Wykonalne przeprogramowanie in vivo komórek nowotworowych na konwencjonalne komórki dendrytyczne typu 1

Podsumowanie

Protokół ten opisuje przeprogramowanie in vivo mysich komórek rakowych na komórki dendrytyczne typu 1 w mikrośrodowisku guza poprzez wymuszoną ekspresję czynników transkrypcyjnych PU.1, IRF8 i BATF3.

Streszczenie

Skuteczność immunoterapii nowotworów zależy od rekrutacji i aktywacji odpowiedzi cytotoksycznych limfocytów T przeciwko guzom litym przez konwencjonalne komórki dendrytyczne typu 1 (cDC1). Jednak wytwarzanie cDC1 do immunoterapii nowotworów napotyka na znaczne ograniczenia, w tym słabą wydajność komórek, niejednorodność funkcjonalną i podatność na immunosupresję w mikrośrodowisku guza (TME). Niedawno opracowaliśmy metodę immunoterapii opartą na przeprogramowaniu in vivo komórek nowotworowych na immunogenne komórki podobne do cDC1, co umożliwiło komórkom rakowym prezentowanie antygenów nowotworowych jako cDC1 i wywołało poliklonalne odpowiedzi cytotoksycznych limfocytów T oraz trwałą ogólnoustrojową odporność przeciwnowotworową. W tym miejscu opisujemy praktyczny protokół generowania komórek podobnych do cDC1 w TME poprzez nadekspresję minimalnej sieci regulacyjnej genu specyficznej dla cDC1 - PU.1, IRF8 i BATF3 (łącznie określanych jako PIB) - w komórkach nowotworowych, a następnie podskórne wszczepienie mieszaniny komórek transdukowanych i rodzicielskich. Nadekspresja PIB napędza stopniowe nabywanie markera krwiotwórczego CD45 i profesjonalnego kompleksu prezentacji antygenu MHC klasy II na komórkach nowotworowych, służąc jako odczyty powierzchni komórek do przeprogramowania cDC1 in vivo . W porównaniu z procesem przeprogramowania in vitro, przeprogramowanie mysiego modelu czerniaka YUMM1.7 in vivo wykazało szybszą kinetykę i wyższą skuteczność. Komórki podobne do cDC1 indukowały szybką przebudowę TME poprzez rekrutację komórek odpornościowych gospodarza w ciągu pierwszych 3 dni i prowadząc do powstania trzeciorzędowej struktury limfatycznej do 9 dnia. Przeprogramowane komórki podobne do cDC1 utrzymywały się w guzach przez co najmniej 9 dni, ale nie zostały wykryte w 15 dniu. Opisany tutaj protokół przeprogramowania cDC1 in vivo zapewnia wykonalną i solidną metodę skutecznego przekształcania "zimno-immunologicznych" guzów w "immunologicznie gorące". Ogólnie rzecz biorąc, stanowi on potężną platformę do badania mechanizmów leżących u podstaw odporności przeciwnowotworowej za pośrednictwem cDC1 i odkrywania synergicznych kombinacji z innymi metodami immunoterapii nowotworów.

Wprowadzenie

Ostatnie postępy w metodach immunoterapii nowotworów, w tym blokada immunologicznego punktu kontrolnego (ICB), adoptywna terapia komórkowa (ACT) i szczepionki, zmieniły krajobraz leczenia raka¹. W czerniaku wskaźniki odpowiedzi na hamowanie białka programowanej śmierci komórki 1 (PD-1) i cytotoksycznego białka związanego z limfocytami T 4 (CTLA-4) mogą sięgać nawet 60%². Niemniej jednak ponad 40% pacjentów z czerniakiem nie reaguje na ICB, a wskaźniki odpowiedzi w mniej immunogennych nowotworach, takich jak rak piersi, stabilny mikrosatelitarnie rak jelita grubego i glejak, pozostają poniżej 5%, co wskazuje na luki kliniczne ^3,4,5. Główną przeszkodą na drodze do szerokiego sukcesu klinicznego jest słaba aktywacja odpowiedzi cytotoksycznych limfocytów T, która zależy od skutecznej prezentacji antygenu w mikrośrodowisku guza (TME)⁶.

Konwencjonalne komórki dendrytyczne typu 1 (cDC1) są rzadkie, ale niezbędne do zainicjowania odporności specyficznej dla nowotworu, oferując trzy kluczowe sygnały do głównych odpowiedzi limfocytów T: (1) profesjonalne przetwarzanie i prezentacja antygenów na głównych kompleksach zgodności tkankowej (MHC) klasy I i II, (2) kostymulacja przez CD80 i CD86 oraz (3) sygnalizacja cytokin prozapalnych, w tym IL-12 ^7,8. Wśród podzbiorów komórek dendrytycznych (DC), cDC1 przodują w krzyżowej prezentacji antygenów związanych z komórkami nowotworowymi w celu przygotowania naiwnych lub reaktywacji limfocytów T pamięci CD8 ⁺ lub napędzania różnicowania limfocytów T CD4 ⁺ do komórek pomocniczych T typu 1 (T_H1)⁹. Dodatkowo, cDC1 są głównymi producentami chemokin, ligandów chemokiny motywu C-X-C 9 i 10 (CXCL9 / 10), które pośredniczą w rekrutacji limfocytów T do tkanki nowotworowej 10,11,12,13. W ciągu ostatnich kilku lat liczne badania wykazały, że odrzucenie guza i skuteczne odpowiedzi na ICB lub ACT silnie korelują z obecnością wewnątrznowotworowych cDC1^12,13. W związku z tym cDC1 stały się atrakcyjnym celem immunoterapii nowotworów, a skuteczne wykorzystanie ich unikalnych cech może mieć znaczny potencjał translacyjny.

Obecne metody generowania cDC1 opierają się na izolacji krwi lub różnicowaniu ^od progenitorów CD34+ lub pluripotencjalnych komórek macierzystych 14,15,16. Dominujące strategie kliniczne polegają na wyizolowaniu mieszaniny autologicznych podzbiorów DC z krwi i stymulowaniu ich ex vivo za pomocą agonistów receptorów toll-podobnych lub cytokin prozapalnych w celu wywołania dojrzałego, immunogennego programu przed reinfuzją¹⁶. Jednak strategie te są ograniczone przez słabe dojrzewanie komórek, bariery immunosupresyjne w TME i niejednorodność podzbioru w infuzji mieszaniny DC, w której obecna jest tylko niewielka część cDC1⁷. Co więcej, wyizolowanie tylko cDC1 do immunoterapii nowotworów lub szczepienia jest wyzwaniem ze względu na ich wyjątkowo niską liczebność we krwi obwodowej (<0,3%)¹⁶. Dodatkowo cDC1 mogą być wytwarzane z komórek progenitorowych CD34 ⁺ lub indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych za pomocą cytokin i sygnalizacji NOTCH. Jednak metody te wymagają złożonych i długich protokołów oraz dają niską liczbę i niejednorodne populacje podzbiorów DC 17,18,19.

