Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Starzenie się komórek wątroby wywołane lekami sprzyja polaryzacji makrofagów M2: Implikacje dla wątrobyczotoksyczności związanej z inhibitorem kinazy tyrozynowej

898 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/68725

⸱

17 października 2025

 ,  ,  ,  , 
1Department of Life Sciences, Shiv Nadar Institution of Eminence, 2Independent Researcher, 3Servier Institute of Translational Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj badamy hepatotoksyczność wywołaną przez lapatynib i neratinib poprzez polaryzację makrofagów sterowaną SASP, co daje głębsze mechanistyczne zrozumienie wykraczające poza tradycyjne testy toksyczności. To podejście pokazuje, jak senescentne hepatocyty wpływają na odpowiedzi immunologiczne. Jest to szczególnie cenne przy ocenie długoterminowych skutków leków oraz odkrywaniu nowych celów terapeutycznych w leczeniu jatrotoksyny wywołanej przez leki.

Streszczenie

Lapatynib i neratinib to inhibitory kinazy tyrozynowej (TKI) zatwierdzone do leczenia przerzutowego raka piersi z HER2, jednak ich zastosowanie kliniczne jest ograniczone przez hepatotoksyczność. W hepatocytach enzymy cytochromu P450 produkują reaktywne metabolity tych leków, powodując uszkodzenia DNA, dysfunkcję mitochondriów oraz stres oksydacyjny, co prowadzi do uszkodzenia hepatocytów. Ten stres komórkowy wywołuje starzenie się hepatocytów, czyli stan zatrzymania wzrostu, któremu towarzyszy wydzielanie czynników prozapalnych i przebudowujących tkanki zwanych fenotypem sekretoryjnym związanym ze starzeniem (SASP). SASP znacząco modyfikuje mikrośrodowisko wątroby, wpływa na zachowanie komórek odpornościowych i pogarsza uszkodzenia tkanek. Pokazujemy, że lapatynib i neratinib wywołują starzenie się i SASP w linii komórkowej wątroby HepG2. Dodatkowo, SASP z tych komórek starzaszących sprzyja polaryzacji makrofagów RAW264.7 podobnej do M2. Chociaż makrofagi M2 są powiązane z odpowiedziami przeciwzapalnymi i naprawą tkanek, ich nadmierna lub długotrwała aktywność może prowadzić do uszkodzenia tkanek i zwłóknienia. Nasze wyniki podkreślają mechanizm, dzięki któremu starzenie hepatocytów wywołane TKI oraz SASP modulują odpowiedź immunologiczną i mogą przyczyniać się do toksyczności wątroby u pacjentek z rakiem piersi. Podkreśla to znaczenie celowania w komórki starzejące, czyli czynniki SASP, aby zmniejszyć toksyczność wątroby i poprawić wyniki leczenia, co czyni identyfikację skutecznych senopeutyków istotnym obszarem badań. Nie ma żadnych raportów naukowych wykazujących wpływ sekretomu komórek wątrobowych indukowanych przez TKI na polaryzację makrofagów.

Wprowadzenie

Lapatynib i neratynib, oba inhibitory małopąsteczkowej tyrozyny kinazowej (TKI), uzyskały zgodę FDA w latach 2007 i 2017 do leczenia przerzutowego raka piersi1. Wiadomo, że te leki hamują ludzki receptor naskórnego czynnika wzrostu 2, HER2-2, receptorową kinazę tyrozynową nadekspresjonowaną w niektórych nowotworach piersi3. Pomimo sukcesu klinicznego, lapatynib i neratinib również wiążą się z działaniami niepożądanymi, szczególnie z hepatotoksycznością 4,5. Ostre uszkodzenie wątroby, objawiające się podwyższonym poziomem aminotransferazy, występuje u około 14% pacjentów leczonych lapatynibem lub neratinibem6. Wątrobotoksynę w dużej mierze przypisuje się metabolizmowi wątrobowemu tych leków, który obejmuje enzymy cytochromu P450 (CYP), głównie CYP3A4/5 7,8. Enzymy te katalizują powstawanie pośredników chinon-iminy, które są elektrofilowe i wysoce reaktywne 9,10. Te reaktywne metabolity, w tym O-dealkylatowany lapatynib, N-dealkylatowany lapatynib, N-hydroksylowy lapatynib, O-dealkylatowany neratynib oraz N-demetylowany neratynib, mogą tworzyć kowalencyjne adukty z makrocząsteczkami komórkowymi, zaburzając tym samym normalne funkcje komórkowe i ostatecznie prowadząc do uszkodzenia wątroby11.

