Artykuł metodologiczny

Test rozcieńczania FRET do analizy dynamicznej wymiany między zespołami białek

DOI:

10.3791/68678

⸱

19 września 2025

 , 
1Department of Molecular, Cellular and Developmental Biology and the Institute for Collaborative Biotechnologies, University of California, Santa Barbara

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten opisuje oczyszczanie i znakowanie kowalencyjne reflektyny A1, a także test rozcieńczania FRET w celu scharakteryzowania dynamicznej wymiany białka reflektyny między zespołami białek w funkcji wieku.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jako molekularny czynnik napędzający przestrajalną opalizację u głowonogów, zachowanie w fazie przestrajalnej białka reflektyny A1 nadal jest przedmiotem zainteresowania inżynierii biomateriałowej. Modulacja stężenia soli i gęstości ładunku netto białka reflektyny A1 napędza białko do tworzenia dynamicznych zespołów jako produktów pośrednich do separacji faz ciecz-ciecz. Zespoły reflektynowe, choć ograniczone wielkością przez stopień neutralizacji ładunku kationowego białka, odpychania kulombowskiego, są początkowo w dynamicznej wymianie z monomerami lub oligomerami z otaczającego roztworu. Zastosowano nowatorski test rozcieńczania metodą rezonansu fluorescencji (FRET) w połączeniu z dynamicznym rozpraszaniem światła (DLS) i testami koncentracji białek, aby scharakteryzować dwukierunkowy przepływ białka między zespołami reflektyny A1 a fazą rozcieńczoną w funkcji wieku złożenia. Ten test rozcieńczania FRET rozróżnia jednokierunkowy i dwukierunkowy przepływ białka do i z zespołów białkowych, a zatem może być stosowany podczas tworzenia zespołu. Rozróżnienie między dynamicznymi i kinetycznie zatrzymanymi zespołami białek ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia ich biofizycznego pochodzenia, a ten nowatorski test rozcieńczania FRET można zaadaptować do uzupełnienia badań biofizycznych innych zespołów białkowych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przestrajalna opalizacja u kałamarnic loliginidów odbywa się za pośrednictwem białek reflektyny w komórkach irydocytów 1,2,3. Irydocyty zawierają rozległe i regularne wgłębienia błonowe, które tworzą stosy gęstych od białka blaszek Bragga, które odbijają światło w sposób zależny od kąta i długości fali 1,4,5,6. Kaskada sygnałowa wyzwalana acetylocholiną osiąga kulminację w fosforylacji kationowych białek reflektyny 1,2,7, zmniejszając wewnątrz- i międzybiałkowe odpychanie elektrostatyczne i napędzając kondensację reflektyn w blaszkach Bragga od cząstek o promieniu hydrodynamicznym 10-50 nm do gęstego ciekłego kondensatu 3,8,9. Reflectin A1 in vitro tworzy stabilne pod względem wielkości zespoły o promieniu 10+ nm, których rozmiary są precyzyjnie dostrojone przez gęstość ładunku netto białka 10,11,12, a to przestrajalne zachowanie koloidalne wzbudziło duże zainteresowanie bioinżynierią w projektowaniu przestrajalnych materiałów biofotonicznych na bazie reflektyny 13,14,15,16,17,18 . Niedawno wykazano, że NaCl napędza montaż A1 i LLPS (separacja faz ciecz-ciecz) poprzez entropowe zwiększanie wkładu energetycznego efektu hydrofobowego i ekranowanie ładunków odpychających przemiennych łączników kationowych19.

W przypadku gęstych od białek kondensatów ciekłych, dynamiczna wymiana między fazą gęstą a fazą rozcieńczoną może być łatwo analizowana za pomocą pełnokropelkowego FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching)20; Potrzebny jest analogiczny test dla zespołów białkowych w skali nanometrowej. Ostatnie doniesienia o fizjologicznie istotnych zespołach białkowych jako produktach pośrednich LLPS 19,21,22 sugerowały potrzebę równoważnych metod badania dynamiki składania i dynamicznej wymiany między zespołami a współistniejącą fazą rozcieńczoną. Klastry białek mogą obejmować kinetycznie zatrzymane koloidy szkliste powstałe w wyniku zatrzymanego rozkładu rdzeniowego, dynamiczne zespoły równowagi, które wymieniają monomery lub oligomery z fazy rozcieńczonej oraz klastry metastabilne 23,24,25,26,27. Zależna od wieku dynamika składania białek jest zatem kluczem do zrozumienia procesów fizycznych napędzających tworzenie się zespołów białek w kontekście bardziej złożonego zachowania fazowego.

