Przedstawiamy tutaj metodę pobrania dużej ilości krwi od świń za pomocą przeskórnej kanilowacji wewnątrzsercowej podłączonej do pompy próżniowej, jako procedurę końcową.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Pobieranie krwi dużej objętości od świń do zastosowań in vitro : zastosowanie kanulacji wewnątrzsercowej i pompy próżniowej jako procedury końcowej
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Rutynowe pobieranie krwi jest wymagane w wielu badaniach podstawowych i stosowanych. Wiele metod pobierania krwi świń jest dobrze opisanych. Należą do nich żyły uszne do pobierania małych objętości krwi oraz żyły szyjne lub żyła głowa czaszkowa do pobierania większych objętości krwi. Niektóre eksperymenty wymagają dużych ilości krwi jednego osobnego zwierzęcia jednocześnie do analizy lub wykorzystania w hodowlach pierwotnych komórek, co najlepiej można osiągnąć poprzez wykrwawienie. Krew pobrana do hodowli komórek pierwotnych musi być świeżo i starannie przetwarzana, aby zachować integralność komórek. Opisujemy metodę aseptycznego pobierania krwi świń pod planem znieczulenia chirurgicznego, z wykorzystaniem dużego cewnika wewnątrz-naczyniowego wprowadzonego przezskórnie do serca oraz pompy próżniowej, która jest wydajna, zapewnia dużą wydajność i minimalizuje lizę komórek. Technika ta jest wykonywana raz na zwierzęciu, na płaszczyźnie znieczulenia chirurgicznego, jako zabieg końcowy, zapewniający minimalne ryzyko bólu lub dyskomfortu.
Wprowadzenie
Świnie były wykorzystywane w badaniach obejmujących badania sercowo-naczyniowe, leczenie ran i toksykologię, a także badania rolnicze, immunologię i badania chorób1. Krew zebrana w badaniach może być wykorzystywana do badania chorób, farmakologii, genetyki, badań układu odpornościowego oraz odkrywania markerów. Hodowla komórkowa jest jedną z najbardziej podstawowych procedur w badaniach i pozwala badaczom badać zachowania i funkcje komórek, a także modele chorób i rozwój szczepionek2. Hodowla patogenów wywołujących choroby, takich jak wirus afrykańskiej epidemii świń, często odbywa się w ustalonym podłożu hodowlowym, w ścisłych, aseptycznych warunkach laboratoryjnych. Rozmnażanie choroby może zachodzić poprzez inwazję, rozprzestrzenianie się lub przyczepienie, co wymaga zdrowych, stabilnych komórek3. Badane patogeny mogą mieć specyficzny tropizm komórkowy, w którym mogą się rozprzestrzeniać, a posiadanie dużej ilości krwi daje większą ilość komórek do wykorzystania.
Aby uzyskać wysoką wydajność komórek pojedynczego zwierzęcia, w przypadku różnicowania komórkowego należy delikatnie pobrać dużą ilość krwi, aby zachować integralność komórek przed rozdzieleniem komórek. U świń całkowita objętość krwi wynosi 65 mL/kg 4,5. Z naszego doświadczenia z dużym pobieraniem objętości, około połowy całkowitej objętości krwi zwierzęcia można odzyskać. Dlatego u dużych dorosłych świń ważących do 600 funtów (273 kg) możliwy jest plon 6-8 L. U świń duże ilości krwi można pobrać przezskórnie z żyły głownej czaszki, żyły szyjnej zewnętrznej, żyły odpiszczelowej przez kaniulację lub serca 4,5,6. Jednak pobieranie krwi wewnątrzsercowej za pomocą kaniuly o dużej średnicy pozwala na efektywne pobranie największej ilości krwi przy minimalnym ryzyku lizy komórek. Jako procedura końcowa, musi być wykonana w planie znieczulenia chirurgicznego5. Niniejszy artykuł opisuje metodę wykorzystania pompy próżniowej do pobrania kilku litrów krwi świń za pomocą przezskórnego podejścia serca za pomocą dużootworowego cewnika dożylnego połączonego z pompą próżniową 7,8.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Badanie to zostało zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Midwest Veterinary Services Inc. Ponieważ zatwierdzoną przez IACUC główną metodą eutanazji podczas tego zabiegu jest wykrwawienie, oczekuje się, że niektóre świnie osiągną zatrzymanie akcji serca z powodu utraty krwi. W takich przypadkach wykonywana jest wtórna metoda eutanazji, taka jak obustronna torakotomia. Po pobraniu wymaganej objętości krwi, jeśli serce jest wyczuwalne, do styletu podłącza się strzykawkę z roztworem eutanazyjnym i podaje się ją wewnątrzsercowo jako podstawową metodę eutanazji, a następnie następuje wtórna metoda fizyczna. Świnie są utrzymywane zgodnie z Przewodnikiem dotyczącym opieki i wykorzystania zwierząt rolnych w badaniach i nauczaniu, Przewodnikiem dotyczącym opieki i wykorzystania zwierząt laboratoryjnych oraz Ustawą o dobrostanie zwierząt, w zależności od stosowności.
