Artykuł metodologiczny

Ulepszona edycja genomu za pomocą techniki dostarczania kwasów nukleinowych jajowódkowych oparta na elektroporacji in vivo dla generowania myszy knockout

1.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/68704

⸱

26 sierpnia 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center of Transgenesis and Genome Editing, St. Petersburg State University, 2Resource Center Molecular and Cell Technologies, St. Petersburg State University, 3Amyloid Biology Laboratory, St. Petersburg State University, 4DNA-Nanosensoric laboratory, ITMO University, 5Laboratory of Toxinology and Molecular Systematics, L.A. Orbeli Institute of Physiology, National Academy of Sciences of the Republic of Armenia

W tym artykule

Podsumowanie

Efektywność metody Improved Genome Editing za pomocą dostarczania kwasów nukleinowych w jajowódku (I-GONAD) jest porównywalna z tradycyjną mikroiniekcją, która wymaga pobrania zygot od samic dawców i przekazania ich do kobiet pseudo-ciężarnych. Protokół ten wykazuje swoją skuteczność, wprowadzając mutacje indukowane przez CRISPR/Cas9 do locus ROSA26 na chromosomie 6.

Streszczenie

Metody tworzenia myszy knockout zazwyczaj obejmują trzy główne etapy: (1) zbieranie zarodków od samic dawców, (2) mikroiniekcje konstruktów genetycznych do zygot ex vivo oraz (3) chirurgiczne przeniesienie ich do jajowodu pseudo-ciężarnych samic. Proces ten wymaga znacznej liczby zwierząt, ponieważ obejmuje nie tylko samice dawcy, ale także samce poddane wazektomii oraz kobiety będące pseudo-ciężarnymi. Ponadto mikroiniekcje do cytoplazmy lub jądra zygot myszy stwarzają wyzwania takie jak zatykanie igieł, problemy z przepuszczalnością błon spowodowane wysoką elastycznością oraz potencjalna śmierć zarodka. Rozwój zaawansowanych elektroporatorów, takich jak Nepa21, daje wyjątkową możliwość generowania myszy z celowanymi knockoutami genowymi w jednym kroku poprzez metodę znaną jako Improved Genome Editing via via Oviductal Nucleic Acids Delivery (I-GONAD). Technika ta polega na mikrowstrzyknięciu składników CRISPR-Cas (białka Cas9 i przewodnika RNA) do jajowódów ciężarnych kobiet 0,7 dnia po poczęciu, a następnie elektroporacji in vivo w celu dostarczenia tych składników bezpośrednio do zygot. Po zabiegu I-GONAD ciężarna mysz nosi i rodzi młode z wycelowanym genem. Ten artykuł przedstawia szczegółowy, krok po kroku protokół wdrażania metody I-GONAD u myszy, oferując bardziej efektywną i dostępną alternatywę dla tradycyjnych technik generowania myszy knockout.

Wprowadzenie

Zrozumienie genetycznych podstaw chorób jest kluczowe dla identyfikacji molekularnych mechanizmów leżących u podstaw ich etiologii i patogenezy. Kluczowym etapem tych badań jest opracowanie modeli zwierzęcych z celowanymi knockoutami genowymi, które symulują ludzkie choroby. Myszy są szczególnie cenne w tych badaniach ze względu na ogólne podobieństwo genomowe do ludzi, niewielki rozmiar, krótką długość życia i wysoką płodność. Modele myszy są ważne zarówno dla badań podstawowych, jak i testów przedklinicznych:1.

Aby stworzyć mysz nokautową za pomocą systemu CRISPR-Cas9, badacze zazwyczaj wstrzykują kompleks przewodnika RNA i nukleazy Cas9 do zygoty, powodując podwójne pęknięcie w docelowym DNA i tym samym aktywując system naprawczy komórki, powodując mutację w miejscu pęknięcia 1,2. Mikrowstrzykiwanie do zygot pozostaje złotym standardem w tym celu. Jednak ta metoda wymaga kilku kroków: izolowania zarodków od samic dawcy, mikrozastrzyków konstrukcji genetycznych w zygoty oraz chirurgicznego przeniesienia ich do jajowódów u kobiet będących pseudo-ciężarną. W związku z tym konieczne jest utrzymanie dużej liczby zwierząt, w tym samic dawców, samców poddanych wazektomii oraz samic w rodzaju pseudo-ciężarnych. Dodatkowo, izolacja zygot wymaga eutanazji samic dawcy. Dlatego preferowane są protokoły minimalizujące wykorzystanie zwierząt, zgodne z zasadami 3R (Zastępowanie, Redukcja, Udoskonalanie)3.

