Method Article

Procedura przecięcia/reaktywacji nerwu kulszowego myszy w celu badania naprawy i funkcjonalnej rekonwalescencji nerwu kulszowego

DOI:

10.3791/68724

⸱

January 16th, 2026

 , 
1Barshop Institute for Longevity and Aging Studies, University of Texas Health Science Center at San Antonio, 2Department of Cell Systems and Anatomy, University of Texas Health Science Center at San Antonio, 3Department of Molecular Medicine, University of Texas Health Science Center at San Antonio

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten opisuje model przecięcia i reaktywacji nerwu kulszowego u myszy do badania regeneracji nerwów obwodowych przy użyciu dorosłych neuronów zwojowe korzenia grzbietowego. Umożliwia analizę in vivo odrostu aksonów, unerwienia mięśni oraz funkcjonalnej regeneracji po uszkodzeniu nerwu.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Naprawa nerwów jest kluczowa dla przywrócenia funkcji po uszkodzeniu aksonów. Jednak dojrzałe neurony w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN) mają ograniczoną zdolność regeneracji aksonów po urazie ze względu na ograniczoną zdolność wzrostu wewnętrznego i wrogie środowisko. Natomiast neurony w obwodowym układzie nerwowym (PNS) wykazują silny potencjał regeneracyjny. Wśród nich dorosłe neurony zwojów grzbietowego korzenia (DRG) są szczególnie znane ze swojej zdolności do skutecznej regeneracji po uszkodzeniach nerwów obwodowych, co czyni je idealnym modelem do badania mechanizmów komórkowych i molekularnych leżących u podstaw naprawy nerwów. Tutaj opisano zmodyfikowaną technikę mikroszwów, zwaną "pętlą przed przecięciem", która służy do generowania modelu przecięcia i reaktywacji nerwu kulszowego u myszy, a następnie analizie regeneracji aksonów. Oceny behawioralne i renerwacja mięśni również wykazują ocenę funkcjonalnej regeneracji. Po przecięciu i reaktywacji nerwu kulszowego zwierzęta początkowo wykazują deficyty behawioralne, ale pełna regeneracja zwykle obserwuje się po 30 dniach od urazu. Stosowanie leków wspierających zespolenie aksonów w miejscu urazu znacząco przyspiesza funkcjonalną regenerację. Ten model oferuje potężne narzędzie do badania mechanizmów naprawiających nerwy ssaków in vivo.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Uszkodzenie aksonów jest częstym i ciężkim skutkiem uszkodzenia mózgu i rdzenia kręgowego, często spowodowanym urazami pourazowymi, neurotoksynami lub zaburzeniami neurologicznymi zakłócającymi łączność nerwową i upośledzającym regenerację aksonów 1,2. Nie wszystkie neurony posiadają wrodzoną zdolność regeneracji, która jest kluczowa dla naprawy przeciętych aksonów. Tempo regeneracji aksonów zależy od wielu czynników, w tym wewnętrznego potencjału wzrostu neuronu, efektywności syntezy białek, dynamiki cytoszkieletu, usuwania zanieczyszczeń mieliny oraz dostępności czynników wzrostu 3,4.

W ośrodkowym układzie nerwowym dorosłych ssaków (OUN) uszkodzenie aksonów prowadzi do osłabienia zdolności regeneracyjnej, głównie z powodu braku wewnętrznych czynników wspierających wzrost oraz obecności hamujących zewnętrznych sygnałów 1,5. Natomiast aksony w obwodowym układzie nerwowym (PNS) wykazują silną zdolność regeneracji po urazie, dzięki wewnętrznym mechanizmom samonaprawy neuronów obwodowych oraz szybkiej reaktywacji programów wzrostu proregeneracyjnego. Po urazie dalszy segment aksonu odłącza się od soma neuronalnego i ulega degeneracji wallerowskiej, charakteryzującej się rozpadem aksonówi fragmentacją 6,7. Efektywne usuwanie zanieczyszczeń aksonalnych i mielinowych przez komórki glejowe jest niezbędne dla skutecznej regeneracji, ponieważ zapobiega powstawaniu blizn, które mogłyby hamować wzrost aksonów 3,8. Proces ten, wraz z przebudową cytoszkieletu uszkodzonych aksonów, wspiera odrost kikuta bliższego i ułatwia renerwację docelową. Zdarzenia te zachodzą w częściowo nakładających się fazach, podczas których aktywacja czynników transkrypcyjnych wywołanych przez uraz, takich jak ATF3 i c-Jun, sprzyja programom proregeneracyjnej ekspresji genów 4,9,10.

Regeneracyjna fuzja aksonów stanowi efektywny mechanizm przywracania łączności neuronalnej po uszkodzeniu aksonów11. Proces ten został po raz pierwszy opisany u raka Procambarus clarkii w 1967 roku12 i od tego czasu został udokumentowany u wielu gatunków13, 14, 15, 16, w tym Caenorhabditis elegans17. Chociaż bezpośrednie dowody na zespolenie aksonów u ssaków pozostają ograniczone, strategie indukujące zespolenie zostały skutecznie zastosowane, aby poprawić naprawę nerwów11. Warto zauważyć, że chemikalik fuzogenowy glikol polietylenowy (PEG) sprzyja ponownemu uszczelnianiu błony i wykazano, że ułatwia funkcjonalną regenerację po urazach nerwów obwodowych i rdzenia kręgowego w modelach ssaków 18,19,20,21,22,23,24. Najnowsze odkrycia wskazują, że wyczerpanie peroksydazy glutationowej (GPX) jest wystarczające, aby sprzyjać fuzji aksonalnej u C. elegans25. Podobnie myszy warunkowego nokautu Gpx4 lub osoby leczone inhibitorem GPX ML162 wykazywały przyspieszoną funkcjonalną regenerację po przecięciu nerwu kulszowego, potencjalnie dzięki wzmocnionej fuzji aksonalnej25.