Aby zaradzić tym ograniczeniom, przeprogramowanie in vivo zapewnia odpowiednią strategię immunoterapii nowotworów w celu wygenerowania komórek podobnych do cDC1, które przypominają właściwości fenotypowe, transkrypcyjne i funkcjonalne cDC1s²⁰. Poprzez nadekspresję specyficznej dla cDC1 minimalnej sieci regulacyjnej genów - PU.1, IRF8 i BATF3 (zbiorczo określanych jako PIB) - fibroblasty, komórki zrębu i komórki rakowe zostały stopniowo przeprogramowane w komórki podobne do cDC1, umożliwiając przetwarzanie antygenu nowotworowego i prezentację na MHC klasy I i II, sygnalizację kostymulującą przez CD80 i CD86 oraz wydzielanie cytokin/chemokin, w tym CXCL9/10 i IL-12^20, 21,22,23. Przeprogramowanie cDC1 postępowało szybciej i wydajniej w ludzkich ksenoprzeszczepach in vivo i niezależnie od immunosupresji, generując komórki podobne do cDC1 z dojrzałą sygnaturą immunogenną²⁰. W syngenicznych guzach czerniaka zaobserwowaliśmy, że komórki podobne do cDC1 przebudowały swoje TME, indukowały tworzenie trzeciorzędowej struktury limfoidalnej (TLS) oraz rekrutowały i ekspandowały poliklonalne limfocyty T_H1 i cytotoksyczne limfocyty T pamięci, prowadząc do długotrwałej odporności ogólnoustrojowej²⁰. Wreszcie, opracowaliśmy nowatorską metodę immunoterapii nowotworów opartą na przeprogramowaniu in situ komórek rakowych w komórki podobne do cDC1 poprzez wstrzyknięcie do guza wektorów adenowirusowych²⁰. Odkrycia te torują drogę do klinicznego przeprogramowania cDC1 jako nowej metody immunoterapii nowotworów, która może wykorzystać funkcjonalne właściwości cDC1.

W tym miejscu przedstawiamy praktyczny protokół generowania komórek podobnych do cDC1 w TME w oparciu o przeprogramowanie cDC1 in vivo . Lentiwirusowe dostarczanie PIB do komórek nowotworowych, a następnie implantacja jako zdefiniowana mieszanina transdukowanych komórek nowotworowych z nietransdukowanymi macierzystymi komórkami nowotworowymi pozwala na przeprogramowanie in vivo kontrolowanej frakcji komórek nowotworowych w TME. Ponadto metoda ta nie jest ograniczona przez skuteczność dostarczania wektorów wirusowych in situ ²⁰. Przedstawiamy kroki w celu wydajnej produkcji wektorów lentiwirusowych, miareczkowania funkcjonalnego i przeprogramowania cDC1 in vivo na przykładzie modelu czerniaka syngenicznego, YUMM1.7. Szczegółowo opisujemy konfigurację eksperymentalną i strategię bramkowania do analizy in vivo przeprogramowanych komórek podobnych do cDC1 za pomocą cytometrii przepływowej po dysocjacji guza. Zapewniamy również kroki do oceny zmian w TME poprzez wykonanie krioprezerwacji, sekcji i barwienia immunofluorescencyjnego skrawków guza, a następnie mikroskopii konfokalnej. Na koniec zajmiemy się tym, jak monitorować odporność indukowaną przez cDC1, mierząc wzrost i przeżycie guza. To wykonalne i skalowalne podejście oferuje naukowcom cenne narzędzie do oceny strategii leczenia skojarzonego z przeprogramowaniem cDC1 in vivo , do scharakteryzowania zmian w neogenezie TME i TLS w modelach nowotworowych lub do przeprowadzenia dużych badań przesiewowych modyfikujących ekspresję różnych szlaków immunologicznych, na przykład prezentacji antygenu lub wydzielania cytokin/chemokin, oraz do zbadania ich wpływu na odporność przeciwnowotworową.

Protokół

Procedury doświadczalne na zwierzętach przeprowadzono zgodnie ze szwedzkimi przepisami po zatwierdzeniu przez Szwedzką Radę ds. Rolnictwa.

1. Przygotowanie odczynnika

1. Aby przygotować zmodyfikowaną pożywkę Eagle's Medium (DMEM) firmy Dulbecco, dodaj 10% (v/v) płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 1 mM pirogronianu sodu, 100 U/ml penicyliny (Pen), 2 mM substytutu glutaminy i 100 mg/ml streptomycyny (Strep).
2. Aby przygotować kompletną pożywkę RPMI 1640, dodaj 10% (v/v) FBS, 2 mM substytut glutaminy, 1 mM pirogronian sodu, 50 mM 2-merkaptoetanolu, 100 U/ml Pen i 100 mg/ml Strep.
3. Aby przygotować kompletną pożywkę DMEM/F12, dodaj 10% (v/v) płodową surowicę bydlęcą (FBS), 1 mM pirogronianu sodu, 0,1 mM aminokwasów endogennych i 100 U/ml Pen i 100 mg/ml Strep.
4. Aby przygotować 1 mg/ml polietyleniminy (PEI), rozpuść 100 mg proszku PEI w 100 ml sterylnej wody dejonizowanej w szklanej zlewce lub stożkowej probówce. Umieść zlewkę na mieszadle magnetycznym i mieszaj w temperaturze pokojowej (RT), aby utworzyć wir, aż do całkowitego rozpuszczenia. Dostosuj pH do 6,9-7,1, dodając kroplami kwas solny (HCl)/wodorotlenek sodu (NaOH) i przefiltruj roztwór przez filtr membranowy PES o wielkości 0,22 μm.
5. Aby przygotować 1 mM maślanu sodu, rozpuść 1,10 mg w 10 ml sterylnej wody dejonizowanej.
6. Aby przygotować 8 mg/ml polibrenu, rozpuścić 80 mg proszku polibrenu w 10 ml sterylnej wody dejonizowanej.
7. Aby przygotować bufor FACS, dodaj 2% FBS i 1 mM EDTA do soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).

