Artykuł metodologiczny

Mysia krezkowa limfadenektomia w celu selektywnego zakłócenia komunikacji limfatycznej z jelitem specyficznym dla regionu

DOI:

10.3791/68696

⸱

30 grudnia 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Surgery, Yale University School of Medicine, 2Department of Immunobiology, Yale University School of Medicine, 3Department of Internal Medicine, Section of Rheumatology, Yale University, 4Howard Hughes Medical Institute, Yale University School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten opisuje procedurę przeżycia dla bezpiecznej i dobrze tolerowanej mysiej krezki limfadenektomii na każdym z czterech stacji wzdłuż łańcucha węzłów chłonnych krezki. Procedura ta jest adaptowalna, aby umożliwić selektywne zakłócenie komunikacji limfatycznej z dalszym jelitem grubym, bliższym i/lub jelitem cienkim.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Immunosurveillance kontra tolerancja antygenowa to delikatna równowaga w mikrośrodowisku jelitowym, podczas której kluczowa rola krążącego primingu limfocytów T w lokalnych węzłach chłonnych jest dobrze znana. Po primowaniu limfocytów T, najnowsza literatura zaczęła wykazywać unikalną, nieredundancyjną rolę niekrążących limfocytów T znajdujących się w drenażowym węźle chłonnym narządu. Może to być szczególnie prawdziwe w jelitach, gdzie drenaż limfatyczny jest znany z bardzo specyficznego charakteru. Jednak aby naprawdę zrozumieć unikalny wpływ tych lokalnych komórek w porównaniu z systemową redundancją funkcjonalną, społeczność naukowa potrzebuje dobrze opisanej procedury izolacji i selektywnego zaburzenia tych węzłów. Opisano tutaj procedurę przeżywalną zapewniającą bezpieczną i dobrze tolerowaną myszą krezkową naczyniową dewenektomię na każdym z czterech stacji wzdłuż łańcucha węzłów chłonnych krezki. Procedura ta jest adaptowalna, aby umożliwić selektywne zakłócenie komunikacji limfatycznej z dalszym jelitem grubym, bliższym i/lub jelitem cienkim. W zestawie znajdują się szczegółowe instrukcje, pomoce wizualne, pomocne wskazówki dotyczące poprawy sukcesu oraz metody rozwiązywania problemów z nieoptymalnym przeżyciem. Przecięte węzły chłonne są natychmiast gotowe do dalszego przetwarzania, jeśli zajdzie taka potrzeba. Technika ta najlepiej sprawdza się w badaniach wymagających selektywnego zakłócania drenażu limfatycznego z dalszego jelita grubego, bliższego okrężnicy i/lub jelita cienkiego.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Limfocyty T są jednym z głównych typów komórek efektorowych w odporności adaptacyjnej, z opisanymi rolami w różnych kategoriach chorób, w tym infekcjach, autoimmunologii i nowotworach 1,2,3. Kluczowym krokiem dla funkcjonowania limfocytów T jest trójfazowe primowanie przez komórki prezentujące antygen w wtórnych narządach chłonnych, takich jak lokalne węzły chłonne4. We współczesnej medycynie podstawą prawidłowej resekcji onkologicznej w wielu układach narządowych jest pewien stopień pobierania próbek lokalnych lub resekcji węzłów chłonnych en bloc 5,6,7,8. Na przykład w przypadku raka jelita grubego konsensus zaleca usunięcie 12 węzłów chłonnych i badanie w resekcji z zamiarem leczniczym ze względu na wyraźną korelację z poprawą długoterminowego przeżycia 6,7. Jednak czy lokalne węzły chłonne naprawdę mogą być usuwane bezkarnie? Najnowsze badania na myszach wykazały, że węzeł chłonny odprowadzający odpływ nowotworowy zawiera rezerwuar prekursorów limfocytów T przeciwnowotworowych, które mogą być chronione przed terminalną różnicacją i wyczerpaniem limfocytów T występującym w mikrośrodowisku nowotworowym 9,10,11. Sugeruje to, że usunięcie tak krytycznej populacji mogłoby osłabić ciągłe możliwości immunonadzoru.