Nerw kulszowy to nerw mieszany, składający się z aksonów czuciowego, somatycznego i autonomicznego aksonu ruchowego26. Występuje z segmentów kręgosłupa L4 i L5 u szczurów27 oraz z segmentów L3 i L4 u myszy28. Dzięki dostępności i anatomicznej spójności, uszkodzenie nerwu kulszowego stało się jednym z najczęściej stosowanych modeli do badania regeneracji nerwów obwodowych29,30. Modele te umożliwiają badanie zarówno wewnętrznych mechanizmów neuronalnych, jak i zewnętrznych czynników środowiskowych wpływających na wzrost aksonów i funkcjonalną regenerację 3,4,9. Wykorzystanie zgniatania nerwu kulszowego jako eksperymentalnego paradygmatu w neurobiologii sięga końca XIXwieku. Oprócz modeli zgniatania nerwów, przecięcie nerwów jest szeroko wykorzystywane do badania regeneracji aksonów i funkcjonalnej regeneracji. Jednak klasyczne przecięcie nerwu kulszowego wraz z szwem u myszy jest często mniej powtarzalne i niezawodne niż u szczurów, ze względu na niewielki rozmiar nerwu i delikatną strukturę31.

Stosując zmodyfikowany model przecięcia i reaktywacji nerwu kulszowego, nazwanego "pętlą przed przecięciem", udało się z powodzeniem wygenerować powtarzalne modele przecięcia i reaktywacji nerwu kulszowego25. Takie podejście eliminuje konieczność obsługi nerwów po przecięciu poprzez wstępne wprowadzenie szwu przed cięciem, co zmniejsza obciążenia mechaniczne i minimalizuje zmienność wynikającą z techniki chirurgicznej. Umiarkowane poziomy modulacji GPX przyczyniły się do funkcjonalnej regeneracji po całkowitym przecięciu nerwu kulszowego myszy25. Współleczenie niskich stężeń ML162 (0,25 μM)32, inhibitora GPX oraz glikolu polietylenowego (PEG, 500 mM)18,19,20,21,22,23,24 na przecięciu nerwu kulszowego (SNT) / zmianie reaktywacyjnej skutecznie poprawiło ocenę zachowania ocenioną na podstawie testu nakłucia stóp, asymetrii usterek stopy oraz rozprzestrzeniania palców 25,33,34. Amputowane fragmenty aksonów dystalnych neuronów zwojów korzenia grzbietowego ssaków (DRG) ulegają degeneracji w ciągu 3 dni, co prowadzi do zakłóceń złączeń nerwowo-mięśniowych (NMJ)6,35, a regeneracyjne neurony DRG unerwiają mięśnie, aby odzyskać ich funkcje. Grupa współleczenia SNT/resutura ML162/PEG wykazała unerwienie NMJ oraz poprawę wyników zachowań na wczesnym etapie (3 dni po operacji), co wskazuje na wczesną regenerację funkcji nerwowo-mięśniowej25.

Tutaj opisano metodę mikroszwu "pętla przed przecięciem" oraz podawanie leków, które umożliwiły powyższe obserwacje u myszy. Wcześniej ustanowiony protokół fuzji PEG, umożliwiający szybką naprawę przeciętych nerwów szczura,został zmodyfikowany. Początkowo wykazano, że glikol polietylenowy (PEG) sprzyja egzogennej rekoneksji przyśrodkowych olbrzymich aksonów raków (MGA) in vitro36. Protokoły PEG-fusion poprawiły wyniki behawioralne w 25%-30% badań dotyczących urazów nerwu kulszowego szczura, choć funkcjonalna regeneracja nie była obserwowana na wczesnym etapie34. Kolejne udoskonalenia wprowadziły koncepcję endogennego uszczelnienia błonowego37. Po uszkodzeniu nerwów szybka naprawa plazmalemów jest neuroprotekcjonalna i zapobiega neurodegeneracji. Nagromadzenie pęcherzyków otoczonych błoną wywołaneprzez Ca 2+ ułatwia ten proces uszczelniania38. Całkowite przecięcie nerwu zakłóca aksolemmę oraz osłonki endoneurialnej, kroczowej i epineurialnej w miejscu zmiany. Mikroszywanie oczka epineurialnego ustawia kikuty nerwu bliższego i dalszego. Podczas etapu szawu użycie soli hipotonicznej wolnej Ca2+ zmniejsza powstawanie pęcherzyków otoczonych błoną, utrzymując otwarte osłonki endoneuralne i kroczowe oraz umożliwiając ich bliskie przybliżenie przez szwy epineuralne. Następnie zastosowanie soli fizjologicznej zawierającej Ca2+ indukuje gromadzenie pęcherzyków w celu uszczelnienia pozostałych rozbić plazmalemowych18.