1. Przygotowanie materiałów i zwierząt (Tabela materiałów i rysunek 1A-C)
- Złóż rurkę ze stalowymi słomkami i podłącz koniec węża do rurki bąbelkowej.
- Przymocuj rurkę do butelki rolkowej za pomocą gumowego korka z dwoma nierównymi metalowymi słomkami i szklaną butelką.
UWAGA: Szkło zapobiega zapadaniu się pojemnika powstałego przez pompę próżniową, ale można użyć dowolnego materiału, który nie zapada się pod ciśnieniem. - Aseptycznie wprowadzić 10 ml heparyny sodu (1 000 USP/mL) przez rurkę ssącą i styl cewnika, aby zapobiec krzepaniu. Aseptycznie dodaj 50 mL heparyny sodu (1 000 USP/mL) do każdej butelki wałkowej, aby osiągnąć końcowe stężenie 50 IU/mL w każdym litrze krwi i zapobiec krzepnięciu krwi podczas pobierania. Upewnij się, że pompa próżniowa jest ustawiona na pobór nie większy niż 7 funtów, aby zapobiec uszkodzeniu ogniw.
2. Znieczulenie i pozycjonowanie zwierząt
- Waż zwierzę nie dłużej niż 24 godziny przed zabiegiem, aby obliczyć wymaganą dawkę leków znieczulających w połączeniu z dodatkiem znieczulającym.
- Wstrzyknij Telazol (3,0-5,0 mg/kg), ketaminę (8-12 mg/kg) oraz ksylazynę (4,0-6,0 mg/kg) domięśniowo do szyi lub innego dużego mięśnia brzucha (np. mięśni epoxialnych), używając zestawu przedłużania o szerokości 30 cali i igły o wymiarach 18 g x 1,5", aby wywołać głęboką anestezję.
UWAGA: U dużych świń maksymalna zalecana objętość iniekcji domięśniowej wynosi 10 mL, więc zmiana miejsca po każdym 10 ml podania może być konieczna9. Chociaż wybraliśmy ten koktajl, procedura ta może być przeprowadzona w dowolnym protokole znieczulenia zatwierdzonym przez IACUC, który prowadzi do operacji znieczulenia. - Gdy zwierzę zostanie potwierdzone w planie znieczulenia chirurgicznego (~5-8 min), nie wykazując odruchu palpebralnego, luźnego tonu szczęki ani reakcji na bodźce bólowe, umieść świnkę na stole podnoszącym, podłodze lub innej płaskiej powierzchni, w pozycji leżącej po prawej stronie.
- Przypnij włosy na tułowiu umieszczonym nad sercem, jeśli to konieczne, w pobliżu czwartej i piątej przestrzeni międzyżebrowej, dokładnie do końca łokcia.
- Jeśli jest to możliwe, użyj USG (Rysunek 2A) do identyfikacji lewej komory. Jeśli nie jest dostępna, lewa komora znajduje się najbliżej czwartej lub piątej przestrzeni międzyżebrowej od punktu maksymalnego impulsu8.
- Aseptycznie szoruj ten obszar gąbkami gazy o wymiarach 4 cale x 4 cale, namoczonymi w 2% peelingu chlorheksydynowym oraz gąbkami gazy o wymiarach 4 cale na 4 cale namoczonymi w alkoholu izopropylowym 70%. Przygotuj skórę, szorując ją w sposób okrężny, zaczynając od miejsca wstrzyknięcia i obracając na zewnątrz, co najmniej 3 razy, naprzemiennie stosując dwa środki dezynfekujące.
3. Pobieranie krwi wewnątrzsercowej
- Sprawdź, czy zwierzę pozostawało w planie znieczulenia chirurgicznego poprzez sprawdzenie odruchu palpebralnego, tonu szczęki i refleksu pedałowego.
