2025).
  33. Huang, Q., et al. The effects of Ti and Ta particle surface chemistry on inflammation, osteogenesis, and osteoclastogenesis in vitro and in vivo. Colloid Interf Sci Commun. 54, 100716(2023).
  34. Zhao, M., et al. Comprehensive comparison on the anti-inflammation and gc-ms-based metabolomics discrimination between bupleuri chinense dc. And b. Scorzonerifolium willd. Front Pharmacol. 13, 1005011(2022).
  35. Bin, L., et al. Analysis of mutual-detoxication compatibility rules of "bupleuri radix decreaseing liver's yin essence" based on data mining. Chin Trad Herbal Drugs. 53 (14), 4428-4436 (2022).
  36. Ying, W., Xuefeng, Z., Minjing, L., Tingting, Z., Ping, L. Xiaochaihu decoction in diabetic kidney disease: A study based on network pharmacology and molecular docking technology. Integrat Med Nephrol Androl. 8 (1), 13-13 (2021).
  37. Sheng, Z., Hongcheng, L., Min, X. Identifying immune cell infiltration and effective diagnostic biomarkers in rheumatoid arthritis by bioinformatics analysis. Front Immunol. 12, 726747(2021).
  38. Menon, S. M. P., Elengoe, A. Evaluation of the role of kras gene in colon cancer pathway using string and cytoscape software. Biomed Res Ther. 7 (6), 3835-3842 (2020).
  39. Yang, J., et al. Bioinformatics identification based on causal association inference using multi-omics reveals the underlying mechanism of gui-zhi-shao-yao-zhi-mu decoction in modulating rheumatoid arthritis. Phytomed Int J Phytother Phytopharmacol. 136, 156332(2024).
  40. Yang, M., et al. Purification of harvested rainwater using gravity-driven ceramic membrane: A visualization study combining micro-CT and Comsol simulations. J Environ Manag. 373, 123333(2024).
  41. Jui-Ting, H., et al. A comparison of micro-CT and dental CT in assessing cortical bone morphology and trabecular bone microarchitecture. PloS one. 9 (9), e107545(2014).
  42. Yang, S. S., et al. Grem1 inhibits osteogenic differentiation of mbmscs in ovx rats through bmp/smad1/5 signaling pathway. Regenerat Ther. 28, 527-535 (2025).
  43. Huang, W., Zheng, X., Yang, X., Fan, S. Stimulation of osteogenic differentiation by saikosaponin-a in bone marrow stromal cells via wnt/β-catenin pathway. Calcified Tiss Int. 100 (4), 392-401 (2017).
  44. Hattori, T., et al. The fixed herbal drug composition "saikokaryukotsuboreito" prevents bone loss with an association of serum IL-6 reductions in the ovariectomized mouse model. Phytomedicine. 17 (3-4), 170-177 (2010).
  45. Wu, X., et al. Inhibition of lipopolysaccharide-induced inflammatory bone loss by saikosaponin d is associated with regulation of the rankl/rank pathway. Drug Des Dev Ther. 15, 4741-4757 (2021).
  46. Yu-Ting, H., et al. Effects of saikosaponin d on differentially expressed genes, Ctla-4, IL-10, and IL-17 in mice with autoimmune hepatitis. J Shanghai Jiaotong Uni. 40 (03), 303-309 (2020).
  47. Allergy, Z. C. F., et al. Sebocytes contribute to skin inflammation by promoting the differentiation of t helper 17 cells. Br J Dermatol. 178 (3), 722-730 (2018).
  48. Piao, C. H., Song, C. H., Lee, E. J., Chai, O. H. Saikosaponin a ameliorates nasal inflammation by suppressing il-6/ror-γt/STAT3/IL-17/nf-κb pathway in ova-induced allergic rhinitis. Chem Biol Interact. 315, 108874(2020).
  49. Zhimeng, L., et al. Il-17/il-17 receptor pathway-mediated inflammatory response in apostichopus japonicus supports the conserved functions of cytokines in invertebrates. J Immunol. 208 (2), 464-479 (2022).
  50. Wang, X., et al. Forsythiaside a repairs uvb-induced skin inflammatory damage by il-17 signaling pathway. Food Biosci. 64, 105845-105845 (2025).
  51. Ridvan, G., Emine, Y. Evaluation of the awareness and knowledge levels of dentists regarding bisphosphonates and bisphosphonate-related jaw necrosis. J Craniofac Surg. 36 (4), e376-e382 (2025).
  52. Lijuan, W., et al. An ultra-performance liquid chromatography photodiode array detection tandem mass spectrometric method for simultaneous determination of seven major bioactive constituents in Xiaochaihutang and its application to a fourteen-compound compatibility study. J Chromatograph Sci. 53 (9), 1570-1576 (2015).
  53. Wang, D. L., Fang, F. F., Liu, C. S., Su, J. C. expert consensus on integrated traditional chinese and western medicine diagnosis and treatment for osteoporotic fractures. Zhongguo gu shang China. J Orthopaed Traumatol. 37 (3), 242-250 (2024).
  54. Shimeng, L., et al. Antidepressant active components of bupleurum chinense dc-paeonia lactiflora pall herb pair: Pharmacological mechanisms. BioMed Res Int. 2022, 1024693-1024693 (2022).
  55. Ran, S., et al. Bupleurum in treatment of depression disorder: A comprehensive review. Pharmaceuticals (Basel). 17 (4), 512(2024).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Postmenopausal OsteoporosisOvariectomized RatsBone MicrostructureChai Hu TreatmentBone Loss InhibitionInflammatory CytokinesAnti Inflammatory PathwaysEstrogen DeficiencyBone DestructionDose Response

Related Articles