W tym protokole użyto dorosłych myszy FVB (8-10 tygodni) oraz myszy C57BL/6, i nie zaobserwowano różnic specyficznych dla szczepu. Nerw kulszowy u myszy znajduje się około 1-2 mm poniżej mięśnia pośladkowego na poziomie środkowej części uda i jest wyraźnie cieńszy oraz bardziej kruchy niż u szczurów, co wymaga większej precyzji chirurgicznej podczas sekcji i szycia. Należy zachować ostrożność, aby uniknąć nadmiernego rozciągnięcia nerwów lub nadmiernej manipulacji, która mogłaby zaburzyć funkcjonalną regenerację. To podejście polega na całkowitym przecięciu nerwu, co skutkuje powstaniem fizycznej szczeliny między knykciami bliższymi a dalszymi. Ponieważ ta luka hamuje bezpośrednią regenerację aksonów, skuteczna rekonwalescencja zazwyczaj wymaga interwencji mikrochirurgicznej lub przeszczepu nerwów.

Ponieważ nerw kulszowy myszy jest cieńszy i delikatniejszy niż u szczura, wymagana jest większa precyzja chirurgiczna. Chociaż mikroszycie jest powszechnie stosowane, może nieumyślnie powodować dodatkowe urazy z powodu nadmiernej manipulacji lub powtarzających się przekroczeń igły39. Te ograniczenia mogą wprowadzać zmienność i potencjalnie utrudniać ocenę nowych strategii leczenia. Dlatego osiągnięcie spójnych wyników chirurgicznych przy jednoczesnym minimalizowaniu uszkodzeń nerwów wywołanych szwami jest niezbędne do wiarygodnej oceny funkcjonalnej rekonwalescencji w modelach przecięcia nerwowego. Stosując tę metodę "pętla przed przecięciem", opracowano powtarzalne modele przecięcia i reaktywacji nerwu kulszowego oraz oceniono wpływ podwójnego leczenia PEG i ML162 na funkcjonalną regenerację. Ogólnie rzecz biorąc, mimo szerokiego zastosowania, model przecięcia nerwu kulszowego myszy stanowi wyzwania techniczne ze względu na niewielki rozmiar i kruchość nerwu. Ta zmodyfikowana metoda reaktywacji opisana tutaj odpowiada na kluczową potrzebę powtarzalnego, ustandaryzowanego protokołu mikrochirurgicznego minimalizującego uszkodzenia mechaniczne.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury na zwierzętach były przeprowadzane zgodnie z wytycznymi Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Instytucjonalnych (IACUC) w University of Texas Health Science Center w San Antonio (Numer Protokołu: 20200082AR). Dorosłe samce i samice myszy FVB (8-10 tygodni, 20-25 g) zostały użyte do eksperymentalnych procedur JoVE opisanych tutaj. Myszy C57BL/6 (8-10 tygodni, 20-25 g) były używane wyłącznie w operacjach wstępnych przeprowadzonych przed formalnymi eksperymentami w celu optymalizacji precyzji obsługi i szycia. Te sesje potwierdziły, że procedura "pętla przed przecięciem" przyniosła porównywalne wyniki w obu szczepach; dlatego wszystkie formalne dane przedstawione w tym manuskrypcie pochodzą od myszy FVB. Łącznie dziesięć myszy z FVB (pięciu mężczyzn i pięć kobiet) początkowo uwzględniono do przecięcia nerwu kulszowego, a następnie do leczenia ML162+ PEG. Jedno zwierzę wykazywało wrodzoną zmienność anatomiczną, w której nerw kulszowy rozdzielił się na dwie główne gałęzie przed miejscem przecięcia, co skutkowało niepełną operacją i wykluczeniem z analizy. Dlatego przeprowadzono analizy behawioralne i histologiczne na dziewięciu zwierzętach (n = 9). Obie płcie wykazywały porównywalną regenerację i wyzdrowienie behawioralne, a różnice specyficzne dla płci nie zaobserwowano. Dodatkowa mysz przeszła podwójne przecięcie bez przecięcia nerwu (fikcyjne kontrolowanie), aby ocenić potencjalny wpływ samego zabiegu na wyniki behawioralne. Nie zaobserwowano zauważalnych różnic w odpowiedzi regeneracyjnej między płciami. Zwierzęta trzymano w standardowych warunkach z 12-godzinnym cyklem światła/ciemności, przy temperaturze 75 °F i wilgotności względnej 40%-60%, z doraźnym dostępem do jedzenia i wody. Użyto zarówno samców, jak i samic myszy, i nie zaobserwowano zauważalnych różnic między samcami a samicami. Zabiegi chirurgiczne wykonywano w znieczuleniu izofluranowym systemu znieczulenia niskoprzepływowego SomnoSuite. Testy behawioralne przeprowadzono od drugiego dnia po operacji, a następnie powtórzono w dniach 4, 7, 10, 14, 18, 22 i 27, zgodnie z odpowiednimi wykresami. Odczynniki i używany sprzęt są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Przecięcie/reaktywacja nerwu kulszowego i leczenie farmakologiczne

