Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

3D Flipwell Engineering do opracowywania asynchronicznych systemów dla terapii toksykologicznych i immunomodulacyjnych w komórkach bakteryjnych, jelitowych i odpornościowych

649 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/68701

⸱

17 października 2025

 , 
1Division of Pediatric Rheumatology, Department of Pediatrics, University of Michigan, Ann Arbor, 2MetroHealth Medical Center, Case Western Reserve University School of Medicine, Case Comprehensive Cancer Center

W tym artykule

Podsumowanie

Ten artykuł przedstawia szczegółowy protokół z kluczowymi krokami prowadzącymi inżynierię i wykorzystanie 3D Flipwell. Opisujemy i pokazujemy, jak składać stosy wkładek do współhodowli oraz wykorzystywać je do współhodowli warstw bakterii jelitowych, nabłonka jelitowego i makrofagów do modelowania środowiska śluzowego jelit.

Streszczenie

Aby zbadać rolę sekretomu bakteryjnego w polaryzacji komórek odpornościowych i homeostazie błony śluzowej jelit, opracowaliśmy trójwymiarowy model kokultury wykorzystujący komercyjnie dostępne wkładki w formacie jeden za drugim. Nazwaliśmy ten system 3D Flipwellami i z powodzeniem współhodowaliśmy bakterie, komórki jelita nabłonkowego i układ odpornościowy w warstwach warstwowych, aby odtworzyć mikrośrodowisko śluzowe jelita. Ten system współhodowli umożliwia zasiewanie komórek nabłonka jelita grubego po jednej stronie błony oraz niezróżnicowanych, nieprzylegających monocytów po drugiej, co umożliwia synchroniczny postęp polaryzacji nabłonka jelita grubego, tworzenia śluzu oraz różnicowania i polaryzacji monocyt-makrofag w ramach jednej kokultury bez konieczności odłączania i ponownego nakładania makrofagów z predyferencjami. System ten jest łatwy do wykonania i wymaga jedynie kilku łatwo dostępnych materiałów i narzędzi. Przetestowaliśmy jej skuteczność, analizując odpowiedzi składników współhodowli na sepiapterinę (SEP), endogenny prekursor BH4 (tetrahydrobiopterina) – kofaktora syntazy tlenkowej azotu (NOS). Wykazaliśmy, że leczenie SEP 3D Flipwellem indukowało tworzenie biofilmu przez bakterie jelitowe, produkcję śluzu przez nabłonek jelita grubego oraz proimmunogenną polaryzację makrofagów. Wskazuje to, że SEP wywołuje aktywację mechanizmu obronnego błony śluzowej poprzez przesłuchiwanie różnych komponentów komórkowych. Potrzebne są dalsze eksperymenty, aby zbadać rolę komunikacji śluzowej prowadzącej do przeprogramowania komórek odpornościowych oraz ocenić przydatność tego systemu współhodowli w poszukiwaniu nowych terapii immunomodulacyjnych.

Wprowadzenie

Wzajemne przesłuchiwanie komórek układu odpornościowego między mikrobiomem a jelitowym znacząco wpływa na skuteczność różnych terapii chorób. Takie przesłuchiwanie jest wyraźnie modyfikowane przez bodźce zewnętrzne, w tym między innymi przez zaburzenia metaboliczne gospodarza, zmiany diety, objawy choroby oraz leczenie farmakologiczne. Te zmiany mogą prowadzić do zaburzenia równowagi w składzie mikroflory, co nazywa się dysbiozą 1,2,3.

Aby lepiej zrozumieć interakcje między mikroorganizmami a komórkami odpornościowymi gospodarza w jelitach, różne grupy opracowały rozbudowane systemy współhodowli w próbie odtworzenia środowiska śluzowego jelit. Od systemu jelit-na-chip opracowanego przez Kima i in.4 po bardziej złożony zespół z wykorzystaniem specjalistycznego substratu chłonącego5, te systemy kokultury nie są łatwe do zbudowania i nie są w stanie zatrzymać pełnego spektrum wydzielanych składników ze względu na ich absorpcję przez substrat ko-kultury. Noel i in. opracowali zatem alternatywny system współhodowli do modelowania błony śluzowej jelita, który jest stosunkowo łatwiejszy do wygenerowania6. Nowy system wykorzystuje pojedynczą inserwację hodowlową z komórkami nabłonkowymi jelita grubego zasianymi po jednej stronie błony i predyferencowanymi makrofagami po drugiej stronie6. Jednak zasiewanie predyferencowanych makrofagów wymaga ich prediferencjacji gdzie indziej oraz dysocjacji i ponownego pokrycia w kokulturę, co może wpłynąć na integralność i żywotność ich komórek.

Wprowadzając ulepszenia do tych wcześniejszych systemów, opracowaliśmy nowatorski, trójwymiarowy (3D) wielowarstwowy system współkultury, który nazwaliśmy systemem 3D Flipwell 7,8. System ten składa się z wkładek hodowli komórkowych ustawionych jeden za drugim, co umożliwia synchroniczny przebieg polaryzacji nabłonka jelita grubego, tworzenia śluzu, różnicowania makrofagów oraz polaryzacji w ramach jednej kokultury. System ten pozwala nam badać zmiany w środowisku śluzowym jelit oraz interakcje między bakteriami jelitowymi, komórkami nabłonka i komórkami odpornościowymi. Dodatkowo system ten może być wykorzystywany do badania wpływu bodźców zewnętrznych, w tym metabolitów bakteryjnych, toksyn, składników odżywczych i leków, na błonę śluzową jelit oraz resztę ciała 7,8.

Wykorzystując nowy system wkładek do kokultury, badaliśmy odpowiedzi różnych składników komórkowych na sepiapterynę (SEP), endogenny prekursor BH4 (tetrahydrobiopterina) – kofaktora syntazy tlenku azotu (NOS). Wcześniej wykazaliśmy, że SEP wywiera działanie proimmunogenne na mikrośrodowisko guza piersi poprzez przeprogramowanie makrofagów związanych z nowotworami do proimmunogennego typu 9,10,11,12. Wykazaliśmy, że SEP indukuje synchroniczne zdarzenia tworzenia biofilmu przez bakterie jelitowe, produkcję śluzu przez nabłonek jelita grubego oraz proimmunogenną polaryzację makrofagów w kokulturach, co wskazuje na aktywację mechanizmu obronnego błony śluzowej7. Te odkrycia potwierdzają przydatność tego nowego systemu współkultury w modelowaniu mikrośrodowiska śluzowego jelita7.

Głównym celem tego protokołu jest dostarczenie krok po kroku instrukcji dotyczących budowy nowej współkultury bakterii jelitowych, nabłonka jelitowego, śluzu i komórek odpornościowych, aby modelować środowisko śluzowe jelit. Pokazujemy również, jak możemy wizualizować przesłuch współhodowanych komórek pod wpływem bodźca zewnętrznego, na przykład podczas leczenia SEP. Dalsze badania wykorzystujące ten system kokultury są potrzebne, aby określić wydzielane składniki komórkowe ułatwiające interakcje między różnymi komórkami w kokulturze, a także przetestować przydatność tego modelu kokultury do wysokoprzepustowego przesiewowego badań nowych terapii. Ponadto, aby osiągnąć kondycję fizjologiczną środowiska śluzowego jelit, ten system kokultury wymagałby dalszych modyfikacji. Na przykład, aby współhodować tlenowe komórki ssaków z bakteriami beztlenowymi, bakterie te musiałyby być osobno hodowane w ośrodkach beztlenowych usuwających tlen lub nałożone na ciekłą parafinę uniemożliwiającą przedostawanie się tlenu, jak opisano w innych miejscach. Tak zaawansowana użyteczność i zastosowanie tego systemu współkultury wymagałyby dalszych badań.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. 3D Inżynieria Flipwella