Reaktywne metabolity lapatynibu i neratinibu mogą również wywoływać stres oksydacyjny, będący kluczowym czynnikiem wywołującym starzenie komórkowe12. Starzenie komórkowe to stan zatrzymany wzrostem, ale aktywny metabolicznie, charakteryzujący się wydzielaniem różnych prozapalnych cytokin, czynników wzrostu i proteaz. Ten fenotyp sekrecyjny znany jest jako fenotyp wydzielniowy związany ze starzeniem (SASP)13,14,15. SASP może głęboko wpływać na otaczające mikrośrodowisko, często sprzyjając stanom zapalnym i przebudowowaniu tkanek. W kontekście terapii nowotworowej SASP może wzbogacić populację komórek macierzystych nowotworowych i modyfikować odpowiedź immunologiczną, aby sprzyjać przeżyciu nowotworów16. Dodatkowo cytokiny zapalne mogą nasilać uszkodzenia tkanek. Przypuszczaliśmy, że u pacjentów leczonych lapatynibem i neratynibem uszkodzenie wątroby częściowo przyczynia się do starzenia wywołanego przez TKI oraz prozapalnej produkcji SASP.

Nasze eksperymenty wykazały, że lapatynib i neratinib indukują produkcję reaktywnych form tlenu (ROS) w komórkach wątroby, co prowadzi do uszkodzenia DNA i dysfunkcji mitochondrialnej, co z kolei wywołuje starzenie się komórek. To starenie może przyczyniać się do indukowanej przez lapatynib/neratynib hepatotoksyczność poprzez uwalnianie czynników SASP, które mogą wpływać na polaryzację makrofagów.

Makrofagi odgrywają kluczową rolę w odpowiedzi immunologicznej, a ich fenotyp funkcjonalny może się zmieniać w odpowiedzi na różne bodźce17,18. Klasyczny fenotyp makrofagów M1 jest zazwyczaj związany z odpowiedziami prozapalnymi, w tym produkcją cytokin takich jak TNF-α i IL-1β, i jest powszechnie uważany za marker ostrego stanu zapalnego19,20. Natomiast fenotyp makrofagów M2 jest związany z włóknieniem mięśni, naprawą tkanek21, immunosupresją oraz odpowiedzią na przewlekłe zapalenie 22,23. Cytokiny zapalne zawarte w SASP mogą wpływać na polaryzację makrofagów, sprzyjając konwersji makrofagów M1 do fenotypuM2 23. Ta zmiana polaryzacji może mieć istotne konsekwencje dla mikrośrodowiska odpornościowego, potencjalnie prowadząc do immunosupresji, postępu guza oraz przebudowy struktury tkanek.

Aby zbadać polaryzartion makrofagów wywołaną przez lapatynib i neratynib, użyliśmy linii komórkowej RAW264.7, linii komórkowej przypominającej makrofaga mysza, powszechnie stosowanej w badaniach immunologicznych24,25. Komórki RAW264.7 pochodzą z myszy BALB/c i są szeroko wykorzystywane do badania stanu zapalnego, fagocytozy oraz odpowiedzi immunologicznych25. Reagują na różne bodźce, w tym na lipopolisacharydy (LPS), i są szczególnie cenne do badania funkcji makrofagów, produkcji cytokin oraz biologii nowotworów26. W tym badaniu HepG2, linia komórkowa ludzkiego wątroby, była leczona lapatynibem i neratinibem, aby naśladować obserwowane u pacjentów efekty hepatotoksyczne. Linia komórkowa HepG2 jest często wykorzystywana jako model badania metabolizmu leków i jatrowej toksyczności ze względu na swoje pochodzenie ludzkie oraz linię raka wątrobowokomórkowego27. Po obróbce komórek HepG2 TKI, podłoża kondicjonowane zostały zebrane i dodane do komórek RAW264.7. Monitorowano kolejne zmiany fenotypowe makrofagów, koncentrując się na tym, czy leczenie wywołuje przejście z fenotypu prozapalnego M1 do immunosupresyjnego M2.

Lekowo-indukowana hepatotoksyczność jest zazwyczaj badana poprzez testy cytotoksyczności, ocenę markerów zapalnych oraz wykorzystanie modeli zwierzęcych. W porównaniu z nimi, nasza metoda badania jatrzotoksyny indukowanej przez TKI lapatynib i neratynib za pomocą czynników fenotypowych (SASP) związanych ze starzeniem oraz ich wpływu na polaryzację makrofagów ma kilka zalet. Po pierwsze, nasza metoda ustanawia związek między czynnikami SASP produkowanymi przez starzejące się komórki wątroby indukowane lekami a wrodzoną odpornością, którą można dodatkowo powiązać z przebudowywaniem tkanek, przewlekłym zapaleniem i karcynogenezą 28,29,30,31. Konwencjonalne badania toksyczności nie pomagają nam uchwycić krótkotrwałych interakcji między wątrobą a komórkami odpornościowymi, ani nie ujawniają długoterminowego wpływu TKI na zapalenie wątroby i włóknienie, szczególnie w kontekście przewlekłej ekspozycji na leki. W połączeniu z odpowiednim podejściem proteomicznym do identyfikacji składników SASP, technika ta może pomóc w identyfikacji predykcyjnych biomarkerów hepatotoksyczności wywołanej TKI oraz informować o projektowaniu interwencji terapeutycznych mających na celu jej ograniczenie 29,30,31.