Podejścia oparte na FRET, analizujące interakcję między zespołami białka znakowanego fluoroforem donorowym a zespołami białka znakowanego akceptorowo-fluoroforem, zostały wykorzystane do scharakteryzowania dynamiki metastabilnych klastrów białkowych21. Po zmieszaniu tych klastrów, pojawienie się FRET demonstruje wymianę i transport białka do klastrów21. Jednak w przypadku niektórych białek, takich jak reflektyna A1, klastry tworzą się i rosną w sposób ciągły przez cały czas trwania eksperymentu19. W przypadku takich białek potrzebne jest podejście, które dekonwolucjonizuje jednokierunkowy transport białka do klastrów, co może mieć miejsce podczas ciągłego tworzenia dynamicznie zatrzymanych klastrów, oraz dwukierunkowy transport białka między zespołami.

Podejście do rozcieńczania FRET osiąga to poprzez rozcieńczanie fluoroforu (ryc. 1), w którym spadek FRET oznacza dwukierunkowy transport białka między zespołami. Przygotowano zespoły białkowe białka reflektyny, które zawierały równe ilości białka znakowanego albo akceptorem-fluoroforem, albo donorem-fluoroforem. Te znakowane zespoły reflektyny rozcieńczono roztworem zawierającym nieznakowane zespoły reflektynowe, a dynamiczną wymianę białka między zespołami analizowano jako funkcję wieku złożenia. Metoda ta odróżnia ciągłe tworzenie kinetycznie zatrzymanych klastrów białkowych od klastrów dynamicznych, w tym między innymi klastrów metastabilnych, klastrów, które rosną w wyniku dojrzewania Ostwalda lub podobnych procesów zgrubienia, klastrów, które rosną w wyniku fuzji oraz klastrów, które nie są półproduktami LLPS. Nie rozróżnia wyłącznie tych różnych mechanizmów dynamicznej wymiany, co wymaga metod ortogonalnych, takich jak dynamiczne rozpraszanie światła, analiza śledzenia nanocząstek (NTA) i testy Bradforda19,21. Protokół ten opisuje metody oczyszczania reflektyny A1 typu dzikiego i pojedynczego mutanta A1-C232S zawierającego cysteinę, znakowania kowalencyjnego A1-C232S oraz analizy rozcieńczenia FRET.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Odczynniki i używany sprzęt są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Oczyszczanie białek i znakowanie kowalencyjne