Postępy w technologii elektroporacji, takie jak zastosowanie systemu Nepa21, dają wyjątkową możliwość generowania ukierunkowanych myszy z eliminacją genu w jednym kroku, stosując technikę znaną jako ulepszona edycja genomu za pomocą dostarczania kwasów nukleinowych jajowódkowych (I-GONAD)4. Super Electroporator NEPA21 Type II wykorzystuje 4-stopniowy wieloimpulsowy system elektroporacji, zapewniający wysoką wydajność elektroporacji przy jednoczesnym zachowaniu wysokiej żywotności zarodków. I-GONAD polega na mikrowstrzyknięciu składników CRISPR-Cas (białka Cas9 (500-600 ng/μl) i przewodnika RNA (80-100 ng/μl)) do jajowódów ciężarnych myszy 0,7 dnia po poczęciu, a następnie elektroporacji in vivo, aby dostarczyć te składniki bezpośrednio do zygot5. Po zabiegu I-GONAD ciężarna mysz rodzi młode z celowanym genem knockoutem 6,7,8. Skuteczność tej metody różni się w zależności od pożądanego celu, ale jest porównywalna ze standardowymi technikami mikroiniekcyjnymi (około 50%)9,10. Dodatkowo, I-GONAD mógłby potencjalnie zostać przystosowany do edycji genomu u innych gatunków.

W tym artykule przedstawiono krok po kroku protokół wdrażania metody I-GONAD do generowania myszy knockout. Na przykład jego skuteczność wykazano poprzez celowanie w locus genomu ROSA26 na chromosomie myszy 6. To miejsce zostało wybrane, ponieważ podlega transkrypcji konstytutywnej bez dalszej translacji. Dlatego wprowadzenie mutacji w tym miejscu raczej nie wpłynie negatywnie na zdrowie powstałych młodych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie badania na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komitet Etyki Badań Zwierząt Uniwersytetu Państwowego w Petersburgu (Zatwierdzenie nr 131-03-5, 11 października 2022). Wszystkie procedury ściśle przestrzegały wytycznych określonych w Przewodniku dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych. Powszechne laboratoryjnie wyprodukowane myszy CD1 pozyskano w Centrum Zbiorowego Użycia Instytutu Związków Fizjologicznie Aktywnych Rosyjskiej Akademii Nauk (IPAC RAS). Samice myszy CD1 w wieku 2-3 miesięcy (średnia waga 27-30 g) były wykorzystywane do kopulacji z samcami myszy CD1 w wieku 2,5-4 miesiące (średnia waga 35-37 g). Odczynniki i sprzęt użyty w tym badaniu są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Projekt pojedynczego RNA (sgRNA) i jego przygotowanie do transfekcji