Wzorzec drenażu limfatycznego jelit u myszy jest znany jako dość wyspecjalizowany wzdłuż łańcucha węzłów chłonnych krezki; na przykład jelito proksymalne jest niemal wyłącznie odprowadzane przez pierwszą stację węzła chłonnego, jelito cienkie przez drugą/trzecią stację, a dalsze jelito grube głównie przez czwartą stacjęwęzła chłonnego nr 12 (Rysunek 1, Ilustracja uzupełniająca 1). W ten sposób bezpośrednia komunikacja między segmentami jelit a limfatycznymi może zostać zakłócona poprzez celowaną ablację tych węzłów. Aby zablokować transport między węzłami chłonnymi a tkankami, powszechnie stosuje się agonisty receptorów S1P, takie jak FTY720, oraz blokadę integriny; jednak leki te szeroko hamują handel i dlatego nie mogą być wykorzystywane do badania udziału konkretnych węzłów chłonnych13,14. Jednak zdolność szerszej społeczności naukowej do badania lokalnych efektów interakcji immunologicznych w węzłach chłonnych jelitowych jest ograniczona przez brak dobrze opisanej resekcji chirurgicznej dla każdego stanowiska. Mając na uwadze tę lukę, opracowano procedurę przeżycia dla mysiej krezki limfadenektomii na każdym stanowisku węzłowym, która jest opisana tutaj. Głównym celem tego zabiegu jest bezpieczne i niezawodne wycięcie stacji węzłów chłonnych krezki u myszy o wysokiej przeżywalności i tolerancji pooperacyjnej.

Procedura ta została przetestowana i łatwa do przeprowadzenia u młodych i dorosłych myszy w różnych szczepach (np. Balb/c, C57BL/6J, 129S4), ale jest ograniczona przez potrzebę dostępnych i łatwo rozpoznawalnych węzłów chłonnych. Dlatego może nie być dobrze dopasowany do łączenia z myszymi modelami lub genotypami z mniejszymi lub niedostrzegalnymi węzłami chłonnymi (np. myszy z niedoborem limfotoksyn-alfa)15. Ponadto starsze myszy (>15 tygodnia) mają tendencję do większej tłustości trzewnej, co utrudnia identyfikację i izolację węzłów chłonnych, i choć nie jest to przeciwwskazanie, może to ograniczać sukces lub zabieg. Poza tymi ograniczeniami, limfadenektomia krezkowa oferuje wysoce kontrolowaną i selektywną perturbację węzłów chłonnych. Zabieg ten najlepiej sprawdziłby się w rozwiązywaniu pytań dotyczących lokalnego wpływu węzłów chłonnych i powiązanych z nimi komórek odpornościowych oraz interakcji na fragmentach jelit (np. okrężnica proksymalna, dalsza jelito, jelito cienkie).

figure-introduction-1
Rysunek 1: Anatomiczne punkty orientacyjne stacji w łańcuchu węzłów chłonnych krezki. (A) Nieoznaczone i (B) oznaczone przedstawienie czterech głównych stacji węzłów chłonnych krezkowej in situ. Drenaż okrężnego jelita grubego odbywa się głównie przez stację 1, jelito cienkie przeważa przez stację 2/3, a jelito dystalne przeważnie przez stację 4. (DC= dalsze jelito, ICV= naczynia jelicowe, PC= okrężnica proksymalna, CEC= krewka, IV/JV= naczynia jelito/czejun, SI = jelito cienkie). Paski skali: 1,5 cm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury są wykonywane zgodnie z protokołami Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Yale Institutional Animal Care and Use Committee. Do opracowania tej procedury wykorzystano szczep C57BL/6 w wieku 8-12 tygodni, myszy typu dzikiego oraz kontrolę pozorowaną według wieku/płci/genotypu. Uwzględniono zarówno samce, jak i samice myszy. Masa ciała wahała się od 18 do 25 g. Odczynniki i używany sprzęt są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Przygotowanie instrumentów, zwierząt i sali operacyjnej

  1. Wysterylizuj wszystkie narzędzia chirurgiczne. Upewnij się, że powierzchnia operacyjna i stożek znieczulający są oczyszczone 70% etanolem.
  2. Ustaw maszynę do inhalacji z anestyzatorem z nosem i ssaniem do nadmiernego usuwania anestetyki. Zorganizuj powierzchnię operacyjną z cyrkulacją ciepłej wody, aby utrzymać temperaturę ciała i zapasy zwierzęcia w dogodnym, sterylnym miejscu.
    UWAGA: Ta procedura nie wymaga mikroskopu operacyjnego; Jednak rozważ włączenie tego instrumentu, aby poprawić wizualizację.
  3. Indukowanie znieczulenia poprzez podanie 2%-3% wdechowego izofluranu z przepływem tlenu 2 L/min przez stożek nosowy z inhalowanego waporyzatora (zgodnie z zatwierdzonymi protokołami instytucjonalnymi).
    1. Zapewnij odpowiednią powierzchnię znieczulenia, potwierdzając częstość oddechu na poziomie około 30-40 oddechów na minutę oraz brak reakcji na szczypanie tylnej stopy. Okresowo sprawdzaj odpowiednią płaszczyznę znieczulenia i odpowiednio dostosowuj przepływ izofluranu.
      UWAGA: Alternatywnie, odpowiedni jest również środek znieczulejący w zastrzykach.
  4. Przestrzegaj wytycznych instytutu dotyczących odpowiedniego leczenia przeciwbólowego i znieczulenia miejscowego. Na przykład podskórnie podaj długo działający środek przeciwbólowy, taki jak buprenorfinę XR w dawce 3,25 mg/kg, a następnie podskórnie w miejscu planowanego nacięcia do 0,04 mL/5 g roztworu lidokainy o masie ciała.
  5. Przygotuj zwierzę do zabiegu, ustawiając się na plecach, nakładając lubrykant do oczu, wyrywając lub przycinając sierść brzucha oraz sterylizując odwłok roztworem povidonu/jodu, a następnie 70% etanolu (Rysunek 2A).
  6. Używaj sterylnych rękawiczek i przyłóż sterylne zasłony na zwierzę z oknem na pole operacyjne. Zachowaj bezpłodność przez cały zabieg.