UWAGA: Sprawdzaj głębokość znieczulenia oraz tętno i częstość oddechu podczas całego zabiegu, aby upewnić się, że zwierzę pozostaje na planie znieczulenia chirurgicznego. - Wyjmij stylet z cewnika dożylnego. Umieść stylet nad lewą komorą i przesuń go prostopadle do skóry, aby wprowadzić stylet do lewej komory (Rysunek 2B). Gdy krew zacznie pulsować z styletu, podłącz go do końca węża rurki bąbelkowej, które jest przymocowane do butelki rolkowej, a następnie włącz pompę próżniową (Rysunek 1A i Rysunek 2C).
- Potwierdź, że krew płynie stałym strumieniem. Gdy krew jest wciągana do butelki wałkowej, delikatnie mieszaj butelkę, aby umożliwić mieszanie krwi z antykoagulantem i zapobieganie powstawaniu skrzepów.
- Po zebraniu 1 L krwi użyj hemostatów, aby zacisnąć rurkę bąbelkową w pobliżu butelki z wałkami. Odłącz gumowy korek i przyłóż go do następnej butelki z rolkami. Usuń hemostat i pozwól krwi swobodnie płynąć, delikatnie mieszając butelkę wałkową.
- Kontynuuj ten proces, aż zostanie pobrana potrzebna krew. Po zakończeniu zaciskaj rurkę, aby zapobiec nadmiernemu rozlewowi krwi i wyłącz pompę.
- Usuń złącze rurki z stylu cewnika i przymocuj strzykawkę sodowo-pentobarbitalową do styletu. Naciągnij strzykawkę, aby upewnić się, że pojawi się błysk krwi, a następnie wstrzyknij roztwór eutanazji. Potwierdź śmierć na podstawie braku bicia serca, oddychania, napięcia mięśniowego i refleksu. Po potwierdzeniu śmierci wyjmij igłę z serca i umieść ją w pojemniku na ostre przedmioty.
- Utylizuj rurki z bąbelkami w pojemniku na odpady biologiczne. Usuń brudną krew z pozostałych elementów ze stali nierdzewnej (np. stalowych słomek, złączek na końcach węży) za pomocą szczotki rurkowej, a następnie autoklawuj do późniejszego użytku.
- Włóż wyczyszczone gumowe korki, słomki, złącza węży i hemostaty do nowej sakiewki na autoklaw i wysterylizuj przed kolejnym użyciem.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Przed pobraniem krwi lochy były wstępnie badane pod kątem Mycoplasma hyopneumoniae, adenowirusa wieprzowego, parwowirusa świńskiego, koronawirusów świń (zakaźne zapalenie żołądka i jelit, epidemii biegunki świńskiej), świńskiego hemoaglutynującego zapalenia mózgu i mięśnia oddechowego, zespołu rozrodczego i oddechowego świń, grypy grupy A, circowirusa 1 i 2 oraz wirusa Seneca A. Powtarzaliśmy tę procedurę wielokrotnie u samic mieszańców Yorkshire ważących 300-600 funtów. Pobieranie krwi dawało od 3 L u mniejszyc...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Procedura opisuje zespół cewnik-stylet do pompy próżniowej do pobrania jednorazowej dużej objętości krwi z serca loch. Ze względu na ryzyko bólu i niepokoju, zabieg ten należy wykonywać wyłącznie u zwierząt znajdujących się w planie znieczulenia chirurgicznego. Nieruchomość spowodowana znieczuleniem pozwala początkującym szybko nauczyć się tej procedury. Do pobierania krwi od zwierząt można użyć wielu żył. Najczęstsze i najbardziej dostępne drogi to żyły szyjne, żyła szyjna i żyła ucha, przy czym kolejne
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają żadnych konfliktów interesów do ujawnienia.