  1. Wykorzystaj narzędzia analizy obliczeniowej, takie jak CHOPCHOP, SYNTHEGO Knockout Guide Design czy CRISPOR, aby zidentyfikować potencjalne sekwencje sgRNA skierowane do wybranego genu.
    UWAGA: Oprogramowanie potrafi identyfikować potencjalne sekwencje sgRNA w całym genie i sugeruje wiele wariantów na wyjściu. Narzędzia te zasugerują najbardziej optymalne opcje sgRNA i pozwolą użytkownikowi wybrać spośród wszystkich zidentyfikowanych wariantów, jeśli zajdzie taka potrzeba. Przy wyborze należy wziąć pod uwagę następujące kryteria:
    1. Bliskość egzonów: Wybierz sekwencje znajdujące się w egzonach jak najbliżej pożądanego punktu mutacji. Aby uzyskać lepsze wyniki, rozważ alternatywne izoformy splicowania i wybierz docelową sekwencję obecną w największej liczbie izoform. Rozważ przeglądarki genomu (np. Ensembl) dla dokładnego wyboru eksonów.
    2. Rozważania poza celem: Analizuj potencjalne efekty poza celem za pomocą systemu punktacji narzędzia, wybierając sekwencje wykazujące najniższą przewidywaną aktywność poza celem.
      UWAGA: Narzędzia obliczeniowe, takie jak CHOPCHOP czy Synthego, są bardzo skuteczne w ocenie bliskości eksonów i efektów poza celem, pomagając identyfikować optymalne sekwencje sgRNA do precyzyjnej edycji genomu. Projektując RNA przewodnika, ważne jest uwzględnienie konkretnej sekwencji genu zainteresowanego w stosowanym szczepie myszy. Dla niektórych szczepów myszy (np. C57Bl, CBA, C3H) dostępna jest pełna sekwencja genomowa. Jeśli takie dane są niedostępne, może być wskazane przeprowadzenie wstępnego sekwencjonowania docelowego genu w planowanym obszarze edycji. Pojedyncze niedopasowania w przewodniku RNA, spowodowane polimorfizmami, mogą obniżać efektywność edycji. Locus genomu myszy ROSA 26 został wycelowany sekwencją sgRNA: 5'-ACTCCAGTCTTTCTAGAAGA-3'.
  2. Zamów zestaw starterów do amplifikacji PCR szablonu sgRNA, zgodnie z Tabelą 1.
    UWAGA: gRNA może być uporządkowane gdzie indziej, zarówno jako sgRNA, jak i jako crRNA:tracrRNA duplex.
  3. Stwórz liniowy szablon dsDNA.
    1. Przygotuj miks master zgodnie z Tabelą 1. Na końcu dodaj polimerazę i trzymaj mieszankę główną na lodzie, aby zachować stabilność.
    2. Przeprowadzić badanie PCR w następujących warunkach: początkowa denaturacja: 30 s przy 95 °C; 30 cykli: 20 s przy 95 °C (denaturacja), 20 s przy 55 °C (wyżarzanie), 15 s przy 72 °C (wydłużenie); Końcowe wydłużenie: 2 minuty przy 72 °C; Utrzymuj temperaturę 4 °C.
  4. Stosuj mieszaninę reakcji PCR w dalszej reakcji transkrypcji in vitro (IVT).
    1. Przygotuj mieszankę główną IVT zgodnie z Tabelą 2 i inkubuj przez 1,5 godziny w 37 °C. Użyj termocyklera do stałej kontroli temperatury.
    2. Dodaj 2 μL DNazy I i inkubuj przez kolejne 30 minut w temperaturze 37 °C, aby usunąć matrycę DNA.
    3. Inaktywuj DNazę I poprzez inkubację mieszaniny reakcji w 75 °C przez 5 minut.
    4. Oczyszczaj RNA za pomocą odczynnika TRIZOL zgodnie z protokołem producenta.
      UWAGA: Utylizacja odczynnika TRIZOL oraz DNAse1, jego roztworów lub jakichkolwiek produktów ubocznych powinna być umieszczana w wyznaczonych pojemnikach na odpady chemiczne.
    5. Zmierz stężenie RNA za pomocą spektrofotometru (typowa wydajność jednej reakcji wynosi 3-5 μg). Sprawdź przełożenia A260/A280 oraz A260/A230. A260/A280 powinien mieć co najmniej 2,0, a stosunek A260/A230 również powinien być co najmniej 2,0 (czyli nie ma zanieczyszczenia białkami ani rozpuszczalnikami organicznymi). Przechowuj sgRNA w temperaturze -80 °C do czasu użycia.
  5. Przygotuj mieszankę RNP do transfekcji
    1. Mieszanka transfekcyjna składa się z kompleksu RNP, który jest mieszaniną białka Cas9 i sgRNA. Postępuj zgodnie z tymi krokami, aby przygotować miks RNP:
    2. Rozcieńcz bufor 1 M Tris-HCl (pH 7,5) do 100 mM wodą wolną od nukleazy i filtruj filtrem strzykawkowym o porze 0,022 μM, podaj w porach po 10 μL i przechowuj w 4 °C do czasu użycia.
    3. W probówce wolnej od nukleazy przygotuj mieszankę transfekcyjną następujących składników w końcowych stężeniach: nukleaza spCas9 500 ng/μL, sgRNA 80 ng/μL, 10 mM Tris-HCl rozcieńczona wodą poddawaną DEPC.
      UWAGA: Wymagane są wysokie stężenia składników mieszanki RNP, aby zapewnić właściwą efektywność protokołu.
    4. Inkubuj mieszankę transfekcyjną w temperaturze 37 °C przez 10 minut, aby umożliwić powstanie kompleksu RNP.
    5. Aliquotuj mieszankę na małe objętości (2 μL) odpowiednie na jedną sesję I-GONAD.
    6. Utrzymuj alikwoty na poziomie 4 °C podczas sesji I-GONAD. Miksie przygotowuje się na świeżo do każdej sesji elektroporacji I-GNANO, aby zachować stabilność.
      UWAGA: Mieszanka RNP powinna być przygotowywana świeżo na każdą sesję I-GONAD, aby zapewnić optymalną aktywność i efektywność.