figure-protocol-1
Rysunek2: Reprezentatywne obrazy głównych etapów proceduralnych w krezkowej limfadenektomii. (A) Wyrwane i wysterylizowane okno brzucha. (B) Nacięcie 0,5 cm przez skórę i linea alba. (C) Odsłonięcie łańcucha węzłów chłonnych krezki przez ustawienie jelita jelita kręcowego w prawo, okrężnicy bliższej w lewo i dolnego cecum. Pierwszy węzeł chłonny krezkowy leży wzdłuż tętnicy kościowo-kościowej (biała strzałka). (D) Wycięty węzeł chłonny krezkowy (wyblakła strzałka). Paski łusek: 0,5 cm (E) Ex vivo węzeł chłonny krezkowy (biała strzałka; 2,5 mm x 3 mm). Ticks = 1 mm. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figury.

2. Przygotowanie do leczenia limfadenektomii krezki

  1. Zrób nacięcie o średnicy środkowej linii 0,5-1 cm przez skórę. Tępo rozczłonkuj skórę z dala od ściany brzucha i zidentyfikuj linea alba. Wykonaj nacięcie o średnicy 0,5-1 cm przez linea alba, aby uzyskać dostęp do jamy otrzewnej (Rysunek 4B).
    UWAGA: Aby poprawić dostęp do węzłów stacji 2/3/4, rozważ przedłużenie cefaladu z nacięciem, ale nie po to, by przekroczyć wyrostek chrzęstkowo-ksifoidalny.
  2. Wprowadzić 1 ml sterylnej soli fizjologicznej w temperaturze ciała do jamy otrzewnej za pomocą tępej igły do nadziewania i zwilżać sterylne zasłony w przygotowaniu do ustawienia jelit. Użyj sterylnych, nawilżonych wymazów z bawełnianymi końcówkami, aby zidentyfikować i rozciąć cekum przez nacięcie.
    1. Unikaj używania ostrych narzędzi do obsługi jelita, ponieważ może to prowadzić do urazów. Okresowo ponownie nawilżaj zasłony i jelita, aby zapobiec uszkodzeniom spowodowanym wysychaniem.
      UWAGA: Cekum mysiego zazwyczaj znajduje się w lewym dolnym kwadrancie odwłoka, ale może być zamieszczony w dowolnym kwadrancie.
  3. Określ docelowe stanowiska węzłów chłonnych krezki do resekcji i postępuj zgodnie z poniższymi instrukcjami (tj. 3.1-3.4). Zobacz rysunek 1A,B dla punktów orientacyjnych anatomicznych i identyfikacji.

3. Sekcja i wycięcie stacji węzłów chłonnych krezki

  1. Pierwsza stacja węzłów chłonnych (drenaż okrężnego; Rysunek uzupełniający 1A,B').
    1. Ukierunkuj zewnętrzne jelito na wilgotne zasłony z cecum od dołu, okrężnicą bliższą górną i kończyną jelita kręconej po prawej stronie chirurga (lewa strona zwierzęcia; Rysunek 1A, Rysunek 2C).
    2. Zidentyfikuj łańcuch węzłów chłonnych krezki, który biegnie wzdłuż jelita grubego. Używając skośnych, cienko zakończonych kleszczy, tępo rozciń pierwszą stację węzłów chłonnych oddaloną od naczyń ileokolowych, umieszczając zamknięte kleszcze w przestrzeni między tymi strukturami i pozwalając na delikatne otwarcie kleszczy.
      1. Usuń kleszcze i powtórz ten manewr 2-3 razy lub aż zostanie utworzony odpowiedni strug do bezpiecznego wycięcia. Unikaj uszkodzenia głównych naczyń okrężnych (rysunek 3A,B).
        UWAGA: Jeśli wystąpi znaczne krwawienie, należy przerwać zabieg i humanitarnie uśpić zwierzę (zgodnie z zatwierdzonymi protokołami instytucjonalnymi).
    3. OPCJONALNIE: Aby zmniejszyć teoretyczne ryzyko ubocznych do pobliskich węzłów, wykonaj opcjonalną ligację szwów z pojedynczymi przerwanymi szwami wzdłuż łańcucha węzłów chłonnych (jeden 1mm dystalny i jeden 1mm bliski do pierwszego punktu węzła chłonnego) z użyciem czarnego nylonowego szwu monofilamentowego 9-0 oraz pinedych szczypiec do napędzania igły (Rysunek 3C,D).
    4. Delikatnie cofnij podwiązaną stację limfatyczną caudad i za pomocą nożyczek cienkopunktowych wyciąć docelową stację węzła chłonnego od cefaladu do caudad (rysunek 3E).
      UWAGA: Często myszy mają małe, ale widoczne naczynie żerowe odchodzące od tętnicy krętokrętowej do tylnej części węzła chłonnego. Krwawienie z tego naczynia można kontrolować delikatnym naciskiem za pomocą wymazu z bawełnianym końcówką, aż do osiągnięcia hemostazy.