  1. Umieść zwierzę na podgrzewanej podkładce, gdzie nerw kulszowy można było obserwować pod mikroskopem stereo rozcinającym (Rysunek 1A).
  2. Znieczulaj mysz za pomocą systemu znieczulenia o niskim przepływie SomnoSuite.
    UWAGA: Przed rozpoczęciem operacji potwierdzić głębokość znieczulenia poprzez brak reakcji odruchowych, takich jak reakcja na uszczypnięcie palca u stopy. Nakładaj na oczy maść okulistą weterynaryjną, aby zapobiec suchości rogówki.
  3. Ogol włosy na udzie i wokół nich.
    UWAGA: Usuń ogolone i opuszczone włosy tak czysto, jak to możliwe. W przeciwnym razie włosy przykleją się do nylonowego szwu 10-0 i zanieczyszczą nerw kulszowy. Pozostałe włosy można delikatnie usunąć taśmą laboratoryjną lub taśmą klejącą po goleniu, aby zapewnić czyste pole operacyjne. Dezynfekuj miejsce operacji, przecierając ogolone miejsce kolejno 70% etanolem, betadyną oraz na koniec wycieraniem 70% etanolem za pomocą wacików z autoklawem.
  4. Zlokalizuj kość udową i wykonaj małe nacięcie skórne o długości około 1,0 cm (zakres 0,8-1,2 cm) na wysokości środkowej części uda, około ~1 mm z tyłu i równolegle do kości udowej, używając precyzyjnych nożyczek chirurgicznych.
    1. Delikatnie cofnij mięśnie pośladkowe maximus, aby odsłonić biceps udowe pod spodem. Następnie użyj końcówek nożyczek, aby delikatnie oddzielić przednią i tylną główkę bicepsa udowego, bez cięcia, odsłaniając nerw kulszowy pod wcięciem kulszowym. Te kroki wykonywane są pod bezpośrednią obserwacją wzrokową, a nie pod mikroskopem.
  5. Wyciągnij nerw kulszowy z organizmu za pomocą kleszczy mikro-dyssekcyjnych, aby ułatwić operację nerwu kulszowego (Rysunek 1A).
    UWAGA: Przymocuj kleszcze taśmą, aby zapobiec ich rozprzestrzenianiu się powyżej określonego poziomu i minimalizować uszkodzenia nerwu kulszowego. Umieść czubek kleszczy pod nerwem kulszowym i unieś go do góry, używając uda myszy jako punktu podparcia. Uważaj, aby unosić nerw tylko na tyle, na ile jest to konieczne, aby ułatwić zszycie, i unikaj naprężania lub ciągnięcia go na zewnątrz, ponieważ nadmierne rozciągnięcie może uszkodzić aksony lub otaczające struktury.
  6. Skup mikroskop na odsłoniętym nerwie kulszowym. Od tego kroku przejdź do kroku 15 pod mikroskopem (rysunek 1A).
  7. Przekłuj dwukrotnie nerw kulszowy szwem nylonowym 10-0 (Rysunek 1B,C). Przejdź do kroków 1-8, aby kontrolować niecięte. Przejdź do kroków 1-11, aby przeciąć nerw.
    UWAGA: Przeprowadzono dwa przebicia w odległości około jednej szerokości nerwu (~0,7 mm), ustawione symetrycznie po obu stronach miejsca przecięcia. Takie odstępy zapewniały prawidłowe ustawienie kłuków bliższych i dalszych, minimalizując jednocześnie naprężenia mechaniczne w miejscu zmiany. Przebij środek nerwu kulszowego szwem, upewniając się, że oba przebicia wykonane przez szew są dokładnie równoległe. Szwy 10-0 są małe i trzeba je kontrolować bardzo cienką pęsetą. Zastosowano nylon niechłonny 10-0, ponieważ zapewnia doskonałą wytrzymałość rozciągającą i minimalną reaktywność tkanek podczas 30-dniowego okresu obserwacji. Materiał ten jest szeroko stosowany w mikrochirurgicznych modelach naprawy nerwów u myszy i szczurów18,31. Nie stosowano szwów wchłaniających, ponieważ stopniowa degradacja mogłaby zaburzyć ustawienie przeciętych kikutów nerwowych przed zakończeniem funkcjonalnej rekonwalescencji. Aby zminimalizować zmienność zależną od operatora, wszystkie zabiegi chirurgiczne były wykonywane przez jednego przeszkolonego chirurga po rozległej praktyce mikrochirurgicznej pod stereomikroskopem. Sama metoda "pętla przed przecięciem" dodatkowo zmniejsza zmienność, eliminując potrzebę manipulacji nerwami po przecięciu, zapewniając tym samym spójne ustawienie i napięcie między zwierzętami. Wymaga to znacznej praktyki i wysokiego poziomu umiejętności kontroli. Przed przeprowadzeniem operacji na zwierzętach początkujący mogą uznać za pomocne ćwiczenie ruchu szycia przy użyciu cienkich, syntetycznych nici, takich jak nić dentystyczna, aby rozwijać zręczność i kontrolę pod stereomikroskopem.
  8. Ostrożnie zawiąż węzeł nylonowym szwem.
  9. Umieść odsłonięty nerw kulszowy pod warstwą mięśniową i zamknij skórę za pomocą szwów nylonowych 4-0.
  10. Ustal, że podwójne przebicie nerwu kulszowego szwem nylonowym 10-0 nie wpływa na zachowanie myszy.