Do realizacji badacze powinni wykorzystać systemy kokultury lub warunkowane z liniami komórkowymi wątroby i układu odpornościowego, jak opisano, oraz oceniać biomarkery starzenia się oraz makrofagi M1 i M2. Metoda ta jest najskuteczniejsza do oceny ostrych lub przewlekłych uszkodzeń wątroby wywołanych lekami lub do poszukiwania strategii minimalizujących efekty leczenia onkologicznego(29,30,31).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Hodowla komórkowa

  1. Hoduj komórki HepG2 w zmodyfikowanym medium orłowym (MEM) wysokoglukozy z 10% płodowym surowikiem bydłym (FBS) oraz komórkami RAW264,7 w Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) o wysokiej glukozie z 10% FBS przy 37 °C i 5% CO2 oraz odświeżaj co 3 dni.
    UWAGA: Stosowanie antybiotyków nie jest zalecane, chyba że występuje skażenie grzybicze lub bakteryjne. Komórki RAW264.7 bardzo szybko rosną i powinny być przejściowane po 2 dniach.

2. Test MTT

  1. Liczenie komórek i powłokowanie komórek
    1. Hodować komórki HepG2 w misce hodowli o średnicy 60 mm w inkubatorze do hodowli komórkowych w kompletnym podłożu wzrostowym (MEM + 10% FBS).
    2. Gdy komórki były zbiegające się w około 80%, usuń podłoże wzrostowe, szybko przemyj 1 mL 1x PBS i dodaj 600 μL 0,5x trypsyny. Inkubuj przez 5-6 minut.
      UWAGA: Wszystkie kroki należy wykonywać w szafce do hodowli komórek BSL 2.
    3. Zneutralizuj trypsynę, dodając 1,2 mL kompletnego podłoża wzrostowego do BSL 2.
      UWAGA: Aby zapobiec nadmiernej trypsynizacji, należy dodać kompletne podłoże, dwukrotnie większą objętość niż dodana trypsyna.
    4. Weź zawiesinę ogniwa w rurce mikrowirówki o pojemności 5 ml (MCT) i rozpyl ją, wirując w 180 g (1000 rpm) przez 3-4 minuty w temperaturze pokojowej (RT).
    5. Usuń supernatant, ponownie zawiesij pellet komórkowy w 1 mL podłoża, pipetuj, aby wymieszać jako zawiesina pojedynczej komórki, i liczyć za pomocą hemocytometru pod mikroskopem.
    6. Następnie należy płytkować komórki HepG2 w 96-dołkowej płycie po 5000-7000 komórek na dołek, w kompletnym medium wzrostowym, w trzech egzemplarzach dla każdej dawki leku, i przechowywać w inkubatorze przez 12-16 godzin.
      UWAGA: Zbieżność komórek powinna wynosić 50-60% w leczeniu farmakologicznym, a ten etap powinien być wykonany wewnątrz okapu.
  2. Leczenie uzależnień
    1. Stopniowo zwiększać stężenia robocze lapatynibu i neratinibu w dimetylosulfenoksydzie (DMSO) z koncentracji zapasowej (odpowiednio 30 mM i 3,5 mM) wewnątrz maski. Końcowe stężenia to 1, 2,5, 5, 10, 15, 25, 50 μM dla lapatynibu oraz 1, 2, 3, 4, 5, 6, 10 μM dla neratinibu w ośrodku wzrostu (MEM + 5% FBS). Zachowaj jedną kontrolę bez leczenia dla obu leków.
    2. Usuń poprzednie podłoże z 96-dołkowej płyty zawierającej komórki, dodaj 100 μL podłoża z lekiem i inkubuj przez 48 godzin wewnątrz inkubatora.
  3. Barwienie i ilościowość
    1. Po 48 godzinach należy dodać 10 μL barwnika bromowego 3- (4,5-dimetylotiazol-2-yl)-2,5-difenylottetrazolu (MTT; 5 mg/mL), rozpuścić w 1x soli fosforanowej (PBS) w każdym dołku i inkubować przez co najmniej 2 godziny w inkubatorze, aż pojawią się fioletowe kryształy.
      UWAGA: Dodaj barwnik bezpośrednio do podłoża zawierającego lek i nie inkubuj komórek z barwnikiem przez więcej niż 4 godziny.
    2. Po inkubacji usuń barwnik, rozpuści kryształy w 100 μL DMSO w każdej dołce i inkubuj przez 15 minut, po czym mierz gęstość optyczną (OD) na 595 nm.
      UWAGA: Ten etap można wykonać poza osiedlem.

