3D Flipwell Engineering do opracowywania asynchronicznych systemów dla terapii toksykologicznych i immunomodulacyjnych w komórkach bakteryjnych, jelitowych i odpornościowych

Maria A. Beamer; Saori Furuta

doi:10.3791/68701

Method Article

3D Flipwell Engineering do opracowywania asynchronicznych systemów dla terapii toksykologicznych i immunomodulacyjnych w komórkach bakteryjnych, jelitowych i odpornościowych

DOI:

10.3791/68701

⸱

October 17th, 2025

Maria A. Beamer¹ , Saori Furuta²

¹Division of Pediatric Rheumatology, Department of Pediatrics, University of Michigan, Ann Arbor, ²MetroHealth Medical Center, Case Western Reserve University School of Medicine, Case Comprehensive Cancer Center

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten artykuł przedstawia szczegółowy protokół z kluczowymi krokami prowadzącymi inżynierię i wykorzystanie 3D Flipwell. Opisujemy i pokazujemy, jak składać stosy wkładek do współhodowli oraz wykorzystywać je do współhodowli warstw bakterii jelitowych, nabłonka jelitowego i makrofagów do modelowania środowiska śluzowego jelit.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby zbadać rolę sekretomu bakteryjnego w polaryzacji komórek odpornościowych i homeostazie błony śluzowej jelit, opracowaliśmy trójwymiarowy model kokultury wykorzystujący komercyjnie dostępne wkładki w formacie jeden za drugim. Nazwaliśmy ten system 3D Flipwellami i z powodzeniem współhodowaliśmy bakterie, komórki jelita nabłonkowego i układ odpornościowy w warstwach warstwowych, aby odtworzyć mikrośrodowisko śluzowe jelita. Ten system współhodowli umożliwia zasiewanie komórek nabłonka jelita grubego po jednej stronie błony oraz niezróżnicowanych, nieprzylegających monocytów po drugiej, co umożliwia synchroniczny postęp polaryzacji nabłonka jelita grubego, tworzenia śluzu oraz różnicowania i polaryzacji monocyt-makrofag w ramach jednej kokultury bez konieczności odłączania i ponownego nakładania makrofagów z predyferencjami. System ten jest łatwy do wykonania i wymaga jedynie kilku łatwo dostępnych materiałów i narzędzi. Przetestowaliśmy jej skuteczność, analizując odpowiedzi składników współhodowli na sepiapterinę (SEP), endogenny prekursor BH₄ (tetrahydrobiopterina) – kofaktora syntazy tlenkowej azotu (NOS). Wykazaliśmy, że leczenie SEP 3D Flipwellem indukowało tworzenie biofilmu przez bakterie jelitowe, produkcję śluzu przez nabłonek jelita grubego oraz proimmunogenną polaryzację makrofagów. Wskazuje to, że SEP wywołuje aktywację mechanizmu obronnego błony śluzowej poprzez przesłuchiwanie różnych komponentów komórkowych. Potrzebne są dalsze eksperymenty, aby zbadać rolę komunikacji śluzowej prowadzącej do przeprogramowania komórek odpornościowych oraz ocenić przydatność tego systemu współhodowli w poszukiwaniu nowych terapii immunomodulacyjnych.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wzajemne przesłuchiwanie komórek układu odpornościowego między mikrobiomem a jelitowym znacząco wpływa na skuteczność różnych terapii chorób. Takie przesłuchiwanie jest wyraźnie modyfikowane przez bodźce zewnętrzne, w tym między innymi przez zaburzenia metaboliczne gospodarza, zmiany diety, objawy choroby oraz leczenie farmakologiczne. Te zmiany mogą prowadzić do zaburzenia równowagi w składzie mikroflory, co nazywa się dysbiozą ^1,2,3.

Aby lepiej zrozumieć interakcje między mikroorganizmami a komórkami odpornościowymi gospodarza w jelitach, różne g....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 3D Inżynieria Flipwella