2. Przygotowanie samic myszy do edycji genomu poprzez dostarczanie kwasów nukleinowych do jajowódu

  1. Kopulacja i selekcja samic myszy: Łącz samice myszy CD1 z samcami CD1 w nocy w jednym miejscu. Rano sprawdź, czy u samic myszy nie ma korków do kopulacji. Wybieraj samice z korkami do kopulacji i przenosi je do nowej klatki na dalsze zabiegi.
    UWAGA: Aby zminimalizować mozaicizm genetyczny, optymalny czas na dostarczenie konstrukcji genetycznej to 0,7 dnia po kopulacji na etapie pojedynczokomórkowym (zygota)10. Odpowiada to mniej więcej godzinie 16:00 w dniu, w którym wykryto korek kopulacyjny. Na tym etapie rozwarstwienie przewodu jajowego ujawnia, że zygoty mają mniej komórek kumulusowych, choć pozostają one w ampeli. Co istotne, komórki kumulusowe mogą również pobierać egzogenne kwasy nukleinowe lub białka podczas elektroporacji. Jeśli zabieg zostanie wykonany wcześniej, na przykład 10 godzin po kopulacji, komórki kumulusowe nadal ściśle otaczają zygoty, co może utrudniać efektywne dostarczanie kwasów nukleinowych elektroforetycznym do zygot. Nie używaj myszy pobudzonych hormonalnie, ponieważ mogą one produkować zbyt wiele oocytów, co może prowadzić do poronienia.
  2. Przygotowanie narzędzi chirurgicznych: Autoklaw wszystkie narzędzia chirurgiczne ze stali nierdzewnej, aby zapewnić bezpłodność. Wszystkie przedmioty nieze stali nierdzewnej, które mają kontakt z narządami wewnętrznymi myszy, powinny być dostarczane jako produkty sterylne lub jednorazowe.
  3. Znieczulenie, znieczulenie i przygotowanie myszy: Zważ wybrane samice myszy i nałóż roztwór meloksykamu (5 mg/kg, s.c.) 15 minut przed indukcją znieczulenia. Znieczulanie myszy za pomocą iniekcji dootrzewnowej z mieszanką ketaminy (100 mg/kg) i ksylazyny (10 mg/kg) (zgodnie z zatwierdzonymi protokołami instytucjonalnymi).
    1. Monitoruj myszy pod kątem utraty odruchu szczypania palców, aby potwierdzić odpowiednie znieczulenie. Umieść znieczuloną mysz na termoforze, aby utrzymać temperaturę ciała podczas zabiegu. Chroń oczy myszy przed suchością podczas znieczulenia, nakładając maść weterynaryjną.

3. Zabieg chirurgiczny

  1. Usuń włosy z miejsca operacji i zdezynfekuj skórę peelingiem lub roztworem z chlorheksydyną lub betadyną, a następnie nałóż 70% etanolu w trzech naprzemiennych przejściach.
  2. Zrób 0,7 cm podłużnego nacięcia skórnego w dolnej części pleców...
  3. Przedłuż nacięcie do 1,3 cm, pchając bocznie lekko rozchylonymi końcówkami nożyczek.
  4. Ostrożnie wykonaj małe nacięcie (0,7 cm) w otrzewnej, aby dostać się do jamy brzusznej.
  5. Przedłuż nacięcie do 1,1 cm, przesuwając bocznie lekko otwartymi końcówkami nożyc.
  6. Zlokalizuj poduszkę tłuszczową przymocowaną do jajnika i delikatnie ją wyciągnij za pomocą kleszczy, aż jajnik, jajowód i macica będą wyraźnie widoczne.
  7. Przymocuj tłuszczową poduszkę na miejscu za pomocą zacisku naczyniowego.
  8. Wizualizuj jajowód pod mikroskopem stereoskopowym dla precyzyjnej manipulacji (Rysunek 1).
  9. Załaduj 2 μL mieszanki do wtrysku do sterylnej płytki włosowatej plastikowej za pomocą pipetora stripper.
    UWAGA: Pipettor Stripper z jałowymi naczyniami włosowatymi z tworzywa sztucznego, pierwotnie zaprojektowany do manipulacji zarodkami w klinikach IVF, może wspierać wiele zastosowań, w tym transfer zarodków oraz dostarczanie konstrukcji CRISPR/Cas9 w procedurach I-GONAD. Pipettor pełni funkcję precyzyjnego dozownika cieczy; W połączeniu ze sterylnymi, jednorazowymi, elastycznymi kapilarami umożliwia sterylność i zapobiega krzyżowemu zanieczyszczeniu. Krewne naczynia włosowate są lepsze niż szkło do wstrzykiwania mieszanki RNP do transfekcji do jajowódu, ponieważ są mniej urazowe dla delikatnych tkanek. W przeciwieństwie do szklanych kapilar, jednorazowe plastikowe nie wymagają polerowania ogniem, aby wygładzić ostre krawędzie przed włożeniem, co skraca czas przygotowania i ryzyko uszkodzenia.
  10. Za pomocą mikronożyczek wykonaj małe nacięcie (0,2 cm) w ścianie przewodu jajowego kilka milimetrów powyżej ampuły.
  11. Ostrożnie włóż pipettor Stripper z plastikową kapilarą do nacięcia i wypchnij mieszankę do jajowódu.
    UWAGA: Upewnij się, że powietrze nie dostaje się do jajowódu, ponieważ może to wpływać na efektywność elektroporacji.
    Aby temu zapobiec, napełnij naczyń z plastikiem do zastrzyków większą ilością mieszanki do wstrzykiwania niż to konieczne i unikaj całkowitego wstrzykiwania. Płytki włosowate tworzywne nadają się zarówno do przenoszenia zabłonka do zapłodnienia, jak i do bezpośredniej sekcji ściany jajowodu pomiędzy zapłodnikiem a ampułką. Metoda bezpośredniego rozcinania ściany jajowodu może być mniej traumatyczna niż transfer z infundibulum, ponieważ ten drugi wymaga początkowego nacięcia przez cienką błonę kaletki pokrywającą jajowód i infundibulum. U myszy CD1 błona ta jest silnie unaczyniona, a jej przecięcie może powodować niewielkie krwawienie, co może utrudnić widoczność i utrudnić mikroiniekcję mieszanki RNP.
  12. Delikatnie usuń plastikową kapilarę z jajowódu.