3. Badanie galaktozydazy SA-β

  1. Leczenie uzależnień
    1. Komórki HepG2 na płytkach w naczyniach o średnicy 35 mm o gęstości 40 x 10 na płytce w trzech zestawach: jednym dla lapatynibu, jednym dla neratynibu oraz jednym nieleczonym kontrolnym.
      UWAGA: Liczenie komórek i etapy poszycia są opisane w kroku 2.1.
    2. Dodaj 1 μL lapatynibu z 5 mM materiału roboczego i 1,43 μL neratinibu z 3,5 mM głównego materiału w 2 mL podłoża, aby uzyskać końcowe stężenie 2,5 μM (dawka subletalna) lapatynibu i neratynibu.
      UWAGA: Dawka leku subletalnego jest wybierana według wykresu przeżycia komórek w teście MTT.
    3. Wyjmij poprzednie medium z naczyń i myj raz 500 μL 1x PBS, dodaj medium zawierające lek (wewnątrz okapu) i przechowywaj przez 48 godzin w inkubatorze.
  2. Utrwalanie i barwienie
    1. Po 48 godzinach usuń lek, szybko przemyj 500 μL 1x PBS raz, a następnie podaj 1,5 mL 2% formacji formaldehydu i 0,2% glutaraldehydu w 1x PBS przez 10 minut w RT.
    2. Po utrwaleniu myj płytki 1 mL 1x PBS dwa razy i upewnij się, że roztwór utrwalający został prawidłowo usunięty. Dodaj 1,5 mL roztworu barwiącego (40 mM kwas cytrynowy / bufor Na-fosforanów, 5 mM K4[Fe(CN)6], 5 mM K3[Fe(CN)6], 150 mM NaCl, 2 mM MgCl 2, 1 mg/mL X-gal w wodzie autoklawowej) i inkubuj przez 8 godzin w temperaturze 37 °C bezCO2.
      UWAGA: Okres inkubacji może się różnić w zależności od typu komórki; dla HepG2 okres inkubacji nie powinien przekraczać 8 godzin.
    3. Po barwieniu szybko przemyj płytki w 1 mL 1x PBS dwa razy i wykonuj obrazy w jasnym polu z powiększeniem 20x i 40x mikroskopem epifluorescencyjnym. Uchwyć co najmniej cztery do pięciu pól dla każdej grupy leczenia.
      UWAGA: Objętość utrwalacza i roztworu barwiącego będzie się różnić w zależności od wielkości płyty, a wszystkie kroki można wykonać poza okapem.
  3. Kwantyfikacja obrazów
    1. Zrób zdjęcie z jednego pola, policz łączną liczbę komórek oraz komórek wyświetlających niebieski sygnał. Ręcznie oblicz procent komórek z niebieskim sygnałem. Oblicz co najmniej cztery obrazy, weź średnią, narysuj wykres w arkuszu kalkulacyjnym i przeprowadź test t-test.

4. Wykrywanie ROS

  1. Płytowanie komórkowe i leczenie farmakologiczne
    1. Komórki HepG2 na płytkach o średnicy 35 mm na szklanym dnie o gęstości 40 x 104 komórki na płytce w trzech zestawach: jeden dla lapatynibu, jeden dla neratynibu oraz jeden nieleczony kontrolny.
      UWAGA: Liczenie komórek i etapy poszycia są opisane w kroku 2.1.
    2. Stosuj tę samą strategię leczenia opisaną w kroku 3.1.
  2. Barwienie i obrazowanie
    1. Po 48 godzinach obróbki dodaj 2 μM ogniwa ROX głęboko czerwony odczynnik (5 mM materiału), 1 μM Mito Tracker Green (1 mM materiału) przez 30 minut oraz kontrastuj barwnikiem jądrowym Hoechst o mocy 500 nM (500 μM materiał).
      UWAGA: Barwnik należy dodawać wewnątrz okapu, a bezpośrednia ekspozycja na światło należy unikać. Kontrastowanie odbywa się poprzez dodanie barwnika jądrowego Hoechst podczas podawania innych barwników.
    2. Po 30 minutach usuń barwnik i myj 1x PBS, aby usunąć nadmiar barwnika i obraz, mikroskopem konfokalnym przy powiększeniu 100x (emerzja olejowa, odpowiednio 640 nm, 488 nm i 405 nm o długości fali wzbudzenia).
  3. Kwantyfikacja obrazów
    1. Ilościowo zdefiniuj sygnał czerwonego ogniwa ROX za pomocą oprogramowania Fiji ImageJ i porównaj go z sygnałem nieprzetworzonej grupy kontrolnej. Użyj zielonego koloru MitoTracker, aby wskazać, że sygnał pochodzi z mitochondriów. Po wykreśleniu wykresów słupkowych o wartościach średnich przeprowadź test t.