    UWAGA: Aby to potwierdzić, myszy, które przeszły podwójne przebijanie bez przecięcia, poddawano tym samym testom behawioralnym co w grupach eksperymentalnych, w tym nakłuciu stóp, asymetrii uskoków stopy oraz rozprzestrzenianiu palców u stóp. Te myszy konsekwentnie osiągały pełne wyniki równoważne nieoperowanym kontrolom typu dzikiego, co wskazuje, że sam zabieg szycia nie upośledził funkcji nerwu kulszowego.
  11. Przetnij nerw kulszowy w połowie drogi między dwoma nylonowymi szwami 10-0 skalpelem (rysunek 1D).
    UWAGA: Aby zminimalizować zmienność, wszystkie operacje były wykonywane przez tego samego wyszkolonego eksperymentatora, stosując ustandaryzowaną procedurę. Ponadto konstrukcja "pętla przed przecięciem" automatycznie minimalizuje zmienność, unikając manipulacji nerwami po przecięciu, zapewniając spójne umiejscowienie szwów i napięcie u wszystkich zwierząt. Pozycja szwów została zweryfikowana pod mikroskopem rozcinającym, aby zapewnić jednolitość u zwierząt.
  12. Odłóż kleszcze.
  13. Przemyj przecięty nerw solą fizjologiczną z buforem fosforanowym Ca2+ (PBS; 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4/NaH2PO4, pH 7,4), przygotowaną bez chlorku wapnia.
    UWAGA: Przepłukaj przecięty kikut nerwowy bezwapniowym PBS przez około 10-20 sekund, aby oczyścić krew i zapobiec przedwczesnemu zaklejeniu. Ponowne podłoże powinno być wykonane niezwięźnie, w ciągu 1-2 minut, aby utrzymać ustawienie i żywotność tkanek.
  14. Usuń PBS wolny od Ca2+, wchłaniając go chusteczką.
  15. Ostrożnie zawiąż węzeł nylonowym szwem (rysunek 1E). Przechodź do etapu 20, jeśli leczenie uzależnień nie jest planowane lub wymagane.
    UWAGA: Do mikroszycia stosowano standardowy węzeł kwadratowy, składający się z dwóch przeciwległych przesuwów delikatnie zaciskanych drobnymi kleszczami pod stereomikroskopem. Dwa przecięte aksony połączone szwem wracają do kształtu zbliżonego do pierwotnego kształtu. Ponowne połączenie przeciętego naczynia krwionośnego może być wizualnym sygnałem, że knycety nerwowe bliższe i dalsze są prawidłowo ustawione. Podczas zabiegu tkanka powinna wyglądać świeżo i wilgotnie, bez bladości i ucisku. Unikaj zbyt mocnego wiązania szwów, ponieważ może to uwolnić naczynia krwionośne lub zdeformować nerw. Przed zawiązaniem ostatniego węzła upewnij się, że końcówki nerwowe są przybliżone bez napięcia. W razie potrzeby delikatnie przestaw kończynę, aby zapewnić naturalne ustawienie, zamiast ciągnąć za nerw, ponieważ nadmierne napięcie może zwiększać ryzyko nerwiaka lub włóknienia.
  16. Umieść 0,25 μM ML162 w DMSO rozcieńczonym w PBS na zszyty nerw kulszowy za pomocą strzykawki. Pozwól, by zszyty nerw kulszowy był zanurzony w leku przez 1 minutę.
  17. Usuń ML162, wchłaniając go sterylnym wacikiem kosmetycznym.
  18. Umieść 500 mM PEG w wodzie destylowanej, wstępnie podgrzanej do 37 °C, na zszyty nerw kulszowy za pomocą strzykawki. Pozwól, by zszyty nerw kulszowy był zanurzony w leku przez 1 minutę.
    UWAGA: 500 mM PEG to gęsty roztwór, który może stać się stały w temperaturze sali operacyjnej. Podczas pracy umieść strzykawkę na podgrzewanej podkładce, aby PEG pozostał płynny. Uważa się, że PEG sprzyja fuzji błonowej poprzez usuwanie cząsteczek wody pomiędzy sąsiednimi dwuwarstwami lipidowymi, co umożliwia bliski kontakt z błoną i spontaniczne fuzje. Chociaż precyzyjny mechanizm molekularny jest nadal przedmiotem badań, wykazano, że to podejście ułatwia ciągłość aksonów i poprawia funkcjonalną regenerację w modelach uszkodzeń nerwów obwodowych.
  19. Usuń PEG, wchłaniając go chusteczką.
  20. Przemyj zszyty nerw PBS zawierającym Ca2+ (PBS uzupełniony o 1 mM CaCl2; 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM buforu fosforanowego, pH7,4).
  21. Usuwając PBS zawierający Ca2+, wchłaniając go chusteczką.
  22. Umieść odsłonięty nerw kulszowy pod warstwą mięśniową i zamknij skórę za pomocą szwów nylonowych 4-0.
  23. Gdy zwierzę wyjdzie z znieczulenia, należy je odłożyć do klatki.
    UWAGA: Po zamknięciu skóry miejsce zabiegu było traktowane maścią antybiotykową miejscowo zawierającą środek przeciwbólowy. Każde zwierzę było monitorowane na poduszce grzewczej, aż odzyskało wystarczającą świadomość do utrzymania pozycji mostkowej. Zwierzęta były następnie trzymane indywidualnie i wracały do grupy dopiero po pełnym wyzdrowieniu funkcji ruchowych. Chociaż środowisko chirurgiczne nie było utrzymywane pod laminarnym kapturem, wszystkie narzędzia chirurgiczne zostały wysterylizowane, a zabiegi wykonywano techniką aseptyczną, z rękawicami i sterylnymi narzędziami.