  1. Wszystkie prace powinny być wykonywane wewnątrz szafki do hodowli komórkowej. Wszystkie materiały umieść w szafce.
  2. Otwórz pokrywkę na szalkę Petriego i odłóż ją na bok. Otwórz ostrze skalpela z ochronnej obudowy i połóż je na krawędzi dna szalki Petriego. Zadbaj o sterylność.
    UWAGA: Wymagana jest ostrożna obsługa ostrza skalpela. Używaj rękawiczek odpornych na cięcia, wzmocnionych włóknami, aby chronić ręce, jeśli zajdzie taka potrzeba.
  3. Otwórz sterylne opakowanie ochronne w 12-dołkowej wkładce komercyjnej. Zadbaj o sterylność. Weź zestaw sterylnych pęset. Delikatnie chwyć wkładkę i wyjmij ją z opakowania.
  4. Trzymaj wkładkę tak, aby jej dno było skierowane do góry. Drugą ręką weź sterylne ostrze skalpela i przynieś je do wkładu.
  5. Używając ruchu w kształcie litery C, przebij membranę na krawędzi i delikatnie przesuwaj ostrze skalpela wokół dna wkładki, pozostając blisko plastikowej ścianki.
  6. Wytnij membranę PET i użyj drugiego zestawu pęset, aby ją usunąć. Usuń błonę.
  7. Użyj ostrza skalpela, aby zeskrobać białe wióry błonowe, aby wyczyścić krawędź i krawędź wkładki. Ostrożnie włóż nowo przygotowaną wkładkę z powrotem do oryginalnej, sterylnej paczki.
  8. Następnie weź silikonową tubkę klejącą i odetnij końcówkę dyszy skalpelem, aby zrobić otwór. Ten otwór powinien mieć 3 mm szerokości.
  9. Sprawdź rozmiar kulki, wyciskając klej z ręcznika papierowego. Koralik powinien mieć grubość 2-3 mm. Reguluj dyszę, jeśli kulka jest mniejsza niż 2 mm i trudno ją wycisnąć z rurki.
    1. Innym sposobem na nałożenie i rozprowadzenie kulki kleju jest użycie końcówki pipety o pojemności 200 μL z odciętą końcówką. Odetnij 3-4 mm nożyczkami i użyj szpatułki, aby rozprowadzić klej wokół krawędzi wkładki.
  10. Zdejmij osłonę ochronną z drugiej wkładki i odłóż na bok. Weź sterylne kleszcze, wyjmij drugą wkładkę z opakowania z membraną skierowaną do góry.
  11. Delikatnie rozłóż cienką krołkę silikonu o średnicy 2-3 mm wokół dna wkładki, uważając, by nie dotykać membrany.
  12. Weź drugi zestaw sterylnych kleszczy i ostrożnie wyjmij pierwszą wkładkę (bez membrany) z jej ochronnego opakowania.
  13. Przyłóż dwie wstawki od dołu do dołu, tak aby dolne obręcze się wyrównywały. Nadmiar kleju może zostać wypchnięty z połączenia. Zostaw klej do wyschnięcia. Można ją odciąć po całkowitym wyschnięciu kleju (24-72 godziny). To jest opcjonalne.
    UWAGA: Ostateczny stos wkładek Flipwell Co-culture (FCI) powinien mieć tylko jedną membranę PET pośrodku. Najlepiej jest umieścić uchwyty w kształcie litery L w wstawkach komercyjnych tak, aby były oddalone o 180° od siebie (na godzinach 3 i 6). Stosuj się do zaleceń producenta kleju silikonowego co do czasu schnięcia, który może wynosić 24-72 godzin w zależności od marki. W przypadku większości klejów na bazie silikonu preferowany jest czas schnięcia wynoszący 72 godziny. Klej można również suszyć tylko przez 24 godziny po sterylizacji UV.
  14. Gdy stos FCI jest przyklejony, umieść go w oryginalnej sterylnej paczce do wyschnięcia lub w głębokiej szalce Petriego. Użyj pokrywki z określonych szalek Petriego, aby przykryć zespół stosu.
  15. Aby wysterylizować zestawy stosów, otwórz pokrywkę z szalki Petriego. Użyj sterylnych kleszczy, aby położyć stos FCI na krawędzi wyznaczonej głębokiej krawędzi szalki Petriego.
  16. Zamknij szklaną osłonę szafki BSC. Włącz światło UV. Odsuń się od szafki dla bezpieczeństwa i wysterylizuj każdą stronę membrany 30 minut do 1 godziny. Wyłącz światło UV po zakończeniu każdego cyklu sterylizacji.
  17. Połóż pokrywkę z miseczki Petriego (zgodnie z zaleceniami) nad miską Petriego wraz ze stosami wkładek i odłóż na bok.

2. Badanie wycieku przed nałożeniem powłoki kolagenowej

  1. Zdejmij pokrywkę z szalki Petriego. Dodaj 500 μL sterylnej wody PBS lub sterylnej wody dejonizowanej.
    UWAGA: Do pomocy wizualnej użyto DMEM, aby ułatwić wizualizację integralności stosów FCI.
  2. Przykryj szalkę Petriego. Zostaw to na noc. Sprawdź integralność FCI rano. Usuń FCI, jeśli wykryje się wyciek. Rób nowe stosy wkładek w razie potrzeby.
  3. Aspiruj ciecz (PBS lub wodę) używaną do testowania. Przykryj szalkę Petriego pokrywką.
  4. Pozwól stosom wyschnąć (1-2 godziny) wewnątrz BSC. Przechowuj FCI w BSC aż do momentu użycia, lub pokryj je kolagenem, aby zasiewać komórki przylegające.

3. Powłoka kolagenowa błony Flipwella

  1. Przygotuj zapas roztworu kolagenowego, rozcieńczając rozwód podawany w ilości 3 mg/mL do rozcieńczenia 1:30 przy 100 μg/mL. Dodaj 33 μL komercyjnie produkowanego roztworu kolagenowego do 1 mL sterylnej wody dejonizowanej w rurce mikrowirówki. Mieszaj przez wirowanie.
    UWAGA: Dla większej objętości należy powiększać skalę i używać 15 mL stożkowej rurki, w zależności od liczby wkładek, które mają być pokryte po obu stronach membrany. Za każdym razem rób to świeże. Nie używaj ponownie gotowej taśmy.
  2. Otwórz pokrywkę od szalki Petriego. Niech Flipwell zwisa na krawędzi szalki Petriego. Ostrożnie dodaj 200 μL roztworu kolagenowego na jedną stronę stosu wkładu.
  3. Niech odczeka 1 godzinę. Aspiruj roztwór kolagenowy. Dodaj 200 μL sterylnego PBS. Wdysać PBS.
  4. Przykryj szalkę Petriego pokrywką i pozwól membranie wyschnąć przez 60 minut wewnątrz szafki. Gdy błona wyschnie, weź sterylne szczypce/pęsetę, odłóż Flipwell na przeciwną stronę i pozwól jej zwisać na krawędzi szalki Petriego.
  5. Dodaj 200 μL roztworu kolagenowego na niepokrytą (obecnie górną) stronę błony. Niech odczeka 1 godzinę.
  6. Aspiruj roztwór kolagenowy. Dodaj 200 μL sterylnego PBS. Wdysać PBS. Przykryj szalkę Petriego pokrywką i pozwól membranie wyschnąć przez 60 minut wewnątrz szafki. Pozwól stosowi FCI wyschnąć przez noc lub siej tego samego dnia.
    UWAGA: Integralność powłoki kolagenowej nie była badana w warunkach długotrwałego przechowywania. Po wstępnym przygotowaniu Flipwellów należy je użyć w ciągu 24 godzin.

4. Konstrukcja wkładów bakteryjnych do hodowli bakteryjnych

  1. Umieść dwa zestawy sterylnych kleszczy i wkładki z 24 dołkami wewnątrz BSC. Ostrożnie otwórz wkładki i połóż je w sterylnym opakowaniu.
  2. Sterylną pęsetą wyjmij wkładkę z jej sterylnego opakowania. Drugim zestawem pęset/kleszczy złam małe plastikowe nóżki na dole wkładki.
  3. Sprawdź wkład 24-dołkowy, umieszczając go w jednym ze sterylnych stosów FCI lub oryginalnych wkładkach 12-dołkowych.
  4. Jeśli wkładka nie wsuwa się do wgłębienia, użyj pęsety ponownie, aby odłamać więcej plastiku z krawędzi, gdzie ranta styka się z nóżkami.
  5. Sprawdź ponownie dopasowanie, aż wkład z 24 dołkami będzie mógł wślizgnąć się do wnętrka z 12 dołkami. Umieść wkładkę albo w sterylnym opakowaniu, albo w sterylnej misce Petriego.
  6. Wkładka sterylizuje UV lub używa etanolu (opcjonalnie). Przykryj opakowanie z powrotem lub przykryj pokrywką od szalki Petriego, aż będzie gotowy do użycia.

