Optymalizacja i ocena ręcznego rysowania i przędzenia na mokro w produkcji rekombinowanych włókien jedwabiu pajęczego

Anupama Ghimire; Hina Batool; Sara Evans; Suad Rashid; Donovan L. Rainey; Andrew A. Y. Chen; Xiang-Qin Liu; Jan  K. Rainey

doi:10.3791/68714

Artykuł metodologiczny

Optymalizacja i ocena ręcznego rysowania i przędzenia na mokro w produkcji rekombinowanych włókien jedwabiu pajęczego

DOI:

10.3791/68714

⸱

29 lipca 2025

Anupama Ghimire^*¹ , Hina Batool^*¹ , Sara Evans^*² , Suad Rashid^*¹ , Donovan L. Rainey¹ , Andrew A. Y. Chen¹ , Xiang-Qin Liu¹ , Jan K. Rainey¹^,²^,³

¹Department of Biochemistry & Molecular Biology, Dalhousie University, ²Department of Chemistry, Dalhousie University, ³School of Biomedical Engineering, Dalhousie University

^* These authors contributed equally

W tym artykule

Informacja o sprostowaniu

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prezentowany protokół dostarcza wszechstronnego zestawu metod optymalizacji solubilizacji rekombinowanych białek jedwabiu do przędzenia; testowania przędzalni za pomocą ręcznego rysowania; wytwarzania długich, ciągłych włókien za pomocą automatycznego przędzenia na mokro; i porównawczej oceny morfologii, dopasowania molekularnego, zachowania mechanicznego i zawartości strukturalnej wtórnych białek we włóknach lub w ich obrębie.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nici pajęcze są znane ze swoich właściwości mechanicznych, z charakterystyczną dla nich wysoką wytrzymałością, wysoką rozciągliwością, lub kombinacją tych cech prowadzących do wysokiej wytrzymałości. Typowa samica pająka tkającego kule wytwarza siedem różnych rodzajów jedwabiu, z których każdy jest zazwyczaj przędzony z białka (białek) specyficznych dla danego typu i mechanicznie dostosowany do odrębnej funkcji przetrwania. Rekombinowana produkcja jedwabiu pajęczego stanowi obiecującą drogę do uzyskania tych materiałów, omijając wyzwania związane z pozyskiwaniem dużych ilości naturalnego jedwabiu i zapewniając korzyści w zakresie umożliwiania dostosowywania białek, na przykład poprzez mutagenezę ukierunkowaną na miejsce lub budowę białek fuzyjnych.

W przedstawionym protokole przedstawiamy metodologię oceny przydatności białka do przędzenia, zarówno metodą ręcznego, jak i mokrego. Począwszy od odpowiednio oczyszczonego liofilizowanego białka w proszku, szczegółowo opisano metody optymalizacji początkowego stanu rozpuszczonego białka w celu zapewnienia stanu "wirującego dopingu" o wysokim stężeniu. Następnie porównano metody ręcznego rysowania i przędzenia na mokro, w tym omówiono metody modulowania zachowania włókien za pomocą losowania po wirowaniu jako części procesu przędzenia. Następnie szczegółowo opisano typowy proces pracy mający na celu scharakteryzowanie powstałych włókien jedwabiu i podjęcie decyzji, które warunki przędzenia najprawdopodobniej będą owocne, w tym mikroskopia optyczna w celu oceny średnicy włókna i jego jednorodności; mikroskopia światła spolaryzowanego w celu oszacowania stopnia (supra)molekularnego wyrównania osiąganego we włóknie; próby rozciągania w celu oceny wytrzymałości, rozciągliwości, modułu Younga i wytrzymałości; i spektromikroskopia w podczerwieni z transformacją Fouriera (FTIR) w celu oceny wtórnej struktury białek we włóknie.

Ten protokół okazał się odpowiedni dla kilku różnych rekombinowanych białek pajęczej nici opartych na powtarzających się i niepowtarzalnych domenach jedwabiu grzyskowatego (owijającego); jedwabiu gruszkowatego; oraz białek fuzyjnych zawierających jedwab groniasty, gruszkowaty i/lub ampułkowy (ciągnący). Szersze zastosowanie jest zapewnione poprzez kilka wyróżnionych etapów, w których warunki i parametry mogą być zmieniane w celu dopasowania do zachowania pojedynczego białka i osiągnięcia różnic w wynikach funkcjonalnych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pająki produkują jedwabie do różnych specjalistycznych zadań, w tym do budowy sieci, chwytania zdobyczy i ochrony jaj¹. Nici pajęcze wykazują wyjątkowe właściwości mechaniczne, które przewyższają większość znanych materiałów naturalnych i syntetycznych², co skłania do znacznych wysiłków w kierunku produkcji zmodyfikowanych i ulepszonych materiałów z jedwabiu pajęczego do różnych zastosowań przemysłowych i biomedycznych. Spidroina, białko tworzące pajęczą nić, składa się ze stosunkowo dużej, powtarzalnej domeny ograniczonej niepowtarzalnymi domenami N-końcowymi i C-końcowymi³, przy czym unikalne właściwości mechaniczne niektórych rodzajów jedwabiu zostały powiązane z powtarzaniem krótkich motywów w powtarzalnej domenie⁴^,⁵^,⁶. W przeciwieństwie do komercyjnie uprawianego jedwabnika morwowego (Bombyx mori), który wytwarza duże ilości jedwabiu w spójnym formacie kokonu nadającym się do zbioru, pająki są z natury kanibalicznymi i terytorialnymi organizmami, które produkują jedwab w ograniczonych ilościach, co stanowi wyzwanie dla produkcji rolnej i zbierania⁷. Biorąc pod uwagę te ograniczenia, rekombinowana produkcja nici pajęczej została opracowana jako bardziej wykonalna i zrównoważona alternatywa dla kontrolowanego uzyskania wystarczających ilości nici pajęczej do aplikacji.

Produkcja rekombinowanej nici pajęczej wymaga wyboru odpowiedniego gospodarza do ekspresji białka. Jedwab pajęczy ulega ekspresji w różnych systemach gospodarzy, w tym w bakteriach⁸^,⁹, drożdże¹⁰^,¹¹, komórki owadów¹², plants¹³^,¹⁴ i komórki ssaków¹⁵^,¹⁶, z Escherichia coli jest najczęściej używanym systemem hosta. Wysoka masa cząsteczkowa spidroin, która może osiągać nawet 700 kDa⁷, stanowi poważne wyzwanie dla ekspresji konstruktów o pełnej długości. Aby wyprodukować rekombinowaną nić pajęczą o porównywalnych lub ulepszonych właściwościach w stosunku do naturalnych pajęczych nici, podstawową strategią stosowaną jest ekspresja skróconych wariantów, takich jak konstrukty z ograniczoną liczbą powtarzających się jednostek (z niepowtarzalnymi domenami lub bez), chimery składające się z kombinacji różnych rodzajów jedwabiu oraz jedwabie hybrydowe połączone z białkami niezwiązanymi z jedwabiem. Na przykład rekombinowana duża ampullatowa spidroina (284,9 kDa) została z powodzeniem wyrażona w metabolicznie zmodyfikowanej E. coli, a uzyskany jedwab wykazywał właściwości mechaniczne porównywalne z naturalnymi głównymi ampullatami jedwabiu⁹. Ponadto zmodyfikowane włókno jedwabiu składające się z dwóch powtarzających się jednostek spidroiny gruszkowatej i dwóch powtarzających się jednostek spidroiny gwarkowatej wykazało lepszą rozciągliwość w stosunku do któregokolwiek ze składników jedwabiu gruszkowatego lub aciniformae, porównywalną z jedwabiem naturalnym w kształcie wiciowców¹⁷.

Produkcja białek rekombinowanych umożliwia również prostą inkorporację funkcjonalnych segmentów peptydów lub białek do białek jedwabiu, umożliwiając wytwarzanie biomateriałów o właściwościach dostosowanych do konkretnych zastosowań. Na przykład, genetyczna i chemiczna fuzja motywów wiążących komórki RGD z genetycznie modyfikowanym jedwabiem pochodzącym z głównych spidroin ampulalowych zaowocowała powstaniem filmów, które znacznie zwiększyły adhezję i proliferację fibroblastów¹⁸. W innym badaniu wykazano, że hybrydowy konstrukt jedwabiu składający się z motywu wiążącego czynnik wzrostu nerwów β (NGF) połączonego z chimerycznym białkiem składającym się z dwóch powtarzających się jednostek spidroiny owadolistnej i domeny C-końcowej głównej spidroiny ampullatowej wykazano, że wspiera wzrost i różnicowanie komórek podobnych do neuronów¹⁹.

Po pomyślnym wyrażeniu i oczyszczeniu rekombinowanego białka jedwabiu, może ono następnie zostać przetworzone na różne formy, takie jak hydrożele, folie, włókna, nanocząsteczki, pianki i gąbki, w zależności od zamierzonego zastosowania²⁰^,²¹. Aby umożliwić produkcję włókien sztucznego jedwabiu, opracowano metody przędzenia, które imitują pewne aspekty wysoce złożonego i ściśle regulowanego procesu przędzenia włókien naturalnych pająków. W naturalnym dużym jedwabiu ampulatowym spidroiny są wytwarzane przez komórki nabłonkowe w głównym gruczole ampułkowym i przechowywane w stanie rozpuszczalnym w świetle w wysokich stężeniach (do 50% (w/v))22, tworząc wodny domieszkę wirującą. Gdy przędzący domieszka przemieszcza się przez kanał przędzalniczy, doświadcza zmian pH, stężenia jonów, zawartości wody i sił ścinających spowodowanych zarówno zwężeniem kanału, jak i procesem pultruzji włókien, co indukuje przemianę płynnych białek jedwabiu we włókna stałe²³^,²⁴. Identyfikacja odpowiedniego rozpuszczalnika, który może rozpuszczać lub zawieszać rekombinowane białka jedwabiu w wysokim stężeniu w celu utworzenia domieszki przędzącej, jest zatem kluczowym pierwszym krokiem w procesie przędzenia włókien sztucznych.

Szeroka gama rozpuszczalników została wykorzystana do formułowania dopingu z białka jedwabiu, a wybór rozpuszczalnika okazał się mieć wpływ na tworzenie włókien i właściwości mechaniczne²⁵^,²⁶. W związku z tym staranne rozważenie wyboru rozpuszczalnika domieszkującego jest niezbędne do optymalizacji uzyskanych właściwości włókien. Domieszka przędzalnicze mogą być formułowane przy użyciu rozpuszczalników organicznych lub wodnych, takich jak 1,1,1,3,3,3-heksafluoroizopropanol (HFIP)²⁷, heksafluoroaceton (HFA)²⁸, mieszaniny kwasu trifluorooctowego (TFA) i 2,2,2-trifluoroetanolu (TFE)²⁶, kwas mrówkowy²⁹ i fosforan sodu/Tris buffer³⁰. Ponieważ na rozpuszczalność białek zwykle wpływają takie czynniki, jak pH, siła jonowa i stężenie, identyfikacja odpowiedniego rozpuszczalnika domieszkującego zazwyczaj obejmuje systematyczną ocenę różnych rozpuszczalników, optymalizację pH i stężeń białek, a w niektórych przypadkach stosowanie mieszanin rozpuszczalnika i wody w celu określenia optymalnych warunków domieszkowania przędzenia. Co więcej, lepkość domieszki przędzącej jest ważnym parametrem, który należy ocenić przed procesem przędzenia, ponieważ roztwór domieszkowki o wysokiej lepkości może utrudniać przepływ płynu podczas przędzenia, podczas gdy domieszka o niskiej lepkości zazwyczaj nie będzie odpowiednia do tworzenia włókien³¹^,³². Należy zauważyć, że stosowanie surowych warunków domieszkowania spinowego może zmienić strukturę białka przy długotrwałym narażeniu; W związku z tym rozwój przyjaznych dla środowiska rozpuszczalników dopingowych pozostaje aktywnym obszarem badań.