4. Elektroporacja i szycie

  1. Włącz elektroporatora, naciskając przełącznik na przednim panelu.
  2. Ustaw parametry elektroporacji: Impuls poracyjny: Napięcie: 50 V, Długość impulsu: 5 m, Interwał impulsów: 50 ms, Liczba impulsów: 3, Szybkość zaniku - 10%, Polaryzacja: +/-; Impuls transferowy: Napięcie: 10 V, Długość impulsu: 50 ms, Interwał impulsów: 50 ms, Liczba impulsów: 3, Szybkość zaniku - 40%, polaryzacja: +/-; Limit obecny: in vivo.
  3. Za pomocą elektrod typu pęsetowego ostrożnie chwyć jajowód i sprawdź wartość rezystancji, naciskając przycisk kΩ na elektroporatorze. Upewnij się, że elektrody są wystarczająco sprężone, aby rezystancja pozostawała w optymalnym zakresie 350-400 Ω.
    UWAGA: Można to osiągnąć, regulując odległość między dwoma elektrodami, gdy nienaruszony jajowód jest umieszczony między nimi.
    1. Bezpośrednio po zmierzeniu oporu naciśnij przycisk Start, aby rozpocząć elektroporację. Ten krok jest kluczowy dla zapewnienia efektywnego dostarczania składników CRISPR-Cas do zygot4. Poczekaj, aż przycisk Ω wyświetli sygnał "zakończenie". Zapisz wartości pokazane w ramce Pomiarów.
      UWAGA: Wartość impedancji powinna wynosić około 250-400 Ω/150-250 mA wartości napięcia, aby zapewnić optymalną równowagę między żywotnością a efektywnością transferu. Aby utrzymać tę równowagę, należy unikać pokrywania obszarów jajowodów kawałkiem mokrego papieru nasączonym zmodyfikowaną solą fosforanową (DPBS) Dulbecco, zalecaną w niektórych protokołach, ponieważ ten krok może znacząco zmniejszyć opór powyżej optymalnego zakresu. Zmniejszona rezystancja może podnieść napięcie do ponad 250 mA, prowadząc do śmierci komórek.
  4. Po zakończeniu elektroporacji jednego jajowodu ostrożnie umieść drogi rozrodcze z powrotem w jamie brzusznej. Zszyj nacięcie za pomocą chirurgicznego szwu z kwasem poliglikolowym 4-0.
  5. Powtórz operację i elektroporację na drugim jajowodzie. Po zakończeniu przywróć drogi rozrodcze do jamy brzusznej i zszyj nacięcie zgodnie z opisanym powyżej.
  6. Monitorowanie po zabiegu: Umieść mysz w ciepłej (37 °C), wyczyść klatkę na czas rekonwalescencji i monitoruj, aż całkowicie wyzdrowieje po znieczuleniu.
    UWAGA: Po operacji trzymaj myszy w klatkach zawierających po dwie myszy w każdej klatce. Jeśli tylko jedna mysz przeszła operację, zapewnij jej towarzyszkę. Ta praktyka pomaga zmniejszyć niepotrzebny stres u myszy chirurgicznej i sprzyja bardziej naturalnemu środowisku społecznemu. Po 12 godzinach wykonaj drugi zastrzyk środka przeciwbólowego (meloksykam, 5 mg/kg, s.c.).