figure-protocol-2
Rysunek3: Zdjęcia z adnotacjami oraz komentarz z krezkowej limfadenektomii (pierwsza stacja). (A) Prawidłowa orientacja jelita odsłania pierwszą stację węzła chłonnego krezki (biała strzałka). (B) Między tętnicą kościowo-kołową (bluearrow) a węzłem powstaje płaśliwość. (C) Podwiązanie szwów naczyń żerujących wchodzących do wierzchołka węzła chłonnego (niebieska strzałka) wykonuje się przy wyłączaniu naczyń ilodelicznych przez wyjście z przestrzeni między tymi strukturami (biała strzałka). (D) Wykonuje się podwiązanie szwów podstawy węzła chłonnego, ponownie zwracając uwagę i unikając dalszych gałęzi tętnicy kościowo-kościowej. (E) Węzeł jest usuwany wzdłuż wcześniej utworzonej płaszczyzny tkanki, pozostając wysoko w kierunku węzła chłonnego i pozostawiając za sobą podwiązania szwów (czarne strzałki). (F) Potwierdzono hemostazę, obserwowano dalsze gałęzie tętnicy kościowo-kołowej, aby zapewnić prawidłowy przepływ krwi, a pusta przestrzeń (zanikła strzałka), gdzie wcześniej żył węzeł, jest oznaczona jako wolna od pozostałego węzła. Paski w skali: 0,5 cm. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