  1. Przekształcenie
    1. Klonuj geny reflektyny A1 i reflektyny A1 C232S (GenBank KF661517.1) do plazmidów pj411.
    2. Transfekcyjna komórka Rosetta 2 (DE3) z plazmidami przy użyciu szoku cieplnego28.
    3. Płytki transfekowane komórki na agarze zawierającym 50 μg/ml kanamycyny.
    4. Wybierz izolowaną kolonię i dodaj do 5 ml TB (Terrific Broth) zawierającego 50 μg/ml kanamycyny i inkubuj w temperaturze 37 ° C na wytrząsarce z prędkością 250 obr./min przez noc.
    5. Wyizoluj plazmidy przy użyciu protokołu zestawu do izolacji plazmidów do sekwencjonowania.
  2. Ekspresja białek, liza i inkluzja oczyszczania organizmu
    1. Dodać 5 ml kultury do 1 l LB (bulionu lizogenicznego) z 50 μg/ml kanamycyny i inkubować w temperaturze 37°C, wstrząsając. Przy A600 0,6-0,7 indukować ekspresję przez dodanie IPTG (izopropylo-β-D-tiogalaktopiranozydu) do końcowego stężenia 5 mM.
    2. Po 16 godzinach komórki osadu odwirowywano przy 12 000 x g przez 10 minut. Zdekantować supernatant i granulki komory zamrażania w zamrażarce o temperaturze -80°C.
    3. Lizować komórki i oczyszczać ciała inkluzyjne za pomocą odczynnika do oczyszczania ciała inkluzyjnego zgodnie z protokołem producenta, w tym 20 minut traktowania 1 μl (25-29 jednostek) benzonazy i 3-5 KU lizozymu na ml odczynnika do oczyszczania ciała inkluzyjnego po wstępnym ponownym zawieszeniu osadu komórkowego. Oczyszczone inkluzje pojawią się jako ciemnobrązowe granulki.
  3. FPLC (szybka chromatografia cieczowa białek)
    1. Przygotować 2 l 8 M roztworu kwasu octowego o stężeniu 8 M (bufor A) i 1 l 8 M chlorowodorku guanidyny: 5% v/v roztwór kwasu octowego (bufor B). Przefiltrować oba za pomocą filtra termosowego 0,22 μm.
      UWAGA: Unikać wdychania, kontaktu oczu i skóry z chlorowodorkiem guanidyny i nosić odpowiednie środki ochrony osobistej (PPE) podczas obsługi. Wyrzucać do specjalnego pojemnika na odpady.
    2. Zawiesić granulki ciała w 8 M roztworze kwasu octowego mocznika: 5% przez energiczne mieszanie za pomocą mieszadła magnetycznego. Roztwór będzie wyglądał na mętny. Odwirować wstępnie schładzać do temperatury 4 °C, odwirowywać przy 18 000 x g w temperaturze 4 °C przez 70 minut i zebrać supernatant do FPLC. Supernatant będzie brązowy i przezroczysty.
    3. Stosując natężenie przepływu 2 ml/min dla wszystkich kolejnych etapów, zrównoważyć 10 ml kolumny kationitowej z 5 objętościami kolumn (CV) 95% buforu A, 5% buforu B i załadować próbkę. Wypłukać niezwiązaną próbkę za pomocą 5 CV, a następnie wykonać gradient krokowy: 5 CV 94% buforu A/6% buforu B, a następnie 5 CV 10% buforu B. Reflektyna A1 eluuje się w 10% buforze B.
    4. Ocenić czystość frakcji odpowiadających początkowej zmianie kroku na 10% bufor B za pomocą SDS-PAGE i zgrupować, jeśli jest podobna. Wstępnie schłodzić wirówkę do temperatury 4 °C i zagęścić frakcje do końcowej objętości 4-5 ml za pomocą koncentratora wirowego MWCO o pojemności 15 ml i pojemności 10 kDa.
  4. HPLC (wysokosprawna chromatografia cieczowa)
    1. Przygotuj 2 litry wody o stężeniu 18 mΩ z 0,1% kwasem trifluorooctowym (TFA) i 2 litry acetonitrylu z 0,1% TFA. Przefiltrować oba za pomocą filtra termosowego 0,22 μm.
      UWAGA: TFA jest silnie dymiącym kwasem. Przechowywać w dygestorium, nosząc odpowiednie środki ochrony indywidualnej i przenosić tylko za pomocą szkła. Unikaj wdychania, kontaktu oczu i skóry z acetonitrylem i noś odpowiednie środki ochrony osobistej podczas obsługi. Wyrzucać do specjalnego pojemnika na odpady.
    2. Stosując natężenie przepływu 1 ml/min dla wszystkich kolejnych kroków, zrównoważ kolumnę C4 z 5 CV 85% 18 mΩ wody, 0,1% TFA i 15% acetonitrylu, 0,1% TFA.
    3. Rozpocząć przepływ i wstrzyknąć próbkę. Przepłyn 2 CV, a następnie rozpocznij stały gradient do 80% acetonitrylu, 0,1% TFA przez 5 CV. Reflectin A1 zwykle eluuje w 73% acetonitrylu.
    4. Frakcje do zamrażania w skorupkach, które zawierają białko reflektyny w probówkach o pojemności 5 ml przy użyciu kąpieli etanolowej i suchego lodu. Liofilizować i przechowywać w temperaturze -80 °C. Białko pojawi się w postaci cienkich białych arkuszy.
  5. Przygotowanie nieznakowanego wywaru białkowego