5. Konstrukcja igieł

  1. Przynieś narzędzia i wszystkie materiały w BSC. Trzymaj igłę ostrożnie szczypcami nosowymi.
  2. Zmierz położenie każdego zgięcia na drutze linijką. Drugim zestawem szczypiec na nos chwyć igłę w wybranym miejscu i zgiąć ją.
  3. Stwórz drugi zakręt. Aby skręcić drut, chwyć ją szczypcami u podstawy oraz przy zgięciu w kształcie litery U i skręć w przeciwnym kierunku, aby uzyskać skręt o długości 4-5 mm. Ten krok jest kluczowy, aby łatwo wprowadzić igłę do Flipwella do usuwania pęcherzyków powietrza.
  4. Przymocuj igłę do sterylnej strzykawki 3 lub 5 mm. Sterylizuj igłę i podstawę strzykawki w 20 mL etanolu 70%-95% w stożkowej probówce o pojemności 50 mL.
  5. Przeciągnij etanol przez igłę i strzykawkę, aby upewnić się, że igła i dno strzykawki są sterylizowane.
  6. Wyjmij strzykawkę i igłę z stożkowej rurki za pomocą etanolu i pozwól wyschnąć na powietrzu, opierając się na szalce Petriego. Przepłucz igłę powietrzem, żeby wyschła i zostaw do wyschnięcia przez kilka minut.

6. Siewnictwo linii komórkowych nabłonka okrężnego Caco-2:HT29-MTX-E12

  1. Rozpocznij hodowlę linii komórkowych Caco-2 i HT29-MTX na 2-3 tygodnie przed eksperymentem w oddzielnych naczyniach powlekanych TC o średnicy 100 mm w ich odpowiednich ośrodkach wzrostu.
    1. Dla mediów HT-29-MTX należy użyć 440 mL DMEM z medium o wysokiej glukozie (4,5 g/L) i 1% (v:v) Glutamax z 50 mL 10% (v:v) inaktywowanego termicznie FBS, 5 mL 1% (v:v) Pen Strep oraz 5 mL HEPES 10 mM końcowego stężenia.
    2. Dla podłoża Caco-2 użyj 440 mL DMEM z medium Glutamax o wysokiej zawartości glukozy (4,5 g/L) i 1% (v:v) z 50 mL 10% (v:v) inaktywowanego termicznie FBS, 5 mL 1% (v:v) Pen Strep oraz 5 mL nieistotnych aminokwasów.
      UWAGA: Określ gęstość nasiewania linii komórkowej Caco-2 za pomocą 12-dołkowych dołków pokrytych kulturą tkankową. Obliczaj liczbę dni do 100% konfluencji w zależności od początkowej gęstości siewu. Podajemy gęstość siewu jako wytyczną; jednak to będzie się różnić w zależności od sformułowania mediów wzrostowych, dostawcy i FBS. Ten etap jest kluczowy, aby zapewnić monowarstwę dla nabłonka jelitowego Flipwella po powleknięciu komórek THP-1 i przeprowadzeniu zabiegów bakterio-SEP.
  2. Aby przepuścić komórki Caco-2 i HT-29, należy aspirować pożywkę hodowlową. Przeprać z 10 mL PBS.
  3. Trypsynizuj komórki, dodając 2 mL 0,25% trypsyny-EDTA. Inkubuj 5-10 minut w 37 °C z 5%CO2.
  4. Dodaj 7 mL medium wzrostowego odpowiedniego dla komórki do płyt. Przenieś komórki do oddzielenia sterylnych stożkowych rurek o pojemności 15 mL.
  5. Granulat przez wirowanie przez 5 minut w temperaturze 500 x g w temperaturze pokojowej. Aspiruj supernatant bez zakłócania osadu komórkowego.
  6. Ponownie zawiesij granulkę w 1 mL podgrzanego medium HT-29 na bazie DMEM. Licz komórki za pomocą hemacytometru lub licznika komórek.
  7. Połącz dwa typy ogniw Caco-2:HT-29 z proporcją 9:1 w nowej stożkowej rurce o pojemności 15 mL lub 50 mL, w zależności od liczby potrzebnych ogniw do pożądanej liczby Flipwellów.
  8. Do poniższych kroków użyj Flipwellów z powlekiem z kolagenem. Zawieś stosy FCI pokryte kolagenem na krawędzi głębokiej szalki Petriego.
  9. Nasiać 500 μL 7,5 x 104 komórek na cm2 (2,6 x 105 komórek /12 wkładek do dołków) na stronę wierzchołkową Flipwella. Obliczaj liczbę komórek początkowych na podstawie liczby stosów stosów. Obejmuje to oba typy komórek w stosunku 9:1.
  10. Przykryj zespoły pokrywką z szalki Petriego. Inkubuj w temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez noc, aż komórki się przyłączą. Komórki zaczynają produkować śluz około 7-10 dni w hodowli. Zmieniaj media co drugi dzień, by utrzymać kulturę.
    UWAGA: Należy obliczyć z wyprzedzeniem liczbę dni w hodowli z zabiegami. Gęstość przewrótów i początkowego zasiewania będą zależeć od tego czasu trwania.

7. Odwrócenie 3D Flipwella w przygotowaniu do zasiewania komórek THP-1

  1. Gdy komórki Caco-2:HT-29 przyczepią się i zaczną się rozmnażać (dokładne zbieganie należy oszacować na podstawie użytego podłoża/FBS i czasu trwania hodowli), ale nie osiągną 100% konfluencji, przełącz Flipwella, aby zasiać komórki THP-1 po drugiej stronie błony.
    UWAGA: Komórki THP-1 muszą być do tego czasu rozwiększone w osobnej hodowli, a dokładne liczby potrzebnych komórek zostaną oszacowane na podstawie liczby stosów FCI.
  2. Otwórz pokrywkę szalki Petriego i zasysaj podłoże DMEM z wierzchołkowej (jelita nabłonkowej) strony stosu FCI.
  3. Używając sterylnych kleszczy, ostrożnie podnieś Flipwella za haczyk i obróć go o 180°. Drugim zestawem sterylnych kleszczy chwyć stos FCI za drugi haczyk, który teraz jest skierowany do góry.
  4. Opuść zespół z powrotem do szalki Petriego i zawieś hak nad jej obręczą. Jeśli nie jest jeszcze gotowy do zasiewania komórek THP-1, dodaj wystarczająco dużo podłoża do głębokiej szalki Petriego, aby podnieść poziom medium i dorównać mu do samej góry błony.
    UWAGA: Flipwell powinien być stabilny w tej pozycji, a zasiew ogniwami THP-1 oraz dodawaniem podłoża należy rozważyć od razu. Te kroki są wykonywane szybko. Ogniwa THP-1 muszą być policzone i gotowe do powlekania. Ogniwa THP1 zostały zasiadzone jako pierwsze, aby obciążyć stos FCI dla większej stabilności i ostatecznej masy. Następnie do głębokiej szalki Petriego dodano medium DMEM, aby podnieść poziom medium do spodu błony. Następnie wykonana na zamówienie igła została użyta do usunięcia pęcherzyka powietrza, co dodatkowo ustabilizowało stos FCI i umożliwiło ostateczne regulacje głośności.
  5. Użyj igły do usunięcia pęcherzyka powietrza, jak opisano w kolejnym kroku.

8. Usuwanie pęcherzyków powietrza

  1. Wstępnie sterylizuj igłę i strzykawkę w etanolu i susz na powietrzu przed użyciem (patrz krok 5). Zanurz tłok strzykawki.
  2. Trzymaj stos FCI za ramię sterylnymi kleszczemi. Ostrożnie opuszczaj igłę do i pod zespół wkładu, a bardzo delikatnie umieść miękką końcówkę igły gavage do pęcherzyka powietrza.
  3. Ostrożnie i bardzo powoli pociągnij tłok strzykawki i obserwuj, jak pęcherzyk powietrza powoli znika. Zatrzymaj się, gdy pęcherzyk powietrza ma około 2 mm średnicy, co wystarcza, by utrzymać dobre pokrycie DMEM dla komórek nabłonka jelita grubego.
  4. Ostrożnie wyjmij igłę i strzykawkę z Flipwella. Przejdź do drugiego zespołu wkładu w głębokiej szalce Petriego.