Ręczne rysowanie i przędzenie na mokro to dwie popularne metody przędzenia rekombinowanych włókien jedwabiu. Właściwości mechaniczne włókien wytwarzanych każdą metodą są w dużym stopniu zależne zarówno od samych warunków przędzenia, jak i od obróbki po przędzeniu. Rysowanie ręczne, zwane również przędzeniem ciągniętym, to prosta metoda produkcji włókien, w której włókna są pobierane z roztworów oczyszczonych białek, zwykle za pomocą końcówki pipety, kleszczyków lub pęsety, a następnie suszone na powietrzu i charakteryzowane³³^,³⁴^,³⁵^,³⁶^,³⁷. Podczas gdy ręczne rysowanie stanowi doskonałe podejście do szybkiego przesiewania różnych warunków tworzenia się włókien jedwabiu i ogólnego klasyfikowania wynikowego zachowania mechanicznego włókien, technika ta nie jest łatwo skalowalna do długich (tj. wielometrowych) ciągłych włókien. Jako alternatywę stosujemy przędzenie na mokro, które polega na ciągłym wytłaczaniu przędzącego domieszki ze stałą prędkością do kąpieli koagulacyjnej, zazwyczaj wodnego lub organicznego rozpuszczalnika składającego się z mieszaniny wody i etanolu lub metanolu9^,¹⁵^,³¹^,³⁸^,³⁹^,⁴⁰. Zanurzenie wirującego domieszku w kąpieli krzepiącej powoduje szybką desolwatację białek, co skutkuje powstawaniem włókien ciągłych²⁴. Następnie włókna są pobierane z kąpieli koagulacyjnej ze stałą prędkością, albo dopasowaną do szybkości wytłaczania, aby uzyskać włókna w stanie przędzenia (AS), albo poddawane ciągnięciu po przędzeniu w celu uzyskania włókien po przędzeniu (PS), które zazwyczaj mają lepsze właściwości mechaniczne. Rysowanie po wirowaniu zazwyczaj polega na rozciąganiu włókien do proporcji 2-8x ich pierwotnej długości w powietrzu, w rozpuszczalniku lub po zanurzeniu w rozpuszczalniku, przy czym każdy parametr przyczynia się do określonych właściwości mechanicznych¹⁵^,¹⁷^,³¹^,³⁸.

Chociaż ten protokół skupia się na metodach ręcznego rysowania i przędzenia na mokro, ważne jest, aby umieścić te metody w kontekście. Metody elektroprzędzenia zostały opisane dla rekombinowanych nici pajęczych zarówno z warunków wodnych, jak i organicznych, umożliwiając produkcję mat włóknistych, wyrównanych włókien i przędz, przy czym włókna zwykle mają średnicę w skali nanometrów⁴¹. Zapewnia to potencjalną przewagę włókien w skali nano i odpowiednie wyzwanie, jeśli pożądane są włókna w skali mikronowej, zwykle z wymogiem przeprowadzenia obróbki po wirowaniu w celu wywołania transformacji do struktury arkusza β celu poprawy mechaniki i kompatybilności z wodą. Wielometrowe rekombinowane wstęgi z pajęczego jedwabiu o szerokości i grubości w skali mikronowej uzyskano przez przędzenie na sucho z rozpuszczalnika organicznego⁴², z niedawnym wykazaniem, że włączenie jonów metali na etapie domieszkowania przędzy poprawia mechanikę⁴³. Przędzenie oparte na mikrofluidyce⁴⁴, w tym niedawne połączenie technologii druku 3D z mikroigłowymi dyszami przędzalniczymi zaprojektowanymi tak, aby naśladować naturalną dyszę przędzalniczą⁴⁵, nadaje się do wysoce kontrolowanego przędzenia rekombinowanych włókien jedwabiu. Niezależnie od szerokiej gamy metod, które uznano za odpowiednie do produkcji włókien jedwabnych (lub jedwabnopodobnych), niniejszy protokół szczegółowo opisuje produkcję rekombinowanych włókien jedwabiu poprzez ręczne ciągnienie i przędzenie na mokro, ponieważ metody te okazały się możliwe do przełożenia na kilka różnych wariantów rekombinowanego jedwabiu w naszych rękach i stanowią wykonalny punkt wyjścia do rozwoju biomateriałów i oceny porównawczej.

Po przędzeniu i zbieraniu światłowodów, kombinacja technik optycznych, mechanicznych i spektroskopowych jest rutynowo stosowana do charakteryzowania właściwości po przędzeniu. Każda metoda dostarcza kluczowych informacji na temat procesu powstawania włókien i jego korelacji z wydajnością materiału. W tym miejscu skupiamy się na podzbiorze tych metod, zauważając, że istnieje wiele innych metodologii, które dostarczają kluczowych informacji na temat właściwości i wydajności włókien jedwabiu. Mikroskopia optyczna służy do oceny morfologii światłowodów, umożliwiając porównanie średnic włókien przędzonych zarówno w identycznych, jak i różnych warunkach¹⁷^,³¹^,³⁸^,⁴⁶. Technika ta jest również ważna dla identyfikacji i eliminacji segmentów włókien z defektami lub anomaliami przed późniejszą charakterystyką. Dodatkowo, mikroskopia światła spolaryzowanego może być stosowana do oceny stopnia wyrównania molekularnego w obrębie włókna, ponieważ wyższe poziomy wyrównania są zwykle związane z lepszymi właściwościami mechanicznymi¹⁷^,²⁶^,⁴⁷. Charakterystykę mechaniczną przeprowadza się za pomocą prób rozciągania, w których mierzy się krzywe naprężenie-odkształcenie i wykorzystuje się je do ilościowego określenia parametrów, takich jak wytrzymałość na rozciąganie, rozciągliwość, moduł Younga i wytrzymałość, dostarczając niezbędnych informacji do oceny przydatności włókien w zastosowaniach strukturalnych lub biomedycznych¹⁷^,³³^,⁴⁸. Ostatnia technika opisana tutaj, spektromikroskopia w podczerwieni z transformacją Fouriera (FTIR), jest stosowana do badania struktury drugorzędowej białka, w szczególności stopnia tworzenia β-arkusza, ponieważ odgrywa to kluczową rolę w stabilności włókien i wytrzymałości mechanicznej¹⁷^,⁴⁶^,⁴⁹. Łącznie techniki te zapewniają kompleksowe zrozumienie morfologii, struktury i zachowania mechanicznego rekombinowanych włókien jedwabiu.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym protokole zakładamy, że punktem wyjścia jest liofilizowany proszek białka jedwabiu. W naszej pracy byłoby to najczęściej rekombinowane białko jedwabiu pajęczego. Przegląd protokołu znajduje się w Rysunek 1, z każdym z następujących pięciu kroków szczegółowo opisanych poniżej: (1) przygotowanie i optymalizacja spinningu dopingującego; (2) ręczne ciągnienie z włókna jedwabiu lub przędzenie na mokro; (3) średnica włókna i ocena morfologiczna za pomocą mikroskopii optycznej; (4) ocena mechaniczna za pomocą próby rozciągania; oraz (5) ocena struktury drugorzędowej za pomocą spektromikroskopii FTIR.

figure-protocol-1
Rysunek 1: Schematyczny przegląd kluczowych kroków w protokole do produkcji, zbierania i charakterystyki włókien białkowych rekombinowanego jedwabiu pajęczego. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

1. Przygotowanie i optymalizacja narkotyku

UWAGA: Dla optymalizacji roztworu domieszkującego przędzenie włókien, spróbuj rozpuścić różne stężenia rekombinowanego białka jedwabiu pajęczego w różnych rozpuszczalnikach, aby przygotować roztwory domieszkujące (Tabela 1). Tylko rozpuszczalniki, które rozpuszczają białko, dając klarowny roztwór domieszkowy bez osadu, powinny być używane do prób przędzenia włókien.

Przygotowanie rozpuszczalników
1. Aby uzyskać 8:1:1 TFA/TFE/_H2O, odmierz 800 μl TFA, 100 μl TFE i 100 μl ultraczystej wody typu 1 do szklanej rurki wewnątrz dygestorium. Dokładnie wymieszaj wszystkie składniki. Zakryj szklaną rurkę i przykryj ją parafilmem, aby zapobiec parowaniu lotnych składników.
  UWAGA: Zawsze przygotowuj świeży roztwór do przędzenia włókien.
  UWAGA: Z TFA i TFE należy obchodzić się ostrożnie, TFA jest silnie i lotny, podczas gdy TFE jest łatwopalny i toksyczny. Nosić odpowiednie środki ochrony osobistej, w tym rękawice, fartuchy laboratoryjne i okulary ochronne, aby zapobiec kontaktowi ze skórą i ryzyku wdychania.
2. Aby uzyskać 3:1:1 TFA/TFE/H₂O, wewnątrz dygestorium przenieś 300 μl TFA, 100 μl TFE i 100 μl ultraczystej wody typu 1 do szklanej probówki i wymieszaj składniki. Przykryj szklaną rurkę i przykryj ją parafilmem, aby zminimalizować parowanie lotnych składników.
  UWAGA: Zawsze przygotowuj świeży roztwór do przędzenia włókien.
3. Aby uzyskać 7:3 HFIP/H₂O, zmieszaj 700 μl 1,1,1,3,3,3-heksafluroro-2-propanolu (HFIP) z 300 μl ultraczystej wody typu 1, aby uzyskać 1 ml roztworu. W razie potrzeby należy przygotować świeży roztwór.
  UWAGA: Z HFIP należy obchodzić się wewnątrz dygestorium i unikać wdychania lub kontaktu ze skórą.
4. Aby przygotować 50 mM bufor fosforanu potasu (pH 7,5), weź 800 ml dejonizowanej wody do zlewki i rozpuść 1,199 g diwodorofosforanu potasu (KH₂PO₄- MW. 136. 09 g/mol) i 7,173 g dwuzasadowego fosforanu potasu (_K2HPO₄- MW. 174,18 g/mol) w nim. Dokładnie wymieszaj wszystkie składniki i dostosuj pH roztworu za pomocą NaOH lub HCl. Uzupełnij objętość do 1 l wodą dejonizowaną i przechowuj w temperaturze pokojowej.
5. Aby przygotować 10 mM buforu Tris-Cl (pH 8,0), rozpuść 1,21 g chlorowodorku trisu (MW. 157,60 g/mol) w 800 ml wody dejonizowanej. Dostosuj pH za pomocą NaOH i uzupełnij końcową objętość do 1 l wodą dejonizowaną. Roztwór należy przechowywać w temperaturze pokojowej.
6. Aby przygotować 20 mM bufor octanu Na (pH 5,0), w 450 ml wody dejonizowanej, rozpuść 0,55 g octanu sodu (MW. 82,03 g/mol) i 0,02 M (6 ml) kwasu octowego. Uzupełnij objętość do 500 ml wodą dejonizowaną i przechowuj w temperaturze pokojowej.
7. Aby uzyskać 1 M bufor fosforanu cytrynianu (pH 7,0), rozpuść 11,69 g wodorofosforanu disodowego (Na₂HPO₄- MW. 141,96 g/mol) i 1,85 g kwasu cytrynowego (MW. 192,12 g/mol) w 400 ml wody dejonizowanej. Dostosuj pH roztworu za pomocą HCl lub NaOH i dostosuj końcową objętość do 500 ml za pomocą wody dejonizowanej.
8. Aby przygotować 98% roztwór kwasu mrówkowego-CaCl₂, rozcieńczyć kwas mrówkowy do 98%, mieszając 98 ml kwasu mrówkowego z 2 ml wody dejonizowanej, co daje łącznie 100 ml roztworu. Teraz dodaj 4 g CaCl₂ do 100 ml 98% roztworu kwasu mrówkowego, aby przygotować 4% w/v roztwór kwasu mrówkowego-CaCl₂. Roztwór należy przechowywać w temperaturze pokojowej.
  UWAGA: Patrz Tabela 1. Tylko rozpuszczalniki, które rozpuszczają białko, dając klarowny roztwór domieszkowy bez osadu, powinny być używane do prób przędzenia włókien.
Przygotowanie roztworu domieszkującego przędzenie włókien
1. Zważyć liofilizowane białko jedwabiu pajęczego zgodnie z pożądanym stężeniem (np. 10 mg dla 10% (w/v) roztworu w 100 μl rozpuszczalnika) i wymieszać z odpowiednią objętością rozpuszczalnika (np. 100 μl dla stężenia 10% (w/v)).
2. Mieszaj mieszaninę, aż białko w proszku całkowicie rozpuści się w rozpuszczalniku.
3. Ponieważ rozpuszczalność białka pajęczej nici różni się w zależności od rozpuszczalnika i rodzaju białka, zacznij od niskiego stężenia białka (10% w/v) i stopniowo zwiększaj stężenie (25-30% w/v) w razie potrzeby.
4. Po całkowitym rozpuszczeniu białka należy ocenić jakościowo lepkość roztworu domieszkowania. Jeśli roztwór domieszkujący wydaje się niewystarczająco lepki, stopniowo zwiększaj stężenie białka, aż do uzyskania klarownego, lepkiego roztworu. Użyj wody jako wzorca odniesienia.

LAT okrążeń LAT Rozdział LAT LAT Godziny

rozpuszczalnik	Stężenie białka (% - w/v)	odniesienie
8:1:1 TFA/TFE/H₂O	10 – 25	^{Rozdział 19}
3:1:1 TFA/TFE/H₂O	10 – 30	²⁶
7:3 HFIP/H₂O	15 – 30	^{Rozdział 31}
50 mM bufor fosforanu potasu (pH 7,5)	10 – 25	⁵⁰
10 mM bufor Tris-Cl (pH 8,0)	10 – 20	^{Rozdział 34}
20 mM bufor octanu Na, (pH 5,0)	10 – 25	^{Rozdział 49}
1 M bufor fosforanowo-cytrynianowy (pH 7,0)	10 – 25	^{51 Rozdział 51}
98% kwas mrówkowy – CaCl₂	20 – 25	^{Rozdział 52}

Tabela 1: Zalecane rozpuszczalniki i stężenia białek do przygotowania dozowników do przędzenia włókien.