Wszystkie prace powinny być wykonywane wewnątrz szafki do hodowli komórkowej. Wszystkie materiały umieść w szafce.
Otwórz pokrywkę na szalkę Petriego i odłóż ją na bok. Otwórz ostrze skalpela z ochronnej obudowy i połóż je na krawędzi dna szalki Petriego. Zadbaj o sterylność.
UWAGA: Wymagana jest ostrożna obsługa ostrza skalpela. Używaj rękawiczek odpornych na cięcia, wzmocnionych włóknami, aby chronić ręce, jeśli zajdzie taka potrzeba.
Otwórz sterylne opakowanie ochronne w 12-dołkowej wkładce komercyjnej. Zadbaj o sterylność. Weź zestaw sterylnych pęset. Delikatnie chwyć wkładkę i wyjmij....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby określić biologiczne znaczenie kokultur Flipwella bakterii jelitowych, nabłonka jelita grubego i makrofagów, poddaliśmy je sepiapterinie (SEP), modulatorowi metabolizmu argininy, aby wspierać produkcję tlenku azotu ^9,10,11 w porównaniu do kontrolnego DMSO. Określiliśmy wpływ leczenia SEP na każdy składnik współkultur za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej (IF) oraz skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM). Barwienia .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby odtworzyć architekturę śluzowości jelit in vitro, zaprojektowaliśmy prosty system współhodowli, który obejmuje warstwowe warstwy bakterii jelitowych, komórek nabłonka jelita produkującego śluz oraz makrofagów. Ten system wielokulturowy pozwolił nam badać wpływ przenikania się między sekretemem bakteryjnym, błonkiem jelitowym i makrofagami na indukowanie immunogennego przeprogramowania i mechanizmów obrony śluzówki.

Jednym z ważnych elementów ostrożności przy tworzeniu 3D Flipwelló.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów. Autorzy niniejszym wyrzekają się wszelkich gwarancji, zarówno wyrażonych, jak i dorozumianych, w możliwym stopniu dozwolonym przez prawo. W żadnym wypadku autorzy nie ponoszą odpowiedzialności, czy to na podstawie jakiejkolwiek ustawy, umowy, deliktu czy innej teorii prawnej, za szczególne, przypadkowe, pośrednie, karne, wielokrotne lub poskutkowane szkody wynikające z użycia narzędzi do budowy Flipwellów, użycia odczynników BSL, linii komórkowych, kultur bakteryjnych, stosowania systemu Flipwella w środowisku beztlenowym w komorze beztlenowej. To ograniczenie odpowiedzialności obejmuje, ale nie ogranicza się do, wszelkich nieokreślonych form wykorzystania Flipwell, które nie zostały tu wyraźnie opisane.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Główna autorka wyraża szczere podziękowania dr Saori Furuta za jej znakomite umiejętności mentorskie, ciągłe wsparcie i wsparcie na duże odległości oraz umiejętne i ciągłe projektowanie, które sprzyja fantastycznym możliwościom nauki. Autorzy dziękują także dr Vandanie Sharma za wiedzę i doradztwo mikrobiologiczne oraz dr Veani R. Fernando za przygotowanie makrofagów THP-1, Gebremichalowi Gebretsadikowi Weidengusowi oraz Syedowi Islamowi za pomoc w przygotowaniu niezbędnych mediów, hodowli komórkowych i bakteryjnych przed zdjęciami.