5. Kolekcja mediów warunkowanych (CM)

  1. Należy leczyć komórki HepG2 2,5 μM lapatynibu lub neratinibu przez 48 godzin (metoda leczenia podobna do kroku 3.1, z wyjątkiem tego eksperymentu, podkładanie 70 x 104 komórek w naczyniu o średnicy 60 mm).
  2. Po 48 godzinach usuń lek i przemyj 500 μL 1x PBS raz.
  3. W maksymalnym dniu starzenia (po 48 godzinach leczenia lekowego) należy dodać 4 mL bezsurowicznego medium MEM (bez FBS lub innych suplementów) do komórek leczonych lekami oraz do nieleczonej kontroli przez 48 godzin.
    UWAGA: Objętość nośników bezsurowicowych zależy od wielkości płytki.
  4. Następnie pobierz nośnik bezsurowicowy zawierający cały sekretom, nazywany mediem kondycjonowanym, i przechowuj go w temperaturze -80 °C do przyszłego użycia.
    UWAGA: Po zebraniu CM należy go wirować przez 5 minut przy 2800 g (4000 obr./min), aby usunąć martwe komórki i inne zanieczyszczenia komórkowe. Komórki RAW264.7 są zazwyczaj hodowane w DMEM, natomiast CM jest zbierany w MEM zgodnie z warunkami hodowli HepG2. Aby zachować kompatybilność, podłoże kondicjonowane powinno być mieszane z bezsurowicowym DMEM w proporcji 1:1 przed inkubacją RAW264.7.