2. Przędzenie i zbieranie włókien

UWAGA: Zapoznaj się z Rysunek 2 dla schematycznego przedstawienia rysunku ręcznego i Rysunek 3 dla różnych konfiguracji urządzeń do przędzenia na mokro opisanych poniżej.

figure-protocol-2
Rysunek 2: Rysunek odręczny włókien pajęczego jedwabiu. (A) Przygotowuje się papierową ramkę w kształcie litery C i mocuje do szkiełka podstawowego z przezroczystą taśmą po lewej stronie i taśmą dwustronną po prawej, aby umożliwić rysowanie włókien od lewej do prawej. (B) Kroplę wirującego domieszka umieszcza się na przezroczystej taśmie, a pojedyncze włókno jest ręcznie przeciągane do taśmy dwustronnej w poprzek otworu ramy w kształcie litery C za pomocą plastikowej końcówki do pipety. (C) Włókno jest przymocowane do ramy papierowej na szkiełku za pomocą taśmy po lewej i prawej stronie. (D,E) Demonstracja reprezentatywnego (D) procesu ręcznego rysowania rekombinowanej nici pajęczej skutecznie rozpuszczonej w domieszku wirowym oraz (E) powstałego włókna przed zabezpieczeniem go taśmą. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-protocol-3
Rysunek 3: Przędzenie na mokro włókien pajęczej nici. We wszystkich przypadkach wirujący dozrób umieszcza się w szklanej, hermetycznej strzykawce i wytłacza ze stałą szybkością za pomocą pompy strzykawkowej przez metalową igłę z końcem (tj. dyszę przędzalniczą) do kąpieli krzepiącej (np. 95% etanolu). (A) Włókna przędzone są zbierane na rolkę 1, obracającą się pod kontrolą komputera z prędkością odpowiadającą szybkości wytłaczania. (B) Rozciąganie po wirowaniu w powietrzu odbywa się poprzez prowadzenie włókien przez rolkę 1 i zbieranie ich na rolce 2, która obraca się z wielokrotnością prędkości rolki 1 (np. Podwójna prędkość dla 2-krotnego współczynnika ciągnięcia). Podobnie, włókna mogą być wytwarzane (C) po zanurzeniu w rozpuszczalniku (np. 40% etanolu, wody itp., w zależności od potrzeb danego jedwabiu) poprzez prowadzenie włókien z rolki 1 do rolki 3 (zanurzonej w kąpieli rozpuszczalnikowej i obracającej się z tą samą szybkością co rolka 1) przed wprowadzeniem ich na rolkę 2 (obracającą się z wielokrotnością prędkości rolek 1 i 3); lub (D) w rozpuszczalniku poprzez prowadzenie włókien od rolki 1 do rolki 3 (zanurzonej w kąpieli rozpuszczalnikowej i obracającej się z taką samą prędkością jak rolka 1), a następnie do rolki 4 (również zanurzonej w rozpuszczalniku i obracającej się z wielokrotnością prędkości rolek 1 i 3) przed zebraniem na rolce 2 (prędkość dopasowana do prędkości rolki 4). Modułowa konfiguracja oznacza, że różne permutacje w warunkach przędzenia włókien mogą być łatwo testowane, z pewnością nie ograniczając się do czterech pokazanych tutaj schematycznie. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek odręczny
1. Przygotuj papierową ramkę w kształcie litery C z okienkiem o wymiarach 1 cm x 0,5 cm (dł. x szer.) i umieść ją na szklanym szkiełku podstawowym (Rysunek 2). Przymocuj górną część papierowej ramy do szkiełka za pomocą taśmy klejącej. Przymocuj przezroczystą taśmę do jednego ramienia ramy papierowej, aby stworzyć hydrofobową powierzchnię do osadzania roztworu domieszkującego i przymocuj taśmę dwustronną do przeciwległego ramienia w celu zabezpieczenia włókien.
2. Umieścić 10-20 μl wirującego roztworu domieszkującego na przezroczystej taśmie w temperaturze pokojowej (22 ± 2 °C).
3. Zanurz plastikową końcówkę pipety o pojemności 200 μl w kropli roztworu domieszkującego i wyciągnij ją pionowo z roztworu ze stałą prędkością (~6 mm/s), umożliwiając wyciągnięcie włókien z roztworu.
4. Poprowadź ręcznie ciągnięte włókno przez okno ramy i przymocuj je do taśmy dwustronnej. Wysusz włókno na powietrzu w temperaturze pokojowej, a następnie zabezpiecz oba końce włókien dodatkową taśmą.
5. Skoncentruj się na części włókna rozciągającej się na ramie papieru, aby następnie scharakteryzować.
Przędzenie na mokro
1. Zbuduj urządzenie do przędzenia na mokro, z opisanym tutaj urządzeniem o zwiększonych możliwościach sterowania silnikiem w porównaniu z wcześniejszymi iteracjami³¹^,³⁸.
  1. Zbuduj sztywną metalową płytę montażową, która jest trzymana pionowo i obrabiana maszynowo z odpowiednią konfiguracją, aby dołączyć zestaw silników krokowych (patrz Rysunek 3). Każde mocowanie silnika wymaga wywiercenia otworów, aby umożliwić bezpieczne przykręcenie silników krokowych z tyłu płyty montażowej (tj. cztery otwory o odpowiednich odstępach i rozmiarach) oraz piątego otworu, aby umożliwić przejście wału silnika.
  2. Wybierz bipolarne silniki krokowe z krokiem 1,8°, momentem dotrzymującym 45 N∙cm, wałem o długości 24 mm i średnicy 5 mm z nacięciem "D" o długości 15 mm, korpusem 39 mm, prądem znamionowym 1,50 A, rezystancją fazową 2,3.
  3. Opracuj system do kontrolowania prędkości i kierunku obrotów dla każdego silnika, taki jak ten używany wcześniej dla różnych typów włókien jedwabiu¹⁷^,⁵³^,⁵⁴, który wykorzystuje graficzny interfejs użytkownika (GUI) zakodowany w Pythonie dla Raspberry Pi podłączonego do kilku kontrolerów silników krokowych, jak opisano w https://github.com/raineylab/MotorController.git.
  4. Do wirowania należy przymocować każdy silnik używany w danej konfiguracji wirowania do obrabianego maszynowo metalowego cylindra (średnica 6 cm, długość 8 cm dla tych w pozycjach 1 i 2 w Rysunek 3, rowkowane rolki o średnicy 9 cm na każdym końcu zwężające się do średnicy 6 cm w środku rolki, długość 7 cm na pozycjach 3 i 4 w Rysunek 3; zobacz na przykład Rysunek 4 dla przykładowej konfiguracji).
  5. Do dyszy przędzalniczej (Rysunek 3), użyj szklanej strzykawki o pojemności 0,25 ml z przymocowaną na stałe metalową igłą z końcem (średnica wewnętrzna 0,127 mm) zamontowanej w pompie strzykawkowej, która wytłacza domieszkę wirową w kontrolowanej szybkości do kąpieli krzepiącej.
2. Odwirować roztwór domieszkowy o stężeniu 20 000-21 000 × g przez 30 minut w temperaturze pokojowej i zebrać supernatant do przędzenia włókien.
  UWAGA: Usuń resztki cząstek stałych, aby zapobiec zatkaniu igły do wytłaczania podczas wirowania na mokro.
3. Załadować 50-80 μl wirującego roztworu domieszkującego do strzykawki, która służy jako dysza przędzalnicza.
4. Zabezpiecz strzykawkę w pompie strzykawkowej i ustaw wytłaczanie na szybkość 600 μL/h.
  UWAGA: Dostosuj i zoptymalizuj szybkość wytłaczania, aby umożliwić tworzenie włókien dla danego stanu domieszkowania przędzenia białka.
5. Przygotować kąpiel krzepnięcia (95% etanol/5% woda dejonizowana, v/v).
6. Ustawić pompę strzykawkową w taki sposób, aby igła strzykawki zawierającej roztwór doziastujący była zanurzona w kąpieli krzepiącej.
7. Przymocuj rolkę (rolki) do urządzenia wirującego, wyreguluj prędkość rolki za pomocą oprogramowania sterującego silnikiem i włącz silnik (silniki) wymagany dla danej konfiguracji wirowania.
  UWAGA: Dopasuj prędkość obrotową rolki 1 do szybkości wytłaczania. Szybkość wytłaczania 400 μl/h lub 600 μl/h odpowiada 6 obr./min lub 9 obr./min dla rolki 1. Jeśli przeprowadzany jest remis po zakręceniu, jeden lub więcej rolek 2-4 musi być ustawionych tak, aby obracały się odpowiednio szybciej.
8. Uruchom pompę strzykawkową i za pomocą pęsety poprowadź włókno, które tworzy się w kąpieli krzepiącej w jeden z następujących sposobów.
  1. Aby zebrać włókna AS, należy skierować włókno powstałe w kąpieli koagulacyjnej na pierwszą rolkę (prędkość równa szybkości wytłaczania) w celu zebrania.
  2. Aby wykonać rozciąganie po wirowaniu w powietrzu, ustaw prędkość obrotową rolki 2 na wielokrotność prędkości obrotowej rolki 1. Prowadź włókno z koagulacji przez rolkę 1 bez zapętlania wokół rolki 1 i zbierz je na rolce 2,
    UWAGA: Współczynnik losowania po zakręceniu wynoszący 2x wymaga, aby szybkość obrotu rolki 2 była dwukrotnie większa niż rolki 1; 3x, trzyosobowy; i tak dalej.
  3. Aby przeprowadzić rozciąganie po odwirowaniu po zanurzeniu w rozpuszczalniku, należy napełnić kąpiel rozpuszczalnikową żądanym rozpuszczalnikiem (np. wodą dejonizowaną; etanol 2:3 v/v/_H2O; itp.) i poprowadzić włókno z kąpieli koagulacyjnej wokół rolki 1 (szybkość obrotu dopasowana do szybkości wytłaczania), wokół rolki 3 (szybkość obrotu równa rolki 1) w kąpieli rozpuszczalnikowej, i zbierz włókno na rolce 2 w powietrzu (obracającej się szybciej niż rolki 1 i 3).
    UWAGA: Szybkość obrotu rolki 2 w stosunku do rolek 1 i 3 określi współczynnik losowania po zakręceniu, jak w kroku 2.2.8.2.
  4. Aby wykonać rozciąganie po wirowaniu w rozpuszczalniku, należy napełnić kąpiel rozpuszczalnikową żądanym rozpuszczalnikiem (np. wodą dejonizowaną; etanol 2:3 v/v/_H2O; itp.) i poprowadzić włókno z kąpieli koagulacyjnej wokół rolki 1 (szybkość obrotu dopasowana do szybkości wytłaczania), wokół rolki 3 (szybkość obrotu równa walce 1) w kąpieli rozpuszczalnikowej, wokół rolki 4 w kąpieli rozpuszczalnikowej (prędkość obrotowa wielokrotność prędkości obrotowej rolek 1 i 3) i zebrać Włókno na rolce 2 w powietrzu (prędkość obrotowa dopasowana do rolki 2).
    UWAGA: Szybkość obrotu rolek 2 i 4 w stosunku do prędkości obrotowej rolek 1 i 3 określi współczynnik losowania po zakręceniu, jak w kroku 2.2.8.2.
    Zbieraj włókna w kontrolowanych warunkach środowiskowych, aby uniknąć wpływu wilgotności i temperatury na zachowanie włókien. Dążymy do wilgotności względnej ~ 28,2 ± 2,4% i temperatury ~ 28,0 ± 2,2 °C.

figure-protocol-4
Rysunek 4: Kluczowe kroki w przędzeniu na mokro włókien pajęczego jedwabiu. (A) Odwirować wytłaczanie domieszek do kąpieli koagulacyjnej, a następnie zebrać włókna (czerwony prostokąt po lewej stronie podkreśla igłę używaną do wytłaczania domieszek; czerwony prostokąt po prawej stronie to ścieżka włókna jedwabnego przędzonego na mokro. (B) Ilustracja włókna poddanego rozciąganiu w powietrzu po wirowaniu (czerwony prostokąt do prowadzenia oka). (C) Ilustracja rozciągania włókna po odwirowaniu po zanurzeniu w wodzie (czerwony prostokąt do prowadzenia oka). (D) Ciągłe rekombinowane włókno jedwabiu zebrane na wałku (np. włókno nawinięte na szpulę przy czerwonej strzałce). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