    1. Przygotować 4 l buforu kwasu octowego o pH 4, 25 mM (21,05 mM kwasu octowego, 3,95 mM trójwodnego octanu sodu) przy użyciu lodowatego kwasu octowego i trójwodnego octanu sodu. W razie potrzeby dostosować pH za pomocą 4 M HCl lub 4 M NaOH. Filtrować za pomocą filtra próżniowego 0,22 μm.
      UWAGA: Z silnymi kwasami/zasadami należy obchodzić się w odpowiednich środkach ochrony indywidualnej. Nigdy nie dodawaj wody do stężonego mocnego kwasu lub zasady.
    2. Rozmrozić probówkę zawierającą liofilizowane białko reflektyny i wraz z probówką w łaźni lodowej rozpuścić w buforze kwasu octowego o pH 4,25 mM. Całkowicie rozpuszczalny roztwór białkowy będzie wyglądał na bezbarwny, bez widocznego zmętnienia lub osadu.
      1. Używając kasety dializacyjnej o masie cząsteczkowej 10 kDa, dializuj rozpuszczalne białko reflektyny w 1000-krotnie większej objętości próbki o pH 4, 25 mM buforze kwasu octowego wstępnie schłodzonym do 4 °C przy użyciu dwóch 12-godzinnych zmian w temperaturze 4 °C.
    3. Rozcieńczyć próbkę buforem kwasu octowego o pH 4,25 mM w celu uzyskania końcowego stężenia białka 100 μM i końcowej objętości co najmniej 150 μl. Za pomocą spektrometru UV-VIS zmierzyć absorbancję przy 280 nm i użyć molowego współczynnika absorpcji29 reflektyny A1 (123,685 M-1 cm-1) w celu określenia stężenia białka.
    4. Przenieść białko reflektynowe do probówki do mikrowirówki z zatrzaskową nasadką o pojemności 0,5 ml i przechowywać w temperaturze 4 °C do 7 dni. Bezpośrednio przed eksperymentami odwirować białko refleksyjne w temperaturze 4 °C we wstępnie schłodzonej mikrowirówce o sile 18 000 x g przez 15 minut. Przygotować materiał reflektyny A1 C232S w podobny sposób, używając molowego współczynnika absorpcji 123,540 M-1 cm-1.
  6. Znakowanie białek
    1. Oddzielnie przygotować zapasy 10 mg/ml FMTS (metaanoetiosulfonianu fluoresceiny) i SRMT (metaanotiosiulfonianu sulforodaminy) przez dodanie 1 ml suchego dimetylosulfotlenku (DMSO) do fiolki zawierającej 10 mg sondy fluorescencyjnej i mieszania pipet.
      UWAGA: Unikać wdychania, kontaktu z oczami i skórą odczynników metanetylosulfonianu.
    2. Dodać 7,7 μl podstawowego 10 mg/ml FMTS lub 10,4 μl 10 mg/ml podstawowego SRMT do buforu kwasu octowego o pH 4, 25 mM do końcowej objętości 150 μl i końcowego stężenia 500 μM FMTS lub SRMT. Roztwór będzie wyglądał na mętny. Podwielokrotność sondy fluorescencyjnej i zamrozić w temperaturze -80 °C.
    3. Połącz ze 150 μl 100 μM bulionu białkowego reflectin i dokładnie wymieszaj pipetami. Końcowe stężenie białka wynosi 50 μM, a końcowe stężenie sondy fluorescencyjnej wynosi 500 μM. Zmętnienie roztworu zmniejszy się.
    4. Zawinąć w folię i inkubować w pozycji pionowej, delikatnie mieszając orbitalnie w temperaturze pokojowej przez 4 godziny, a następnie przez noc w temperaturze 4 °C. Zmętnienie roztworu nie powinno się zmieniać.
    5. Jeśli osad jest obecny, zawiesić go ponownie przez energiczne mieszanie pipetą. Roztwór będzie mętny. Skoncentrować reflektynę za pomocą filtra odśrodkowego MWCO o sile 10 000 kDa do docelowej objętości 100 μl i stężenia 150 μM.
    6. Użyć tej samej metody HPLC i liofilizacji, co do oczyszczania białek, aby usunąć niezwiązaną sondę fluorescencyjną i przechowywać białko w temperaturze -80 °C owinięte w folię. Ponownie rozpuścić znakowane białko przy użyciu tej samej metody dla białka nieznakowanego. Określ stopień oznakowania.
      UWAGA: Rozpuszczalne, znakowane fluorescencyjnie białko reflektyny będzie miało kolor żółto-zielony (C199-F) lub ciemnoczerwony (C199-R) bez zmętnienia i wytrącania się.
  7. Preparat białkowy ze współznakowanym białkiem
    1. Dodaj 27 μl 100 μM białka A1 do mikrowirówki zatrzaskowej o pojemności 0,5 ml.
    2. Dodać 1,5 μl znakowanej fluoresceiną reflektyny A1-C232S (określanej jako C199-F dla oznaczenia pozycji aminokwasowej fluoresceiny) do tej samej probówki.
    3. Dodać 1,5 μl znakowanej sulforodaminą reflektyny A1-C232S (określanej jako C199-R dla oznaczenia pozycji aminokwasowej fluoresceiny) do tej samej probówki. Stężenia końcowe wynoszą 90 μM A1, 5 μM C199-F i 5 μM C199-R.
    4. Zawinąć w folię i przechowywać w temperaturze 4 °C do 7 dni.