  1. Druga stacja węzłów chłonnych (drenaż jelita cienkiego w środkowej części)
    1. Delikatnie rozciąć także jelito cienkie. Skieruj zewnętrzną jelita na wilgotne zasłony z cekum skierowanym w dół, okrężnicą bliższą górną, a jelito cienkie po prawej stronie chirurga (lewa strona zwierzęcia; Rysunek 1A).
    2. Zidentyfikuj łańcuch węzłów chłonnych krezki, który biegnie wzdłuż jelita grubego. Druga stacja zaczyna się na zbiegu naczyń ilealnych/jejunalnych (Rysun 1B).
      1. Używając skośnych, cienko zakończonych kleszczy, tępo rozcinaj drugi węzeł chłonny stąd od naczyń jelitow, umieszczając zamknięte kleszcze w przestrzeni między tymi strukturami i pozwalając kleszcze delikatnie się otworzyć.
      2. Usuń kleszcze i powtórz ten manewr 2-3 razy lub aż zostanie utworzony odpowiedni strug do bezpiecznego wycięcia. Unikaj uszkodzenia głównych naczyń okrężnych. Zwróć też szczególną uwagę na naczynia szyjowe i czczowate, które mogą być szkodliwe w przypadku urazu.
        UWAGA: Jeśli wystąpi znaczne krwawienie, należy przerwać zabieg i humanitarnie uśpić zwierzę.
    3. OPCJONALNIE: Aby zmniejszyć teoretyczne ryzyko ubocznych dla pobliskich węzłów, wykonaj opcjonalną ligację szwów z pojedynczymi przerwanymi szwami wzdłuż łańcucha węzłów chłonnych (jeden 1 mm dystalny i jeden 1 mm bliski do drugiego punktu węzła chłonnego) przy użyciu czarnego nylonowego szwu z monofilamentu 9-0 oraz cienko zakończonych kleszczy do wbicia igły (Ilustracja uzupełniająca 2A).
    4. Delikatnie cofnij podwiązany statek limfatyczny i za pomocą nożyczek cienkich wyciąć docelowy węzeł chłonny od cefaladu do caudad (Ilustracja uzupełniająca 2B).
      UWAGA: Często myszy mają małe, ale widoczne naczynie żerowe odchodzące od tętnicy krętokrętowej do tylnej części węzła chłonnego. Krwawienie z tego naczynia można kontrolować delikatnym naciskiem za pomocą wymazu z bawełnianym końcówką, aż do osiągnięcia hemostazy.
  2. Druga i trzecia stacja węzłów chłonnych (drenaż jelita cienkiego w środkowej połowie dystansu; Rysunek uzupełniający 1C,D'
    1. Delikatnie rozciąć całe jelito cienkie do momentu tylnego uwięzienia (więzadło Treitza). Skieruj zewnętrzną jelita na wilgotne zasłony z cekum skierowanym w dół, okrężnicą bliższą górną, a jelito cienkie po prawej stronie chirurga (lewa strona zwierzęcia; Rysunek 1A).
    2. Zidentyfikuj łańcuch węzłów chłonnych krezki, który biegnie wzdłuż jelita grubego. Druga stacja zaczyna się na zbiegu naczyń ilealnych/jejunalnych (Rysun 1B).
      1. Używając skośnych, cienko końcówkowych kleszczy, tępo rozcinaj drugi i trzeci punkt węzła chłonnego z dala od naczyń jelitow, umieszczając zamknięte kleszcze w przestrzeni między tymi strukturami i pozwalając na delikatne otwarcie kleszczy.
      2. Usuń kleszcze i powtórz ten manewr 2-3 razy lub aż zostanie utworzony odpowiedni strug do bezpiecznego wycięcia. Unikaj uszkodzenia głównych naczyń okrężnych. Zwróć też szczególną uwagę na naczynia szyjowe i czczowate, które mogą być szkodliwe w przypadku urazu.
        UWAGA: Jeśli wystąpi znaczne krwawienie, należy przerwać zabieg i humanitarnie uśpić zwierzę.
    3. OPCJONALNIE: Aby zmniejszyć teoretyczne ryzyko ubocznych do pobliskich węzłów, wykonaj opcjonalną ligację szwów z pojedynczymi przerwanymi szwami wzdłuż łańcucha węzłów chłonnych (zwykle jeden 1 mm dystalny, dwa boczne 1 mm i jeden 1 mm bliski do drugiego/trzeciego stacjonu węzła chłonnego) z użyciem czarnego szwu nylonowego z monofilamentu 9-0 oraz cienko zakończonych kleszczy do napędzania igły (Dodatkowy Rysunek 3B, C).
      1. Zwróć uwagę na drogi limfatyczne aferentne, które leżą tuż powierzchownie względem pęczków naczyniowych jeliowo-czczowych (Rysunek uzupełniający 3B). Zachowaj ostrożność, aby zabezpieczyć podwiązanie szwów głęboko do limfatycznych i powierzchowne do głównych struktur naczyniowych, ponieważ uszkodzenia pęczków naczyń jeliowych/czczych mogłyby być szkodliwe.
    4. Delikatnie cofnij stacje swiązane limfatyczne cephalad, a używając nożyczek cienkich lub bardzo cienkich punktów, usuń docelowe stacje węzłów chłonnych od caudad do cephalad.
      UWAGA: Przed rozpoczęciem działania upewnij się, że jelito cienkie pozostaje różowe i dobrze przekrwione. Incydentalne podwiązanie naczyń jelitowo-czczowych prowadzi do niedokrwiennego jelita cienkiego.
  3. Czwarta stacja węzłów chłonnych (dalszy drenaż jelita grubego; Rysunek uzupełniający 1E,F')
    1. Delikatnie rozciąć całe jelito cienkie do momentu tylnego uwięzienia (więzadło Treitza). Skieruj zewnętrzną jelita na wilgotne zasłony z cekum skierowanym w dół, okrężnicą bliższą górną, a jelito cienkie po prawej stronie chirurga (lewa strona zwierzęcia; Rysunek 1A).
    2. Zidentyfikuj łańcuch węzłów chłonnych krezki, który biegnie wzdłuż jelita grubego. Czwarta stacja znajduje się tuż przyśrodkowo od dalszego okrężnicy i bocznie od trzeciej stacji (Rysunek 1B, Rysunek 4A).
      1. Używając skośnych, cienko zakończonych kleszczy lub nożyczek o bardzo cienkim końcu, tępo rozciń czwartą stację węzłów chłonnych z dala od naczyń jelita grubego i otaczającej ją warstwy tłuszczowej, umieszczając zamknięte kłęby/nożyczki w przestrzeni między tymi strukturami i pozwalając na delikatne otwarcie kleszczy/nożyczek.
      2. Wyjmij kleszcze/nożyczki i powtórz ten manewr 2-3 razy lub aż utworzy się odpowiedni strug do bezpiecznego wycięcia. Unikaj uszkodzenia głównych naczyń okrężnych.
        UWAGA: Jeśli wystąpi znaczne krwawienie, należy przerwać zabieg i humanitarnie uśpić zwierzę.
    3. OPCJONALNIE: Aby zmniejszyć teoretyczne ryzyko ubocznych dla pobliskich węzłów, wykonaj opcjonalną ligację szwów z pojedynczymi przerwanymi szwami przy każdym rozpoznawalnym węźle chłonnym (zwykle jeden mm od węzła) przy użyciu czarnego nylonu monofilamentowego 9-0 i cienko zakończonych kleszczy do napędzania igły (Rysunek 4B - D).
    4. Delikatnie cofnij sparkowane stacje limfatyczne cephalad, a za pomocą nożyczek o bardzo cienkim końcu wyciąć docelową stację węzła chłonnego od caudad do cephalad (rysunek 4D,E).