3. Mikroskopowa ocena optyczna światłowodów

Montaż światłowodu
1. Utwórz uchwyt na papier w kształcie litery C, wycinając kwadrat o wymiarach 1 x 1 cm z prostokątnej kartki papieru o wymiarach 3 x 2 cm (Rysunek 5).
2. Przymocuj uchwyt w kształcie litery C do szklanego szkiełka mikroskopowego za pomocą taśmy.
3. Przymocuj dwa kawałki taśmy dwustronnej po obu stronach 1 cm szczeliny w uchwycie na papier w kształcie litery C.
4. Usuń włókno z wałka, na którym zostało zebrane, i wytnij segment o długości około 2 cm.
  UWAGA: Unikaj używania nadmiernej siły podczas obchodzenia się z włóknami, aby zapobiec deformacji materiału lub innej zmianie właściwości.
5. Umieść segment włókna na górze taśmy dwustronnej, upewniając się, że długa oś włókna jest wyrównana równolegle do dolnej krawędzi uchwytu ( Rysunek 5) .
6. Zabezpiecz włókno taśmą maskującą na wierzchu taśmy dwustronnej po obu stronach.
7. Przymocuj dodatkowy kawałek taśmy maskującej, aby mocno przymocować dolną część uchwytu papieru do szkiełka szklanego, aby zapobiec przesuwaniu się włókna do czasu użycia.
8. Przechowuj zamontowane włókna w pudełku do przechowywania szkiełek do czasu użycia do obrazowania i prób rozciągania.
Określanie średnicy i ocena wad
1. Zbadaj zamontowane włókna za pomocą mikroskopii optycznej. Najpierw przesiewaj włókno na całej długości pod kątem widocznych niedoskonałości, takich jak szyjkowanie, skręcanie, wybrzuszenie lub podwójne włókna. W przypadku zaobserwowania jakichkolwiek wad należy wykluczyć te włókna z badań mechanicznych.
2. W przypadku włókien, które wydają się wolne od wad, należy wykonać trzy mikrofotografie w 10-krotnym powiększeniu wzdłuż długiej osi włókna, po jednym w środku i po jednym w pobliżu każdego końca włókna.
3. Zmierz średnicę światłowodu za pomocą oprogramowania ImageJ⁵⁵:
  1. W ImageJ przejdź do menu Analizuj i wybierz Ustaw skalę (Plik uzupełniający 1 - Rysunek uzupełniający S1). Wyreguluj skalę zgodnie z ustawieniami kalibracji mikroskopu i ustaw jednostkę miary na mikrometry (μm) (plik uzupełniający 1 - rysunek uzupełniający S2).
  2. Za pomocą narzędzia Linia narysuj linię prostą prostopadłą do długiej osi włókna, rozciągającą się od jednej krawędzi włókna do drugiej krawędzi.
  3. Dla każdej mikrofotografii zmierz średnicę włókna w sześciu różnych obszarach wzdłuż włókna.
  4. Po narysowaniu każdej linii kliknij przycisk Zmierz w menu Analizuj, aby wyświetlić średnicę włókna (Plik uzupełniający 1 - Rysunek uzupełniający S3).
Jakościowa ocena dopasowania molekularnego za pomocą mikroskopii światła spolaryzowanego
1. Użyj mikroskopii światła spolaryzowanego, aby ocenić wyrównanie molekularne we włóknie po średnicy i ocenie defektów za pomocą mikroskopii optycznej.
  1. Zbadaj światłowód za pomocą odwróconego mikroskopu optycznego wyposażonego w obrotowy stolik, stały suwak analizatora i polaryzator obracany o 90°.
  2. Umieść włókno pod kątem około 45 ° w stosunku do padającego światła spolaryzowanego w płaszczyźnie, aby zmaksymalizować jasność z powodu dwójłomności, poprawiając widoczność struktury molekularnej.
  3. Zrób zdjęcie włókna w tych warunkach, aby ocenić jego dwójłomność.
    UWAGA: Wysoka dwójłomność sugeruje dobrze wyrównaną strukturę molekularną, podczas gdy niska dwójłomność lub jej brak sugeruje bardziej amorficzną lub losowo zorientowaną strukturę.

figure-protocol-5
Rysunek 5: Montaż włókna z pajęczego jedwabiu na szkiełku umożliwiającym dalszą analizę za pomocą uchwytu na papier w kształcie litery C i szeregu warstw taśmy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

4. Próba rozciągania

UWAGA: Urządzenie do badania wytrzymałości na rozciąganie odpowiednie do dokładnej oceny włókien jedwabiu może być łatwo wyprodukowane przy stosunkowo niskich kosztach²⁵^,⁵⁶. Krótko mówiąc, wyprodukuj parę zacisków ze stali nierdzewnej, aby umożliwić mocne uchwycenie każdego końca każdego włókna w testowanej ramie w kształcie litery C (np. Rysunek 6). Przymocuj jeden z tych zacisków do odważnika umieszczonego na wadze analitycznej, a drugi do pompy strzykawkowej. Pompa strzykawkowa musi być skonfigurowana tak, aby umożliwiała ciągłe ciągnięcie z ustaloną szybkością odkształcania. Waga analityczna musi być połączona z komputerem w celu rejestrowania danych dotyczących masy/masy w funkcji czasu.

figure-protocol-6
Rysunek 6: Schemat ideowy przedstawiający etapy przygotowawcze do próby rozciągania. (A) Uchwyt na papier z włóknem (patrz Rysunek 5 dla konfiguracji) jest odłączany od szkiełka i montowany pionowo za pomocą klipsa przymocowanego do ciężarka. (B) Ten obciążony zacisk umieszcza się na wadze analitycznej, a górną część uchwytu na papier mocuje się do zacisku przymocowanego do pręta, który jest trwale przymocowany do pompy strzykawkowej. Uchwyt na papier jest cięty poziomo na środku przed rozpoczęciem próby rozciągania. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Akwizycja danych krzywej naprężenie-odkształcenie
1. Po zmierzeniu średnicy włókna wykonaj próbę rozciągania na tym samym włóknie za pomocą domowej aparatury (Rysunek 6).
  1. Odłącz papierową ramkę w kształcie litery C przytrzymującą włókno od szkiełka i przymocuj do zacisku przymocowanego do ciężarka (Rysunek 6A).
  2. Podłącz wagę analityczną do oprogramowania rejestrującego/sterującego danymi i przejdź do stołu roboczego (plik uzupełniający 1 - rysunek uzupełniający S4).
  3. Skonfiguruj eksperyment w oprogramowaniu do kontroli równowagi, klikając przycisk Start. Wprowadź nazwę eksperymentu po wyświetleniu monitu (Plik uzupełniający 1 - Rysunek uzupełniający S5).
  4. Upewnij się, że waga analityczna jest pusta i umieść obciążony zacisk z włóknem na nim.
  5. Przymocuj górną część ramki papierowej do zacisku podłączonego do pompy strzykawkowej i odetnij jedną stronę uchwytu papieru, aby umożliwić swobodny ruch włókna ( Rysunek 6B).
    UWAGA: Upewnij się, że oba zaciski są równoległe do siebie i że włókno jest wyśrodkowane w zacisku na długości miernika 10 mm.
  6. Wytaruj wagę, aby wyzerować masę odważnika i clamp i naciśnij przycisk Uruchom na pompie strzykawkowej i kliknij OK w oprogramowaniu kontrolującym wagę (Plik uzupełniający 1 - Rysunek uzupełniający S6).
  7. Gdy włókno pęknie, naciśnij przycisk Stop na pompie strzykawkowej i przycisk Tak w oprogramowaniu kontrolującym wagę (Plik uzupełniający 1 - Rysunek uzupełniający S7), aby zarejestrować zmierzoną masę w funkcji czasu.
  8. Przenieś dane do arkusza kalkulacyjnego lub innego odpowiedniego pakietu oprogramowania do przetwarzania danych w celu przetworzenia. Skopiuj dziennik danych wagi w funkcji czasu do schowka i wklej go do dostarczonego arkusza kalkulacyjnego testów mechanicznych (plik uzupełniający 2) lub eksportując dane jako plik tekstowy i importując z odpowiednią analizą.
Przetwarzanie danych krzywej naprężenie-odkształcenie
UWAGA: Poniższy protokół jest oparty na arkuszu kalkulacyjnym testów mechanicznych sformatowanym do użytku w programie Microsoft Excel (plik uzupełniający 2).
1. Upewnij się, że parametry eksperymentalne są prawidłowe (kolumna C).
2. Dodaj masowe nagrania w funkcji czasu do arkusza kalkulacyjnego ("Masa netto" w kolumnie F). Jeśli istnieją wartości masy zarejestrowane przed rozpoczęciem rozciągania, usuń te wartości poprzez usunięcie odpowiednich komórek z przesunięciem danych w górę. Jeśli po zerwaniu światłowodu zarejestrowano wartości masy, usuń te komórki danych.
3. Automatycznie uzupełniaj wartości indeksów w kolumnie E poprzez dodawanie przyrostów co 1, tak aby całkowita liczba indeksów odpowiadała całkowitej liczbie zmierzonych wartości masy w kolumnie F.
4. Przeskaluj masę netto tak, aby zaczynała się od 0 g i wzrastała podczas eksperymentu rozciągania, odejmując początkową masę netto od każdej wartości masy netto i mnożąc tę różnicę przez -1 (kolumna G).
5. Obliczyć zmianę długości włókna przy każdym pomiarze, mnożąc wskaźnik pomiaru przez szybkość ciągnięcia pompy strzykawkowej i opóźnienie czasowe między zarejestrowanymi pomiarami masy (kolumna H).
6. Oblicz odkształcenie inżynieryjne, dzieląc zmianę długości włókna przez pierwotną długość (kolumna I).
  UWAGA: W tym obliczeniu podane jest odkształcenie inżynieryjne w mm/mm. Aby przekonwertować wartości odkształcenia inżynieryjnego na %, pomnóż wartości w kolumnie I przez 100%.
7. Zapisz rozciągliwość jako maksymalną wartość odkształcenia inżynieryjnego (komórka T3).
8. Obliczyć siłę (w N) wymaganą do osiągnięcia każdej zarejestrowanej zmiany długości, przeliczając masę z g na kg i mnożąc przez grawitację standardową (9,81 m/s²; Kolumna J).
9. Oblicz naprężenie inżynierskie (w Pa), dzieląc siłę wyznaczoną przy danym stopniu rozciągnięcia przez pole przekroju poprzecznego włókna i pomnóż przez ^10-6, aby przeliczyć na MPa (kolumna K).
10. Zapisz maksymalne obserwowane naprężenie jako naprężenie końcowe (komórka U3), a naprężenie przy zerwaniu jako końcową wartość naprężenia zarejestrowane przed zerwaniem włókna (komórka V3).
11. Obliczyć obszar pod krzywą naprężenie-odkształcenie, aby uzyskać udarność, stosując regułę trapezową, aby obliczyć pole pod krzywą po każdym pomiarze (kolumna L). Zsumuj te obszary, aby znaleźć wytrzymałość (komórka W3).
12. Oblicz moduł Younga (w MPa), określając nachylenie początkowego obszaru liniowego krzywej naprężenie-odkształcenie za pomocą funkcji REGLINP. Konwertuj na GPa, mnożąc przez 10³ (komórka X3).