Podziękowania
Szczególnie dziękujemy Plum Island Animal Disease Center Animal Resource Branch, zarówno Animal Health Techs, jak i Animal Care za doskonałą pomoc techniczną. Finansowanie projektu w organizacji badawczej na zlecenie zapewniła USDA, ARS, Animal Resources Unit przy NBAF.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Pompa przeponowa 1/8 HP Lab Model Pumpa Diaphragm & ndash; 115 vac, 60 max psi | Centrum Zaopatrzenia bazy | 80058845 | |
| 10 G x 6 w cewniku z igłą i bez igły; | Covetrus Północnoamerykańskie Materiały Weterynaryjne | 024616 | |
| 50 mL strzykawka, luer lock & nbsp; | Fisher Scientific | 13-689-8 | |
| Aquasonic 100 żel ultradźwiękowy niebieski & nbsp; | Midwest Veterinary Supply | 001.02109.2 | |
| Rurka bąbelkowa Argyl, nieprzewodząca (¼ ") | Fisher Scientific | NC2282605 (katalog dostawców # 8888280412) | |
| Chlorheksydyna Q Peeling 2% | Midwest Veterinary Supply | 562.30804.3 | |
| Jednorazowe butelki rolkowe Corning. | Fisher Scientific | 06-413 | |
| Corning PYREX o wąskim otworze z ciężkiego szkła Erlenmeyer lub podobnego tworzącego ssanie | Fisher Scientific | 10-040F | |
| Nylonowa szczoteczka do probówek Eisco | Fisher Scientific | S13962 | |
| Dwuotworowe gumowe korki Fisherbrand | Fisher Scientific | Zależy od rozmiaru | |
| Ketamina (10 mg/mL) i nbsp; | Midwest Veterinary Supply | 275.22100.3 | |
| Końcówka węża MLL do 6 mm (stal nierdzewna) | Cadence Science | 6547IND | |
| MLL do końca węża 8mm (stal nierdzewna) | Cadence Science | 6549IND | |
| MVet gąbka z gazy nietkana 4 x 4 sklejka | Midwest Veterinary Supply | 000.30156.2 | |
| MVet alkohol izopropylowy 70% | Midwest Veterinary Supply | 000.50054.3 | |
| MVet Kelly hemostatyczne kleszcze proste 5,5" | Midwest Veterinary Supply | 000.36800.2 | |
| Heparyna sodu (1000 U/mL) & nbsp; | Midwest Veterinary Supply | 191.46701.3 | |
| Pentobarbital sodu (390 mg/mL) & nbsp; | Midwest Veterinary Supply | 749.20000.3 | |
| Słomki ze stali nierdzewnej | Hobby Lobby | 1893635 | |
| Telazol (100 mg/mL) i nie do końca; | Midwest Veterinary Supply | 275.40000.3 | |
| Ksylazyna (100 mg/mL) i ksylazyna; | Midwest Veterinary Supply | 310.01150.3 |
Bibliografia
- Almond, G. W. Research applications using pigs. Vet Clin North Am Food Anim Pract. 12 (3), 707-716 (1996).
- Sageritz, C. P., Vallier, L. Cell culture. Growing cells as model systems in vitro. Basic Science Methods for Clinical Researchers. Jalali, M., Saldanha, F. Y. L., Jalali, M. , 151-172 (2017).
- Mothes, W., Sherer, N. M., Jin, J., Zhong, P. Virus cell-to-cell transmission. Virol. J. 84 (17), 8360-8368 (2010).
- Stærk, K., Langhorn, L., Palarasah, Y., Andersen, T. E. A method for collecting high numbers of blood samples in standard vacuum tubes from non-heparinized pigs. Lab Anim. 57 (3), 336-340 (2023).
- Diehl, K. H., et al. A good practice guide to the administration of substances and removal of blood, including routes and volumes. J Toxicol. 21 (1), 15-23 (2001).
- Schwartz, W. L., Smallwood, J. E. Collection of blood from swine. N Z Vet J. 25 (9), 237-238 (1977).
- Zou, W., et al. Repeated blood collection from tail vein of non-anesthetized rats with a vacuum blood collection system. J Vis Exp. (130), e55852(2017).
- Calvert, G. D., Scott, P. J., Sharpe, D. N. Percutaneous cardiac puncture in domestic pigs. Aust Vet J. 53 (7), 337-339 (1977).
- Costea, R., Ioana, E., Pavel, E. Pig sedation and anesthesia for medical research. J Animals. 13 (24), 3807(2023).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr Protoc Immunol. Appendix 3: Appendix 3B. , (2001).
- Veterinary ergonomic guidelines. , American Veterinary Medical Association. https://www.avma.org/resources-tools/avma-policies/veterinary-ergonomic-guidelines (2025).
- Velazquez-Salinas, L., et al. Confirming the absence of parental African swine fever virus as a potential contaminant of recombinant live attenuated ASF vaccines. Biologicals. 83, 101685(2023).
- Soleimani, S. A review of the establishment of the seed lot system in the production of biological products and its importance. Arch Razi Inst. 77 (6), 2023-2035 (2022).
- Anil, M. H., Whittington, P. E., McKinstry, J. L. The effect of the sticking method on the welfare of slaughter pigs. Meat Sci. 55 (3), 315-319 (2000).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