5. Genotypowanie

  1. Konstrukcja spłonka
    1. Do genotypowania projektuj startery wzmacniające produkt PCR o długości od 300 do 600 bp. Startery powinny mieć długość 18-21 nukleotydów i temperaturę topnienia (Tm) około 60 °C.
    2. Unikaj sekwencji tworzących struktury wtórne lub dimery podkładowe. Korzystaj z narzędzi programowych takich jak PerlPrimer 1.1.2111, In-Silico PCR V39x1 lub podobnych, aby zapewnić jakość podkładu.
    3. Wykonaj wyszukiwanie BLAST w bazie genomu myszy, aby potwierdzić specyficzność starterów i uniknąć niespecyficznego amplifikowania11.
      UWAGA: Następujące zapalniki zostały zaprojektowane do genotypowania sekwencji docelowej: Zapalnik przedni: 5'-CTCTCCCAAGTCGCTCTGA-3'; Odwrotny zapalnik: - 5'-TCTGTGGGAAGTCTTGTCCC-3', oczekiwana długość produktu PCR: 320 bp, Tm 62°C. Do sekwencjonowania Sangera zaprojektuj podkład sekwencjonowy, który wyżarza 150-200 bp od miejsca cięcia Cas9.
  2. Wykonaj ekstrakcję DNA. Do szybkiej ekstrakcji DNA najprostszy jest protokół izolacji Hotshot12 .
    1. Za pomocą ciosuka do ucha pobierz mały fragment tkanki (około 2 mm) z ucha myszy.
    2. Dodaj 100 μL buforu lizy (25 mM NaOH, 0,2 mM EDTA, pH = 12).
    3. Inkubuj w 95 °C przez 60 minut, wirując mieszankę co 20 minut.
    4. Dodaj 100 μL buforu neutralizującego (40 mM Tris-HCl, pH = 5) i dokładnie przeszukaj wiry.
    5. Użyj 1-5 μL końcowego przygotowania do PCR.
  3. Wzmacnianie i sekwencjonowanie PCR. Przygotuj mieszankę PCR zgodnie z Tabelą 3. Użyj polimerazy DNA do korekty, aby zapewnić wysoką wierność. Aliquot master miesza w wymaganej liczbie probówek i dodaje DNA genomowe.
    UWAGA: Zawsze uwzględniaj próbkę DNA typu dzikiego jako kontrolę do analizy sekwencjonowania.
  4. Zrób PCR do genotypowania ROSA26 . Zastosowano następujące warunki: początkowa denaturacja: 30 s przy 95 °C; 28 cykli: 20 s przy 95 °C (denaturacja), 20 s przy 62 °C (wyżarzanie), 20 s przy 72 °C (wydłużenie); Końcowe wydłużenie: 2 minuty przy 72 °C; Utrzymuj temperaturę 4 °C.
    UWAGA: Dostarczony protokół jest dokładny dla amplifikacji fragmentu locus ROSA26 (szacowany rozmiar 320 bp) przy użyciu starterów z kroku 1.1.2. Aby uzyskać bardziej precyzyjne i dokładne wzmocnienie, ogranicz liczbę cykli wzmacniania do 28-30.
  5. Sekwencjonowanie i analiza
    1. Wykonaj sekwencjonowanie Sangera uzyskanych fragmentów PCR (krok 5.4).
    2. Analiza wyników sekwencjonowania
      UWAGA: Udana transfekcja skutkuje powstaniem mozaikowych zwierząt, rozpoznawalnych po pojawieniu się dodatkowych sekwencji DNA w pobliżu miejsca przecięcia nukleazy w chromatogramie sekwencjonującym. Korzystaj z narzędzi obliczeniowych, takich jak EditCo ICE Analysis czy TIDE13 , aby zidentyfikować i ilościowo określić indele w genomie.
      1. Aby użyć analizy ICE, wystarczy przesłać uzyskane pliki sekwencjonowania Sangera (plik kontrolny .ab1 dla sekwencji produktu PCR myszy bez edycji oraz plik .ab1 eksperymentu dla sekwencji produktu PCR z myszy eksperymentu), wpisać sekwencję RNA prowadzącą i wybrać nukleazę użytą w eksperymencie CRISPR.
        UWAGA: Narzędzie ICE Analysis oblicza ogólną efektywność edycji oraz określa profile i względne liczebności wszystkich różnych typów edycji obecnych w próbce.
      2. Aby użyć TIDE, wprowadź sekwencję RNA prowadzącą, prześlij uzyskane pliki sekwencjonowania Sangera (plik .ab1 dla sekwencji produktu PCR wt mouse bez edycji oraz plik eksperymentalny .ab1 dla sekwencji produktu PCR eksperymentalnej) i sprawdź parametry (w niektórych przypadkach zaawansowane ustawienia pomagają znaleźć indele większe niż 10 bp).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Jeśli elektroporacja zakończyła się sukcesem, eksperymentalne myszy: (1) urodziły garstkę młodych, a (2) niektóre zwierzęta będą miały inne indele w genomie. Jeśli startery genotypizujące są dobrze zaprojektowane, a program PCR optymalny, produkt PCR będzie obecny na żelu agarozowym jako jeden przezroczysty pas o pożądanym rozmiarze. Jeśli nukleaza skutecznie przecina docelowe DNA, uzyskane zwierzęta prawdopodobnie będą mozaikowe i będą miały szereg indelów w genomie. Do znalezienia dokładnych indelów w genomie użyto nar...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Efektywność generowania myszy nokautujących metodą I-GONAD jest porównywalna z tradycyjną techniką mikroiniekcji. Tradycyjne metody polegają jednak na izolowaniu zygot od samic dawcy, wykonywaniu mikrozastrzyków oraz przeszczepianiu zarodków do jajowódów pseudo-ciężarnych samic. Dla kontrastu, metoda I-GONAD upraszcza ten proces, dostarczając komponenty edytujące genom bezpośrednio do jajowódów u ciężarnych samic, eliminując potrzebę izolacji i przeszczepu zygot. Przedstawiony protokół podkreśla skuteczność metody I-GONA...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