figure-protocol-3
Rys. 4: Zdjęcia z adnotacjami i komentarze z krezkowo-naczyniowej limfadenektomii (czwarta stacja). (A) Prawidłowa orientacja jelit odsłania czwartą stację węzła chłonnego krezki (białe strzałki) przyśrodkowo od dalszego jelita grubego i bocznie od trzeciej stacji. (B,C) Po tępym przecięciu stacji węzła wykonuje się podwiązanie szwów (strzałka) przy każdym rozpoznawalnym węźle, dbając o uwzględnienie wszystkich naczyń odżywiających węzły chłonne (niebieskie strzałki). (D) Węzeł jest usuwany wzdłuż wcześniej utworzonej płaszczyzny tkanki, pozostając wysoko w kierunku węzłów chłonnych i pozostawiając podwiązania szwów (czarne strzałki). (E) Po wycięciu stacji węzła (białe strzałki) potwierdza się hemostazę, widoczne są wiązania szwów (czarne strzałki), a pusta przestrzeń (wyblakłe strzałki), gdzie węzeł wcześniej żył, jest oznaczona jako wolna od pozostałego węzła. Paski skalowe: 0,2 cm. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

4. Zakończenie krezkowej limfadenektomii

  1. Obserwuj dalsze gałęzie naczyń ilokołowych, naczyń jeliowych i/lub naczyń czczowych, aby upewnić się, że ukrwienie jest nienaruszone. Dobrze przepuszczone jelito jest jasne i różowe, z widocznymi pulsacjami.
    1. Za pomocą wymazów z bawełnianymi końcówkami należy wprowadzić zawartość jamy brzusznej do jamy otrzewnej. Przed powrotem należy uwolnić fragmenty bawełny, kłaczków, okrycia lub szwów z jelit, ponieważ może to prowadzić do dodatkowego stanu zapalnego po operacji.
    2. Upewnij się, że jelito nie jest skręcane w krezce, potwierdzając, że jelito pozostaje jasne/różowe (przekrwione), a nie matowe/szare/fioletowe (niedokrwienne).
  2. Tuż przed zamknięciem wszczep 1 mL bezpłodnej soli fizjologicznej w temperaturze ciała do jamy brzusznej, aby zapobiec nieodczuwalnej utracie lub parowaniu płynów. Zamknąć odwłok w dwóch warstwach (ściana brzucha i skóra) za pomocą szwów z monofilamentu polipropylenowego 6-0 w sposób biegający.
  3. Nałóż sterylny klej chirurgiczny na ranę.
    UWAGA: Alternatywnie do zamknięcia skóry można użyć szwów przerwanych lub klipsów ranowych.

5. Opieka pooperacyjna

  1. Przenieś zwierzę do czystej klatki, która jest częściowo na ciepłej wodzie z cyrkulacją i w połowie z niej z dostępem do jedzenia i wody improwizorycznie.
  2. Pozwól zwierzęciu dojść do siebie po znieczuleniu i uważnie obserwuj oznaki niepokoju. Jeśli zwierzęta nie wychodzą szybko do siebie po znieczuleniu przy odpowiednich zachowaniach (np. przyspieszone oddychanie, samowystarczanie, chodzenie, pielęgnacja), należy je uśpić w sposób humanitarny.
  3. Gdy wszystkie zwierzęta wyzdrowieją po znieczuleniu, należy zwrócić klatki do placówki opieki nad zwierzętami z dostępem do wody, jedzenia, ściółki i materiałów wzbogacających ad libium.
  4. Obserwuj myszy co 12 godzin co 12 godzin przez 3 dni pod kątem oznak bólu lub niepokoju (np. pochylona postawa, zmniejszona aktywność, zmniejszone zaangażowanie, zła pielęgnacja). Humanitarnie uśpiać myszy wykazujące oznaki stresu.
  5. Jeśli używasz trwałego szwu (np. polipropylena monofilamentowego 6-0), obejrzyj nacięcia w 10. dniu po operacji i usuń wszelkie pozostałe materiały do szwów.