2. Produkcja lentiwirusa

1. Rozmrozić komórki HEK 293T, dodając 1 ml komórek do 9 ml wstępnie podgrzanej kompletnej pożywki DMEM i odwirować komórki w temperaturze 350 × g przez 5 minut. Zawiesić osad komórkowy w 20 ml kompletnej pożywki DMEM i komórki hodowlane na płytce o średnicy 150 mm w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ .
2. Rozszerzaj i dziel komórki HEK 293T, gdy osiągną 80-90% konfluencji. Aby podzielić komórki, przemyj je raz PBS, dodaj 5 ml trypsyny, aby oddzielić je od płytki i inkubuj 5-10 minut w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ .
3. Zebrać komórki z 5 ml kompletnej pożywki DMEM, odwirować je przy 350 × g przez 5 minut i podzielić 1:6 na nowe płytki o średnicy 150 mm, 48 godzin przed transfekcją.
   UWAGA: Jakość linii komórkowej produkującej lentiwirusa ma kluczowe znaczenie dla produkcji wysokich mian. Nie pozwól, aby komórki przekroczyły 95% konfluencji i unikaj wysiewania ich przy <30% konfluencji.
4. Po 48 godzinach lub gdy komórki osiągną 70-80% konfluencji, przygotuj mieszankę transfekcyjną w stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Użyj następującego plazmidu transferowego: 1) SFFV-PIB-IRES-eGFP-policistroniczny wektor lentiwirusowy zawierający czynniki transkrypcyjne PU.1, IRF8, BATF3, wewnętrzne rybosomalne miejsce wejścia (IRES) i wzmocnione białko zielonej fluorescencji (eGFP) jako reporter transdukcji fluorescencyjnej; lub 2) SFFV-eGFP, kontrolny wektor lentiwirusowy z wielokrotnym miejscem klonowania i eGFP; lub 3) SFFV-mCherry, wektor lentiwirusowy wykazujący ekspresję mCherry. Dodać 10 μg plazmidu transferowego, 7,5 μg plazmidu pakującego psPAX2 i 2,5 μg plazmidu otoczkowego pMD2.G. Uzupełnij probówkę preparatem Opti-MEM, aby uzyskać całkowitą objętość 2 ml. Na koniec dodać 60 μl odczynnika do transfekcji PEI (z 1 mg/ml podstawy) do mieszanki transfekcyjnej.
   UWAGA: Wektor lentiwirusowy SFFV-eGFP jest używany jako kontrola transdukcji do eksperymentów z przeprogramowaniem w celu uwzględnienia immunogenności za pośrednictwem lentiwirusa, podczas gdy SFFV-mCherry służy do generowania znakowanych fluorescencyjnie linii komórek rakowych.
5. Wirować transfekcję, dokładnie mieszać przez 1 minutę i inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej, aby umożliwić utworzenie kompleksów DNA-lipid.
   UWAGA: Konfluencja znacząco wpływa na miana wirusów. Transfekcja komórek przy zbieganiu mniejszym niż 70% spowoduje obniżenie miana wirusa ze względu na mniejszą liczbę komórek otrzymujących plazmidy.
6. Odessać pożywkę komórek HEK 293T i dodać 10 ml DMEM bez wstrzykiwacza/kroku i z 10% sterylnie przefiltrowanego FBS.
7. Dodawać mieszaninę do transfekcji kroplami na płytki o średnicy 150 mm i inkubować przez 16 godzin w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ .
8. Po transfekcji zastąpić pożywkę 20 ml kompletnej pożywki DMEM uzupełnionej 1 mM maślanu sodu i inkubować komórki przez 24 godziny w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ .
   UWAGA: Maślan sodu jest inhibitorem deacetylazy histonowej klasy 1 (HDAC) i może zwiększać ekspresję genów w komórkach HEK 293T poprzez indukowanie hiperacetylacji histonów, co otwiera strukturę chromatyny i ułatwia transkrypcję opakowania wirusa i przenoszenie plazmidów. Skuteczność transfekcji można ocenić, sprawdzając ekspresję eGFP za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.
9. Zebrać supernatant zawierający lentiwirusa 48 godzin i 60 godzin po transfekcji do stożkowych probówek o pojemności 50 ml. Po pierwszym pobraniu dodać 12 ml wstępnie podgrzanej kompletnej pożywki DMEM na płytkę 150 mm do drugiej zbiórki. Przechowywać zebrane składniki w temperaturze 4 °C, przefiltrować je przez filtr PES o niskiej liczbie wiązań białkowych 0,45 μm i połączyć.
10. Aby zagęścić wirusa, należy odpipetować 37 g pożywki zawierającej lentiwirusa do 38,5 ml cienkościennych probówek polipropylenowych o pojemności 38,5 ml. Zmierz wagę probówek za pomocą wagi stołowej.
    UWAGA: Zmierz masę pożywki zawierającej lentiwirusa, a nie jego objętość, ponieważ masa zapewnia większą precyzję wyważania. Waga probówek musi być dobrze wyważona, aby uniknąć uszkodzenia ultrawirówki.
11. Umieść probówki w wiadrach do ultrawirowania, zamknij pokrywy i umieść wiadra w wirniku z wiadrem wahadłowym. Wirować przy 25 000 × g przez 90 minut w temperaturze 4 °C.
12. Po odwirowaniu wyjąć probówki z wiader i zassać supernatant.
    UWAGA: Te same probówki mogą być wielokrotnie napełniane i używane do łącznej liczby trzech rund wirowania, aby uzyskać większą osadkę lentiwirusa na probówkę.
13. Umieść cienkościenne rurki polipropylenowe z otwartą górą do góry nogami na 5 minut na chusteczce laboratoryjnej lub podobnym materiale chłonnym, aby nadmiar płynu mógł spłynąć i wysuszyć granulki.
14. Do każdej granulki dodać 200 μl lodowatego DMEM uzupełnionego HEPES lub PBS. Umieść probówki do mikrowirówek w stożkowych probówkach o pojemności 50 ml i zamknij pokrywkę, aby zachować sterylność.
15. Inkubować osad przez noc w temperaturze 4 °C, aby umożliwić ponowne zawieszenie.
16. Połączyć zawieszone granulki, podwielokrotność, i przechowywać je w temperaturze -80 °C przez okres do roku.
    UWAGA: Aby uniknąć utraty miana przez wielokrotne rundy zamrażania i rozmrażania, należy stosować mniejsze porcje objętości (np. 50-200 μL).

3. Funkcjonalne miareczkowanie wirusa

UWAGA: Ten krok należy powtórzyć dla każdej partii lentiwirusa w celu określenia optymalnej dawki wirusa wymaganej do osiągnięcia stosunku 1:1 komórek transdukowanych (eGFP⁺) do nietransdukowanych (eGFP^-).