Autorzy dziękują także Metro Health Medical Center/Division of Cancer Biology za gościnność i wsparcie podcza....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number
0,4% PFA (patrz przepis w Reagents and Solutions)	opisane w tekście
Serologiczna pipeta 10 ml	Corning	4488
12-wiertnowa płyta TC Plate, Costar	Corning	3513
Stożkowe lampy 15 ml, SpectraTube	Alkali Scientific	C2715
200 & mikro; L wskazówki	USA Scientific	1111-1700
Wkłady 24-dołkowe - Wkłady hodowlane dla płytek 24-dołkowe, PET 0,4 i mikro; m	BrandTech Scientific	782710
3D Flipwells gotowe, sterylizowane UV	Make in lab
4% PFA (patrz przepis w Reagents and Solutions)	opisane w tekście
50 mM bulionu Sepiapterin (SEP, zobacz przepis w Reagents and Solution)	Kariera Henan Chemical Co	CAS#: 17094-01-8
Stożkowe rurki o pojemności 50 ml	Greiner Bio-One	227261
Pipeta serologiczna 5 ml	Corning	4487
70-95% etanolu (alkohol etylowy)	Decon Labs	04-355-151
Folia aluminiowa	Fisher Scientific	01-213-100
Igły do karmienia zwierząt, 20 gauge 1,5" długość, jednorazowe użycie	Fisher Scientific	01-208-87
Bufor rozcieńczający przeciwciała (patrz przepis w Reagent and Solutions)	opisane w tekście
Komora Atomowych Komórek Attofluorowych	ThermoFisher Scientific	A7816
Taśma autoklawowa	Fisher Scientific	15-901-111
Szczepy Bacillus subtilis wt (3A1T) w bulii glicerolowej ()	Centrum Genetyczne Bacillus (https:// bgsc. org/
Rękawice BioGrip Pink Nitrile bez lateksu	Produkcja najwyższej jakości	P2810
Bufor blokujący (patrz przepis w Reagent and Solutions - 10% normalnej surowicy koziej w PBS)	opisane w tekście
Bufor blokujący (patrz przepis w Reagents and Solutions)	opisane w tekście
Mikroskop jasnego pola (Nikon lub odpowiednik) Eclipse Ts2	Nikon	TS2
Komórki Caco-2	ATCC	HTB-37
Inkubator hodowli komórkowych, 37 stopni; C, 5% CO2 (Eppendorf CellXpert)	Eppendorf	6734010015
Wirówka (Eppendorf, wirówka 5804/5804 R lub równoważna	Eppendorf	22622501
Rurki wirówkowe 50 ml SpectraTube	Alkali Scientific	C2750
Wkłady hodowlane dla płytek 12-dołkowe, PET, 0,4 i mikro; m, sterylny	BrandTech Scientific, BRAND Insert 2in1, BIO-CERT	782730
Medium mocujące DAPI VectaShield	Laboratoria Vector	H-1000
Głębokie dno szalek Petriego, 100 x 25 mm głęboka polstyrenowa szalka Petriego, sterylna	USA Scientific	8609-0625
Drummond Pipet Aid XP	Drummond	4-000-101
Wirówka Eppendorf 5804 z wirnikem łyżkowym na rurki stożkowe o pojemności 50 ml	Eppendorf	22622501
Kleszcze, stal nierdzewna, sterylny autoklaw, zestawy 2x	VWR	82027-438
Kleszcze, stal nierdzewna, sterylny autoklaw, zestawy 2x, kleszcze do próbek	VWR	82027-438
Szklana kolba 500 ml	Corning	4980-500
Hemacytometr (Neubauer z pokrywkami)	Thermo Fisher Scientific	50-312-90
Ogniwa HT-29-MTX-E12	Millipore Sigma	12040401
ImmunoPen (opcjonalnie)	Fisher Scientific	4021761EA
Rękawice z Kevlaru lub inne odporne na przecięcia (opcjonalnie)	Sklep z narzędziami lub Amazon
Taśma laboratoryjna lub taśma wysyłkowa	Fisher Scientific	159015R
Laminarny przepływ kaptur 1300 Series A2 BSC Class II	ThermoFisher Scientific	1375
Laminarny okap z lampą UV SterilGARD	Firma Baker	SG403A-HE
Markery proof rozpuszczalnika	VWR	52877-310 lub 95042-566
Medium dla komórek Caco-2 (na bazie DMEM o wysokiej glukozie, zobacz przepis w Reagent and Solutions)	opisane w Tekst
Medium dla komórek HT-29 (DMEM Wysoka glukoza, patrz przepis w Reagents and Solutions)	opisane w tekście
Medium dla komórek THP-1 (RPMI, patrz przepis w Reagent and Solutions)	opisane w tekście
Rurka mikrowirówkowa, 1,7 ml, sterylna	Alkali Scientific	C3017-ST
Rurki mikrowirówkowe	Thermo Fisher	3451
Medium Millera LB (patrz przepis w Reagents and Solutions)	Sigma-Aldrich	L3522
Szczypce z igłowym końcem, zestawy 2x	Sklep z narzędziami lub Amazon
Rękawice Aurelia bez proszku nitrylu	MidSci	92885
Pokrywki do misek Petri, sterylne w stylu 100x15 mm w formie sterylnej miseczki Falcon Petri	Corning Inc	351029
Octan myrystaniatu phorbol (PMA) (100 ng/μ l, zobacz przepis w Reagents and Solutions)	InvivoGen	Tlrl-pma
Końcówki pipetowe (10 & micro; L, 200 & mikro; L, 1000 & mikro; l) PurePoint lub równoważny	Alkali Scientific	ST1010-CS, ST1200-CS, ST1000-CS
Folia	Sklep spożywczy