5. Spektromikroskopia w podczerwieni z transformacją Fouriera (FTIR)

Przygotuj próbkę do FTIR, przyklejając drugi szklany szkiełko do dolnej części szkiełka przygotowanego do mikroskopii optycznej.
Obraz optyczny i kolekcja spektralna FTIR
1. Napełnij detektor dewara ciekłym azotem, aby schłodzić detektor.
2. Otwórz oprogramowanie sterujące przyrządem FTIR.
3. W oknie View and Collect (Plik uzupełniający 1 - Rysunek uzupełniający S8) otwórz zakładkę Zbieranie, ustaw Tryb zbierania na ATR i detektor na Chłodzony (Plik uzupełniający 1 - Rysunek uzupełniający S9).
4. Umieść slajd w uchwycie szkiełka i umieść uchwyt na stoliku.
5. Ustaw górne oświetlenie na 100, a przysłonę i dolne oświetlenie na 0.
6. Ustaw ostrość środek pola widzenia dla obrazu próbki z mikroskopu optycznego na światłowodzie za pomocą fizycznego joysticka lub cyfrowego joysticka w oprogramowaniu, aby kontrolować położenie środka pola widzenia i płaszczyzny ogniskowej.
7. Ustaw tryb zbierania na Mapowanie (plik uzupełniający 1 - rysunek uzupełniający S8).
8. Wybierz obszar, który ma zostać zobrazowany i zmierzony za pomocą narzędzia Widok mapy - Obszar. Kliknij i przeciągnij kursor, aby określić obszar, dla którego widma mają być uzyskane w podglądzie mikrografii (Plik uzupełniający 1 - Rysunek uzupełniający S8). Każdy okrąg na obrazie reprezentuje jedno uzyskane widmo w tej pozycji. W razie potrzeby zmień krawędzie tego pola, umieszczając kursor nad daną krawędzią pola, a następnie klikając i przeciągając w żądane miejsce. Przetłumacz całe pole, klikając i przeciągając w obrębie prostokąta. Zmodyfikuj obszar pola i liczbę punktów danych w obszarze Stół montażowy, Przysłona i Wyświetlanie (plik uzupełniający 1 - rysunek uzupełniający S10).
9. Kliknij prawym przyciskiem myszy podgląd mikrofotografii i wybierz Przechwyć mozaikę, aby zapisać obraz (Plik uzupełniający 1 - Rysunek uzupełniający S8).
10. Ustaw ciśnienie ATR, klikając menu rozwijane Aktualny profil ciśnienia. W przypadku włókien białkowych należy użyć ciśnienia 2% (tj. najniższego możliwego ciśnienia ATR), aby zminimalizować uszkodzenie włókna (plik uzupełniający 1 - rysunek uzupełniający S8).
11. Włóż końcówkę ATR FTIR.
12. Kliknij przycisk Collect (Plik uzupełniający 1 - Rysunek uzupełniający S8), aby uzyskać widmo tła, a następnie widmo w każdym z wybranych punktów. Po zakończeniu zbierania dane zostaną wyświetlone w nowym oknie.
Przygotowanie danych do dalszej analizy
1. Kliknij lewym przyciskiem myszy mapę cieplną lub mikrofotografię, aby wyświetlić widmo, które zostało zarejestrowane w odpowiedniej pozycji (Plik uzupełniający 1 - Rysunek uzupełniający S11).
2. Kliknij prawym przyciskiem myszy widmo, które ma być analizowane i wybierz Kopiuj (Plik uzupełniający 1 - Rysunek uzupełniający S11).
3. Kliknij prawym przyciskiem myszy na pasku Windows u góry ekranu i wybierz Nowe okno (plik uzupełniający 1 - rysunek uzupełniający S11).
4. Kliknij przycisk Wklej u góry ekranu, gdy otworzy się nowe okno (Plik uzupełniający 1 - Rysunek uzupełniający S11).
5. Użyj tego samego podejścia, aby skopiować i wkleić dowolne inne widma pożądane do analizy w tym oknie.
6. Podświetl widmo lub widma, naciskając Ctrl podczas klikania każdego żądanego widma lub podświetlając żądane widma w menu rozwijanym.
7. Kliknij Zapisz jako... i zapisz pliki jako pliki .spa, aby przeanalizować dane w oprogramowaniu sterującym spektrometrem lub .csv aby przeanalizować dane w innym pakiecie oprogramowania (Plik uzupełniający 1 - Rysunek uzupełniający S12).
Druga analiza pochodna przy użyciu oprogramowania specyficznego dla danego instrumentu
1. Otwórz widma do analizy w pakiecie oprogramowania do przetwarzania i analizy spektralnej specyficznego dla danego instrumentu.
2. Aby przekonwertować między trybami % przepuszczalności i absorbancji, użyj Ctrl+A (% przepuszczalności do absorbancji) lub Ctrl+T (absorbancji do % przepuszczalności).
3. Wybierz obszar zainteresowania, klikając pozycję Widok | Granice wyświetlania (lub Ctrl+D) (Plik uzupełniający 1 - Rysunek uzupełniający S13A). Aby wyświetlić pasma Amidu I (1 700-1 600 ^cm-1) i Amidu II (1 600-1 500 ^cm-1), należy ustawić Granice początkowej i końcowej osi X na odpowiednie liczby fal. Jeśli analizujesz więcej niż jedno widmo, wybierz opcję Zastosuj do wszystkich widm. Kliknij przycisk OK (Plik uzupełniający 1 - Rysunek uzupełniający S13B).
4. Aby wykreślić drugą pochodną, kliknij przycisk Procesowy | Pochodna... i wybierz Drugi z menu rozwijanego (Plik uzupełniający 1 - Rysunek uzupełniający S14A). Wybierz pochodną Norrisa o długości segmentu 5 i przerwie między segmentami wynoszącej 5 (plik uzupełniający 1 - rysunek uzupełniający S14B). Minima drugiego widma pochodnej pokrywają się z pikami składowych w pierwotnym widmie absorbancji.
  1. Jeśli widmo jest zbyt zaszumione, aby ocenić minima, wygładź widmo, klikając Proces>Automatyczne wygładzanie (Plik uzupełniający 1 - Rysunek uzupełniający S15). Następnie oblicz drugą pochodną i znajdź minima.
5. Powiąż liczby falowe na drugim minimie pochodnej z charakterystycznymi pozycjami pasm dla struktur drugorzędowych, korzystając z tabeli referencyjnej (np. Tabela 2), aby uzyskać wgląd w strukturę drugorzędową białka.
Dekonwolucja pików za pomocą oprogramowania do analizy specyficznego dla przyrządu
1. Ustaw region wyświetlania na obszar, który ma zostać zdekonwoluowany, jak w kroku 5.4.3. Tylko ten region zostanie zdekonwirowany.
2. Linia bazowa skoryguj wybrany obszar widmowy przy użyciu jednej z następujących metod:
  1. Kliknij opcję Process (Proces) | Automatyczna korekta linii bazowej (plik uzupełniający 1 - rysunek uzupełniający S16); lub
  2. Kliknij opcję Process (Proces) | Poprawna linia bazowa (plik uzupełniający 1 - rysunek uzupełniający S17A), a następnie wybierz opcję Liniowy z menu rozwijanego i określ obszar spektralny, który ma zostać skorygowany według linii bazowej w widmie Położenie, klikając i przeciągając dwa punkty, które określają dolną i górną granicę obszaru, który ma zostać skorygowany do celów dekonwolucji. Następnie wybierz Dodaj do okna z drugiego menu rozwijanego i kliknij przycisk Dodaj (Plik uzupełniający 1 - Rysunek uzupełniający S17B).
3. Po wybraniu widma z korekcją linii bazowej kliknij przycisk Analizuj | Peak Resolve..., aby otworzyć okno Peak Resolve (Plik uzupełniający 1 - Rysunek uzupełniający S18).
4. Wybierz widma i krzywe do analizy za pomocą paska wyboru po lewej stronie ekranu.
5. Wybierz opcję Gaussian/Lorentzian z ustawieniem Czułość na niską i ustawieniem FWHH na 2 na karcie Znajdź szczyty, a następnie kliknij przycisk Znajdź szczyty (Plik uzupełniający 1 - Rysunek uzupełniający S19).
6. Kliknij przycisk Szczyty, aby otworzyć tabelę opisującą szczyty.
  1. Jeśli wybrano więcej pików, niż jest to fizycznie uzasadnione, klikaj przycisk Usuń pik do momentu uzyskania prawidłowej liczby pików do analizy (Plik uzupełniający 1 - Rysunek uzupełniający S20). Na przykład w przypadku regionu amidu I w literaturze zwykle podaje się 5-11 pików (Tabela 2).
  2. Aby upewnić się, że wszystkie szczyty są dodatnie po dopasowaniu, kliknij przycisk Edytuj szczyt i ustaw minimalną wysokość na 0. Następnie kliknij Dalej i powtórz dla każdego szczytu, a następnie OK, aby zamknąć okno edycji (Plik uzupełniający 1 - Rysunek uzupełniający S21).
  3. Jeśli istnieją określone liczby falowe, które muszą być obecne w końcowej dekonwolucji, kliknij przycisk Edytuj szczyt i ustal środek piku do liczby falowej określonej w polu Wartość, wybierając opcję Stała lub podaj zakres przy użyciu pól Dolny limit i Górny limit. Kliknij przycisk OK, aby zastosować te ustawienia do danego peak.
    UWAGA: Na tym etapie optymalne jest użycie pozycji pików znalezionych podczas drugiej analizy pochodnej lub pików z tabeli referencyjnej struktur drugorzędowych FTIR, najlepiej oznaczonych adnotacjami dla podobnego typu próbki jedwabiu (np. Tabela 2).
7. Kliknij przycisk Dopasuj szczyty (plik uzupełniający 1 - rysunek uzupełniający S22).
  1. Jeśli algorytm dopasowania wartości szczytowych nie zostanie pomyślnie zbieżny, kliknij ponownie przycisk Dopasuj szczyty, aby iteracyjnie kontynuować dopasowywanie szczytów.
8. Kliknij przycisk Szczyty, aby uzyskać informacje o położeniu, wysokości, FWHH i powierzchni wszystkich szczytów, które były dopasowane.
  1. Szczyty te można skopiować do schowka, klikając Schowek, aby umożliwić ich wklejenie do innego okna lub pliku (Plik uzupełniający 1 - Rysunek uzupełniający S23).
  2. Skopiuj piki i widma do innego okna, wybierając miejsce docelowe z menu rozwijanego wyboru okna obok przycisku Dodaj (Plik uzupełniający 1 - Rysunek uzupełniający S24).
  3. Kliknij przycisk Zaznacz wszystko i użyj punktu menu Plik | Zapisz jako, aby zapisać piki i widma jako pliki .spa i/lub .csv (Plik uzupełniający 1 - Rysunek uzupełniający S25).
9. Powiąż każdy pik komponentu ze strukturą drugorzędną za pomocą tabeli referencyjnej. Względna powierzchnia piku (pików) odpowiadająca danej strukturze drugorzędowej w stosunku do całkowitej powierzchni wszystkich przypisanych pików zapewnia proporcję białka, które ma tę strukturę drugorzędową.
Przygotowanie danych do dalszej analizy za pomocą oprogramowania innych firm
1. Otwórz skoroszyt i załaduj dane spektralne do oprogramowania do przetwarzania i analizy spektralnej innej firmy, wybierając punkt menu Dane | Nawiązywanie połączenia z plikiem | Tekst/CSV (Plik uzupełniający 1 - Rysunek uzupełniający S26). Wybierz żądany plik w Eksploratorze plików i kliknij przycisk Otwórz.
2. Wykreśl widmo, podświetlając kolumny do wykreślenia i wybierając punkt menu Wykres | Podstawowe 2D | Pozycja menu (Plik uzupełniający 1 - Rysunek uzupełniający S27).
3. Kliknij dwukrotnie oś x i użyj zakładki Skala, aby dostosować zakres tak, aby pasował do piku Amidu I (Plik uzupełniający 1 - Rysunek uzupełniający S28).
4. Jeśli dane są bardzo zaszumione, wygładź krzywą, wybierając punkt menu Analiza | Przetwarzanie sygnału>Płynne>Otwórz okno dialogowe... (Plik uzupełniający 1 - rysunek uzupełniający S29A).
  1. Ustaw opcję Przelicz na Auto, Metodę na Savitzky'ego-Golaya, Punkty okna na 5, Warunek brzegowy na Brak i Porządek wielomianów na 2 (Plik uzupełniający 1 - Rysunek uzupełniający S29B).
  2. Kliknij przycisk OK, aby przetworzyć.
Druga analiza pochodna przy użyciu oprogramowania innych firm
1. Wybierz punkt menu Analiza | Matematyka | Wyróżnij się | Otwórz okno dialogowe... (Plik uzupełniający 1 - rysunek uzupełniający S30).
2. Ustaw opcję Przelicz na Auto, ustaw Kolejność pochodnych na 2, wybierz opcję Kreśl krzywą pochodną i kliknij przycisk OK (Plik uzupełniający 1 - Rysunek uzupełniający S31).
3. Jeśli wynikowa druga krzywa pochodna jest bardzo zaszumiona, wykonaj kroki 5.7.1 i 5.7.2, wybierając opcję Wygładź Savitzky'ego-Golaya na karcie Wygładzanie w oknie dialogowym Różnicuj.
4. Podobnie jak w ppkt 5.4.5, odnieś liczby falowe na minimach drugiej pochodnej do struktur drugorzędowych.
Dekonwolucja szczytów przy użyciu oprogramowania innych firm
1. Po kliknięciu na wykres widma absorbancji amidu I należy wybrać punkt menu Analiza | Wartości szczytowe i linia bazowa | Analizator wartości szczytowych | Otwórz okno dialogowe... (Plik uzupełniający 1 - Rysunek uzupełniający S32).
2. W oknie dialogowym Cel - Dopasuj szczyty (Pro) ustaw opcję Oblicz ponownie na Auto, wybierz opcję Dopasuj szczyty i kliknij przycisk Dalej. (Plik uzupełniający 1 - Rysunek uzupełniający S33A).
3. W oknie dialogowym Tryb linii bazowej ustaw parametr Tryb linii bazowej na Linia prosta i kliknij przycisk Dalej (Plik uzupełniający 1 - Rysunek uzupełniający S33B).
4. W oknie dialogowym Leczenie linii bazowej wybierz opcję Automatycznie odejmij linię bazową, kliknij przycisk Odejmij teraz, a następnie kliknij przycisk Dalej (Plik uzupełniający 1 - Rysunek uzupełniający S33C).
5. W oknie dialogowym Znajdowanie szczytów wyłącz opcję Włącz automatyczne wyszukiwanie i kliknij przycisk Dodaj.
  1. Kliknij dwukrotnie na okno zawierające wykres widma z pikami, które mają być dopasowane.
  2. Piki należy wybrać na podstawie minimów zaobserwowanych w drugiej pochodnej (krok 5.7.4) lub tabelach referencyjnych (np. Tabela 2).
  3. Kliknij przycisk Gotowe, a następnie kliknij przycisk Dalej (Plik uzupełniający 1 - Rysunek uzupełniający S33D).
6. W oknie dialogowym Dopasuj szczyty (Pro) wybierz opcję Generuj raport na podstawie bieżącego wyniku dopasowania i kliknij Dopasuj, a następnie Zakończ (Plik uzupełniający 1 - Rysunek uzupełniający S33E).
7. Oceń kartę PeakProperties1 skoroszytu, aby wyświetlić środek, zintegrowany obszar i FWHM każdego piku (plik uzupełniający 1 — rysunek uzupełniający S34). Podobnie jak w kroku 5.5.9, powiąż każdy pik składnika z typem struktury drugorzędowej i oceń procent struktury białka z tą strukturą drugorzędową.