6. Obsługa węzłów chłonnych

  1. Natychmiast wykonaj test wyporności, umieszczając wyciętą tkankę w mikrowirówce o pojemności 1,5 mL z solą fizjologiczną (PBS) o pojemności 500 μL z buforem fosforanowym (PBS). Potwierdź wycięcie węzłów chłonnych, obserwując zapadające się tkanki w PBS w porównaniu do przypadkowo usuniętej atusy, która będzie unoszić się (rysunek 5A).
    UWAGA: Stacje wyciętych węzłów chłonnych są natychmiast gotowe do dalszego przetwarzania.
  2. W przypadku technik z żywymi komórkami umieść stację wyciętych węzłów chłonnych w pożywce do hodowli komórkowej (np. DMEM, RPMI) lub PBS na lodzie. W planowanej histologii umieść wycięte stacje węzłów chłonnych w utrwalaczu (np. 10% neutralnej buforowanej formaliny, 4% paraformaldehydu).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby potwierdzić dokładność tego zabiegu, wykonano krezkowe naczynia chłonne u jedenastu dzieci w wieku 4-6 tygodni, o wieku wieku, płci i genotypie dopasowanym z szczepu szczepu C57BL/6J. Czas zabiegu wynosił od 5 do 15 minut na myszkę. Wszystkie myszy dobrze tolerowały zabieg, z 100% przeżyciem okołooperacyjnym. Usunięte próbki umieszczono w PBS na lodzie. Wszystkie próbki natychmiast zatonęły, potwierdzając niską zawartość tłuszczu. Usunięte próbki (oraz cztery oddzielne grupy tkankowe tłuszczowe) były następnie miażdż...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisano tutaj procedurę przeżywalną dla bezpiecznej i dobrze tolerowanej mysiej krezki limfadenektomii na każdym z czterech stanowisk węzłowych. Głównym ograniczeniem tego zabiegu jest pośredni związek między ekspozycją a postępem węzłów chłonnych wzdłuż łańcucha krezkowego. Pierwsza stacja węzłów chłonnych jest łatwo i łatwo odsłonięta w całości. Często widoczna jest druga stacja węzłów chłonnych, a ekspozycja na 2.do 4. stacji można poprawić poprzez rozszerzenie nacięcia skóry/ściany brzucha, cefa...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

R.A.F. jest doradcą dla GlaxoSmithKline, Plythera Inc. oraz Ventus Therapeutics. Wszyscy inni autorzy deklarują brak konkurencyjnych interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy J. Aldermanowi, B. Caduganowi, E. Hughes-Picardowi i J. Horrocksowi za pomoc administracyjną oraz C. Hughesowi za zarządzanie kolonią myszy. H.N.B. jest stypendystą Yale Surgeon Scientist Training Program, który częściowo finansował i wspierał ten projekt. Prace te były również finansowane przez Howard Hughes Medical Institute (dla R.A.F.) oraz American College of Surgeons Resident Research Award (dla H.N.B.).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Obwód anestezjologicznyDowolnyAlbo znieczulenie do zastrzyków
Cytometr przepływowy BD LSRII (lub odpowiednik)BD BiosciencesWyposażony w oprogramowanie FACS Diva (do cytometrii przepływowej) i nie do końca;
Buprenorfina XRDowolnyDla przeciwbólu
Medium do hodowli komórkowych  Dowolny(dla technik z żywymi komórkami; np. DMEM lub RPMI)
DAPIBiolegenda422801Stężenie robocze: 15 ug/mL
Etanol (70% w wodzie)DowolnyDo czyszczenia
FITC-sprzężony antymyszy CD45.2 (104)Biolegenda109806Stężenie robocze: 5 ug/mL
Kleszcze: Ukośne, cienko końcówkowe kleszczeRobozRS-5058Materiał: Dumoxel; Wzór #5, kąt 45 stopni; Rozmiar grotu 0,1 x 0,06 mm
Kleszcze: Kleszcze z drobnymi końcówkamiRobozRS-4960Materiał: Dumostar; Wzór #1; Rozmiar grotu: 0,20 x 0,12 mm
Kleszcze: Kleszcze z drobnymi końcówkamiRobozRS-4966Materiał: Dumostar, wskazówka biologiczna; Wzór #3; Rozmiar grotu: 0,08 x 0,04 mm
LidokainaDowolnyDla przeciwbólu
Metalowa igła gavageDowolnyIgła gavage o grubości 20/22, powtarzalna, ze stali nierdzewnej.
Przewozki igłyRobozRS-6410uchwyt na igły Castroviejo; Prosta
OPTIONAL:      Lampy LED mikroskopu z podwójną lub podwójną gęsią szyjkąDowolny
OPCJONALNE: barwnik Evans BlueSigmaE2129-10GOpcjonalne śledzenie limfy.
OPTIONAL: Mikroskop operacyjnyLeicaMZ9.5Stereo mikroskop operacyjny Leica Mz9.5
Sól fizjologiczna z buforem fosforanowym (PBS)Dowolny
Roztwór povidonu i joduDowolnyDo przygotowania/sterylizacji skóry
Nożyczki: Nożyczki z dodatkowymi cienkimi końcówkamiRobozRS-5605McPherson-Vannas; Krawędź tnąca 3 mm; zakrzywiony (dla węzłów stacji 3/4)
Nożyczki: Nożyczki z cienkim końcówkąRobozRS-5650SCSurecut Castroviejo scissors (dla węzłów stacji 1/2/3)
Nożyczki: Nożyczki średnieRobozRS-5676Noyes; Krawędź tnąca 13 mm; proste
Klej chirurgicznyDowolnyKlej tkankowy 3M Vetbond
Szew: 6-0 niebieski monofilament polipropyleksDowolny
Szew: 9-0 szew nylonowy z monofilamentuDowolny(opcjonalnie) Można też użyć nieco większego 8-0 Rozmiar szwów.
Utrwalacz tkankowyDowolny(dla planowanej histologii; tj. 10% neutralnej formaliny buforowanej lub 4% paraformaldehydu)
Poduszka grzewcza z cyrkulacją w ciepłej wodzieDowolny