Autorzy są wdzięczni Uniwersytetowi Badawczemu w Peterburgu, Centrum Technologii Molekularnych i Komórkowych. Sekwencjonowanie przeprowadzono za pomocą analizatora genetycznego ABI 3500 xL (Thermo Fisher Scientific, USA) w Centrum Zasobów Technologii Molekularnych i Komórkowych, Parku Naukowego Uniwersytetu Państwowego w Petersburgu. Autorzy są wdzięczni Marii Rubel za pomoc w redagowaniu i przesyłaniu dokumentów. Badania te zostały sfinansowane przez Uniwersytet Państwowy Petersburski, projekt badawczy ID: 129658320, a Luibov Shkodenko był wspierany przez Rosyjską Fundację Naukową (projekt 25-26-00247).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,5 i zarytka; 5 uL pipetek Thermo Scientific4642020
Rurka 1,5 mLAptaca1003/G
100-1000 uL pipetki Thermo Scientific4642090
Lampa 200 uLAxygenPCR-02-C
20-200 uL pipetki Thermo Scientific4642080
2-20 uL pipetki Thermo Scientific4642060
4x żelowy barwnik do ładowaniaBiolabmixD-3002
AgaroseAppliChemA8963,0500
DNaza I, wolna od RNazy (1 U/μ L)Thermo FisherEN0521
Zestaw dNTP, rozwiązanie 100 mMThermo ScientificR0181
Polimeraza DNA DreamTaq Green (5 U/μ L)Thermo ScientificEP0713
Dulbecco' s zmodyfikowana sól fizjologiczna z buforem fosforanowymSigma AldrichD8537
Analiza ICE w EditCohttps://ice.editco.bio/#/dostęp 04.06.2025
Roztwór EDTA 0,5M, pH = 8AppliChemA4892,0500
Ensembl  https://www.ensembl.org/index.htmldostęp 09.06.2025
Bromek etidyBiolabmixEtBr-10
Krople żelowe do oczu" Oftagel"URSAPHARM204604
System dokumentowania żelu ChemiDoc XRS+Bio-Rad1708265
In-Silico PCR V39x1 https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgPcr  dostęp 09.06.2025
Zintegrowane technologie DNA https://eu.idtdna.comdostęp 09.06.2025
Nożyczki mikrochirurgiczneMedin URALM124
Elektroporator NEPA21Nepa GeneNEPA21Z elektrodą CUY652P2,5X4
Zestaw NTP, rozwiązanie 100 mMThermo ScientificR0481
OligonukleotydyEvrogenBezpośrednie zamówienie, standardowe oczyszczanie odsalania
Opti-MEM I Zredukowane Medium SerumThermo Fisher31985070
PerlPrimerhttps://perlprimer.sourceforge.netWersja 1.1.21.
Phusion Wysokowierna polimeraza DNA (2 U/μ L)Thermo ScientificF530L
Końcówki pipette 10 uLUlplastHT-10-960
Końcówki pipette 1000 uLUlplastHT-1000-576
Końcówki Pipette 200 uLUlplastHT-200-960
Zasilacz " Elf-4"Technologia DNAPS-400 NOWY
Woda wolna od RNAse/DNAInvitrogen10977049
Roztwór soli fizjologicznejPanEcoP011n
System elektroforezy horyzontalnej SE-1HelikonSE-1
Wodorotlenek soduSigma-AldrichS5881-500G
Drabinka DNA Step100BiolabmixS-8100
Stereomikroskop SMZ1000Nikon5-363376
Mikropipeter ze stripperemCooperSurgicalMXL3-STR
Końcówki do stripperaORIGIOMXL3-125
Igła chirurgiczna KMIZ4A1- 0,6& razy; 20
Kleszcze szawczeMedin URALM302.2
Kleszcze szawczeMedin URALM303
Nić szycia POLYCON Nfigure-materials-10Tonzos 95234
SYNTHEGO Knockout Guide Design https://design.synthego.com/#/dostęp 09.06.2025
Wzmacniacz T100BioRad10014822
polimeraza RNA T7 Thermo ScientificEP0111
Bufor TBE 10xBiolabmixTBE-500
Tide https://tide.nki.nl/dostęp 04.06.2025 oraz nbsp;
Tris chlorowodorekSuzhou Yacoo ScienceSYS-S0005-0.5
Roztwór chlorowodorku trizmySigma AldrichT2663
Odczynnik TRIzolInvitrogen15596026
Białko TrueCut Cas9InvitrogenA36499
Nożyczki uniwersalneMedin URALM147
KsylazynaInterchemie Werken de AdelaarIX2
ZoletilLaboratorium Virbac2000443714739.00