jezdnych

Zakres liczby falowej (^cm-1)	przypisanie
1605−1615	Łańcuchy boczne opon/zagregowane β-nici
1616−1621	Zagregowane nici β/Wewnątrzcząsteczkowe arkusze β [słabe]
1622−1627	Arkusze β międzycząsteczkowych [mocne]
1628−1637	Arkusze β wewnątrzcząsteczkowych [mocne]
1638−1646	Losowa cewka/Przedłużone łańcuchy
1647−1655	Losowa cewka
1656−1662	α-Helisy
Lata 1663−1696	Zamienia
Lata 1697-1703	Arkusze β międzycząsteczkowych [słabe]

Tabela 2: Przypisanie pasm wibracyjnych regionu Amidu I dla jedwabiu Bombyx mori na podstawie oceny porównawczej kilku badań przeprowadzonych przez Hu et al.⁵⁷.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Idealnym roztworem domieszkowym do przędzenia jest klarowny, wolny od osadów i lepki roztwór, wskazujący na całkowite rozpuszczenie białka (Rysunek 7A). I odwrotnie, niepełne rozpuszczenie skutkuje albo mleczną zawiesiną, albo widocznymi osadami (Rysunek 7B,C). Czas potrzebny do całkowitego rozpuszczenia białka różni się w zależności od rozpuszczalnika, przy czym niektóre rozpuszczalniki, takie jak mieszaniny TFA/TFE/_H2O, zazwyczaj całkowicie rozpuszczają białko w odstępie 30 minut, podczas gdy inne, takie jak HFIP, mogą wymagać nocnego mieszania wraz z okazjonalnym wirowaniem.

figure-results-1
Rysunek 7: Optymalizacja rozwiązania Spinning Dope. (A) Rozpuszczalnik zdolny do całkowitego rozpuszczenia białka daje klarowny i lepki roztwór domieszkowy, nadający się do przędzenia. Częściowe rozpuszczenie lub zawieszenie białka przez nieoptymalny dobór rozpuszczalnika może spowodować (B) nadmiernie lepki stan, zwykle z widocznym osadem lub (C) mleczną zawiesinę. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2E pokazuje reprezentatywne włókno rysowane ręcznie, podczas gdy Rysunek 4D pokazuje nawinięte na mokro włókno. Przed przystąpieniem do dalszej analizy mikroskopia optyczna jest niezbędna do oceny jakości światłowodów. Reprezentatywne mikrofotografie optyczne rekombinowanych włókien jedwabiu przędzonych na mokro nadających się do dalszej analizy i przędzonych w dwóch różnych warunkach (patrz Rysunek 3 dla próbnych konfiguracji przędzenia na mokro) są pokazane w Rysunek 8. Za pomocą mikroskopii optycznej (Rysunek 8A), jasne jest, że włókna te wykazują jednolitą średnicę, ze zmniejszoną średnicą widoczną po zastosowaniu naciągu po przędzeniu (tj. AS) vs. po przędzeniu rozciągnięte w proporcji 4x w 40% etanolu (4x-EtOH)). Większy stopień dwójłomności skutkujący większym kontrastem w mikroskopii światła spolaryzowanego (Rysunek 8B) jest zgodny z lepszym wyrównaniem molekularnym we włóknie w wyniku procesu rysowania po wirowaniu. Na koniec należy zauważyć, że defekty najprawdopodobniej zostaną zaobserwowane w pewnej frakcji ocenianych włókien, co sprawi, że dany segment włókna nie będzie nadawał się do dalszej analizy. Dwa takie przykłady są pokazane w Rysunek 9.

figure-results-2
Rysunek 8: Reprezentatywne mikrofotografie optyczne rekombinowanych włókien jedwabiu pajęczego przędzonych na mokro. Włókna w stanie AS i po 4-krotnym rozciągnięciu po wirowaniu w etanolu (EtOH) zilustrowano dla chimerycznego konstruktu jedwabiu w kształcie gruszkowato-ogoniastym (Py_{, 2}W,₂) obserwowanego za pomocą mikroskopii optycznej (lewa kolumna) i mikroskopii światła spolaryzowanego (prawa kolumna). Obrazy są reprodukowane za zgodą Ghimire et al.¹⁷. Podziałka = 30 μm. Skróty: AS = as-spun; EtOH = etanol. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 9: Przykład potencjalnych wad światłowodów możliwych do zaobserwowania za pomocą mikroskopii optycznej. (A) Przykład "wybrzuszenia" wady. (B) Przykład wady "neckingowej". Podziałka = 20 μm Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Po upewnieniu się, że defekty nie występują w danym segmencie włókna i po określeniu średnicy (sekcja protokołu 3.2), można przeprowadzić próbę rozciągania (np. Rysunek 6). Reprezentatywne krzywe naprężenie-odkształcenie uzyskane dla chimerycznej rekombinowanej nici pajęczej przędzonej w różnych warunkach pokazano na rysunku Rysunek 10. W zależności od warunków przędzenia, powstałe włókna wahają się od kruchych (stan AS) do wysoce rozciągliwych o podobnej wytrzymałości jak stan AS (stan 2x-powietrze) do znacznie mocniejszych i mniej rozciągliwych włókien (stan 4x-EtOH). Należy zauważyć, że wiele segmentów włókien i partii przędzonych włókien musi być ocenianych, aby jednoznacznie i rygorystycznie ocenić zachowanie mechaniczne.

figure-results-4
Rysunek 10: Reprezentatywna krzywa naprężenie-odkształcenie włókien przędzonych w różnych warunkach. Włókna analizowano albo w stanie podczas przędzenia (AS), albo podczas produkcji przy użyciu automatycznego rozciągania po wirowaniu (wskazany współczynnik naciągu i stan rozciągania (powietrze vs. rozpuszczalnik)). Rysunek zaadaptowany za zgodą Ghimire et al.(2024)¹⁷. Skrót: AS = as-spun. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Na koniec, struktura drugorzędowa w stanie włókna może być oceniona za pomocą spektromikroskopii ATR-FTIR. Typowe widma włókien jedwabiu uzyskane za pomocą tej metodologii (Rysunek 11A,B) miałyby charakterystyczne pasma białkowe, w tym szeroki pik amidu A (wyśrodkowany wokół ~3,300 ^cm-1), pik amidu I (~1,600-1,700 ^cm-1) i pik amidu II (~1,500-1,600 ^cm-1). Tutaj skupiamy się na ocenie regionu amidu I (np. Rysunek 11C,D). Druga analiza pochodna jest przydatna jako sposób identyfikacji kluczowych składników piku amidu I (Rysunek 11E,F), uwiarygadniając ilościową dekonwolucję pików (Rysunek 11G-J), która pozwala na ocenę i porównanie proporcji typu struktury drugorzędowej obserwowanych we włóknie jedwabiu przędzonym w danych warunkach.

figure-results-5
Rysunek 11: Widma FTIR i analiza struktury drugorzędowej. Panie przewodniczący, panie i panowie! Widma FTIR włókien Py₂W₂ wytwarzanych przez przędzenie na mokro w stanie (A) jako przędzenie (AS) i (B) zawierające 4-stopniowe rozciąganie po przędzeniu w etanolu. (C,D) Regiony amidu I widm FTIR pokazane odpowiednio w A i B. (E-F) Druga pochodna regionów amidu I oznaczona odpowiednio w C i D, obliczona przy użyciu wskazanego pakietu oprogramowania. (G-J) Dekonwolucja piku amidu I wykonywana przy użyciu pakietów oprogramowania (G i I) OMNIC lub (H i J) OriginPro, przy czym panele G i I są dekonwolucją odpowiadającą C i H oraz J D. Skróty: FTIR = transformata Fouriera w podczerwieni; AS = w stanie przędzenia. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Wykraczając poza indywidualne techniki, korelacja danych o strukturze wtórnej, wydajności mechanicznej i orientacji (supra)molekularnej jest zazwyczaj niezbędna zarówno do zrozumienia wpływu różnych parametrów przędzenia na uzyskany materiał, jak i do racjonalnej optymalizacji procesu przędzenia. W dekonwolucjach FTIR pokazanych na Rysunek 11, na przykład, porównując warunki AS do 4×-EtOH dla chimerycznego jedwabiu, znaczne wkłady β arkuszy do pasma amidu I są wyraźne dla obu warunków, ale obejmują większą część całkowitej struktury drugorzędowej dla stanu rozciągniętego po przędzeniu w stosunku do stanu AS, niezależnie od metody dekonwolucji (np. Rysunek 11G,H vs. Rysunek 11I,J). Jest to zgodne zarówno ze znacznie wyższą siłą obserwowaną dla stanu 4×-EtOH niż dla stanu AS (Rysunek 10), jak i poprawą dopasowania molekularnego w stanie 4×-EtOH w stosunku do stanu AS ( Rysunek 9). Szczegółowa charakterystyka i analiza, obejmująca zakres warunków pokazanych w Rysunek 10, zostały zgłoszone wcześniej¹⁷. W związku z tym nie podsumowaliśmy tutaj całej analizy, zamiast tego użyliśmy tego porównania parami jako demonstracji sposobu, w jaki te trzy klasy danych uzupełniają się nawzajem i umożliwiają rozwój znacznie bardziej wszechstronnego zrozumienia zachowania włókien niż jakakolwiek pojedyncza technika w izolacji.

Plik uzupełniający 1: Plik zawierający rysunki uzupełniające S1-S34 przedstawiające pomiar średnicy światłowodu, przetwarzanie danych mechanicznych oraz akwizycję i przetwarzanie danych FTIR. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik uzupełniający 2: Arkusz kalkulacyjny umożliwiający określenie kluczowych właściwości mechanicznych (tj. naprężenia, odkształcenia, modułu Younga i wytrzymałości) na podstawie danych dotyczących masy w funkcji czasu. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Produkcja białek rekombinowanych umożliwia ekscytujący potencjał wytwarzania materiałów w szerokiej gamie formatów, przy czym ostatnie postępy sugerują, że te materiały na bazie białek zbliżają się do bardziej powszechnego zastosowania przemysłowego⁵⁸. Tutaj skupiliśmy się na produkcji włókien z jedwabiu rekombinowanego, ponieważ jest to format jedwabiu rekombinowanego bezpośrednio spokrewniony z rodzimymi włóknistymi niciami pajęczymi. Włókna jedwabiu są reklamowane jako mające wiele potencjalnych zastosowań ze względu na renomowane właściwości mechaniczne naturalnych nici pajęczych oraz ze względu na potencjał do produkcji wysokowydajnych włókien w sposób zrównoważony³². Proponowane zastosowania obejmują zarówno wysokowydajne tekstylia, materiały pochłaniające energię, produkty higieny osobistej, jak i opiekę zdrowotną^58,59. Urządzenia i materiały na bazie pajęczego jedwabiu w formatach ubieralnych lub w innych kontekstach, w których zwiększa się przewodność elektryczna, są również aktywnie badane zarówno pod kątem biomedycznym, jak i szerszego zastosowania⁶⁰. W związku z tym istnieje duże zainteresowanie opracowywaniem, optymalizacją i dostosowywaniem materiałów na bazie pajęczego jedwabiu. W tym protokole przedstawiamy szereg procedur mających na celu szybką produkcję włókien po przygotowaniu nowego rekombinowanego białka jedwabiu lub modulację właściwości materiału rekombinowanego jedwabiu, co do którego już ustalono, że nadaje się do przędzenia.