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chopp, L., Redmond, C., O'shea, J. J., Schwartz, D. M. From thymus to tissues and tumor: A review of T cell biology. J Allergy Clin Immunol. 151 (1), 81-97 (2023).
  2. Rouiz-Argüelles, A. Autoimmunity: From bench to bedside. Anaya, J. -M. , El Rosario University Press. Colombia. (2013).
  3. Crespo, J., Sun, H., Welling, T. H., Tian, Z., Zou, W. T cell anergy, exhaustion, senescence, and stemness in the tumor microenvironment. Curr Opin Immunol. 25 (2), 214-221 (2013).
  4. Mempel, T. R., Henrickson, S. E., Von Andrian, U. H. T-cell priming by dendritic cells in lymph nodes occurs in three distinct phases. Nature. 427 (6970), 154-159 (2004).
  5. Divi, V., et al. Lymph node count from neck dissection predicts mortality in head and neck cancer. J Clin Oncol. 34 (32), 3892-3897 (2016).
  6. Chang, G. J., Rodriguez-Bigas, M. A., Skibber, J. M., Moyer, V. A. Lymph node evaluation and survival after curative resection of colon cancer: Systematic review. JNCI. 99 (6), 433-441 (2007).
  7. Simoes, P., et al. Lymph node yield in the pathological staging of resected nonmetastatic colon cancer: The more the better. Surg Oncol. 43, 101806(2022).
  8. Resio, B. J., et al. Commission on cancer standards for lymph node sampling and oncologic outcomes after lung resection. Ann Thorac Surg. 119 (2), 308-315 (2025).
  9. Connolly, K. A., et al. A reservoir of stem-like CD8 T cells in the tumor-draining lymph node preserves the ongoing antitumor immune response. Sci Immunol. 6 (64), eabg7836(2021).
  10. Saddawi-Konefka, R., et al. Lymphatic-preserving treatment sequencing with immune checkpoint inhibition unleashes cdc1-dependent antitumor immunity in HNSCC. Nat Commun. 13, 4298(2022).
  11. Saddawi-Konefka, R., Schokrpur, S., Gutkind, J. S. Let it be: Preserving tumor-draining lymph nodes in the era of immuno-oncology. Cancer Cell. 42 (6), 930-933 (2024).
  12. Houston, S. A., et al. The lymph nodes draining the small intestine and colon are anatomically separate and immunologically distinct. Mucosal Immunol. 9 (2), 468-478 (2016).
  13. Brinkmann, V., Pinschewer, D., Chiba, K., Feng, L. Fty720: A novel transplantation drug that modulates lymphocyte traffic rather than activation. Trends Pharmacol Sci. 21 (2), 49-52 (2000).
  14. Mehandru, S., Colombel, J. -F., Juarez, J., Bugni, J., Lindsay, J. O. Understanding the molecular mechanisms of anti-trafficking therapies and their clinical relevance in inflammatory bowel disease. Mucosal Immunol. 16 (6), 859-870 (2023).
  15. Mariathasan, S., et al. Absence of lymph nodes in lymphotoxin-alpha (lt alpha)-deficient mice is due to abnormal organ development, not defective lymphocyte migration. J Inflam. 45 (1), 72-78 (1995).
  16. Kwon, S., Agollah, G. D., Wu, G., Sevick-Muraca, E. M. Spatio-temporal changes of lymphatic contractility and drainage patterns following lymphadenectomy in mice. PLoS One. 9 (8), e106034(2014).
  17. Blum, K. S., Proulx, S. T., Luciani, P., Leroux, J. -C., Detmar, M. Dynamics of lymphatic regeneration and flow patterns after lymph node dissection. Breast Cancer Res Treat. 139 (1), 81-86 (2013).
  18. Shaikh, H., et al. Mesenteric lymph node transplantation in mice to study immune responses of the gastrointestinal tract. Front Immunol. 12, 689896(2021).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

immunonadz r jelitowypriming limfocyt w Tresekcja w z a ch onnegoa cuch w z w ch onnychcytometria przep ywowaligacja szwemchirurgia brzusznakom rki CD45 dodatnie

Powiązane artykuły