9. Siew THP-1 i leczenie PMA

  1. Produkuj medium THP1 z 420 mL Roswell Park Memorial Institute (RPMI)-1640 medium, 50 mL 10% (v:v) inaktywowanego termicznie FBS, 5 mL Glutamax 1% (v:v), 5 mL HEPES (10 mM końcowe stężenie), 11 mL glukozy (4,5 g/L końcowe stężenie) oraz 5 mL Pen-Strep (1% v:v).
    UWAGA: Komórki THP-1 muszą być hodowane w podłożu opartym na RPMI przez kilka dni przed wysiewem w inserwacjach. Obliczaj liczbę komórek przed seedingiem i skaluj w zależności od liczby stosów FCI, które mają być użyte.
  2. Przygotuj zawiesinę ogniwa na podstawie objętości 500 μL oraz6 komórek na 500 μL podłoża THP-1 w stężeniu 0,5 x 10 litrów. Jeśli PMA musi być użyte do różnicowania i polaryzacji, należy dodać je do ośrodka RPMI przy 100 ng/μL.
    1. Aby wyprodukować PMA, należy odtworzyć 5 mg octana pirbolu myrystanu (PMA) w 1 mL DMSO, aby uzyskać roztwór buljowy o stężeniu 5 mg/mL. Mieszaj przez wirowanie. Należy zastosować do rurek mikrowirówek po 20 μL każda i przechowywać w temperaturze -20 °C.
    2. Aby użyć PMA, należy uzyskać działający materiał o napięciu 50 μg/mL, rozcieńczając 1 μL materiału 5 mg/mL w 99 μL (1:100) kompletnego medium wzrostu. Dodaj 1 μL materiału roboczego do 500 μL mediów lub 20 μL materiału roboczego do 10 mL mediów.
  3. Wirówka ogniwa THP-1 w ilości 94 x g przez 5 minut w RT do rozpylenia. Zawiesić 5-10 ml materiałów RPMI. Policz komórki THP-1 dowolną preferowaną metodą liczenia.
  4. Ponownie wirować w 94 x g przez 5 minut w RT. Ponownie zawiesijcie w 0,5 x 106 ogniw na 500 μL podłoża THP-1.
  5. Dodaj 500 μL zawiesiny ogniwa THP-1 do strony wierzchołowej stosu wkładu kokulturowego. Dostosuj medium HT-29 dla komórek nabłonka jelita grubego, dodając medium do głębokiej szalki Petriego.
  6. Usuń pęcherzyk powietrza igłą gavage zgodnie z krokiem 8, jeśli to konieczne. Oba typy komórek hodować w inkubatorze w temperaturze 37°C, 5%CO2, wilgotności 100%, aż komórki THP-1 się przyczepią (w nocy) i będą się rozmnażać przez 1-2 dni.
  7. Przygotuj się na leczenie SEP lub innymi lekami albo na wkładki bakteryjne (patrz krok 4). Zacznij hodować bakterie dzień przed kolejnym flipem FCI.

10. Drugie przewrócenie Flipwella i usuwanie pęcherzyków powietrza dla wkładów SEP i bakterii

  1. Otwórz pokrywkę od szalki Petriego. Aspiruj medium RPMI od strony wierzchołkowej. Trzymaj Flipwell za ramię sterylną pęsetą i podnieś stos.
  2. Obróć stos do góry nogami. Używając drugiego zestawu pęset, trzymaj zestaw stosu na dostępnym ramieniu.
  3. Opuszczaj stos do nowej sterylnej głębokiej miski Petriego i zawiesz nad krawędzią. Dodaj 500 μL podłoża DMEM do teraz epikalnej/nabłonkowej strony jelitowej.
  4. Dodaj wystarczająco dużo materiału RPMI do głębokiej szalki Petriego, aż medium będzie tuż przy szczycie błony. Objętość RPMI szacowana była na około 40-55 mL, ale zmienia się w zależności od liczby stosów FCI używanych na głęboką miskę Petriego.
  5. Usuń pęcherzyk powietrza krokiem 8, zostawiając 2-3 mm pęcherzyka. W razie potrzeby dostosuj nośniki RPMI. Zakryj talerz.
  6. Hodować, aż komórki nabłonkowe jelita grubego zaczną produkować śluz. Zmieniaj media częściowo co drugi dzień.
    UWAGA: Jeśli komórki nabłonkowe jelita grubego były hodowane wystarczająco długo i już produkowały śluz, mogą przejść do wkładki bakteryjnej lub leczenia. Nie pozwól, by medium w dolnej komorze przeniknęło poniżej błony pod wkład. Dodaj więcej nośników DMEM, aby utrzymać poziom nośnika na błonie. Idealną metodą zmiany ośrodka jest usunięcie połowy ośrodka z przedziału podstawowo-bocznego i pozostawienie niewielkiej objętości ośrodka w komorze wierzchołkowej, aby zapobiec infiltracji powietrza.
  7. W przypadku zabiegów SEP należy dodać SEP do końcowego stężenia 100 μM do studni w tym momencie, jeśli nie zostanie użyta hodowla bakteryjna. Jeśli używasz hodowli bakteryjnej i wkładu, dodaj do hodowli SEP. O hodowli bakteryjnej zobacz krok 11.
    1. Aby przygotować SEP, dodaj 100 mg L-Sepiapteriny do 84,3 mL DMSO i wymieszaj przez wirowanie. Należy do rurek mikrowirówek po 100 μL każda. Przechowywać w temperaturze -20 °C. Używaj aliquotów SEP w ilości 1 μL na medium 500 μL na zestaw wkładek (końcowe stężenie 100 μM).

11. Rozpoczęcie hodowli bakteryjnej (opcjonalnie)

  1. Aby zbadać wpływ metabolitów bakteryjnych na komórki odpornościowe, śluz i nabłonek jelita grubego, należy dodać wkład bakteryjny po stronie wierzchołkowej zespołu wkładu. Przy budowie wkładu bakteryjnego postępuj zgodnie z krokiem 4. Bacillus subtilis hodowaliśmy dzień przed zastosowaniem wkładu bakteryjnego.
  2. Zrób i podkłucuj Miller LB na 2 dni przed użyciem wkładu bakteryjnego. Aby uzyskać LB, połącz 6,25 g Miller LB z 250 mL wody dejonizowanej w szklanej kolbie o pojemności 500 mL. Przykryj folią aluminiową. Autoklaw, schłodzić się do RT. Można przechowywać sterylne LB w temperaturze 4 °C lub RT.
  3. Zacznij hodować bakterie Bacillus subtilis z materiału glicerolowego dzień przed użyciem wkładu bakteryjnego.
  4. Aby rozpocząć hodowlę bakteryjną, zaszczep 10 mL Miller LB Bacillus subtilis z mrożonego bulionu glicerolowego umieszczonego w sterylnej stożkowej probówce o pojemności 50 mL. Nie pozwól, by bulion glicerolowy się rozmroził.
  5. Używając sterylnej końcówki 200 μL, pobierz niewielką ilość bakterii z bulionu glicerolowego. Wyrzuć końcówkę do 10 mL LB w sterylnej stożkowej rurce 50 mL.
  6. Jeśli stosujesz SEP, rozpocznij zabieg od 20 μL zapasu SEP (końcowe stężenie powinno wynosić 100 μM). Dodaj bezpośrednio do 10 mL kultury bakteryjnej w stożkowej rurce rozruszającej 50 mL.
  7. Hodować Bacillus subtilis przez 8 godzin w inkubatorze potrząsającym przy 220 obr./min i 37 °C. Na koniec dnia dodaj drugi zabieg SEP – do końcowego stężenia 100 μM do 10 mL LB z bakteriami dodaj 20 μL SEP.
  8. Hodować przez noc przy 220 obr./min, 37 °C. Następnego ranka dodaj trzeci zabieg 20 μL SEP do 10 mL LB z Bacillus subtilis i kontynuuj wstrząsanie aż do przygotowania do włożenia wkładek bakteryjnych.