2. Test zachowania - Pinprid

UWAGA: Ocena reakcji na wrażliwość mechaniczną na wysoki próg po urazie33.

  1. Umieść mysz w siatce drucianej i pozwól jej swobodnie poruszać się przez 30 minut, by przyzwyczaiła się do nowego otoczenia.
  2. Najbardziej boczna część powierzchni podeszwowej tylnej łapy była podzielona na 5 obszarów (od A do E). Delikatnie nałóż Austerlitz (rozmiar 000) na powierzchnię podeszwową łapy ipsilateralnej. Ukłucie było stosowane dwukrotnie od najbardziej bocznego palca (obszar A) do pięty (obszar E).
    UWAGA: Nie penetruj skóry.
    UWAGA: Odpowiedź uznano za pozytywną, gdy zwierzę energicznie odsunęło łapę od dwóch bodźców ukłutych igłą. Mysz została oceniona na 1 dla tego obszaru, a następnie przetestowana na kolejnym (maksymalnie 5). Jeśli żadna z aplikacji nie uzyskała pozytywnej odpowiedzi, ogólna ocena wynosiła 0. Użyj obszaru odpiszczelowego tej samej strony ipsilateralnej jako kontroli pozytywnej. Zawsze wywoła pozytywną reakcję.

3. Test zachowania – asymetria usterek stopy (FF)

UWAGA: Aby zmierzyć, jak dobrze aksony rwy kulszowej unerwiają bardziej bliższe mięśnie34.

  1. Pozwól zwierzętom swobodnie poruszać się po siatki drucianej podniesionej na klatce, aby przyzwyczaić się do środowiska. Jedno badanie składa się z łącznie 50 kroków na każdą kończynę tylną.
  2. Strzelaj, gdy zwierzęta się pomyliły. Kryteria punktacji są następujące.
    Ocena 1: Częściowa wina. Cofnął się, zanim noga całkowicie wypadła na udo.
    Wynik 2: Pełna wina. Całkowicie spadł do krocza.
  3. Oblicz łączny wynik uszkodzeń stopy na podstawie wszystkich uszkodzonych i zdrowych kończyn tylnych zwierząt w każdym czasie pooperacyjnym.
    Sumowany wynik uskoków stopy = (# uskoków częściowych x 1) + (# uskoków pełnych x 2)
  4. Podziel łączny wynik uskoku stopy przez 50 (łączna liczba kroków/kończyna), aby uzyskać procent uskoku dla każdej kończyny tylnej.
    % uskoku stopy = Łączny wynik uskoku stopy/50 (łączna liczba kroków) x 100%
  5. Odejmij uskoki stopy w uszkodzonej kończynie tylnej od proporcji usterek stóp w nienaruszonej kończynie, aby uzyskać wynik asymetrii dla każdego zwierzęcia w określonym czasie pooperacyjnym.
    Wynik asymetrii stopy (FF) = %FF (nienaruszona kończyna) - %FF (kontuzjazowana kończyna)

4. Test zachowania – rozchylanie palców u stóp

UWAGA: Ocena powrotu do zdrowia motorycznego po uszkodzeniu nerwu. Według wcześniejszego badania, test ruchowy rozprzestrzeniający się palce jest bardziej czuły niż analiza chodu, aby wykryć regenerację funkcji ruchowych po urazie nerwu kulszowego30.

  1. Delikatnie przykryj zwierzątko kawałkiem materiału i podnieś ogon, aby mieć wyraźną obserwację tylnych łap.
    UWAGA: Alternatywa: Delikatnie chwyć szyję myszy, poprawij ogon, obróć go i spraw, by mysz się wierciła, by obserwować ruch palców.
  2. Przyznaj ocenę za rozchylenie palców w następujący sposób:
    Wynik 2: Pełne rozprzestrzenianie. Definiuj to jako pełne, szerokie i trwałe rozłożenie wszystkich palców na co najmniej 2 sekundy.
    Ocena 1: Rozprzestrzenianie się pośrednio. Każdy ruch, który nie osiąga pełnego wyniku rozprzestrzeniania się. Lekko drż lub częściowy ruch.
    Ocena 0: Nie rozprzestrzeniać się. Nie było żadnego ruchu.
    UWAGA: Wszystkie oceny behawioralne (nakłucie stóp, usterka stopy i rozprzestrzenianie palców) zostały podwójnie sprawdzone przez eksperymentatora nieświadomego grup leczących. Zwierzęta zostały losowo przydzielone do grup leczenia podczas operacji zgodnie z projektem zastosowanym w naszym wcześniejszym badaniu (Ko i in.25), które obejmowało cztery warunki eksperymentalne (tylko reaktywacja, PEG, ML162, ML162 + PEG). Obecny artykuł przedstawia dane z grupy ML162+ PEG, analizowane niezależnie przy zachowaniu pierwotnej rzetelności eksperymentalnej.