Bibliografia

  1. Fujihara, Y., Ikawa, M. CRISPR/Cas9-Based Genome Editing in Mice by Single Plasmid Injection. Methods Enzymol. 546, 319-336 (2014).
  2. Zuo, E., et al. One-step generation of complete gene knockout mice and monkeys by CRISPR/Cas9-mediated gene editing with multiple sgRNAs. Cell Res. 27 (7), 933-945 (2017).
  3. Hubrecht, R. C., Carter, E. The 3Rs and humane experimental technique: Implementing change. Animals. 9 (10), 754(2019).
  4. Kobayashi, Y., et al. Modification of i-GONAD suitable for production of genome-edited C57BL/6 inbred mouse strain. Cells. 9 (4), 957(2020).
  5. Takabayashi, S., et al. Successful i-GONAD in mice at early zygote stage through in vivo electroporation three minutes after intra-oviductal instillation of CRISPR-ribonucleoprotein. Int J Mol Sci. 23 (18), 10678(2022).
  6. Sato, M., et al. Sequential i-GONAD: An improved in vivo technique for CRISPR/Cas9-based genetic manipulations in mice. Cells. 9 (3), 546(2020).
  7. Kessler, S., et al. A multiple super-enhancer region establishes inter-TAD interactions and controls Hoxa function in cranial neural crest. Nat Commun. 14 (1), 3242(2023).
  8. Kaneko, T., Tanaka, S. Improvement of genome editing by electroporation using embryos artificially removed cumulus cells in the oviducts. Biochem Biophys Res Commun. 527 (4), 1039-1042 (2020).
  9. Gurumurthy, C. B., et al. Creation of CRISPR-based germline-genome-engineered mice without ex vivo handling of zygotes by i-GONAD. Nat Protoc. 14 (8), 2452-2482 (2019).
  10. Ohtsuka, M., et al. i-GONAD: A robust method for in situ germline genome engineering using CRISPR nucleases. Genome Biol. 19 (1), 25(2018).
  11. Marshall, O. J. PerlPrimer: Cross-platform, graphical primer design for standard, bisulphite and real-time PCR. Bioinformatics. 20 (15), 2471-2472 (2004).
  12. Truett, G. E., et al. Preparation of PCR-quality mouse genomic DNA with hot sodium hydroxide and Tris (HotSHOT). BioTechniques. 29 (1), 52-54 (2000).
  13. Brinkman, E. K., Van Steensel, B. Rapid quantitative evaluation of CRISPR genome editing by TIDE and TIDER. CRISPR Gene Editing. 1961, 29-44 (2019).
  14. Imai, Y., Tanave, A., Matsuyama, M., Koide, T. Efficient genome editing in wild strains of mice using the i-GONAD method. Sci Rep. 12 (1), 13821(2022).
  15. Iwata, S., et al. Simple and large-scale chromosomal engineering of mouse zygotes viain vitro and in vivo electroporation. Sci Rep. 9 (1), 14713(2019).
  16. Abe, M., et al. A novel technique for large-fragment knock-in animal production without ex vivo handling of zygotes. Sci Rep. 13 (1), 2245(2023).
  17. Meyer-Dilhet, G., Courchet, J. In utero cortical electroporation of plasmids in the mouse embryo. STAR Protocols. 1 (1), 100027(2020).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

CRISPR Cas9kompleks rybonukleoproteinowyelektroporacja zygotsekwencjonowanie metod Sangeraprojektowanie przewodz cego RNAgenotypowanie metod PCR

Powiązane artykuły