12. Dodanie wkładu bakteryjnego do Flipwella (opcjonalnie)

  1. Wykonaj wykonanie wkładu bakteryjnego zgodnie z krokiem 4. Wykonaj hodowlę bakterii zgodnie z krokiem 11.
    UWAGA: Jeśli dostępna jest osobna szafka do hodowli komórek, to będzie ona najlepsza. W przeciwnym razie podziel obszar roboczy wewnątrz szafki do hodowli komórkowej na pół. Utrzymuj posiewy bakteryjne i komórkowe oddzielnie. Posiewy komórkowe nie powinny być wracane do inkubatora hodowli komórkowych. BSC musi zostać wysterylizowany i wystawiony na działanie UV przez 24 godziny lub dłużej po wykonaniu tej metody.
  2. Do poniższych kroków użyj dwóch par sterylnych kleszczy. Wszystkie poniższe kroki należy wykonać w BSC.
  3. Za pomocą kleszczy można wyjąć gotową sterylną wkładkę z 24 dołkami z opakowania. Włóż wkładkę do sterylnej miseczki Petriego i przykryj pokrywkę.
  4. Powtarzaj liczbę potrzebnych wkładów bakteryjnych. Przenieś szalkę Petriego z Flipwellami z inkubatora do BSC i odłóż po przeciwnej stronie miseczki z wkładkami bakteryjnymi.
  5. Usuń 300 μL ośrodka DMEM z wierzchołkowej (górnej) strony Flipwella, aby umożliwić włożenie wkładki bakteryjnej. Zostaw około 200 μL na górnej stronie stosu FCI. Przyłóż pokrywkę z szalki Petriego na zestawy wkładek.
  6. Dodaj 50-100 μL hodowli B. subtilis do wkładów bakteryjnych z 24 dołkami. Uważaj, aby nie rozlać lub nie zanieczyścić zewnętrznej ściany i krawędzi wkładu bakteryjnego. OD600 można przyjmować do monitorowania fazy wzrostu hodowli.
  7. Sterylnymi kleszczemi podnieś wkład bakteryjny za pomocą hodowli i ostrożnie włóż go do górnej części Flipwell. Obróć ramię i zawieś je na krawędzi stosu FCI. Przytrzymaj stos drugim zestawem sterylnych kleszczy.
  8. Powtarzaj to dla reszty stosów FCI. Przykryj szalkę Petriego i odpocznij w BSC 3 godziny. Nie wnosz do inkubatora.
  9. Po 3 godzinach użyj sterylnych kleszczy, aby usunąć wkładkę bakteryjną z Flipwella. Powtarzaj to dla pozostałych zestawów wkładek. Usuń wkładki bakteryjne.
    UWAGA: Usuwaj bakterie i wkładki bakteryjne zgodnie z polityką utylizacji odpadów biologicznych oraz wytycznymi dotyczącymi bezpieczeństwa i higieny należącymi do tej instytucji. Nie badane były składniki bakteryjne ani same bakterie.
  10. Aby przeanalizować zmiany w przedziałach komórek błonowych śluzówki, nabłonka i układu odpornościowego, należy przeprowadzić mycie błon i przygotować je do obrazowania.
  11. Aspiruj medium DMEM z górnej części Flipwell. Przemyj 500 μL sterylnego PBS. Używając kleszczy, wyjmij stos FCI z szalki Petriego i przełóż go do nowej szalki.
  12. Odwróć Flipwella i zawieś go na krawędzi szalki Petriego. Przemyj błonę 500 μL bezpłodnego PBS.
  13. Jeśli jest konieczne przechowywanie, przechowywać stosy FCI krótkoterminowo (30 minut – noc) w sterylnym PBS wewnątrz stożkowej rurki o pojemności 50 mL.
    UWAGA: Ważne jest, aby określić, która metoda obrazowania będzie zastosowana jako następna oraz czy błona zostanie przecięta na pół zarówno do mikroskopii elektronowej, jak i znakowania przeciwciał fluorescencjonalnych.

13. Rozkładanie Flipwella do skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM)

UWAGA: Aby zbadać zmiany morfologiczne w komórkach nabłonka jelita grubego i makrofagach po leczeniu SEP/bakteryjnym, utrwaliliśmy błony w buforze fiksacyjnym, a następnie rozłożyliśmy Flipwelly do skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM). PFA była stosowana jako utrwalający; jednak można również stosować glutaraldehyd. Ważne jest, aby skonsultować się z Mikroskopijnym Rdzeniem w sprawie preferowanego bufora fiksacyjnego, konkretnych kroków odwodnienia oraz początkowych stężeń buforu fiksacyjnego. Membrany można przechowywać w buforze fiksacyjnym, jeśli jest to konieczne. Prace mogą być wykonywane poza BSC. Jeśli Obrazujący Rdzeń będzie przyklejał membranę, można ją przeciąć na pół i ustawić tak, aby obrazować obie strony osobno.

  1. Za pomocą markera odpornego na rozpuszczalniki oznacz plastikowe boki stosu FCI kodem symbolicznym dla używanego typu komórki. Alternatywnie, oznacz błonę bezpośrednio kropką, znaczkiem zahaczenia lub x, aby oznaczyć użyty typ komórki.
  2. Umieść Flipwell w stożkowej rurce o pojemności 50 mL bez rozkładania. Dodaj 4% PFA, wystarczająco, by zanurzyć stos. Utrzymuj 4% PFA przez noc.
    1. Aby uzyskać 4% PFA (bez metanolu), rozpuścić 40 g paradehydu w 800 mL 1x PBS. Aby uzyskać 0,4% PFA, rozpuścić 4 g paraformaldehydu w 800 mL 1x PBS lub rozcieńcz 4% PFA 1:10 z 1x PBS, dodając 100 mL 4% PFA do 900 mL 1x PBS.
  3. Wymień PFA na 0,4% za dłuższe przechowywanie. Skonsultuj się z Microscopy Core w celu uzyskania czasu przechowywania i.
  4. Aby rozłożyć Flipwell, trzymaj go obiema rękami i odkręcaj każdą przyklejoną część stosu. Stos rozkłada się na dwie części: jedna będzie miała membranę, a druga to wkładka bez membrany. Usuń wkład bez membrany.
  5. Obróć wkład razem z membraną i połóż go tak, że membrana jest skierowana do góry. Można oznaczyć błonę małą kropką lub x na jej krawędzi, aby określić, po której stronie znajduje się jaki typ komórki.
  6. Przytrzymaj wkładkę przy ścianie za pomocą kleszczy. Ostrożnie wytnij membranę ostrzem skalpela i umieść ją w probówce 1,7 mL lub małej szklanej butelce z 500 μL-1 mL roztworu PFA o pojemności 500 μL-1 mL 0,4%-4%.
  7. Poddaj się rdzeniowi mikroskopowemu na etapy odwodnienia i obrazowania. Etapy odwodnienia opisano w Beamer i in.7.
  8. Usuwaj PFA lub inne utrwalające środki zgodnie z przepisanymi politykami organizacji dotyczącymi utylizacji odpadów niebezpiecznych oraz wytycznymi dotyczącymi zdrowia i bezpieczeństwa.

14. Metoda dużych kropli do rozkładania Flipwella do mikroskopii konfokalnej

UWAGA: Stworzono nową metodę barwienia i obrazowania błon. Stos wkładek współkultury został zachowany w całości dzięki początkowym krokom fiksacji, permeabilizacji i blokowania wykonanym wewnątrz stożkowej rurki o pojemności 50 mL. Do obrazowania obu stron błony zastosowano znakowanie immunofluorescencyjne oraz mikroskopię konfokalną. Nowo nazwana metoda płyty 12-dołkowej stosowano do nocnych etapów inkubacji, a do barwienia dna rozebranej wkładki stosowano metodę dużych kropli (large droplet). Konfokalny stos Z był używany do obrazowania obu stron błoną. Bejcowane membrany umieszczono pomiędzy dwoma okrągłymi szklanymi pokrywkami, a zespół wklejony umieszczono pośrodku, między dwoma metalowymi pierścieniami komercyjnie produkowanej komory okrągłej do obrazowania. Wielofotonowy laserowy skanujący mikroskop konfokalny był używany z komercyjnym oprogramowaniem obrazującym.