1. Rozmrażaj i namnażaj komórki rakowe w odpowiednich pożywkach hodowlanych (np. linii komórkowej mysiego czerniaka YUMM1.7 w kompletnej pożywce DMEM/F12).
   UWAGA: Komórki powinny przejść co najmniej jedną rundę podziału przed eksperymentem przeprogramowania. Pasaże komórek powinny być podobne między eksperymentami.
2. Na dzień przed powstaniem guza należy wyhodować komórki rakowe, odsysając ich pożywkę hodowlaną, przemywając raz PBS i dodając 2 ml lub 5 ml trypsyny na płytkę 100 mm lub 150 mm. Inkubować przez 5-10 minut w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ i zebrać komórki, dodając 8 ml lub 5 ml kompletnej pożywki na płytkę 100 mm lub 150 mm do probówek stożkowych o pojemności 50 ml.
3. Odwirować komórki o masie 350 × g przez 5 minut, aby usunąć trypsynę i ponownie zawiesić w kompletnym podłożu.
4. Weź 10 μl podwielokrotności komórek, dodaj 10 μl błękitu trypanowego i policz żywe komórki za pomocą hemocytometru.
5. Przenieść 6 × 10⁵ komórek do nowej stożkowej probówki o pojemności 50 ml zawierającej 12 ml kompletnej pożywki i dodać 12 μl 8 mg/ml polibrenu do zawiesiny komórek, aby osiągnąć stężenie robocze 8 μg/ml.
6. Odpipetować pipetą 2 ml zawiesiny komórkowej do każdego dołka na 6-dołkowej płytce do hodowli tkankowej.
   UWAGA: W razie potrzeby zwiększ liczbę komórek do 1,2-1,8 x 10⁶ na płytkę 6-dołkową.
7. Dodaj rosnące objętości lentiwirusa do każdej studzienki, aby określić optymalną objętość potrzebną do osiągnięcia stosunku 1:1 komórek transdukowanych (eGFP⁺) do nietransdukowanych (eGFP^-).
   UWAGA: Dodać zalecane objętości lentiwirusa wynoszące 1, 2, 4, 8, 16 i 32 μl w trzech egzemplarzach. Przeprowadzić miareczkowanie funkcjonalne dla pustego kontrolnego wektora lentiwirusowego SFFV-eGFP i SFFV-mCherry.
8. Inkubować komórki przez 24 godziny w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ .
9. W dniu 0 usunąć pożywkę zawierającą lentiwirusa, zastąpić ją nową pożywką i inkubować przez 72 godziny w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ .
10. W 3 dniu sprawdź komórki pod kątem ekspresji eGFP pod mikroskopem fluorescencyjnym.
    UWAGA: Ten etap zapewnia szybką weryfikację transdukcji komórek, ale nie zastępuje analizy wykonywanej za pomocą cytometrii przepływowej w kroku 3.14 w celu określenia dokładnego stosunku komórek eGFP⁺ do eGFP^- .
    W niektórych komórkach nowotworowych (np. mysich komórkach czerniaka B16) sygnał eGFP może być niski i trudny do wykrycia za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Zaleca się przejście bezpośrednio do cytometrii przepływowej.
11. Odessać pożywkę, przemyć komórki raz PBS i dodać 500 μl trypsyny do dołka. Inkubować przez 5-10 minut w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ .
12. Podnieś komórki w każdym dołku za pomocą 1,5 ml buforu FACS i odpipetuj zawiesinę komórek do probówek polistyrenowych o pojemności 5 ml. Weź porcję i policz żywe komórki za pomocą hemocytometru i barwienia błękitem trypanowym.
13. Odwirować zawiesinę komórek o stężeniu 350 × g przez 5 minut, ponownie zawiesić osad w 100 μl buforu FACS i przystąpić do analizy metodą cytometrii przepływowej.
14. Określ ilościowo dokładny stosunek komórek transdukowanych (eGFP⁺) do nietransdukowanych (eGFP^-) za pomocą cytometrii przepływowej. Do badań in vivo należy użyć objętości lentiwirusa, która jest najbardziej zbliżona do stosunku 1:1.
    UWAGA: Aby dokładnie określić stosunek komórek eGFP⁺ do eGFP^, należy uwzględnić nietransdukowane komórki rakowe jako kontrole ujemne dla bramkowania.