6. Polaryzacja M1/M2 w RAW264.7

  1. Powłoka komórkowa
    1. Postępuj według liczenia komórek i poszycia komórek opisanego w kroku 2.1, z wyjątkiem etapu trypsynizacji. Podczas trypsynizacji komórek RAW264.7 należy dodać 600-700 μL 0,5x trypsyny, inkubować przez 15-20 minut w inkubatorze, a w celu neutralizacji trypsyny dodać 2 mL podłoża wzrostu (DMEM + 10% FBS) i umieścić 70 x 104 komórek w misce o średnicy 60 mm w trzech zestawach: lapatynib, neratinib i jedna nieleczona kontrola.
  2. Indukcja RAW264.7
    1. Usuń zwykły podłoże wzrostowe, przemyj 1 mL 1x PBS raz i dodaj odpowiedni CM na 48 godzin.
      UWAGA: Przed dodaniem CM upewnij się, że kondycjonujesz go bezsurowicowym DMEM w proporcji 1:1, ponieważ komórki RAW264.7 rosną w DMEM, więc utrzymywanie komórek w MEM powoduje stres, co może utrudnić efekt. Hodowla RAW264,7 w CM (medium wolne od surowicy) przez 48 godzin może również powodować stres; W takim przypadku można wykonać inkubację 24-30 godzin przed zebraniem danych.
    2. Po inkubacji wyrzuć CM, przemyć 1 mL 1x PBS, dodać 600 μL trypsyny do każdej płytki, inkubować przez 10 minut, a następnie oddawać granulki przy 180 g (1000 rpm) przez 3 minuty w RT. Użyj granulatu do oczyszczania białek lub przechowuj go w -80 °C do przyszłego użycia.
      UWAGA: Czas trypsynizacji różni się w zależności od typu komórki, a wirowanie nie jest zalecane powyżej 180 g.
  3. Izolacja białek i western bloting
    1. Przygotuj bufor lizyczny, mieszając bufor lizyczny z testu radioimmunoprecipitacyjnego (RIPA) oraz koktajl inhibitorów proteazy w stosunku 100:1. Dodaj bufor lizowy do pelletu komórkowego, ponownie zawiesni i inkubuj na lodzie przez 30 minut.
      UWAGA: Objętość buforu lizy będzie się różnić w zależności od wielkości palety komórek, a poliza może być przeprowadzona poza okapem. Jeśli pellet jest przechowywany w temperaturze -80 °C, najpierw rozmroz go na lodzie, wykonaj krótki obrót i usuń wszelkie pozostałe nośniki.
    2. Po inkubacji obróć lizat komórkowy w dawce 20 000 g przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Zbierz supernatant i przejdź do western blot lub przechowuj w temperaturze -20 °C do przyszłego użycia.
    3. Przygotuj próbkę białka, pobierając 35-40 μg białka, dodając 1x barwnik ładujący, podgrzewaj przez 5-6 minut w temperaturze 95 °C, przepuszczaj SDS-PAGE (żel akrylamidowy 10% i 12%) w temperaturze 90 V i przelej do błony nitrocelulozowej.
    4. UWAGA: Szczegółowe informacje o zachodniej plamce można znaleźć w Joubert i in.32.
    5. Sprawdź ekspresję markerów polaryzacji M1 i M2, wywołując plamę za pomocą wywoływacza peroksydazy chrzanu (HRP), iNOS (M1) i arginazy1 (M2), odpowiednio za pomocą przeciwciał anty-NOS2 i anty-ARG1.
      UWAGA: Stężenie obu przeciwciał pierwotnych, anty-NOS2 i anty-ARG1, wynosi 1:1000, a przeciwciało przeciwkrólikowe wtórne to 1:10 000.
  4. Polaryzacja makrofagów z użyciem LPS i IFN-γ
    1. Płyta 70 x 10 4 ogniwa RAW264,7 w dwóch talerzach 60 mm.
      UWAGA: Procedura nakładania jest podobna do kroku 6.1.
    2. Po 12-16 godzinach wymieszaj 4 μL 1 μg/mL lipopolisacharydu (LPS, stężenie zapasowe to 1 mg/mL) oraz 1,33 μL interferonu-γ 33 ng/mL (IFN-γ, stężenie surowe to 100 μg/mL) w 4 mL podłoża wzrostu (DMEM + 10% FBS) i dodaj do wstępnie powlekanego RAW264,7, zachowując jedną kontrolę nieindukowaną.
    3. Po 48 godzinach pobierz pellet komórkowy trypsynizacji, wyizoluj białko, wykonaj western blot i sprawdź ekspresję iNOS (M1) i ARG1 (M2), stosując odpowiednio przeciwciała anty-iNOS i anty-ARG1.
      UWAGA: Wszystkie odpady z hodowli komórkowych oraz biochemiczne powinny być wyrzucane do pojemnika na zagrożenie biologiczne, odpowiednio zautoklawowane, a następnie utylizowane.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Przeprowadzono serię testów oceniających wpływ lapatynibu i neratinibu TKI na komórki raka wątrobowokomórkowego (HepG2) oraz ich dalsze działania parakrynowe na makrofagi. Komórki HepG2 były leczone różnym stężeniem lapatynibu lub neratynibu, a żywotność komórek mierzono po 48 godzinach za pomocą testu MTT (Rysunki 1A,B). Na podstawie krzywych przeżycia wybrano dawkę subletalną 2,5 μM do dalszych eksperymentów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Obecne badanie bada pośredni wpływ leczenia lapatynibem lub neratinibem na polaryzację makrofagów poprzez warunkowane media pobrane z komórek wątroby leczonej przez zabieg TKI. Wykorzystując makrofagi RAW264.7, obserwujemy fenotyp M2 po ekspozycji na podłoże warunkowane, co wskazuje wzrost poziomu ARG1. Morfologicznie traktowane makrofagi wykazywały charakterystyczny powiększony i wydłużony kształt, co dodatkowo wspierało indukcję stanu podobnego do M2. Poniżej omawiamy kluczowe kroki protokołu, potencjalne modyfikacje, ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują, że nie mają konfliktu interesów.