  1. Aby przemyć membranę, umieść stos wkładek do współhodowli bezpośrednio do stożkowej probówki o pojemności 50 mL i dodaj 15 mL sterylnego PBS lub przemyj każdą stronę osobno (opisane poniżej).
  2. Aspiruj DMEM i dodaj 300 μL bezpłodnego PBS po stronie wierzchołkowej. Wdechuj PBS i ostrożnie wyjmij stos z szalki Petriego.
  3. Przełącz Flipwella i dodaj 300 μL PBS do obecnie skierowanego RPMI stosu FCI. Aspiruj PBS.
  4. Używając markera odpornego na rozpuszczalnik, oznacz górną i dolną stronę stosu, aby określić, która strona ma który typ komórek.
  5. Umieść Flipwell w stożkowej rurce o pojemności 50 mL. Dodaj 15 ml sterylnego 4% PFA jako początkowy bufor fiksacyjny na 10 minut. Jeśli potrzebna jest inkubacja nocna, wymień na 15 mL 0,4% PFA w PBS, przykryj i wyjdź na noc.
  6. Aby przejść do immunobarwienia, zrób miejsce na stole pod metodę dużych kropel.
    Zerwij folię foliową o wymiarach 10 x 14 cali i przyklej ją taśmą do stołu w narożnikach, aby uzyskać gładką powierzchnię.
  7. Używając pipety 200 μL, tworzymy dużą kroplę z 200 μL PBS. Odkręć zespół wkładek, aby rozdzielić je na wkładki.
  8. Za pomocą markera odpornego na rozpuszczalniki umieść małą kropkę blisko krawędzi jednej strony błony, aby określić, który typ komórki jest używany do barwienia i obrazowania.
  9. Usuń resztki silikonowej uszczelki z dna wkładu, jeśli wkładka z membraną nadal zawiera resztki kleju. Robi się to, aby upewnić się, że wkładka pozostanie pionowa podczas poniższych kroków.
  10. Ostrożnie umieść stos FCI (z ogniwami THP-1) na wierzchu dużej kropli PBS o pojemności 200 μL. Dodaj 200 μL buforu permeabilizacyjnego na górną stronę z komórkami nabłonkowymi jelita grubego i utrzymuj przez 10 minut.
    1. Aby przygotować bufor permeabilizacji, użyj 0,1% v/v Triton-X100 w PBS.
  11. Wsysaj i dodaj 200 μL PBS. Powtórz to mycie dwa razy. Stwórz nową kroplę z 250 μL bufora blokującego.
    1. Aby stworzyć bufor blokujący, dodaj 250 μL zwykłej surowicy koziej w 5 ml 1x PBS (ostatnie 5% surowice). Dodaj 15 μL Triton-X100 (ostateczne 0,3% v:v). Dobrze wymieszaj i przechowuj w 4 °C przez 1-2 dni.
  12. Umieść wkład na buforze blokującym. Blokuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Aspiruj PBS od strony wierzchołkowej i dodaj 200 μL bufora blokującego na górę wkładki. Obie strony błony są teraz gotowe do zabarwienia przeciwciałami przez noc.

15. Barwienie immunofluorescencyjne (IF)

UWAGA: Barwienie odbywa się w nocy metodą 12-dołkowej płyty lub na stole metodą dużych kropel.

  1. Przygotuj niezbędne przeciwciała do barwienia obu stron błony przez noc w temperaturze 4 °C lub na stole laboratoryjnym w RT. Rozcieńcz wszystkie przeciwciała w stosunku 1:100 w 1% BSA w PBS. Alternatywnie, stosuj się do zaleceń producenta i optymalizuj barwienie, aby określić idealne stężenia i bufor rozcieńczający przeciwciała.
  2. Metoda dużych kropel
    1. Stwórz duży prostokąt, używając folii spożywczej na stole i przyklej narożniki. Pipet rozcieńczony 200 μL przeciwciał na plastiku, tworząc dużą kroplę. Połóż membranę wkładową na dużej kropli.
    2. Dodaj 200 μL pierwotnego Ab na górę wkładki. Inkubuj w RT przez 2 godziny.
  3. Metoda płyty 12-dołowej
    1. Jeśli stosujesz metodę z płytką 12-dołkową przez noc, dodaj 300 μL przeciwciała pierwotnego na górę wkładu.
    2. Dodaj 300 μL przeciwciał pierwotnych do dołku płytki 12-dołkowej. Umieść wkład wewnątrz płytki z 12 dołkami na powierzchni kropli. Przykryj talerz pokrywką i podgrzej go w 4 °C przez noc.
  4. Po zakończeniu barwienia przemyj obie strony błony PBS. Używając pipety i końcówki 200 μL, ostrożnie opłucz dolną stronę wkładu 3x 200 μL PBS. Na górze wkładu myj przez dodanie 200 μL PBS na górę, asekuracji i powtarzając pranie 3 razy.
  5. Przygotuj wszystkie przeciwciała wtórne (prosimy zobaczyć Tabelę Materiałów dla konkretnych przeciwciał) zgodnie z zaleceniami producenta lub rozcieńczeniem 1:1000 w 1% BSA w PBS lub innym. Wtórne barwienie przeciwciał musi być wykonywane w ciemności; Użyj kartonowego pudełka lub szuflady szafki, aby stworzyć środowisko wolne od światła.
  6. Stosując metodę dużych kropelek lub 12-dołkową płytkę, przygotuj nową płytkę sterylną. Inkubuj przez 2 godziny w RT w ciemnym środowisku. Wash opisany w 15.4.

16: Przygotowanie do obrazowania konfokalnego

  1. Jeśli błona nie została jeszcze oznaczona zgodnie z krokiem 14, oznacz ją, aby znać lokalizację typu komórki. Umieść mały znak (kropka, x, zaznaczenie itp.) markerem odpornym na rozpuszczalnik w dowolnym miejscu (preferowana krawędź).
  2. Ostrożnie zdejmij okrągłe pokrywy z pojemnika i delikatnie połóż je na powierzchni stołu.
  3. Rozcieńcz DAPI w PBS w rozcieńczeniu 1:100. Do podawania DAPI za pomocą dozownika kropel dodaj 1-3 krople na środek pokrywy. W przeciwnym razie pipetować 1-3 krople DAPI na środek pokrywy.
  4. Trzymaj wkładkę kleszczemi. Ostrożnie wytnij membranę ostrzem skalpela okrężnym ruchem wokół krawędzi i dolnej krawędzi. Nie pozwól, by błona spadła na ławkę. Połóż plastikową wkładkę na stole i przytrzymaj membranę kleszczami, odcinając ostatnie włókna ostrzem skalpela.
  5. Połóż wkład na DAPI. Rozprowadz 1-3 krople DAPI (rozcieńczenie 1:100) na górę błony, aby obie strony membrany miały DAPI.
  6. Podnieś otulkę z drugiej rundy palcami (noś środki ochrony osobistej). Nie używaj kleszczy, ponieważ osłona jest bardzo delikatna.
  7. Wyrównaj drugi pokrywak na pierwszym i ostrożnie opuszczaj go na membranę.
  8. Używając markera odpornego na rozpuszczalnik, starannie oznacz stronę pokrywy, jeśli jest to potrzebne, aby zakodować typ/orientację komórki (opcjonalnie). Jeśli błona była oznaczona, pomiń ten krok.
  9. W zależności od liczby obrazowanych pokrywek oraz dostępnych metalowych pierścieni, można je zamontować między komercyjnie produkowanymi metalowymi pierścieniami, aby utrzymać okrągłe pokrywki razem do obrazowania, albo przechowywać je w ciemności do czasu wykonania obrazowania.
  10. Aby obrazować, zamontuj pokrywę z membraną między metalowymi pierścieniami komory komórkowej i umieść ją w uchwytie mikroskopu konfokalnego. Skontaktuj się z osobą mikroskopii konfokalnej przed zapoznaniem się, jaki uchwyt może być potrzebny do zdjęcia okrągłych pokrywek.
  11. Gdy będziesz gotowy do zdjęcia, owiń każdą kanapkę folią aluminiową i zabierz do placówki.
  12. Korzystając z funkcji stosu Z, skanuj każdą stronę membrany indywidualnie, używając odpowiedniej długości fali zależnej od użytych fluoroforów. Odwróć i zobrazuj drugą stronę. Aby przechowywać pokrywki, trzymaj je w ciemności w temperaturze 4 °C.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Aby określić biologiczne znaczenie kokultur Flipwella bakterii jelitowych, nabłonka jelita grubego i makrofagów, poddaliśmy je sepiapterinie (SEP), modulatorowi metabolizmu argininy, aby wspierać produkcję tlenku azotu 9,10,11 w porównaniu do kontrolnego DMSO. Określiliśmy wpływ leczenia SEP na każdy składnik współkultur za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej (IF) oraz skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM). Barwienia ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Aby odtworzyć architekturę śluzowości jelit in vitro, zaprojektowaliśmy prosty system współhodowli, który obejmuje warstwowe warstwy bakterii jelitowych, komórek nabłonka jelita produkującego śluz oraz makrofagów. Ten system wielokulturowy pozwolił nam badać wpływ przenikania się między sekretemem bakteryjnym, błonkiem jelitowym i makrofagami na indukowanie immunogennego przeprogramowania i mechanizmów obrony śluzówki.