Roztwór roboczej kolagenazy Purecol (100 & mikro; g/mL)	Zaawansowany BioMatrix	5005-100ML
Okrągłe pokrywy #1 1 oz (Corning Float Glass lub Fisherbrand)	Corning lub Fisherbrand	50143822 lub 12-546-2 25CIR-2
Ostrza skalpelowe, sterylne, jednorazowe	Mopec czy Pióro #10	AJ136 lub 2975#10
Sepiapterin (WRZESIEŃ, 100 &; M, zobacz przepis w Reagents and Solution)	Kariera Henan Chemical Co	CAS#: 17094-01-8
Inkubator wstrząsający, ustawiony na 220 obr./min, 37 stopni; C	Eppendorf New Brunswick Scientific	M12990080
Silikonowy klej Loctite Clear Silicone IDH lub 3M Marine Grade Silicon Sealant Clear z końcówką nosa	Loctite lub 3M	1745658 czy PN08019
Pipet jednokanałowy Eppendorf Research Plus, 200 &; l	Eppendorf
Pipety jednokanałowe (10 & micro; L, 200 & mikro; L, 1000 & mikro; l)	Eppendorf	2231001122
Spektrofotometr NanoDropOneC	Thermo Fisher Scientific	13-400-519
Sterylna woda dejonizowana
Sterylna fosforanowa buforowana seryna (PBS) bez wapnia i magnezu	Fisher Scientific	BSS-PBS-1X6
Strzykawka 3 ml lub 5 ml z końcówką Luer-Lok	BD	309585 czy 309603
Ogniwa THP-1	ATCC	TIB-202
Pipety transferowe, sterylne	Fisherbrand	13-711-20
Triton X-100	Millipore Sigma	X100
Roztwór trypanowego niebieskiego	VWR	97063-702
Trypsyna-EDTA 0,25%	Thermo Fisher Scientific	25200-056
Wyczyścił Kimwipes Professional za pomocą LintGuard Anti-Stat Polyshield	Kimberly-Clark	34120
przeciwciała pierwotne:
Antyludzki CD163	Abcam	156769
Antyludzki CD68	Novus Biologicals	NB100-683-0,1 mg
Antyludzki CD80, E3Q9V	Technologie sygnalizacji komórkowej	15416
Antyludzki CK20	Technologie życia	PA5-82875
Antyludzki MUC2 (996/1)	ThermoFisher	MA5-12345
przeciwciała wtórne:
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG (dla CD80 i CK20)	ThermoFisher	A11008
Alexa Fluor 594 Goat Anti-Mouse IgG (dla MUC2 i CD68 lub CD163)	ThermoFisher	A11005
Odczynniki i Roztwory:
Caco-2 Średni:
DMEM z wysokim poziomem glukozy (4,5g/L) i 1% (v:v) GlutaMax	Thermo Fisher Scientific	35050061
FBS 10% (v:v) nieaktywowany termicznie	Sigma	F2242-500ML
Aminokwasy nieistotne 1% dla podłoża Caco-2	Thermo Fisher Scientific	11140076
Angina pen 1% (v:v)	Sigma	F2242-500ML
HT-29-MTX Średni
DMEM z wysokim poziomem glukozy (4,5g/L) i 1% (v:v) GlutaMax	Thermo Fisher Scientific	35050061
FBS 10% (v:v) nieaktywowany termicznie	Sigma	F2242-500ML
HEPES (10 mM końcowe stężenie)	Thermo Fisher Scientific	15630080
Angina pen 1% (v:v)	Sigma	F2242-500ML
THP-1 Średni:
Surowica z bydła płodu inaktywowana termicznie (10% v:v)	Sigma	F2242-500ML
Glukoza (końcowe stężenie 4,5 g/L)	Thermo Fisher Scientific	A249001
GlutaMax 1% (v:v) 2 mM końcowa koncentracja	Thermo Fisher Scientific	35050061
HEPES (10 mM końcowe stężenie)	Thermo Fisher Scientific	15630080
Angina pen 1% (v:v)	Sigma	F2242-500ML
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) – 1640 medium	Thermo Fisher Scientific	11875119
Pirowinian sodu (1 mM końcowe stężenie)	Thermo Fisher Scientific	11360070
roztwór roboczej kolagenazy Purecol (rozcieńczenie do 1:30 100 & mikro; g/ml):
Purecol 3 mg/ml w formie 1:30 do 100 & mikro; g/ml	Zaawansowany BioMatrix	5005-100ML
Sterylna woda dejonizowana
L-Sepiapterin roztwór wywarowy (50 mM):
L-Sepiapterin (WRZEŚNIE)	Kariera Henan Chemical Co	CAS#: 17094-01-8
roztwór octanowy pirobolu myristanowego (PMA, 5 mg/mL)	InvivoGen	Tlrl-pma
BSA 1% albuminy surowicy wołowej	Sigma-Aldrich	5470
DMSO	Sigma	D2650
Miller LB	Sigma-Aldrich	L3522
Normalne serum z tego samego gatunku co przeciwciało wtórne	Sigma	NS02L-1ML
Paraformaldehyd	Sigma-Aldrich	441244

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Goldsmith, J. R., Sartor, R. B. The role of diet on intestinal microbiota metabolism: downstream impacts on host immune function and health, and therapeutic implications. J Gastroenterol. 49 (5), 785-798 (2014).
Xuan, C., et al.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

3D Flipwell Engineering do opracowywania asynchronicznych systemów dla terapii toksykologicznych i immunomodulacyjnych w komórkach bakteryjnych, jelitowych i odpornościowych

In This Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgements

Materials

References

Reprints and Permissions

Tags

Related Articles