4. Założenie guza podskórnego do przeprogramowania in vivo

1. Rozmrozić i namnażać komórki rakowe w odpowiedniej pożywce hodowlanej do wytworzenia komórek wykazujących ekspresję mCherry.
   UWAGA: Ekspresja mCherry ułatwia odróżnienie komórek nowotworowych podczas analizy cytometrii przepływowej od innych populacji w guzie, na przykład endogennych komórek zrębowych i odpornościowych.
2. Wykonaj kroki 3.2-3.4 i ponownie zawieś komórki w kompletnym pożywce w stężeniu^10-5 komórek na ml.
3. Dodać 8 μg/ml polibrenu i oznaczoną objętość lentiwirusa SFFV-mCherry do zawiesiny komórkowej, aby osiągnąć >90% skuteczności transdukcji.
   UWAGA: Alternatywnie, jeśli osiągnięcie transdukcji >90% zagraża żywotności komórek, posortuj komórki mCherry⁺ przez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS) 72 godziny po transdukcji i namnażaj posortowane komórki w hodowli.
4. Płytka 5 ml zawiesiny komórek (zawierająca 5 × 10⁵ komórek) na 100 mm płytkę i inkubować komórki w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ przez 24 godziny.
5. Po 24 godzinach zastąpić pożywkę 10 ml kompletnej pożywki i rozmnażać komórki, hodując je w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ przez co najmniej 7 dni przed rozpoczęciem eksperymentów z przeprogramowywaniem.
6. Po ekspansji wykonaj kroki 3.2-3.4, aby przygotować zawiesiny komórek do późniejszej transdukcji z wcześniej określoną objętością SFFV-PIB-IRES-eGFP, co daje najbliższy stosunek 1:1 komórek transdukowanych (eGFP⁺) do nietransdukowanych (eGFP^-) w dniu 3.
7. Dodać 8 μg/ml polibrenu do zawiesiny komórek, wraz z wcześniej oznaczoną objętością lentiwirusa do zawiesiny komórkowej w stożkowych probówkach o pojemności 50 ml. Dobrze wymieszaj, nie tworząc bąbelków.
8. Odpipetować 2 ml zawiesiny komórkowej (zawierającej 10-5 komórek) na basenik na 6-dołkowej płytce do hodowli tkankowej i inkubować przez 24 godziny w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ .
   UWAGA: Alternatywnie, umieść komórki w 5 ml pożywki transdukcyjnej na 100-milimetrowych płytkach do hodowli tkankowych. Należy jednak pamiętać, że wydajność transdukcji może być zmniejszona w większych objętościach i powinna być empirycznie określona zgodnie z opisem w krokach 3.1-3.13.
   Zaleca się transdukcję co najmniej 10% więcej komórek, aby skompensować potencjalną utratę komórek podczas procesu transdukcji i zapewnić wystarczającą objętość do pipetowania lub wstrzykiwania podczas tworzenia guza.
9. Po 24 godzinach usunąć pożywkę zawierającą lentiwirusa, przemyć dwukrotnie PBS, dodać 500 μl trypsyny do każdej studzienki i inkubować przez 5-10 minut w temperaturze 37 °C z 5% CO₂ .
10. Sprawdź pod mikroskopem świetlnym, czy komórki całkowicie oddzieliły się od płytek, a następnie zbierz je z kompletną pożywką do stożkowych probówek o pojemności 50 ml.
11. Osadzać komórki, odwirowując je przez 5 minut w temperaturze 350 × g, przemyć osad PBS i ponownie odwirować przez 5 minut w temperaturze 350 × g. Weź porcję i policz żywe komórki za pomocą hemocytometru i barwienia błękitem trypanowym.
12. Zawiesić osad w lodowatym PBS, aby osiągnąć stężenie 2-4 × 10⁷ komórek na ml, co odpowiada 1-2 × 10⁶ komórek w 50 μl objętości wstrzyknięcia na guz.
    UWAGA: Co ważne, liczby te zostały potwierdzone dla guzów czerniaka YUMM1.7 w celu wyizolowania in vivo przeprogramowanych komórek podobnych do cDC1 do analizy cytometrii przepływowej. W przypadku innych linii komórkowych i innych odczytów eksperymentalnych, takich jak eksperymenty dotyczące wzrostu i przeżycia guza, liczby muszą być przetestowane empirycznie. W przypadku eksperymentów dotyczących wzrostu i przeżycia guza zaleca się niższą liczbę komórek - od 100 000 do 250 000 komórek na guz.
13. Przenieś się do obszaru roboczego, w którym przeprowadzane są eksperymenty na zwierzętach i utrzymuj komórki na lodzie.
    UWAGA: Po przygotowaniu komórek należy wykonać wstrzyknięcia komórek tak szybko, jak to możliwe, ponieważ żywotność komórek zmniejsza się z czasem.
14. Przygotuj 60 μl roztworu znieczulającego na mysz, rozcieńczając ksylazynę (3 mg/kg na mysz) i ketaminę (135 mg/kg na mysz) w PBS.
15. Znieczulij myszy CD45.1, wstrzykując dootrzewnowo 60 μl środka znieczulającego. Losowo dobieraj myszy i trzymaj je na podkładce rozgrzewającej, aby uniknąć spadku temperatury ciała. Nałóż krem pod oczy na oczy, aby zapobiec odwodnieniu oczu podczas znieczulenia.
    UWAGA: Bardzo ważne jest użycie myszy CD45.1, aby umożliwić rozróżnienie między przeprogramowanymi in vivo komórkami podobnymi do cDC1 wyrażającymi allel CD45.2 typu dzikiego a endogennymi komórkami odpornościowymi. Jeśli linia komórkowa to CD45.1, myszy C57BL/6 (CD45.2) mogą być używane jako biorcy. Myszy powinny być dopasowane pod względem płci i wieku między grupami eksperymentalnymi i randomizowane przed ustaleniem guza. W tym badaniu wykorzystano 8-tygodniowe samice myszy.
16. Odczekaj 5-10 minut, aż wszystkie myszy zostaną w pełni znieczulone.
17. Ogol prawy bok myszy za pomocą brzytwy; Opcjonalnie oznacz je za pomocą obcinacza do uszu. Zdezynfekuj obszar i zetrzyj pozostałe włosy 70% etanolem.
18. Ponownie zawiesić komórki rakowe, pipetując w górę i w dół za pomocą pipety P1000. Załadować zawiesinę komórkową do strzykawki o pojemności 0,5 ml i pojemności 30 g.
19. Delikatnie unieś skórę ogolonego boku myszy dwoma palcami i włóż końcówkę igły w miejsce, w którym skóra tworzy fałdę.
    UWAGA: Zachowaj ostrożność, aby nie przebić palców igłą.
20. Zwolnić skórę, jedną ręką przytrzymać strzykawkę na miejscu, a następnie dwoma palcami drugiej ręki rozciągnąć skórę myszy.
21. Powoli wstrzyknąć 50 μl zawiesiny komórek rakowych, aby w miejscu wstrzyknięcia powstało owalne wybrzuszenie (obrzęk podskórny).
    UWAGA: Jeśli wybrzuszenie nie powstanie, zawiesina mogła przeciekać do otaczającej tkanki podskórnej, co może prowadzić do niespójnego lub nieudanego tworzenia guza.
22. Po zabiegu monitoruj budzenie się wszystkich myszy, aby zapewnić przeżycie po znieczuleniu.
23. Utrzymuj myszy w środowisku o kontrolowanej temperaturze 23 ± 2 °C i stałym 12-godzinnym cyklu światła/ciemności oraz swobodnym dostępie do pożywienia i wody.
    UWAGA: Jeśli chcesz monitorować wzrost guza, wykonaj kroki 4.24-4.26. W przeciwnym razie pomiń te kroki i przejdź bezpośrednio do następnych sekcji.
24. Aby monitorować wzrost guza, delikatnie przytrzymaj mysz jedną ręką, umożliwiając wyraźną wizualizację guza.
25. Za pomocą suwmiarki elektronicznej zmierz długość guza (l), szerokość (w) i wysokość (h). Oblicz objętość guza (V) za pomocą wzoru: V = (dł . x szer . x wys.) / 2.
26. Mierz wymiary guza co dwa do trzech dni. Gdy guz osiągnie objętość spełniającą kryterium humanitarnego punktu końcowego (np. 1500 mm³), zwierzę należy poddać eutanazji zgodnie z wytycznymi etycznymi i instytucjonalnymi.