Jednym z ważnych elementów ostrożności przy tworzeniu 3D Flipwelló...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów. Autorzy niniejszym wyrzekają się wszelkich gwarancji, zarówno wyrażonych, jak i dorozumianych, w możliwym stopniu dozwolonym przez prawo. W żadnym wypadku autorzy nie ponoszą odpowiedzialności, czy to na podstawie jakiejkolwiek ustawy, umowy, deliktu czy innej teorii prawnej, za szczególne, przypadkowe, pośrednie, karne, wielokrotne lub poskutkowane szkody wynikające z użycia narzędzi do budowy Flipwellów, użycia odczynników BSL, linii komórkowych, kultur bakteryjnych, stosowania systemu Flipwella w środowisku beztlenowym w komorze beztlenowej. To ograniczenie odpowiedzialności obejmuje, ale nie ogranicza się do, wszelkich nieokreślonych form wykorzystania Flipwell, które nie zostały tu wyraźnie opisane.

Podziękowania

Główna autorka wyraża szczere podziękowania dr Saori Furuta za jej znakomite umiejętności mentorskie, ciągłe wsparcie i wsparcie na duże odległości oraz umiejętne i ciągłe projektowanie, które sprzyja fantastycznym możliwościom nauki. Autorzy dziękują także dr Vandanie Sharma za wiedzę i doradztwo mikrobiologiczne oraz dr Veani R. Fernando za przygotowanie makrofagów THP-1, Gebremichalowi Gebretsadikowi Weidengusowi oraz Syedowi Islamowi za pomoc w przygotowaniu niezbędnych mediów, hodowli komórkowych i bakteryjnych przed zdjęciami.

Autorzy dziękują także Metro Health Medical Center/Division of Cancer Biology za gościnność i wsparcie podczas procesu zdjęć. Główny autor dziękuje Uniwersytetowi Michigan dr Erin Janssen, dr Elize Tsou i Caroline Foster za wsparcie projektu w formie zapasowych materiałów oraz białego fartucha XL używanego podczas zdjęć.

Dodatkowo autorzy dziękują dr Andrew Kleinhenzowi i dr Williamowi T. Gunningowi z Electron Microscopy Facility oraz Cassandrze Zamorze i Kristin Kirschbaum z Instrumentation Center na Uniwersytecie w Toledo za konstruktywne sugestie dotyczące obrazowania EM. Prace te były wspierane przez fundusz początkowy z University of Toledo Health Science Campus, College of Medicine and Life Sciences, Department of Cancer Biology dla S.F.; Grant na ponowne poszukiwania raka w Ohio (Projekt #: 5017) dla S.F; Nagroda Medical Research Society (Toledo Foundation, #206298) dla S.F.; Grant badawczy American Cancer Society (RSG-18-238-01-CSM) dla S.F; oraz grant badawczy National Cancer Institute (R01CA248304) dla SF.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,4% PFA (patrz przepis w Reagents and Solutions)opisane w tekście
Serologiczna pipeta 10 mlCorning4488
12-wiertnowa płyta TC Plate,  CostarCorning3513
Stożkowe lampy 15 ml, SpectraTubeAlkali ScientificC2715
200 & mikro; L wskazówki USA Scientific1111-1700
Wkłady 24-dołkowe - Wkłady hodowlane dla płytek 24-dołkowe, PET 0,4 i mikro; m BrandTech Scientific782710
3D Flipwells gotowe, sterylizowane UV  Make in lab
4% PFA (patrz przepis w Reagents and Solutions)opisane w tekście
50 mM bulionu Sepiapterin (SEP, zobacz przepis w Reagents and Solution)Kariera Henan Chemical CoCAS#: 17094-01-8
Stożkowe rurki o pojemności 50 mlGreiner Bio-One227261
Pipeta serologiczna 5 mlCorning4487
70-95% etanolu (alkohol etylowy)Decon Labs04-355-151
Folia aluminiowaFisher Scientific01-213-100
Igły do karmienia zwierząt, 20 gauge 1,5" długość, jednorazowe użycie Fisher Scientific01-208-87
Bufor rozcieńczający przeciwciała (patrz przepis w Reagent and Solutions)opisane w tekście
Komora Atomowych Komórek Attofluorowych  ThermoFisher ScientificA7816
Taśma autoklawowaFisher Scientific15-901-111
Szczepy Bacillus subtilis wt (3A1T) w bulii glicerolowej ()Centrum Genetyczne Bacillus (https:// bgsc. org/
Rękawice BioGrip Pink Nitrile bez lateksuProdukcja najwyższej jakościP2810
Bufor blokujący (patrz przepis w Reagent and Solutions - 10% normalnej surowicy koziej w PBS)opisane w tekście
Bufor blokujący (patrz przepis w Reagents and Solutions)opisane w tekście
Mikroskop jasnego pola (Nikon lub odpowiednik) Eclipse Ts2NikonTS2
Komórki Caco-2ATCCHTB-37
Inkubator hodowli komórkowych, 37 stopni; C, 5% CO2 (Eppendorf CellXpert)Eppendorf6734010015
Wirówka (Eppendorf, wirówka 5804/5804 R lub równoważnaEppendorf22622501
Rurki wirówkowe 50 ml SpectraTubeAlkali ScientificC2750
Wkłady hodowlane dla płytek 12-dołkowe, PET, 0,4 i mikro; m, sterylnyBrandTech Scientific, BRAND Insert 2in1, BIO-CERT782730
Medium mocujące DAPI VectaShieldLaboratoria VectorH-1000
Głębokie dno szalek Petriego, 100 x 25 mm głęboka polstyrenowa szalka Petriego, sterylna USA Scientific8609-0625
Drummond Pipet Aid XPDrummond 4-000-101
Wirówka Eppendorf 5804 z wirnikem łyżkowym na rurki stożkowe o pojemności 50 mlEppendorf22622501
Kleszcze, stal nierdzewna, sterylny autoklaw, zestawy 2xVWR82027-438
Kleszcze, stal nierdzewna, sterylny autoklaw, zestawy 2x, kleszcze do próbekVWR82027-438
Szklana kolba 500 mlCorning  4980-500
Hemacytometr (Neubauer z pokrywkami)Thermo Fisher Scientific50-312-90
Ogniwa HT-29-MTX-E12Millipore Sigma12040401
ImmunoPen (opcjonalnie)Fisher Scientific4021761EA
Rękawice z Kevlaru lub inne odporne na przecięcia (opcjonalnie)Sklep z narzędziami lub Amazon
Taśma laboratoryjna lub taśma wysyłkowaFisher Scientific  159015R
Laminarny przepływ kaptur 1300 Series A2 BSC Class IIThermoFisher Scientific1375
Laminarny okap z lampą UV SterilGARDFirma BakerSG403A-HE
Markery proof rozpuszczalnikaVWR52877-310 lub 95042-566
Medium dla komórek Caco-2 (na bazie DMEM o wysokiej glukozie, zobacz przepis w Reagent and Solutions)opisane w  Tekst
Medium dla komórek HT-29 (DMEM Wysoka glukoza, patrz przepis w Reagents and Solutions)opisane w tekście
Medium dla komórek THP-1 (RPMI, patrz przepis w Reagent and Solutions)opisane w tekście
Rurka mikrowirówkowa, 1,7 ml, sterylna Alkali ScientificC3017-ST
Rurki mikrowirówkoweThermo Fisher3451
Medium Millera LB (patrz przepis w Reagents and Solutions)Sigma-Aldrich  L3522
Szczypce z igłowym końcem, zestawy 2xSklep z narzędziami lub Amazon
Rękawice Aurelia bez proszku nitryluMidSci92885
Pokrywki do misek Petri, sterylne w stylu 100x15 mm w formie sterylnej miseczki Falcon PetriCorning Inc351029
Octan myrystaniatu phorbol (PMA) (100 ng/μ l, zobacz przepis w Reagents and Solutions)  InvivoGenTlrl-pma
Końcówki pipetowe (10 & micro; L, 200 & mikro; L, 1000 & mikro; l) PurePoint lub równoważnyAlkali Scientific ST1010-CS, ST1200-CS, ST1000-CS
FoliaSklep spożywczy
Roztwór roboczej kolagenazy Purecol (100 & mikro; g/mL)Zaawansowany BioMatrix5005-100ML
Okrągłe pokrywy #1 1 oz (Corning Float Glass lub Fisherbrand)Corning lub Fisherbrand50143822 lub 12-546-2 25CIR-2
Ostrza skalpelowe, sterylne, jednorazowe Mopec czy Pióro #10AJ136 lub 2975#10
Sepiapterin (WRZESIEŃ, 100 &; M, zobacz przepis w Reagents and Solution)Kariera Henan Chemical CoCAS#: 17094-01-8
Inkubator wstrząsający, ustawiony na 220 obr./min, 37 stopni; CEppendorf New Brunswick ScientificM12990080
Silikonowy klej Loctite Clear Silicone IDH lub 3M Marine Grade Silicon Sealant Clear z końcówką nosaLoctite lub 3M1745658 czy PN08019
Pipet jednokanałowy Eppendorf Research Plus, 200 &; lEppendorf
Pipety jednokanałowe (10 & micro; L, 200 & mikro; L, 1000 & mikro; l)Eppendorf2231001122
Spektrofotometr NanoDropOneCThermo Fisher Scientific13-400-519
Sterylna woda dejonizowana   
Sterylna fosforanowa buforowana seryna (PBS) bez wapnia i magnezuFisher Scientific  BSS-PBS-1X6
Strzykawka 3 ml lub 5 ml z końcówką Luer-LokBD309585 czy 309603
Ogniwa THP-1ATCCTIB-202
Pipety transferowe, sterylneFisherbrand13-711-20
Triton X-100Millipore SigmaX100
Roztwór trypanowego niebieskiegoVWR97063-702
Trypsyna-EDTA 0,25%Thermo Fisher Scientific25200-056
Wyczyścił Kimwipes Professional za pomocą LintGuard Anti-Stat PolyshieldKimberly-Clark34120
przeciwciała pierwotne: 
Antyludzki CD163Abcam156769
Antyludzki CD68Novus BiologicalsNB100-683-0,1 mg
Antyludzki CD80, E3Q9VTechnologie sygnalizacji komórkowej15416
Antyludzki CK20 Technologie życiaPA5-82875
Antyludzki MUC2 (996/1)ThermoFisherMA5-12345
przeciwciała wtórne:
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG (dla CD80 i CK20)ThermoFisherA11008
Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG (dla MUC2 i CD68 lub CD163)ThermoFisherA11005
Odczynniki i Roztwory:   
Caco-2 Średni:
DMEM z wysokim poziomem glukozy (4,5g/L) i 1% (v:v) GlutaMax Thermo Fisher Scientific35050061
FBS 10% (v:v) nieaktywowany termicznieSigmaF2242-500ML
Aminokwasy nieistotne 1% dla podłoża Caco-2Thermo Fisher Scientific11140076
Angina pen 1% (v:v)SigmaF2242-500ML
HT-29-MTX Średni
DMEM z wysokim poziomem glukozy (4,5g/L) i 1% (v:v) GlutaMax Thermo Fisher Scientific35050061
FBS 10% (v:v) nieaktywowany termicznieSigmaF2242-500ML
HEPES (10 mM końcowe stężenie)Thermo Fisher Scientific15630080
Angina pen 1% (v:v)SigmaF2242-500ML
THP-1 Średni:
Surowica z bydła płodu inaktywowana termicznie (10% v:v)Sigma F2242-500ML
Glukoza (końcowe stężenie 4,5 g/L)Thermo Fisher ScientificA249001
GlutaMax 1% (v:v)  2 mM końcowa koncentracjaThermo Fisher Scientific35050061
HEPES (10 mM końcowe stężenie)Thermo Fisher Scientific15630080
Angina pen 1% (v:v)SigmaF2242-500ML
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) – 1640 mediumThermo Fisher Scientific11875119
Pirowinian sodu (1 mM końcowe stężenie)Thermo Fisher Scientific11360070
roztwór roboczej kolagenazy Purecol (rozcieńczenie do 1:30 100 & mikro; g/ml):
Purecol 3 mg/ml w formie 1:30 do 100 & mikro; g/ml Zaawansowany BioMatrix5005-100ML
Sterylna woda dejonizowana
L-Sepiapterin roztwór wywarowy (50 mM):
L-Sepiapterin (WRZEŚNIE)Kariera Henan Chemical CoCAS#: 17094-01-8
roztwór octanowy pirobolu myristanowego (PMA, 5 mg/mL)InvivoGenTlrl-pma
BSA 1% albuminy surowicy wołowej Sigma-Aldrich5470
DMSO Sigma D2650
Miller LBSigma-Aldrich  L3522
Normalne serum z tego samego gatunku co przeciwciało wtórneSigma NS02L-1ML
ParaformaldehydSigma-Aldrich441244