2. Szeregi czasowe FRET

  1. Przygotowanie i filtracja
    1. Przygotować 500 ml 25 mM buforu kwasu 3-(N-morfolino)propanosulfonowego (MOPS). Doprowadzić pH roztworu do 7, powoli dodając 4 M wodorotlenek sodu. Przefiltrować 10 ml za pomocą strzykawki 10 ml i filtra strzykawkowego 0,22 μm.
  2. Odwirowywanie białka
    1. Mikrowirówkę stołową ze wstępnym schładzaniem do temperatury 4 °C. Wirować nieoznakowane i znakowane zapasy reflektyny A1 w temperaturze 18 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C.
  3. Przygotowanie zespołów A1 z etykietami
    1. Aby przygotować trzy powtórzenia, należy odpipetować 9,6 μl buforu MOPS (pH 7, 25 mM) do trzech probówek do mikrowirówek typu snap-cap o pojemności 0,5 ml.
    2. Dodać 0,4 μl znakowanego białka do każdej probówki zawierającej już 9,6 μl buforu MOPS, aby uzyskać końcowe stężenie białka 4 μM. Powoli wymieszać pipetą dwukrotnie, zasysając i dozując całą objętość próbki.
    3. Natychmiast zawinąć w folię aluminiową i umieścić w inkubatorze w temperaturze 25 °C. To i wszystkie następne roztwory zespołów nie mają widocznego zmętnienia lub wytrącania się przed lub po inkubacji.
  4. Przygotowanie nieoznakowanych zespołów A1
    1. Aby przygotować trzy powtórzenia, należy odpipetować 38,4 μl buforu MOPS do trzech probówek wirówkowych z zatrzaskową nasadką o pojemności 0,5 ml.
    2. Dodać 1,6 μl białka reflektyny A1 do każdej probówki zawierającej już 38,4 μl buforu MOPS, aby uzyskać końcowe stężenie białka 4 μM. Powoli wymieszać pipetą dwukrotnie, zasysając i dozując całą objętość próbki.
    3. Natychmiast zawinąć w folię aluminiową i umieścić w inkubatorze w temperaturze 25 °C.
  5. Czas i mieszanie zespołów A1 z kooznakowaniem i bez etykiety
    1. Uporządkuj przygotowanie zespołów w następujący sposób: równocześnie i osobno przygotuj zespoły eksperymentalnego jednego z kotagiem reflectin i eksperymentalnego jednego nieoznakowanego reflectin. Powtórz kroki 2.3 i 2.4.
    2. Wymieszać, dodając 40 μl nieznakowanego zespołu eksperymentalnego A1 do 10 μl odpowiedniego współznakowanego eksperymentalnego i delikatnie wymieszać pipetą, zasysając i dozując całą objętość dwukrotnie. Pomiary zostaną wykonane po 24 godzinach od tego kroku.
    3. Czas pomiędzy napędzaniem zespołu reflektyny A1 przez rozcieńczenie do buforu MOPS (pH 7, 25 mM) a zmieszaniem oznakowanych i nieoznakowanych zestawów to wiek zespołu. Wiek zespołów użytych do tych danych wynosił 0 min, 1 min, 10 min, 30 min, 60 min, 120 min, 180 min, 540 min, 1080 min i 1620 min.
  6. Formantów
    1. Kontrola pozytywna
      1. Z A1 i znakowanych zapasów białkowych przygotuj 20 μl białka, które składa się z 80 μM A1 i 20 μM współznakowanego białka.
      2. Dodać 38,4 μl buforu MOPS do probówek wirówkowych z zatrzaskową nasadką o pojemności 0,5 ml, a następnie dodać 1,6 μl białka znakowanego 80 μM A1/20 μM i dwukrotnie wymieszać pipetą, powoli zasysając i dozując całą objętość. Natychmiast przykryć folią i umieścić w inkubatorze w temperaturze 25 °C. Powtórzyć te czynności dla łącznie 9 próbek.
    2. Kontrola ujemna
      1. Dodać 0,4 μl oznakowanego bulionu do probówki mikrowirówkowej o pojemności 0,5 ml z zatrzaskową nasadką, która zawiera już 9,6 μl buforu MOPS. Powoli wymieszać pipetą dwukrotnie, zasysając i dozując całą objętość próbki.
      2. Dodać 40 μl buforu MOPS i wymieszać pipety, dwukrotnie zasysając i dozując całą objętość próbki. Natychmiast przykryć folią i umieścić w inkubatorze w temperaturze 25 °C. Powtórzyć te czynności dla łącznie 9 próbek.
  7. Ślepa próba kuwety i bufora
    1. Ustaw fluorymetr na wzbudzenie przy 488 nm i rejestruj ciągłe widma od 520-700 nm.
    2. Napełnij czystą kwarcową kuwetę sub-mikrofluorymetru 50 μl buforu MOPS (pH 7, 25 mM) i zmierz.
    3. Usuń bufor.
  8. Procedura doświadczalna
    UWAGA: Wszyscy eksperymentalni powinni być nagrani 24 godziny po zmieszaniu wspólnie znakowanych i nieoznakowanych zespołów reflektynowych A1. Delikatnie odpipetować 50 μl roztworu doświadczalnego do kuwety i odmierzyć.
    1. Usunąć próbkę, przepłukać 500 μl buforu kwasu octowego, a następnie 500 μl wody przefiltrowanej przez 0,22 μm 18 mΩ. Wykonaj ślepe buforowanie.
  9. Formantów
    1. Pomiar w 1440 min, 1960 min i 3060 min po przygotowaniu kontroli (odpowiadających wiekowi montażu 0 min, 520 min i 1620 min). Pomiary te kończą eksperymentalną część protokołu.