5. Izolacja guza do analizy cytometrii przepływowej

1. Przygotuj nożyczki, kleszcze, bufor FACS i 12-dołkowe płytki do hodowli nietkankowych z lodowato zimnym, kompletnym podłożem RPMI do pobierania próbek guza.
2. Przygotować roztwór do trawienia guza, mieszając 30 μl kolagenazy D 100 mg/ml i 3 μl 10 mg/ml DNAzy I w 3 ml pełnej pożywki RPMI na guz (aby osiągnąć stężenie robocze 1 mg/ml kolagenazy D i 10 μg/ml DNAzy I).
   UWAGA: Jeśli wydajność trawienia nie jest optymalna, dodaj 2-5 mM CaCl₂ , aby wspomóc aktywność kolagenazy.
3. Poddaj myszy eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy lub uduszenie CO₂ w dniu izolacji.
   UWAGA: Jeśli wybrano eutanazję CO₂ należy wprowadzić CO₂ w ilości 30–70% objętości komory/min i potwierdzić zgon zatwierdzoną metodą wtórną (np. zwichnięcie szyjki macicy).
4. Wytnij guzy podskórne nożyczkami i kleszczami i umieść każdy guz w studzience 12-dołkowej płytki do hodowli nietkankowej z lodowatym RPMI. Staraj się zminimalizować wycięcie tkanki nienowotworowej.
5. Pokrój próbki guza na 1-2 mm³ kawałki za pomocą nożyczek, zbierz kawałki do stożkowych probówek o pojemności 50 ml zawierających 3 ml roztworu trawiącego i inkubuj w temperaturze 37 °C, wstrząsając z prędkością 200-250 obr./min przez 30-45 min.
   UWAGA: Wirować lub pipetować co 15 minut, aby ułatwić proces trawienia.
6. Po roztrawieniu energicznie pipetować mieszaninę przez 1 minutę za pomocą pipety serologicznej o pojemności 5 ml. Przefiltruj zawiesinę komórek przez sitko o pojemności 70 μm do nowej stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
7. Za pomocą tłoka strzykawki o pojemności 10 ml rozbić niestrawione kawałki o sitko o komórek 70 μm i przepłukać sitko 10 ml kompletnego podłoża RPMI.
8. Odwirować zawiesinę komórek w stężeniu 350 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C, ponownie zawiesić w 1 ml buforu FACS i policzyć żywe komórki.
9. Przenieść zawiesinę komórek do probówek polistyrenowych o pojemności 5 ml, granulować komórki w ilości 350 × g przez 5 minut i ponownie zawiesić 10⁶ żywych komórek na 100 μl buforu FACS.
10. Oddzielne komórki dla kontroli jednokolorowych (SC) i FMO w oddzielnych rurkach polistyrenowych.
11. Przygotować główną mieszaninę barwienia przeciwciał zawierającą surowicę szczurów (1:100) w celu zablokowania niespecyficznego wiązania; dający się utrwalić barwnik żywotności (1:100) w celu wykluczenia martwych komórek z analizy; oraz znakowane fluorescencyjnie przeciwciała anty-CD45.1, anty-CD45.2 i anty-MHC-II w ich optymalnym stężeniu. Dodać 100 μl mieszanki wzorcowej do każdej próbki i inkubować przez 20 minut w temperaturze 4 °C w ciemności.
12. Przemyć próbki 2x 2 ml buforu FACS i przystąpić do analizy metodą cytometrii przepływowej.
13. Określ ilościowo procentową zawartość komórek podobnych do cDC1 wykazujących ekspresję CD45.2 i / lub MHC-II, poprzez bramkowanie w transdukowanych (eGFP⁺) komórkach rakowych (CD45.1-mCherry⁺).
    UWAGA: Protokół ten może być stosowany do przeprowadzania immunofenotypowania nowotworów po przeprogramowaniu in vivo cDC1 poprzez uzupełnienie panelu barwienia przeciwciałami przeciwko endogennym populacjom limfoidalnych i / lub szpikowych komórek odpornościowych.

6. Zamrażanie i cięcie guza do analizy mikroskopii konfokalnej

1. Przygotuj się do izolacji guza, wykonując kroki 5.1 i 5.3. Wytnij guzy podskórne nożyczkami i kleszczami.
2. Unieruchomić guzy w świeżo przygotowanym 4% paraformaldehydzie (PFA) w PBS w temperaturze 4 °C, delikatnie wstrząsając. Dostosuj czas fiksacji do wielkości guza, przyjmując jako wskazówkę 1 godzinę na mm³ tkanki.
3. Przenieś guzy do 15% sacharozy w PBS i inkubuj w temperaturze 4 °C, delikatnie potrząsając tkankami, aż opadną na dno probówki. Następnie przenieś je do 20% sacharozy w PBS w tych samych warunkach.
4. Gdy guzy osiądą na dnie probówki, inkubuj je w mieszaninie 1:1 20% sacharozy w PBS i związku OCT przez 30 minut w temperaturze 4 °C z potrząsaniem.
5. Usuń mieszaninę, osadź tkanki w kriofordzie ze 100% OCT i zamroź błyskawicznie przy użyciu ciekłego azotu.
   UWAGA: Zawsze noś odpowiednie środki ochrony osobistej (rękawice kriogeniczne, osłona twarzy i fartuch laboratoryjny), aby zapobiec oparzeniom zimnem lub obrażeniom spowodowanym szybkim rozszerzaniem się pary. Pracuj w dobrze wentylowanym miejscu, aby uniknąć ryzyka uduszenia.
   1. Przechowywać bloki w temperaturze -80 °C w zamkniętych pojemnikach, aby zapobiec odwodnieniu.

7. Barwienie immunofluorescencyjne wycinków guza

1. Za pomocą kriostatu pokrój guzy na odcinki o grubości około 8 μm i zamontuj je na szkiełkach mikroskopowych. W razie potrzeby przechowywać szkiełka w temperaturze -80 °C.
   UWAGA: Aby zachować integralność tkanek, bloki i szkiełka z zamontowanymi nacięciami guza należy przechowywać na suchym lodzie podczas transportu do iz kriostatu. Upewnij się, że kriostat jest utrzymywany w temperaturze -20 °C podczas cięcia.
2. Rozmrażaj szkiełka w PBS przez 5 minut i mocuj je w 4% roztworze PFA przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
3. Po utrwaleniu umyć szkiełka w PBS przez 5 minut.
   UWAGA: Upewnij się, że tkanki pozostają nawodnione; Zawsze utrzymuj je w płynie przez wszystkie kolejne etapy barwienia. Jeśli eksperyment musi zostać wstrzymany, slajdy mogą być przechowywane w PBS w RT przez maksymalnie 3 godziny. Unikaj przechowywania szkiełek w PBS przez noc.
4. W celu pobrania antygenu napełnij parowiec wodą i włącz go. Umieść słoik z wodą dejonizowaną i słoik zawierający 10 mM cytrynianu sodu (pH 6) w naczyniu do gotowania na parze i przykryj otwór folią aluminiową. Nie zdejmując pokrywki, włóż termometr przez otwory wentylacyjne pokrywy naczynia do gotowania na parze, przebij folię aluminiową i monitoruj temperaturę, upewniając się, że roztwory osiągną ~99 °C.
5. Gdy osiągną ~99 °C, zanurz szkiełka w wodzie dejonizowanej na 10 s, a następnie szybko przenieś je do roztworu do pobierania antygenu.
6. Inkubować szkiełka w temperaturze ~99 °C przez 15 minut.
7. Myć szkiełka w 1x PBS przez 3 x 5 min.
8. Użyj długopisu Hydrophobic Barrier Pap Pen, aby wyznaczyć każdy odcinek tkanki, tworząc hydrofobowy obwód, który zapobiega wyciekaniu płynu dodanego do tkanek.
   UWAGA: Kolejne płukania PBS mogą naruszyć hydrofobowy obwód otaczający tkanki i wymagać odnowienia. W razie potrzeby narysuj go ponownie.
9. Blokować i przepuszczać tkanki za pomocą 150 μl buforu blokującego (5% surowicy i 0,5% Triton X-100 w 1x PBS) przez 60 minut w temperaturze pokojowej. Do wszystkich etapów barwienia należy użyć surowicy tego samego gatunku, co gospodarz przeciwciała drugorzędowego.
10. Myj szkiełka w 1x PBS przez 3 x 5 min.
11. Inkubować tkanki z 20 μg/ml pierwszorzędowego przeciwciała anty-CD45 w buforze blokującym (5% surowicy i 0,5% Triton X-100 w 1X PBS) przez noc w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Aby użyć innych przeciwciał, empirycznie zweryfikuj stężenie przeciwciał.
12. Myj szkiełka w 1x PBS przez 3 x 5 min.
13. Inkubować skrawki tkanki z kozim przeciwciałem drugorzędowym przeciw szczurom sprzężonym z AlexaFluor-647 w rozcieńczeniu 1:250 w buforze blokującym (5% surowicy) przez 2 godziny w ciemności w temperaturze RT.
    UWAGA Po dodaniu przeciwciała drugorzędowego wszystkie kolejne kroki należy wykonać w ciemności, aby zapobiec fotowybielaniu fluoroforów.
14. Myj szkiełka w 1x PBS przez 3 x 5 min.
15. Inkubować tkanki z 1 μg/ml DAPI i 20 μg/ml skoniugowanych przeciwciał AlexaFluor-594 w buforze blokującym (5% surowicy) przez 1 godzinę w ciemności w temperaturze RT.
16. Myj szkiełka w 1x PBS przez 3 x 5 min.
17. Dodaj kroplę roztworu montażowego na każdy fragment guza, a następnie nałóż kilka kropli podłoża montażowego na szkiełko nakrywkowe. Szybko odwróć szkiełko nakrywkowe na szkiełko, aby je zamontować i upewnić się, że w pobliżu guzów nie ma pęcherzyków.
18. Pozostaw szkiełka do wyschnięcia na noc i zobrazuj je za pomocą mikroskopii konfokalnej.