Bibliografia

  1. Goldsmith, J. R., Sartor, R. B. The role of diet on intestinal microbiota metabolism: downstream impacts on host immune function and health, and therapeutic implications. J Gastroenterol. 49 (5), 785-798 (2014).
  2. Xuan, C., et al. Microbial dysbiosis is associated with human breast cancer. PLoS One. 9 (1), e83744(2014).
  3. Yoo, J. Y., Groer, M., Dutra, S. V. O., Sarkar, A., McSkimming, D. I. Gut Microbiota and Immune System Interactions. Microorganisms. 8 (10), 1587(2020).
  4. Kim, H. J., Li, H., Collins, J. J., Ingber, D. E. Contributions of microbiome and mechanical deformation to intestinal bacterial overgrowth and inflammation in a human gut-on-a-chip. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (1), E7-E15 (2016).
  5. Donkers, J. M., Eslami Amirabadi, H., van de Steeg, E. Intestine-on-a-chip: Next level in vitro research model of the human intestine. Curr Opinion Toxicol. 25, 6-14 (2021).
  6. Noel, G., et al. A primary human macrophage-enteroid co-culture model to investigate mucosal gut physiology and host-pathogen interactions. Sci Rep. 7, 45270(2017).
  7. Beamer, M. A., et al. Novel 3D Flipwell system that models gut mucosal microenvironment for studying interactions between gut microbiota, epithelia and immunity. Sci Rep. 13 (1), 870(2023).
  8. Beamer, M. A., Furuta, S. Redefining Cell Culture Using a 3D Flipwell Co-culture System: A Mimetic for Gut Architecture and Dynamics In Vitro. Curr Protoc. 5 (2), e70107(2025).
  9. Fernando, V., et al. Reprogramming of breast tumor-associated macrophages with modulation of arginine metabolism. Life Sci Alliance. 7 (11), e202302339(2024).
  10. Sharma, V., et al. Immunogenic shift of arginine metabolism triggers systemic metabolic and immunological reprogramming to suppress HER2 + breast cancer. Cancer Metab. 13 (1), 15(2025).
  11. Zheng, X., et al. Correction of arginine metabolism with sepiapterin-the precursor of nitric oxide synthase cofactor BH(4)-induces immunostimulatory-shift of breast cancer. Biochem Pharmacol. 176, 113887(2020).
  12. Ren, G., et al. Reduced Basal Nitric Oxide Production Induces Precancerous Mammary Lesions via ERBB2 and TGFβ. Sci Rep. 9 (1), 6688(2019).
  13. Trejo, M., et al. Elasticity and wrinkled morphology of Bacillus subtilis pellicles. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (6), 2011-2016 (2013).
  14. Sadaghian Sadabad, M., et al. A simple coculture system shows mutualism between anaerobic faecalibacteria and epithelial Caco-2 cells. Sci Rep. 5, 17906(2015).
  15. Umehara, Y., Aoyagi, H. Development of a simple cultured cell-anaerobic microbial co-culture system using liquid paraffin. J Biosci Bioeng. 135 (6), 487-492 (2023).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

trójwymiarowa kokulturamodel błony śluzowej jelitasekretom bakteryjnypolaryzacja komórek odpornościowychkomórki nabłonka jelita grubegopolaryzacja makrofagówtworzenie biofilmuleczenie sepiapterynąbarwienie immunofluorescencyjne
3D Flipwell Engineering do opracowywania asynchronicznych systemów dla terapii toksykologicznych i immunomodulacyjnych w komórkach bakteryjnych, jelitowych i odpornościowych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.