5. Perfuzja i przetwarzanie tkanek w histologii

  1. Głęboko znieczulić zwierzę i wykonać perfuzję przezsercyjną z fosforanową solą fizjologiczną (PBS) przez lewą komorę.
  2. Naciń prawe przedsionko, aby umożliwić pełny odpływ krwi.
  3. Zanurz zebrane tkanki w 4% paraformaldehydzie (PFA) w temperaturze 4 °C na noc w celu utrwalenia.
  4. Przemyj utrwalone tkanki trzy razy PBS, a następnie inkubuj je w PBS w temperaturze 4 °C przez noc.
  5. Krioproprotucuj tkanki, zanurzając je w 30% sacharozie w temperaturze 4 °C na noc.
  6. Umieść tkanki w związku OCT, zamroz je i przecień z grubością 12 μm za pomocą kriostatu.
  7. Bloki tkanek przechowywane w temperaturze -80 °C, a kriosekcje w -20 °C do użycia.
  8. Przy samym zbieraniu nerwu kulszowego należy pominąć perfuzję, ponieważ zawartość krwi nie wpływa znacząco na jakość barwienia immunologicznego w tych tkankach obwodowych.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Poprzedni protokół PEG-fusion18 został zmodyfikowany, aby utrzymać spójne wyniki chirurgiczne i zminimalizować uszkodzenia nerwów spowodowane zszyciem25. Umieszczając szew tak, aby przeszedł przez nerw przed przecięciem, minimalizowano uszkodzenia spowodowane szczypnięciem pęsetą lub ukłuciem igłą po przecięciu. Aby sprawdzić wpływ wiązania szwu penetrującego nerw na jego funkcję, szew był dwukrotnie przeprowadzony przez nienaruszony nerw i wiązany (Rys...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badania regeneracji nerwów z użyciem modeli przecięcia nerwowego są szeroko prowadzone na nerwie kulszowym myszy31,39. Jednak ze względu na niewielki rozmiar i miękką strukturę, nerw kulszowy myszy jest trudny do delikatnego obsługiwania narzędziami chirurgicznymi, a tkanka jest podatna na pękanie podczas szycia. Proces mikroszawu, często wymagający nadmiernej manipulacji, może prowadzić do deformacji nerwów i urazów. Nawet gdy niepotrzebna stymulacja instrumentó...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają konfliktów interesów do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prace te były wspierane przez NIA R01AG070214 do L.C., NIA R01AG071591 do L.C. oraz NIA 1R01AG085545 do L.C. Treść jest wyłącznie odpowiedzialnością autorów i niekoniecznie odzwierciedla oficjalne stanowisko NIH.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
#55 KleszczeDumostar-Biologia11295-51Po jednym w każdej ręce. Do zdobycia nylonowego szwu 10-0 potrzebne są dwa.
Szew nylonowy 10-0DemeTECHNL761000,4F0P
Szew nylonowy 4-0Czarodziej Matrixa0197
Anty-beta-tubulinaR& D SystemsMAB1195
Anty-NF-200Millipore SigmaN4142
Austerlitz rozmiar 000Do testu Pinprid
CF488 sprzężona alfa-bungarotoksynaBiot00005
Nożyczki do rozcinaniaKent Scientific  
Nożyczki do drobnego szyciaKent Scientific  
Kleszcze tęczówkiKent Scientific  
K& Podgrzewana podkładka dla małych zwierzątK& Produkty dla zwierząt domowych
ML162Millipore SigmaSML2561
Zestaw chirurgiczny do myszyKent Scientific  
Uchwyt na igłyKent Scientific  
Glikol polietylenowy (PEG)Millipore SigmaP5413
SCG10Novus BiologicalsNBP1-49461
SomnoSuiteKent Scientific  Do znieczulenia izofluranowego
Kleszcz rozdzielaczaUżywa się do odsłonięcia nerwu kulszowego.