Niezależnie od zastosowanej metody przędzenia, kluczowe znaczenie ma określenie warunków, które umożliwiają produkcję domieszki wirowej poprzez badanie przesiewowe warunków rozpuszczalnika/bufora i stężenia białka, jak opisano w niniejszym dokumencie. Ostatecznym celem jest rozpuszczanie białka w wystarczająco wysokim stężeniu, aby umożliwić szybką konwersję do włókna bez samoorganizacji poza szlakiem w agregaty lub inne nierozpuszczalne gatunki, które uniemożliwią "produktywne" przędzenie. Jest to zazwyczaj przezroczysty, stosunkowo lepki roztwór, najprawdopodobniej zawierający samoorganizujące się gatunki, takie jak micele/nanocząstki^26,61 i/lub separacja faz ciecz-ciecz⁶². Protokół ten nie wyszczególnia metod kompleksowej oceny stanu domieszkowania spinowego, ponieważ udane przędzenie włókien można osiągnąć poprzez iteracyjną ocenę różnych domieszek spinowych i konfiguracji przędzenia. Szczegółowy molekularny i supramolekularny wgląd w stan domieszkowania spinowego można uzyskać za pomocą technik takich jak wiskozymetria, rozpraszanie światła, spektroskopia dichroizmu kołowego dalekiego UV, spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego i/lub mikroskopia elektronowa²⁶. Należy również zauważyć, że samo rekombinowane białko może być modyfikowane w celu poprawy jego zachowania podczas wirowania, z włączeniem globularnych, niepowtarzalnych domen N- i C-końcowych będących jednym z przykładów metody zwiększania rozpuszczalności spidroiny³². Krótko mówiąc, bez odpowiedniej identyfikacji domieszek spinowych nie jest możliwe przystąpienie do testów porównawczych warunków przędzenia.

Po zidentyfikowaniu jednego lub więcej warunków domieszkowania przędzowego, ręczne rysowanie zapewnia szybką drogę do oceny właściwości włókien jedwabiu. Ponieważ do wydajnego ręcznego rysowania wymagane są znacznie mniejsze ilości domieszkowania, wymagane są znacznie mniejsze masy czystego białka, co czyni go doskonałym prekursorem zautomatyzowanych metod przędzenia na mokro. Zapewnia to również bardzo łatwą i prostą metodę bezpośredniego porównywania właściwości błonnika różnych spidroin³³, ponownie z korzyścią, że produkcja błonnika jest stosunkowo prosta przy niewielkich ilościach białka. Oznaczałoby to, że optymalizacja protokołów ekspresji i oczyszczania białek w celu uzyskania wyższych plonów potrzebnych do przędzenia na mokro może być skoncentrowana na najbardziej obiecujących spidroinach. Minusem jest oczywiście to, że ręczne ciągnienie nie nadaje się do produkcji ani długich, ciągłych włókien, ani znacznych ilości włókien w opływowy sposób.

Przy wystarczającej ilości białka przędzenie na mokro zapewnia korzyści dla usprawnionej produkcji długich, ciągłych włókien³². Nie tylko to, ale właściwości włókien można łatwo modulować w procesie przędzenia. Na przykład wybór warunków przędzenia zapewnia jedną z wyraźnych dróg do poprawy mechaniki włókien. Na przykład, w przypadku rekombinowanego białka jedwabiu o masie ~60 kDa, zmiana z jednego domieszkowania wirowania na drugi, przy zachowaniu wszystkich innych parametrów przędzenia, doprowadziła do dramatycznych zmian w rozciągliwości włókien²⁶. To z kolei odnosiło się do sposobu, w jaki spidroina groniasta gromadziła się w domieszku spinowym przed przędzeniem, z poprawioną jednorodnością samoorganizujących się nanocząstek w domieszku spinowym, co było skorelowane z ulepszoną mechaniką włókien. Włączenie losowania po wirowaniu, zauważając, że współczynnik naciągu musi być zoptymalizowany dla danego rodzaju włókna, zazwyczaj poprawia również mechanikę włókien jedwabiu poprzez pewne połączenie ulepszonego wyrównania molekularnego i zwiększonej konwersji na, na przykład, krystality z β arkuszy, które wzmacniają włókna³². Wreszcie, zastosowanie różnych warunków na etapie losowania po wirowaniu zapewnia środki do modulowania właściwości włókien. Narażenie na działanie rozpuszczalnika bezpośrednio przed lub w trakcie pobierania może znacząco zmienić właściwości mechaniczne i strukturalne włókien ^17,38, przy czym należy zauważyć, że różne spidroiny będą miały różne preferencje i tolerancje rozpuszczalników (np. przy czym rekombinowane włókna groniaste są wysoce kompatybilne z wodą^26,31 w porównaniu z rekombinowanymi włóknami gruszkowatymi ulegającymi skurczowi w wodzie³⁸ w porównaniu z włóknami chimerycznej spidroiny gruszkowatej wykazującej kompatybilność wodną spidroiny groniastej z tworzywa groniastego, mimo że stanowi ona mniej niż połowę białka w masie¹⁷).

Opisany protokół zapewnia wysoce konfigurowalne i wszechstronne podejście do oceny i optymalizacji przędzalni i właściwości włókien rekombinowanych pajęczych nici. We wszystkich przypadkach uzyskane właściwości włókien muszą być konsekwentnie i solidnie analizowane i porównywane. W tym celu proponujemy zastosowanie mikroskopii optycznej, w tym mikroskopii w świetle spolaryzowanym, prób rozciągania i spektromikroskopii FTIR jako "standardowego zestawu narzędzi" technik do tego celu. Dodatkowe techniki charakterystyki biofizycznej i materiałowej mogą być stosowane w celu poszerzenia wiedzy na temat powstałych włókien, ale ten zestaw technik zapewnia wyjątkowe pokrycie kluczowych właściwości morfologii, wyrównania/anizotropii wewnątrzfibrylarnej, wydajności mechanicznej i wtórnej struktury białek. W szczególności, chociaż spektromikroskopia FTIR zapewnia stosunkowo prosty sposób oceny wtórnej struktury włókien jedwabiu, a mikroskopia światła spolaryzowanego pozwala wnioskować o stopniu osiągniętego zwiększonego dopasowania molekularnego, inne metodologie, takie jak spektroskopia NMR w stanie stałym^63,64, dyfrakcja rentgenowska⁶⁴, spolaryzowana spektromikroskopia Ramana⁶⁵ i/lub nieliniowa mikroskopia optyczna⁵⁴ powinny być brane pod uwagę w celu bardziej kompleksowej oceny krystaliczności, wyrównania i strukturyzacji we włóknach jedwabiu w celu pełnego wyjaśnienia zależności struktura-mechanika. Biorąc pod uwagę przydatność przędzenia na mokro dla innych rodzajów białek⁶⁶, przewidujemy, że protokół ten będzie ogólnie stosowany poza rekombinowanymi jedwabiami.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jan K. Rainey informuje o powiązaniach z 3DBioFibR Inc., które obejmują udziały w kapitale własnym i dotacje finansowe. Pozostali autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Finansowanie tej pracy zostało zapewnione przez Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) Discovery Grants (RGPIN-2020-06083 do X-QL i RGPIN-2023-05912 do JKR), suplement Departamentu Obrony Narodowej/NSERC (DGDND-2023-05912 do JKR), grant NSERC Alliance (ALLRP-578541-22 do JKR) we współpracy z 3DBioFibR Inc oraz granty NSERC Research Tools and Instruments. AG jest laureatem stypendium doktoranckiego dla absolwentów Nowej Szkocji (NSGS-D) oraz stypendium podyplomowego Wydziału Medycyny Dalhousie 2024 finansowanego ze wsparcia darczyńców Molly Appeal; HB jest laureatem stypendium Vanier Canada Graduate Scholarship ufundowanego przez NSERC, stypendium przeddoktoranckiego Killam (poziom 2) oraz NSGS-D; SE jest laureatem stypendium podyplomowego NSERC Doctoral Postgraduate Scholarship (PGS-D), nagrody NSERC/Department of National Defence Supplemental Funding Award oraz stypendium Walter C. Sumner Memorial Fellowship. Autorzy są wdzięczni za wsparcie techniczne ze strony Sophie Haverstock i Emily Smith.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
1,1,1,3,3,3-heksafluroropropanol (HFIP)	Thermo Fisher Scientific	445820500	Służy do przygotowania dopingu
Strzykawka 1725LTSN z igłą cementowaną z końcówką Luer	Hamilton	81100	Używany do przędzenia na mokro
2,2,2-trifluoroetanol (TFE)	Sigma-Aldrich	T63002-500G	Używany do przygotowania domieszek
Absolutny etanol	Fisher Scientific	BP28184	Używany do kąpieli krzepnięcia
Kwas octowy	Fisher Scientific	A38-212	Używany do przygotowania domieszek
Waga analityczna	Mettler Toledo	XS105	Dwuzakresowe urządzenie do prób rozciągania
Chlorek wapnia (CaCl₂)	Sigma-Aldrich	C-3881	Używany do przygotowania środków dopingujących
Kwas cytrynowy	Millipore Sigma	77-92-9	Służy do przygotowania środków dopingujących
Komputer	Raspberry Pi	Raspberry Pi 4 Model B	Urządzenie do wirowania na mokro - zapewnia możliwość wykorzystania graficznego interfejsu użytkownika do sterowania silnikami krokowymi
Wodorofosforan disodowy (Na₂HPO₄)	Millipore Sigma	7558-79-4	Używany do przygotowania domieszek
Kwas mrówkowy	Fisher Scientific	A118-500	Służy do przygotowania środków dopingujących
Szkiełka szklane	Millipore Sigma	S8902-1PAK	Służy do montażu światłowodu
Kwas solny (HCl)	EM Science	HX0603-53	Służy do przygotowania domieszek
MCT-A Chłodzony detektor	Thermo Fisher Scientific	840-199300	Ocena FTIR struktury wtórnej włókien
Płyta	montażowa Produkowane we własnym zakresie		urządzenie do przędzenia na mokro
NEMA 17 Biopolarny silnik krokowy	STEPPERONLINE	17HS15-1504S-X1	Urządzenie do przędzenia na mokro - uwaga: do wykonania rozciągania po wirowaniu wymaganych jest wiele silników
Spektromikroskop Nicolet iN10 FTIR	Thermo Fisher Scientific	912A0604	FTIR ocena struktury wtórnej włókien
Nicolet iN10 Etap mapowania	Thermo Fisher Scientific	840-198800	FTIR ocena struktury wtórnej włókna
Nicolet iN10 Zmotoryzowany joystick sceniczny	Thermo Fisher Scientific	840-199800	FTIR ocena struktury drugorzędowej włókien
Nicolet Slide-On Ge Micro Tip ATR 350	Thermo Fisher Scientific	840-194800	Ocena FTIR struktury drugorzędowej włókien
OMNIC Picta ver. 1.7.224	Thermo Fisher Scientific	INQSOF018	Oprogramowanie sterujące przyrządem FTIR
OMNIC wersja 9.11.745	Thermo Fisher Scientific	INQSOF018	Oprogramowanie do przetwarzania i analizy danych FTIR specyficzne dla przyrządu
optyczne/spolaryzowane	mikroskop Zeiss Canada	Axio Observer A1	Odwrócony mikroskop optyczny
OriginPro 2025 10.2 SR1	OriginLab Corporation	OriginPro 10.200196	Oprogramowanie do przetwarzania i analizy danych FTIR innych firm
Diwodorofosforan potasu (KH₂PO₄)	Fisher Scientific	P285-10	Używany do przygotowania dopingu
Fosforan potasu dwuzasadowy (K₂HPO₄)	Fisher Scientific	BP363-500	Używany do przygotowania dopingu
Zasilacz	ALITOVE	ALT-1205	Urządzenie do przędzenia na mokro - 12V 5A Zasilacz Adapter Przetwornica AC 100-240V Wejście z gniazdem wyjściowym DC 5,5x2,5mm - UWAGA: dla optymalnej wydajności może wymagać oddzielnego zasilacza dla każdego silnika
Octan sodu	Sigma-Aldrich	S2889-1KG	Używany do przygotowania domieszek
Wodorotlenek sodu (NaOH)	Milipore Sigma	1310-73-2	Używany do przygotowania domieszek
Rolki przędzalnicze	Produkowane we własnym zakresie		Używane do przędzenia na mokro
silnika krokowego	B0BD5FV3R2		Urządzenie do wirowania na mokro - zapewnia połączenie od sterowników silników krokowych do silników krokowych
Sterownik silnika krokowego (Pi HAT)	Adafruit	DC & Czapka silnika krokowego do Raspberry Pi	Sterownik silnika urządzenia do wirowania na mokro Permutacja 1 - uwaga ograniczona prędkość obrotowa silnika ~46 obr./min
Sterownik silnika krokowego (USB)	Polulu	Tic T249	Sterownik silnika do wirowania na mokro permutacja 2 - używaj, gdy może być potrzebny obrót szybszy niż 46 obr./min
Pompa strzykawkowa	KD	Scientific Model 100	Przyrząd do prób rozciągania i urządzenie do przędzenia na mokro
Kwas trifluorooctowy (TFA)	Millipore Sigma	TX1276-7	Służy do przygotowania domieszek
Chlorowodorek tris	EMD Millipore	9310-500GM	Służy do przygotowania środków dopingujących
Hub USB	Acasis	B07Q3TYF15	Urządzenie do wirowania na mokro - Hub USB zasilany 48W - ACASIS 10 portów Koncentrator danych USB 3.0 - z indywidualnymi przełącznikami włączania/wyłączania i zasilaczem 12V/4A Rozdzielacz USB - interfejs pomiędzy sterownikami silników krokowych Raspberry Pi i Tic T249