Wyniki

Schematyczny przegląd wykonalnego protokołu przeprogramowania in vivo przedstawiono na rysunku 1. Najpierw wyprodukowaliśmy policistroniczny wektor lentiwirusowy SFFV-PIB-IRES-eGFP (PIB-eGFP), kodujący czynniki przeprogramowujące instruujące cDC1 PU.1, IRF8, BATF3, a następnie wewnętrzne rybosomalne miejsce wejścia (IRES) i wzmocnione białko zielonej fluorescencji (eGFP) w linii komórkowej pakowania HEK 293T. Aby kontrolować immunogenność za pośrednictwem lentiwirusa, wyprodukowaliśmy pusty wektor SFFV-MCS-eGFP (eGFP), zawierający wiele miejsc klonowania (MCS) i IRES-eGFP, ale z wyłączeniem czynników przeprogramowujących. Po wyprodukowaniu wirusa zebraliśmy supernatant zawierający lentiwirusa i zagęściliśmy go przez ultrawirowanie. Funkcjonalnie miareczkowaliśmy wirusa, aby określić ilość wymaganą do osiągnięcia stosunku 1: 1 komórek transdukowanych (eGFP⁺) do nietransdukowanych (eGFP^-), które oceniliśmy w 3 dniu po transdukcji. Następnie wykorzystaliśmy otrzymaną ilość wirusa do transdukcji wybranej linii komórek rakowych w dniu -1. Po 24 godzinach pobraliśmy komórki i wszczepiliśmy je podskórnie w celu ustalenia guzów. Strategia ta zapewniła, że transdukowane komórki zostały przeprogramowane na komórki podobne do cDC1 in vivo, w TME. We wskazanych punktach czasowych po wszczepieniu wycięliśmy i przetworzyliśmy guzy do dalszych analiz, w tym cytometrii przepływowej zdysocjowanych komórek nowotworowych, w celu ilościowego określenia skuteczności przeprogramowania in vivo lub barwienia immunofluorescencyjnego kriokonserwowanych skrawków guza w celu scharakteryzowania zmian w TME.

Po pierwsze, aby zapewnić produkcję wysokich mian lentiwirusowych, monitorowaliśmy komórki HEK 293T przed transfekcją, dążąc do osiągnięcia 70-80% konfluencji, a 24 godziny później oceniliśmy skuteczność transfekcji poprzez ekspresję eGFP za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej (Figura 2A). Następnie zebraliśmy pożywkę zawierającą wirusa 48 godzin i 60 godzin po transfekcji, ultraodwirowaliśmy ją i przechowywaliśmy w podwielokrotnościach w temperaturze -80 °C (ryc. 2B). Następnie określiliśmy optymalną ilość wirusa wymaganą do osiągnięcia stosunku 1:1 komórek eGFP⁺ do eGFP^- w komórkach czerniaka YUMM1.7. Wysialiśmy 10⁵ komórek YUMM1,7 na studzienkę na 6-dołkowej płytce, transdukowaliśmy komórki zwiększającymi się objętościami lentiwirusa i zastąpiliśmy supernatant zawierający wirusa świeżą kompletną pożywką DMEM / F12 po 24 godzinach (Figura 2C). W dniu 3 oceniliśmy ekspresję eGFP za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, zanim przystąpiliśmy do ilościowego określenia dokładnej procentowej zawartości komórek eGFP ⁺ za pomocą cytometrii przepływowej (Figura 2C). Aby określić ilościowo stosunek komórek eGFP⁺ do eGFP^- , przeprowadziliśmy bramkowanie w żywych, pojedynczych komórkach, aby wykluczyć martwe komórki i dublety (ryc. 2D). Optymalna objętość wyprodukowanej partii lentiwirusa została określona zarówno dla PIB-eGFP, jak i kontrolnego wirusa eGFP jako 2 μl na 10⁵ komórek YUMM1,7, co daje odpowiednio 50,0 ± 0,3% i 63,0 ± 0,9% komórek eGFP⁺ (ryc. 2E).