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Akram, R., et al. Axonal Regeneration: Underlying molecular mechanisms and potential therapeutic targets. Biomedicines. 10 (12), 10123186(2022).
  2. Sutherland, T. C., Geoffroy, C. G. The influence of neuron-extrinsic factors and aging on injury progression and axonal repair in the central nervous system. Front Cell Dev Biol. 8, 190(2020).
  3. Farah, M. H., et al. Reduced BACE1 activity enhances clearance of myelin debris and regeneration of axons in the injured peripheral nervous system. J Neurosci. 31 (15), 5744-5754 (2011).
  4. Mahar, M., Cavalli, V. Intrinsic mechanisms of neuronal axon regeneration. Nat Rev Neurosci. 19 (6), 323-337 (2018).
  5. He, Z., Jin, Y. Intrinsic control of axon regeneration. Neuron. 90 (3), 437-451 (2016).
  6. Tsao, J. W., George, E. B., Griffin, J. W. Temperature modulation reveals three distinct stages of Wallerian degeneration. J Neurosci. 19 (12), 4718-4726 (1999).
  7. Vargas, M. E., Barres, B. A. Why is Wallerian degeneration in the CNS so slow. Annu Rev Neurosci. 30, 153-179 (2007).
  8. Gaudet, A. D., Popovich, P. G., Ramer, M. S. Wallerian degeneration: Gaining perspective on inflammatory events after peripheral nerve injury. J Neuroinflammation. 8, 110(2011).
  9. Hussain, G., et al. Current status of therapeutic approaches against peripheral nerve injuries: A detailed story from injury to recovery. Int J Biol Sci. 16 (1), 116-134 (2020).
  10. Raivich, G., Makwana, M. The making of successful axonal regeneration: genes, molecules and signal transduction pathways. Brain Res Rev. 53 (2), 287-311 (2007).
  11. Neumann, B., Linton, C., Giordano-Santini, R., Hilliard, M. A. Axonal fusion: An alternative and efficient mechanism of nerve repair. Prog Neurobiol. 173, 88-101 (2019).
  12. Hoy, R. R., Bittner, G. D., Kennedy, D. Regeneration in Crustacean Motoneurons: Evidence for axonal fusion. Science. 156, 251-252 (1967).
  13. Birse, S. C., Bittner, G. D. Regeneration of giant axons in earthworms. Brain Res. 113, 575-581 (1976).
  14. Murphy, A. D., Kater, S. B. Specific reinnervation of a target organ by a pair of identified molluscan neurons. Brain Res. 156, 322-328 (1978).
  15. Deriemer, S. A., Elliott, E. J., Macagno, E. R., Muller, K. J. Morphological evidence that regenerating axons can fuse with severed axon segments. Brain Res. 272, 157-161 (1983).
  16. Bedi, S. S., Glanzman, D. L. Axonal rejoining inhibits injury-induced long-term changes in aplysia sensory neurons in vitro. J Neurosci. 21 (24), 9667-9677 (2001).
  17. Neumann, B., Nguyen, K. C., Hall, D. H., Ben-Yakar, A., Hilliard, M. A. Axonal regeneration proceeds through specific axonal fusion in transected C. elegans neurons. Dev Dyn. 240 (6), 1365-1372 (2011).
  18. Bittner, G. D., et al. effective, and long-lasting behavioral recovery produced by microsutures, methylene blue, and polyethylene glycol after completely cutting rat sciatic nerves. J Neurosci Res. 90 (5), 967-980 (2012).
  19. Bamba, R., et al. A novel therapy to promote axonal fusion in human digital nerves. J Trauma Acute Care Surg. 81, S177-S183 (2016).
  20. Borgens, R. B., Shi, R., Bohnert, D. Behavioral recovery from spinal cord injury following delayed application of polyethylene glycol. J Exp Biol. 205, 1-12 (2002).
  21. Kim, C. Y., et al. Accelerated recovery of sensorimotor function in a dog submitted to quasi-total transection of the cervical spinal cord and treated with PEG. Surg Neurol Int. 7 (Suppl 24), S637-S640 (2016).
  22. Kim, C. Y., Oh, H., Hwang, I. K., Hong, K. S. GEMINI: Initial behavioral results after full severance of the cervical spinal cord in mice. Surg Neurol Int. 7 (Suppl 24), S629-S631 (2016).
  23. Liu, Z., et al. Restoration of motor function after operative reconstruction of the acutely transected spinal cord in the canine model. Surgery. 163 (5), 976-983 (2018).
  24. Shi, R., Borgens, R. B. Acute repair of crushed cuinea pig spinal cord by polyethylene glycol. Am Physiol Soc. 81 (5), 2406-2414 (1999).
  25. Ko, S. H., et al. GPX modulation promotes regenerative axonal fusion and functional recovery after injury through PSR-1 condensation. Nat Commun. 16 (1), 1079(2025).
  26. Schmalbruch, H. Fiber composition of the rat sciatic nerve. Anat Rec. 215 (1), 71-81 (1986).
  27. Swett, J. E., Torigoe, Y., Elie, V. R., Bourassa, C. M., Miller, P. G. Sensory neurons of the rat sciatic nerve. Exp Neurol. 114 (1), 82-103 (1991).
  28. Rigaud, M., et al. Species and strain differences in rodent sciatic nerve anatomy: Implications for studies of neuropathic pain. Pain. 136 (1-2), 188-201 (2008).
  29. Savastano, L. E., et al. Sciatic nerve injury: A simple and subtle model for investigating many aspects of nervous system damage and recovery. J Neurosci Methods. 227, 166-180 (2014).
  30. Bozkurt, A., et al. Aspects of static and dynamic motor function in peripheral nerve regeneration: SSI and CatWalk gait analysis. Behav Brain Res. 219 (1), 55-62 (2011).
  31. Lee, J. I., et al. A novel nerve transection and repair method in mice: histomorphometric analysis of nerves, blood vessels, and muscles with functional recovery. Sci Rep. 10 (1), 21637(2020).
  32. Moosmayer, D., et al. Crystal structures of the selenoprotein glutathione peroxidase 4 in its apo form and in complex with the covalently bound inhibitor ML162. Acta Crystallogr D Struct Biol. 77 (Pt 2), 237-248 (2021).
  33. Ma, C. H., et al. Accelerating axonal growth promotes motor recovery after peripheral nerve injury in mice. J Clin Invest. 121 (11), 4332-4347 (2011).
  34. Britt, J. M., et al. Polyethylene glycol rapidly restores axonal integrity and improves the rate of motor behavior recovery after sciatic nerve crush injury. J Neurophysiol. 104 (2), 695-703 (2010).
  35. Bittner, G. D., Schallert, T., Peduzzi, J. D. Degeneration, trophic interactions, and repair of severed axons: A reconsideration of some common assumptions. Neuroscientist. 6 (2), 88-109 (2000).
  36. Bittner, G. D., Ballinger, M. L., Raymond, M. A. Reconnection of severed nerve axons with polyethylene glycol. Brain Res. 367 (1-2), 351-355 (1986).
  37. Spaeth, C. S., Robison, T., Fan, J. D., Bittner, G. D. Cellular mechanisms of plasmalemmal sealing and axonal repair by polyethylene glycol and methylene blue. J Neurosci Res. 90 (5), 955-966 (2012).
  38. Spaeth, C. S., Boydston, E. A., Figard, L. R., Zuzek, A., Bittner, G. D. A model for sealing plasmalemmal damage in neurons and other eukaryotic cells. J Neurosci. 30 (47), 15790-15800 (2010).
  39. Félix, S. P., Pereira Lopes, F. R., Marques, S. A., Martinez, A. M. Comparison between suture and fibrin glue on repair by direct coaptation or tubulization of injured mouse sciatic nerve. Microsurgery. 33 (6), 468-477 (2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Sciatic Nerve TransectionNerve RepairFunctional RecoveryAxon RegenerationPeripheral Nerve InjuryDorsal Root GanglionMicrosuture TechniqueMuscle ReinnervationAxonal FusionBehavioral Assessment
Video Coming Soon

Related Articles