Światło

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gosline, J. M., Demont, M. E., Denny, M. W. The structure and properties of spider silk. Endeavour. 10 (1), 37-43 (1986).
Gosline, J. M., Guerette, P. A., Ortlepp, C. S., Savage, K. N. The mechanical design of spider silks: from fibroin sequence to mechanical function. J Exp Biol. 202 (23), 3295-3303 (1999).
Lewis, R. V. Spider silk: Ancient ideas for new biomaterials. Chem Rev. 106 (9), 3762-3774 (2006).
Omenetto, F. G., Kaplan, D. L. New opportunities for an ancient material. Science. 329 (5991), 528-531 (2010).
Hayashi, C. Y., Shipley, N. H., Lewis, R. V. Hypotheses that correlate the sequence, structure, and mechanical properties of spider silk proteins. Int J Biol Macromol. 24 (2-3), 271-275 (1999).
Römer, L., Scheibel, T. The elaborate structure of spider silk: structure and function of a natural high performance fiber. Prion. 2 (4), 154-161 (2008).
Altman, G. H., et al. Silk-based biomaterials. Biomaterials. 24 (3), 401-416 (2003).
Fahnestock, S. R., Irwin, S. L. Synthetic spider dragline silk proteins and their production in Escherichia coli. Appl Microbiol Biotechnol. 47, 23-32 (1997).
Xia, X. -X., et al. Native-sized recombinant spider silk protein produced in metabolically engineered Escherichia coli results in a strong fiber. Proc Natl Acad Sci USA. 107 (32), 14059-14063 (2010).
Fahnestock, S. R., Bedzyk, L. A. Production of synthetic spider dragline silk protein in Pichia pastoris. Appl Microbiol Biotechnol. 47, 33-39 (1997).
Bogush, V. G., et al. Recombinant analogue of spidroin 2 for biomedical materials. Dokl Biochem Biophys. 441, 276-279 (2011).
Huemmerich, D., et al. Novel assembly properties of recombinant spider dragline silk proteins. Curr Biol. 14 (22), 2070-2074 (2004).
Menassa, R., et al. Spider dragline silk proteins in transgenic tobacco leaves: Accumulation and field production. Plant Biotechnol J. 2 (5), 431-438 (2004).
Hauptmann, V., et al. Native-sized spider silk proteins synthesized in planta via intein-based multimerization. Transgenic Res. 22, 369-377 (2013).
Lazaris, A., et al. Spider silk fibers spun from soluble recombinant silk produced in mammalian cells. Science. 295 (5554), 472-476 (2002).
Xu, H. T., et al. Construct synthetic gene encoding artificial spider dragline silk protein and its expression in milk of transgenic mice. Anim Biotechnol. 18, 1-12 (2007).
Ghimire, A., Xu, L., Liu, X. Q., Rainey, J. K. A recombinant chimeric spider pyriform-aciniform silk with highly tunable mechanical performance. Mater Today Bio. 26, 101073(2024).
Wohlrab, S., et al. Cell adhesion and proliferation on RGD-modified recombinant spider silk proteins. Biomaterials. 33 (28), 6650-6659 (2012).
Baker, L. A., et al. Nerve growth factor-binding engineered silk films promote neuronal attachment and neurite outgrowth. Adv Funct Mater. 32 (45), 2205178(2022).
Kluge, J. A., Rabotyagova, O., Leisk, G. G., Kaplan, D. L. Spider silks and their applications. Trends Biotechnol. 26 (5), 244-251 (2008).
Bakhshandeh, B., Nateghi, S. S., Gazani, M. M., Dehghani, Z., Mohammadzadeh, F. A review on advances in the applications of spider silk in biomedical issues. Int J Biol Macromol. 192, 258-271 (2021).
Hijirida, D. H., et al. 13C NMR of Nephila clavipes major ampullate silk gland. Biophys J. 71 (6), 3442-3447 (1996).
Vollrath, F., Knight, D. P. Liquid Crystalline Spinning of Spider Silk. Nature. 410 (6828), 541-548 (2001).
Doblhofer, E., Heidebrecht, A., Scheibel, T. To spin or not to spin: spider silk fibers and more. Appl Microbiol Biotechnol. 99, 9361-9380 (2015).
Koeppel, A., Holland, C. Progress and trends in artificial silk spinning: A systematic review. ACS Biomater Sci Eng. 3 (3), 226-237 (2017).
Xu, L., Weatherbee-Martin, N., Liu, X. Q., Rainey, J. K. Recombinant silk fiber properties correlate to prefibrillar self-assembly. Small. 15 (12), 1805294(2019).
Teulé, F., et al. A protocol for the production of recombinant spider silk-like proteins for artificial fiber spinning. Nat Protoc. 4 (3), 341-355 (2009).
Yang, M., Kawamura, J., Zhu, Z., Yamauchi, K., Asakura, T. Development of silk-like materials based on Bombyx mori and Nephila clavipes dragline silk fibroins. Polymer. 50 (1), 117-124 (2009).
Lewis, R. V., Hinman, M., Kothakota, S., Fournier, M. J. Expression and purification of a spider silk protein: a new strategy for producing repetitive proteins. Protein Express Purif. 7 (4), 400-406 (1996).
Arcidiacono, S., et al. Aqueous processing and fiber spinning of recombinant spider silks. Macromolecules. 35 (4), 1262-1266 (2002).
Weatherbee-Martin, N., et al. Identification of wet-spinning and post-spin stretching methods amenable to recombinant spider aciniform silk. Biomacromolecules. 17 (8), 2737-2746 (2016).
Schmuck, B., et al. Strategies for making high-performance artificial spider silk fibers. Adv Funct Mater. 34 (35), 2305040(2024).
Xu, L., et al. Structural and mechanical roles for the C-terminal nonrepetitive domain become apparent in recombinant spider aciniform silk. Biomacromolecules. 18, 3678-3686 (2017).
Xu, L., Rainey, J. K., Meng, Q., Liu, X. Q. Recombinant minimalist spider wrapping silk proteins capable of native-like fiber formation. PLoS One. 7 (11), e50227(2012).
Exler, J. H., Hümmerich, D., Scheibel, T. The amphiphilic properties of spider silks are important for spinning. Angew. Chem, Int Ed. 46 (19), 3559-3562 (2007).
Teulé, F., Furin, W. A., Cooper, A. R., Duncan, J. R., Lewis, R. V. Modifications of spider silk sequences in an attempt to control the mechanical properties of the synthetic fibers. J Mater Sci. 42, 8974-8985 (2007).
Khan, A. Q., et al. Innovations in spider silk-inspired artificial gel fibers: methods, properties, strengthening, functionality, and challenges. SusMat. 4 (3), e205(2024).
Simmons, J. R., Xu, L., Rainey, J. K. Recombinant pyriform silk fiber mechanics are modulated by wet-spinning conditions. ACS Biomater Sci Eng. 5 (10), 4985-4993 (2019).
Seidel, A., Liivak, O., Jelinski, L. W. Artificial spinning of spider silk. Macromolecules. 31 (19), 6733-6736 (1998).
Venkatesan, H., et al. Artificial spider silk is smart like natural one: Having humidity-sensitive shape memory with superior recovery stress. Mater Chem Front. 3 (11), 2472-2482 (2019).
Sommer, C., Scheibel, T. Suitable electrospinning approaches for recombinant spider silk proteins. Open Ceramics. 15, 100420(2023).
Wang, M. Y., et al. Dry-spinning of artificial spider silk ribbons from regenerated natural spidroin in an organic medium. Macromol Rapid Commun. 44 (12), 2300024(2023).
Chang, M., Zhang, X., Yang, Z. Artificial metal-ion doped spider silk fibers with excellent mechanical property and humidity-driven actuator property. Macromol Chem Phys. 226 (10), 2400502(2025).
Kang, E., et al. Digitally tunable physicochemical coding of material composition and topography in continuous microfibres. Nat Mater. 10 (11), 877-883 (2011).
Lin, B., et al. Overexpressed artificial spidroin based microneedle spinneret for 3D air spinning of hybrid spider silk. ACS Nano. 18 (37), 25778-25794 (2024).
Gonska, N., et al. Structure-function relationship of artificial spider silk fibers produced by straining flow spinning. Biomacromolecules. 21 (6), 2116-2124 (2020).
Blackledge, T. A., Cardullo, R. A., Hayashi, C. Y. Polarized light microscopy, variability in spider silk diameters, and the mechanical characterization of spider silk. Invert Biol. 124 (2), 165-173 (2005).
Greco, G., et al. Properties of biomimetic artificial spider silk fibers tuned by postspin bath incubation. Molecules. 25 (14), 3244(2020).
Andersson, M., et al. Biomimetic spinning of artificial spider silk from a chimeric minispidroin. Nat Chem Biol. 13 (3), 262-264 (2017).
Tremblay, M. L., et al. Spider wrapping silk fibre architecture arising from its modular soluble protein precursor. Sci Rep. 5 (1), 11502(2015).
Schmuck, B., et al. Impact of physio-chemical spinning conditions on the mechanical properties of biomimetic spider silk fibers. Commun Mater. 3 (1), 83(2022).
Yue, X., et al. A novel route to prepare dry-spun silk fibers from CaCl2-formic acid solution. Mater Lett. 128, 175-178 (2014).
Sulekha, A., et al. An engineered recombinant spider silk protein providing disulfide-locked control over self-assembly and fiber formation. Adv Funct Mater. 35 (15), 2420254(2025).
Harvey, M., Ghimire, A., Cisek, R., Kreplak, L., Rainey, J. K., Tokarz, D. Polarization-resolved second harmonic generation microscopy of silk fibers is sensitive to β-sheet orientation and molecular structure. ACS Appl Bio Mater. 8 (6), 5229-5238 (2025).
Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
Huan, Y., et al. Experimental study of the mechanical properties of a novel supramolecular polymer filament using a microtensile tester based on electronic balance. Exp Tech. 40, 737-742 (2014).
Hu, X., Kaplan, D., Cebe, P. Determining beta-sheet crystallinity in fibrous proteins by thermal analysis and infrared spectroscopy. Macromolecules. 39 (18), 6161-6170 (2006).
Breslauer, D. N. Current progress on scale-up and commercialization of microbially-produced silk. Adv Funct Mater. 35 (15), 2408386(2025).
Branković, M., et al. Review of spider silk applications in biomedical and tissue engineering. Biomimetics. 9 (3), 169(2024).
Pan, L., et al. A supertough electro-tendon based on spider silk composites. Nat Commun. 11 (1), 1332(2020).
Jin, H. J., Kaplan, D. L. Mechanism of silk processing in insects and spiders. Nature. 424 (6952), 1057-1061 (2003).
Malay, A. D., et al. Spider silk self-assembly via modular liquid-liquid phase separation and nanofibrillation. Sci Adv. 6 (45), eabb6030(2020).
Asakura, T., Naito, A. Structure of spider silk studied with solid-state NMR. Adv Funct Mater. 35 (15), 2407544(2024).
Yarger, J. L., Cherry, B. R., Van Der Vaart, A. Uncovering the structure-function relationship in spider silk. Nat Rev Mater. 3 (3), 1-11 (2018).
Lefèvre, T., Paquet-Mercier, F., Rioux-Dubé, J. F., Pézolet, M. Structure of silk by Raman spectromicroscopy: from the spinning glands to the fibers. Biopolymers. 97 (6), 322-336 (2012).
Schiller, T., Scheibel, T. Bioinspired and biomimetic protein-based fibers and their applications. Commun Mater. 5 (1), 56(2024).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Sprostowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: Optimizing and Evaluating Hand-drawing and Wet-spinning for Recombinant Spider Silk Fiber Production
Posted by JoVE Editors on 9/08/2025. Citeable Link.

This corrects the article 10.3791/68714

Tagi

Produkcja jedwabiu paj czego r czne wyci ganie jedwabiu mokre prz dzenie jedwabiu optymalizacja w kna jedwabnego przygotowanie roztworu prz dzalnego wyci ganie po prz dzeniu mikroskopia optyczna badanie wytrzyma o ci na rozci ganie spektromikroskopia FTIR

Optymalizacja i ocena ręcznego rysowania i przędzenia na mokro w produkcji rekombinowanych włókien jedwabiu pajęczego

W tym artykule

Informacja o sprostowaniu

Podsumowanie

Streszczenie

Wprowadzenie

Protokół

Wyniki

Dyskusja

Oświadczenia

Podziękowania

Materiały

Bibliografia

Przedruki i uprawnienia

Sprostowanie

Tagi

Powiązane artykuły