Podziękowania

Autorzy dziękują Instytucji Wybitnej Shiv Nadar za wsparcie infrastrukturalne. Badanie to jest finansowane z grantu Departamentu Nauki i Technologii CRG/2022/003242.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Linia komórkowa HepG2NCCSLinia komórkowa przylegająca
Linia komórkowa RAW264.7NCCSLinia komórkowa przylegająca
DMEM (Zmodyfikowany Eagle Medium firmy Dulbacco)HimediaAT066Wysoka glukoza, proszek
MEM (Modified Eagle MediumGibco611100-053Proszek
PBS (sól buforowa fosforanowa)HimediaTS1101Proszek
Roztwór trypsyny-EDTAHimediaTCL007Rozwiązanie
FBS (Serum płodowe bydło)HimediaRM1112Ciecz
MTT DyeHimediaTC191Proszek
LapatinibSelleckchemS2111Proszek
NeratinibCayman Chemical Company18404Proszek
DMSO (dimetylsulfotlenek)  HimediaTC185Rozwiązanie
Formaldehyd  RankemF0080Rozwiązanie
GlutaraldehydSigma-aldrich340855Rozwiązanie
Monohydrat kwasu cytrynowego w PureHimediaGRM229Proszek
Fosforan sodu dwubazowy bezwodny  HimediaMB024Proszek
Ferrocyjanek potasu, K4[Fe(CN)6]Fisher Scientific  P-236-500
Ferryjanek potasu, K3[Fe(CN)6]Fisher Scientific  P-232-500
NaClSRL41721Proszek
Heksahydrat MgCl2HimediaGRM-1068Proszek
X-GalSRL45904Proszek
LipopolisacharydSigma-aldrichL6529
Ludzki rekombinowany interferon i gamma;HimediaCF040-20MCG
Głęboko czerwony odczynnik Cell ROXNauka o wędkarstwie termoC10422
HoechstInvitrogen, Thermo Fisher ScientificH3570Proszek
MitoTRACKER GreenInvitrogen, Thermo Fisher Scientific1842298Proszek
Przeciwciało przeciw ARG1PowinowactwoDF6657Rozwiązanie, obliczone MW - 35kDa, obserwowane MW - 65kDa
Przeciwciało przeciw NOS2Cloudo Clone Corp.PAA837Hu01Rozwiązanie, obliczone MW - 130kDa, obserwowane MW - 65kDa
Przeciwciało anty-iNOSPowinowactwoRozwiązanie, obliczone MW - 130kDa, obserwowane MW - 120kDa
Przeciwciało anty-GAPDHBiobharati LifeScience Pvt.LtdBB-AB0060Rozwiązanie
Przeciwciało przeciwkrólikoweCayman Chemical Company10004301Rozwiązanie
Błona nitrocelulozowa Merck Millipore Ltd. HATF00010 (Numer produktu)
femtoLUCENTTMPLUS HRPG Bioscience 786-003
Anteny 60mmNUCK150462
Płyta 96 otworów,  NUCK165306
Inkubator do hodowli komórkowych  Thermo Fisher Scientific371
Mikroskop i niebsp;1. LEICA mikroskop odwrócony    2. Mikroskop konfokalny Nikon  1. DMIL LED        2. Ti2E, A1R  Oba mają numer modelu
System obrazowania iBrightInvitrogen, Thermo Fisher ScientificCL1500 (numer modelowy)
Czytnik tablicBio-RADCzytnik mikropłyt iMark
Wirówka  Thermo Fisher ScientificSorvall ST 8R (numer modelu)