3. Analiza danych

  1. Odejmij widma ślepej próby buforu od widm doświadczalnych.
  2. Określ stosunek Em588/Em520.
  3. Dla każdej kontrpróby należy następnie wyznaczyć średnią i odchylenie standardowe każdej grupy trzech powtórzeń. Wykres Em588/Em520 w funkcji wieku montażu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Po rozcieńczeniu zespołów reflektyny A1 zawierających zarówno białko znakowane fluoroforem donorowym, jak i białko znakowane fluoroforem akceptorowym nieznakowanymi zespołami reflektyny A1, zaobserwowano początkowy spadek emisji FRET przy 588 nm w stosunku do zespołów nierozcieńczonych (Figura 2A). FRET dla zespołów w wieku 0 min był podobny do kontroli pozytywnej, a FRET dla zespołów w wieku 1620 min (czas między utworzeniem zespołu a mieszaniem nieznakowanych i znakowanych zespołów reflekt...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Częstym punktem utraty białka podczas oczyszczania jest niepełne ponowne zawieszenie granulek inkluzji dla wszystkich etapów protokołu oczyszczania ciała inkluzji oraz końcowe ponowne zawieszenie oczyszczonych ciał inkluzyjnych w 8 M moczniku 5% v/v kwasu octowego. Rozdzielczość ciała inkluzyjnego może zająć do 24 godzin energicznego mieszania za pomocą małego mieszadła magnetycznego w stożkowej probówce o pojemności 40 ml. Aby uniknąć znacznych strat białka w filtrach, filtracja poprzedzająca FPLC i HPLC została zastąpi...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badania były wspierane przez Institute for Collaborative Biotechnologies poprzez granty W911NF-19-2-0026 i W911NF-23-1-0330 z U.S. Army Research Office. Treść informacji niekoniecznie odzwierciedla stanowisko lub politykę rządu i nie należy wnioskować o oficjalnym poparciu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
10 μ Mikropipeta o pojemności L
2 μ Mikropipeta o pojemności L
2-[(5-Fluoresceinylo)aminokarbonylo]etylo-metanosulfonianSanta Cruz BiotechnologiesSC-216155 powiedział:CAS  351330-42-2
20 μ Mikropipeta o pojemności L
200 μ Mikropipeta o pojemności L
Kwas 3-(N-Morfolino)propanosulfonowy, Kwas 4-morfolinopropanosulfonowySigma-AldrichZobacz materiał M1254CAS 1132-61-2
Kwas octowySigma-AldrichCiągnik siodłowy A6283CAS 64-19-7
AcetonitryluSigma-Aldrich34851-1LCAS 75-05-8
Agar w proszkuKarolina Biologiczna842133CAS 9002-18-0
Folia aluminiowa
Filtr odśrodkowy Amicon Ultra, 10 kDa MWCOMillipore SigmaUFC501008Pojemność 0,5 ml
Filtr odśrodkowy Amicon Ultra, 10 kDa MWCOMillipore SigmaUFC901008Pojemność 15 ml
Waga analityczna
BenzonazaMillipore-Sigma70664-3CAS 9025-65-4
Odczynnik do ekstrakcji białek BugBusterMillipore Sigma70584-3
Spektrometr fluorescencji Cary EclipseCary-Eclipse (Zaćmienie Cary'ego)
Oprogramowanie Cary Eclipse
Probówki wirówkowe Corning 50 mlMillipore-SigmaCLS430829
Strzykawki jednorazowe, Luer-Lok 10 mlCole'a-ParmeraUX-12915-02
DMSOSigma-AldrichZobacz materiał D8418CAS 67-68-5
Suchy lód
System FPLC z dwiema pompami
System HPLC z dwiema pompami
EtanolMillipore SigmaEX0280-3CAS 64-17-5
Rotor wirówki stojącej o pojemności 500 ml
Wirówka stojąca 
Zamrażarka, -80° C
Wyciąg wyciągowy
Chlorowodorek guanidynyThermo ScientificAAA135430B50-01-1
Kolumna chromatografii kationowymiennej HiTrap SP HPCytiva (Cytiwa)17115101
Kwas solnySigma-Aldrich258148-25MLCAS 7647-01-0
Inkubator
Izopropyl β-D-1-tiogalaktopiranozydSigma-AldrichI6758-1G
Siarczan kanamycynySigma-AldrichZobacz materiał K1637CAS 25389-94-0
Liofilizator
LizozymuThermo Scientific90082
Mieszadło magnetyczne
Mieszadło magnetyczne
Mikroelektroda pH S7Metler Toledo51343160
Mikrowirówka z regulacją temperatury
Filtr strzykawkowy Millex PVDFMiliporySLGVR33RS0,22 &m; M, średnica 33 mm
Filtr Milli-Q MillipakMillipore SigmaMPGP002A1
System oczyszczania wody Milli-Q UltraPureMillipore Sigma
Zawartość NaClThermo ScientificAA12314A9CAS 7647-14-5
Butelki wirówkowe Nalgene, typ 3120Millipore-SigmaZobacz materiał B1283-4EADo granulowania bakterii
Laboratorium orbitalne  Wytrząsarka z inkubatorem
Komputer osobisty
Szalki PetriegoSigma-AldrichZobacz materiał P5731-500EA
Plazmid PJ411DNA 2.0
Białko LoBind  Rury stożkoweEppendorf powiedział:EP30108302Pojemność 5 ml
Białko LoBind  Probówki do mikrowirówekEppendorf powiedział:EP022431102Pojemność 0,5 ml
Kolba Erlenmeyera z przegrodą Pyrex 1 000 mlMillipore-SigmaCLS44501Do inkubacji kultur bakteryjnych
Zlewki Pyrex Griffin 2 000 mlMillipore-SigmaCLS10002LDo wszystkich przygotowań i roztworów 
Okrągłe butelki do przechowywania pożywek Pyrex 1 000 mlMillipore-SigmaCLS13951LDo przechowywania całego buforu i przygotowanego roztworu należy używać z filtrami do kolb próżniowych
Zestaw Qiaprep Spin MiniprepQiagen powiedział:27104
Lodówka
Kompetentne komórki Rosetta 2(DE3)Novagen71397-3
Kasety dializacyjne Slide-a-lyzer 10K MWCOThermo ScientificPI66383Pojemność 0,5 ml
Octan sodu trójwodnySigma-AldrichZobacz materiał S8625 powiedział:CAS 6131-90-4
Wodorotlenek soduSigma-Aldrich567530-250GMCAS 1310-73-2
Filtr górny do butelki próżniowej SteritopMillipore SigmaS2GPT05RE0,22 &m; m Sterylny filtr
Submikrokuweta o pojemności 50 μlKomórki Starna16.40F-Q-10/Z15
Metanetylosulonian sulforodaminySanta Cruz BiotechnologiesSC-220172 powiedział:CAS  386229-71-6
Kwas trifluorooctowySigma-AldrichNumer katalogowy: 106232-25GCAS 407-25-0
TryptonWidmo chemiczne Zobacz materiał T1333
MocznikThermo ScientificAAA123600ECAS 57-13-6
Spektrometr UV-VIS
Ekstrakt drożdżowyGibco (firma Gibco)211929