Bibliografia

  1. Xuhong, J. C., Qi, X. W., Zhang, Y., Jiang, J. Mechanism, safety and efficacy of three tyrosine kinase inhibitors lapatinib, neratinib and pyrotinib in HER2-positive breast cancer. Am J Cancer Res. 9 (10), 2103-2119 (2019).
  2. Yang, X., Wu, D., Yuan, S. Tyrosine kinase inhibitors in the combination therapy of HER2-positive breast cancer. Technol Cancer Res Treat. 19, 1533033820962140(2020).
  3. Slamon, D. J., et al. Human breast cancer: correlation of relapse and survival with amplification of the HER-2/neu oncogene. Science. 235 (4785), 177-182 (1987).
  4. Viganò, M., et al. Hepatotoxicity of small molecule protein kinase inhibitors for cancer. Cancers (Basel). 15 (6), 1766(2023).
  5. Chan, A., et al. Final efficacy results of neratinib in HER2-positive hormone receptor-positive early-stage breast cancer from the Phase III ExteNET trial. Clin Breast Cancer. 21 (1), 80-91.e87 (2021).
  6. Hoofnagle, J. H., Serrano, J., Knoben, J. E., Navarro, V. J. LiverTox: a website on drug-induced liver injury. Hepatology. 57 (3), 873-874 (2013).
  7. Guengerich, F. P. Cytochrome P-450 3A4: regulation and role in drug metabolism. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 39, 1-17 (1999).
  8. Jackson, K. D., Durandis, R., Vergne, M. J. Role of cytochrome P450 enzymes in the metabolic activation of tyrosine kinase inhibitors. Int J Mol Sci. 19 (8), 2367(2018).
  9. Paludetto, M. N., Puisset, F., Chatelut, E., Arellano, C. Identifying the reactive metabolites of tyrosine kinase inhibitors in a comprehensive approach: implications for drug-drug interactions and hepatotoxicity. Med Res Rev. 39 (6), 2105-2152 (2019).
  10. Kalgutkar, A. S., Dalvie, D. K. Drug discovery for a new generation of covalent drugs. Expert Opin Drug Discov. 7 (7), 561-581 (2012).
  11. Andreu, I., et al. Protein binding of lapatinib and its N- and O-dealkylated metabolites interrogated by fluorescence, ultrafast spectroscopy and molecular dynamics simulations. Front Pharmacol. 11, 576495(2020).
  12. Lin, W., et al. Promoting reactive oxygen species accumulation to overcome tyrosine kinase inhibitor resistance in cancer. Cancer Cell Int. 24 (1), 239(2024).
  13. Choi, Y. W., et al. Senescent tumor cells build a cytokine shield in colorectal cancer. Adv Sci (Weinh). 8 (4), 2002497(2021).
  14. Birch, J., Gil, J. Senescence and the SASP: many therapeutic avenues. Genes Dev. 34 (23-24), 1565-1576 (2020).
  15. Dong, Z., et al. Cellular senescence and SASP in tumor progression and therapeutic opportunities. Mol Cancer. 23 (1), 181(2024).
  16. Salminen, A., Kauppinen, A., Kaarniranta, K. Emerging role of NF-κB signaling in the induction of senescence-associated secretory phenotype (SASP). Cell Signal. 24 (4), 835-845 (2012).
  17. Lichtnekert, J., Kawakami, T., Parks, W. C., Duffield, J. S. Changes in macrophage phenotype as the immune response evolves. Curr Opin Pharmacol. 13 (4), 555-564 (2013).
  18. Galli, S. J., Borregaard, N., Wynn, T. A. Phenotypic and functional plasticity of cells of innate immunity: macrophages, mast cells and neutrophils. Nat Immunol. 12 (11), 1035-1044 (2011).
  19. Wang, N., Liang, H., Zen, K. Molecular mechanisms that influence the macrophage M1-M2 polarization balance. Front Immunol. 5, 614(2014).
  20. Tardito, S., et al. Macrophage M1/M2 polarization and rheumatoid arthritis: a systematic review. Autoimmun Rev. 18 (11), 102397(2019).
  21. Novak, M. L., Koh, T. J. Macrophage phenotypes during tissue repair. J Leukoc Biol. 93 (6), 875-881 (2013).
  22. Kanterman, J., Sade-Feldman, M., Baniyash, M. New insights into chronic inflammation-induced immunosuppression. Semin Cancer Biol. 22 (4), 307-318 (2012).
  23. Mazzoni, M., et al. Senescent thyrocytes and thyroid tumor cells induce M2-like macrophage polarization of human monocytes via a PGE2-dependent mechanism. J Exp Clin Cancer Res. 38 (1), 208(2019).
  24. Hartley, J. W., et al. Expression of infectious murine leukemia viruses by RAW264.7 cells, a potential complication for studies with a widely used mouse macrophage cell line. Retrovirology. 5, 1(2008).
  25. Kong, L., Smith, W., Hao, D. Overview of RAW264.7 for osteoclastogenesis study: phenotype and stimuli. J Cell Mol Med. 23 (5), 3077-3087 (2019).
  26. Li, Y., et al. D(-)-Salicin inhibits the LPS-induced inflammation in RAW264.7 cells and mouse models. Int Immunopharmacol. 26 (2), 286-294 (2015).
  27. Castell, J. V., Jover, R., Martínez-Jiménez, C. P., Gómez-Lechón, M. J. Hepatocyte cell lines: their use, scope and limitations in drug metabolism studies. Expert Opin Drug Metab Toxicol. 2 (2), 183-212 (2006).
  28. Huang, Y., et al. The hepatic senescence-associated secretory phenotype promotes hepatocarcinogenesis through Bcl3-dependent activation of macrophages. Cell Biosci. 11 (1), 173(2021).
  29. Wang, B., Han, J., Elisseeff, J. H., Demaria, M. The senescence-associated secretory phenotype and its physiological and pathological implications. Nat Rev Mol Cell Biol. 25 (12), 958-978 (2024).
  30. Ohtani, N. The roles and mechanisms of senescence-associated secretory phenotype (SASP): can it be controlled by senolysis. Inflamm Regen. 42 (1), 11(2022).
  31. Cuollo, L., Antonangeli, F., Santoni, A., Soriani, A. The senescence-associated secretory phenotype (SASP) in the challenging future of cancer therapy and age-related diseases. Biology (Basel). 9 (12), 485(2020).
  32. Joubert, O., Nehmé, R., Bidet, M., Mus-Veteau, I. Heterologous expression of human membrane receptors in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Methods Mol Biol. 601, 87-103 (2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Starzenie się komórek wątrobyinhibitory kinazy tyrozynowejmechanizmy hepatotoksycznościfenotyp wydzielniczy związany ze starzeniemkomórki HepG2pożywka warunkowanareaktywne formy tlenuWestern blotting
Starzenie się komórek wątroby wywołane lekami sprzyja polaryzacji makrofagów M2: Implikacje dla wątrobyczotoksyczności związanej z inhibitorem kinazy tyrozynowej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.