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. DeMartini, D. G., Izumi, M., Weaver, A. T., Pandolfi, E., Morse, D. E. Structures, organization, and function of reflectin proteins in dynamically tunable reflective cells. J Biol Chem. 290 (24), 15238-15249 (2015).
  2. Izumi, M., et al. Changes in reflectin protein phosphorylation are associated with dynamic iridescence in squid. J R Soc Interface. 7 (44), 549-560 (2010).
  3. Tao, A. R., et al. The role of protein assembly in dynamically tunable bio-optical tissues. Biomaterials. 31 (5), 793-801 (2010).
  4. Ghoshal, A., DeMartini, D. G., Eck, E., Morse, D. E. Optical parameters of the tunable Bragg reflectors in squid. J R Soc Interface. 10 (85), 20130386(2013).
  5. Ghoshal, A., DeMartini, D. G., Eck, E., Morse, D. E. Experimental determination of refractive index of condensed reflectin in squid iridocytes. J R Soc Interface. 11 (95), 20140106(2014).
  6. Ghoshal, A., Eck, E., Gordon, M., Morse, D. E. Wavelength-specific forward scattering of light by Bragg-reflective iridocytes in giant clams. J R Soc Interface. 13 (120), 20160285(2016).
  7. Mäthger, L. M., Collins, T. F. T., Lima, P. A. The role of muscarinic receptors and intracellular Ca2+ in the spectral reflectivity changes of squid iridophores. J Exp Biol. 207 (11), 1759-1769 (2004).
  8. Morse, D. E., Taxon, E. Reflectin needs its intensity amplifier: Realizing the potential of tunable structural biophotonics. Appl Phys Lett. 117 (22), 220501(2020).
  9. Hanlon, R. T., Cooper, K. M., Budelmann, B. U., Pappas, T. C. Physiological color change in squid iridophores. Cell Tissue Res. 259, 3-14 (1990).
  10. Levenson, R., et al. Calibration between trigger and color: Neutralization of a genetically encoded coulombic switch and dynamic arrest precisely tune reflectin assembly. J Biol Chem. 294 (45), 16804-16815 (2019).
  11. Levenson, R., Bracken, C., Bush, N., Morse, D. E. Cyclable condensation and hierarchical assembly of metastable reflectin proteins, the drivers of tunable biophotonics. J Biol Chem. 291 (8), 4058-4068 (2016).
  12. Levenson, R., et al. Protein charge neutralization is the proximate driver dynamically tuning a nanoscale Bragg reflector. bioRxiv. 9, (2021).
  13. Tobin, C. M., et al. Reversible and size-controlled assembly of reflectin proteins using a charged azobenzene photoswitch. Chem Sci. 15, 13279-13289 (2024).
  14. Loke, J. J., Hoon, S., Miserez, A. Cephalopod-mimetic tunable photonic coatings assembled from quasi-monodispersed reflectin protein nanoparticles. ACS Appl Mater Interfaces. 14 (18), 21436-21452 (2022).
  15. Kramer, R. M., Crookes-Goodson, W. J., Naik, R. R. The self-organizing properties of squid reflectin protein. Nat Mater. 6 (7), 533-538 (2007).
  16. Xu, C., Stiubianu, G. T., Gorodetsky, A. A. Adaptive infrared-reflecting systems inspired by cephalopods. Science. 359 (6383), 1495-1500 (2018).
  17. Ordinario, D. D., et al. Bulk protonic conductivity in a cephalopod structural protein. Nat Chem. 6 (7), 596-602 (2014).
  18. Ordinario, D. D., et al. Protochromic devices from a cephalopod structural protein. Adv Opt Mater. 5 (20), 1600751(2017).
  19. Gordon, R., et al. Charge screening and hydrophobicity drive progressive assembly and liquid-liquid phase separation of reflectin protein. J Biol Chem. 301 (3), 108277(2025).
  20. Bracha, D., Walls, M. T., Brangwynne, C. P. Probing and engineering liquid-phase organelles. Nat Biotechnol. 37 (12), 1435-1445 (2019).
  21. Kar, M., et al. Phase separating RNA binding proteins form heterogeneous distributions of clusters in subsaturated solutions. Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (28), e2202222119(2022).
  22. Lan, C., et al. Quantitative real-time in-cell imaging reveals heterogeneous clusters of proteins prior to condensation. Nat Commun. 14 (1), 4831(2023).
  23. Vekilov, P. G. The two-step mechanism of nucleation of crystals in solution. Nanoscale. 2 (11), 2346(2010).
  24. Gibaud, T., Schurtenberger, P. A closer look at arrested spinodal decomposition in protein solutions. J Phys Condens Matter. 21 (32), 322201(2009).
  25. Cardinaux, F., Gibaud, T., Stradner, A., Schurtenberger, P. Interplay between spinodal decomposition and glass formation in proteins exhibiting short-range attractions. Phys Rev Lett. 99 (11), 118301(2007).
  26. Sciortino, F., Mossa, S., Zaccarelli, E., Tartaglia, P. Equilibrium cluster phases and low-density arrested disordered states: The role of short-range attraction and long-range repulsion. Phys Rev Lett. 93 (5), 055701(2004).
  27. Segrè, P., Prasad, V., Schofield, A., Weitz, D. Glass-like kinetic arrest at the colloidal-gelation transition. Phys Rev Lett. 86 (26), 6042-6045 (2001).
  28. Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. J Vis Exp. (6), e253(2007).
  29. Gill, S. C., Von Hippel, P. H. Calculation of protein extinction coefficients from amino acid sequence data. Anal Biochem. 182 (2), 319-326 (1989).
  30. Lychko, I., Soares, C. L., Dias, A. M. G. C., Roque, A. C. A. A scalable method to purify reflectins from inclusion bodies. Sep Purif Technol. 315, 123736(2023).
  31. Berliner, L. J., Grunwald, J., Hankovszky, H. O., Hideg, K. A novel reversible thiol-specific spin label: Papain active site labeling and inhibition. Anal Biochem. 119 (2), 450-455 (1982).
  32. Kenyon, G. L., Bruice, T. W. Novel sulfhydryl reagents. Methods Enzymol. 47, 407-430 (1977).
  33. Renault, K., Fredy, J. W., Renard, P. Y., Sabot, C. Covalent modification of biomolecules through maleimide-based labeling strategies. Bioconjug Chem. 29 (8), 2497-2513 (2018).
  34. Northrop, B. H., Frayne, S. H., Choudhary, U. Thiol-maleimide "click" chemistry: Evaluating the influence of solvent, initiator, and thiol on the reaction mechanism, kinetics, and selectivity. Polym Chem. 6 (18), 3415-3430 (2015).
  35. Stauffer, D. A., Karlin, A. Electrostatic potential of the acetylcholine binding sites in the nicotinic receptor probed by reactions of binding-site cysteines with charged methanethiosulfonates. Biochemistry. 33 (22), 6840-6849 (1994).
  36. Bressloff, P. C. Active suppression of Ostwald ripening: Beyond mean-field theory. Phys Rev E. 101 (4), 042804(2020).
  37. Berry, J., Brangwynne, C. P., Haataja, M. Physical principles of intracellular organization via active and passive phase transitions. Rep Prog Phys. 81 (4), 046601(2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Reflektyna A1separacja faz ciecz cieczst enie solig sto adunkudynamiczne rozpraszanie wiat astrumie bia kabadanie biofizyczne

Powiązane artykuły