Następnie, aby ocenić skuteczność przeprogramowania in vivo, wygenerowaliśmy znakowaną fluorescencyjnie (mCherry⁺) linię komórek nowotworowych (YUMM1.7-mCherry). Zapewniło to, że możemy odróżnić komórki rakowe od komórek zrębowych lub odpornościowych poprzez bramkowanie w żywych komórkach mCherry ⁺ w analizie cytometrii przepływowej (ryc. 3A, B). Następnie transdukowaliśmy komórki YUMM1.7-mCherry z 2 μl PIB-eGFP lub kontrolnego wirusa eGFP na 10-5 komórek, aby uzyskać stosunek 1:1 eGFP⁺ do eGFP^-. Wszczepiliśmy podskórnie 1,6 × 10⁶ komórek na guz myszom CD45.1 i zachowaliśmy porcję komórek do hodowli in vitro dla porównania. Oceniliśmy skuteczność przeprogramowania za pomocą cytometrii przepływowej, bramkowania żywych komórek mCherry ⁺ eGFP ⁺ i CD45.1 ^w celu wykluczenia komórek odpornościowych gospodarza, które pochłonęły eGFP lub mCherry (Figura 3B). Od 1 do 9 dni zaobserwowaliśmy stopniowe nabywanie ekspresji CD45.2 i / lub MHC-II, oznaczając częściowo przeprogramowane komórki podobne do cDC1 (CD45.2 ⁺ MHC-II ^- lub CD45.2 ^- MHC-II ⁺) i w pełni przeprogramowane komórki podobne do cDC1 (CD45 ⁺ MHC-II ⁺) (Figura 3C). Potwierdziliśmy, że przeprogramowanie mysich komórek rakowych in vivo skutkowało wyższym odsetkiem komórek podobnych do cDC1 w dniu 9 w porównaniu z warunkami in vitro (9,54 ± 1,54% CD45 ⁺ MHC-II ⁺ in vivo w porównaniu z 4,72 ± 1,1 % CD45 ⁺ MHC-II ⁺ in vitro, P = 0,018). Kinetyka przeprogramowania została również przyspieszona, ponieważ zaobserwowaliśmy wyższy odsetek komórek podobnych do cDC1 już w 4 dniu (8,7 ± 3,3% CD45 ⁺ MHC-II ⁺ in vivo w porównaniu z 0,3 ± 0,1% CD45 ⁺ MHC-II ⁺ in vitro, P = 0,05), co wskazuje, że obecność sygnałów środowiskowych sprzyja szybszemu i bardziej wydajnemu przeprogramowaniu w kierunku komórek podobnych do cDC1¹⁹. Podczas gdy przeprogramowane in vitro komórki podobne do cDC1 były obecne do 15 dnia, komórki podobne do cDC1 in vivo utrzymywały się przez 9 dni, ale nie zostały wykryte do 15 dnia, co sugeruje wyczerpanie TME przez układ odpornościowy gospodarza (Figura 3C).

Na koniec naszym celem było scharakteryzowanie wczesnych zmian w TME w wyniku przeprogramowania cDC1 in vivo w ciągu pierwszych 9 dni. Przeprowadziliśmy barwienie immunofluorescencyjne kriokonserwowanych i wyciętych tkanek nowotworowych zarówno z guzów eGFP, jak i PIB-eGFP po 3 i 9 dniach przeprogramowania in vivo, koncentrując się na infiltracji komórek odpornościowych oznaczonych markerem pan-hematopoetycznym CD45. Warto zauważyć, że komórki podobne do cDC1 rekrutowały znacznie więcej komórek CD45 do TME w 3 dniu, w porównaniu z guzami eGFP (49,6 ± 17,0 w porównaniu z 8,0 ± 5,8 średnia intensywność fluorescencji barwienia CD45 na obszar guza; Rysunek 4A,B). Co ciekawe, wykryliśmy TLS w TME guzów po 9 dniach przeprogramowania in vivo. Sugeruje to, że komórki podobne do cDC1 mogą szybko przemodelować TME z "immunologicznie zimnego" do "immunologicznie gorącego" środowiska w ciągu 3 dni, co następnie prowadzi do powstania TLS w 9 dniu.

Rysunek 1: Przegląd protokołu generowania komórek podobnych do cDC1 poprzez przeprogramowanie komórek nowotworowych in vivo. Wektory lentiwirusowe SFFV-PIB-IRES-eGFP kodujące PU.1, IRF8 i BATF3 w kasecie policistronicznej pod kontrolą promotora wirusa tworzącego ognisko śledziony (SFFV) i eGFP po wewnętrznym miejscu wejścia rybosomu (IRES) w celu śledzenia transdukowanych komórek za pomocą cytometrii przepływowej i mikroskopii fluorescencyjnej - są wytwarzane w linii komórkowej HEK 293T. Następnie wektory lentiwirusowe są ultrawirowane i funkcjonalnie miareczkowane w celu określenia ilości wirusa wymaganej do transdukcji komórek rakowych w stosunku 1:1 transdukowanych eGFP⁺ do nietransdukowanych komórek eGFP^. W przypadku eksperymentów z przeprogramowaniem in vivo, komórki rakowe są posiane optymalną ilością lentiwirusa w dniu -1. Następnego dnia ta mieszanina 1:1 transdukowanych ^komórek GFP⁺ i nietransdukowanych komórek GFP jest myta i zbierana w celu podskórnego ustalenia guza u myszy. Równoległe hodowle in vitro są utrzymywane w celu walidacji transdukcji w dniu 3 za pomocą cytometrii przepływowej. Zwierzęta są monitorowane co 2-3 dni pod kątem wzrostu i przeżycia guza. Guzy są zbierane w określonych punktach czasowych, dysocjowane i barwione w celu ekspresji markera powierzchniowego do analizy cytometrii przepływowej. Alternatywnie, całe tkanki są utrwalane, kriokonserwowane i cięte w celu barwienia immunofluorescencyjnego i analizy mikroskopii konfokalnej. Skuteczność przeprogramowania in vivo ocenia się za pomocą analizy cytometrii przepływowej, natomiast zmiany w mikrośrodowisku guza charakteryzują się obrazowaniem konfokalnym. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Ryc. 2: Wytwarzanie i miareczkowanie funkcjonalne lentiwirusa do przeprogramowania cDC1 in vivo.(A) Gdy komórki HEK 293T osiągną konfluencję ~ 70-80%, są transfekowane mieszaniną zawierającą 10 μg plazmidu transferowego SFFV-PIB-eGFP (PIB-eGFP) lub pustego wektora lentiwirusowego kontrolnego SFFV-eGFP (eGFP), wraz z 7,5 μg psPAX2 i 2,5 μg mPD2.G i 60 μl 1 mg / ml PEI. Obrazy z mikroskopii jasnego pola i fluorescencji komórek HEK 293T wykazujące ekspresję eGFP 24 godziny po transfekcji, co wskazuje na pomyślne dostarczenie plazmidu. Podziałka = 200 μm. (B) Schematyczne przedstawienie przebiegu ultrawirowania w celu zagęszczenia lentiwirusa. Supernatant komórek HEK 293T zawierający lentiwirusa jest pobierany 48 godzin i 60 godzin po transfekcji, filtrowany przez filtr PES o niskiej wartości wiązania białka 0,45 μm, a następnie ważony 37 g w cienkościennych probówkach polipropylenowych typu open za pomocą wagi stołowej. Probówki są ultrawirowane w wirniku z wahliwym kubełkiem, supernatant jest zasysany, a osad suszony przez 5 minut. Granulki są następnie ponownie zawieszane w lodowatym DMEM zawierającym HEPES i inkubowane przez noc przed porcjowaniem i przechowywaniem w temperaturze -80 °C. (C) Eksperymentalna strategia miareczkowania funkcjonalnego w celu określenia optymalnej dawki wirusa w celu osiągnięcia stosunku 1:1 komórek GFP+ do GFP-. Obrazy z mikroskopii jasnego pola i fluorescencji pokazujące ekspresję eGFP w komórkach czerniaka YUMM1.7, 72 godziny po transdukcji, wskazujące na pomyślne dostarczenie czynników przeprogramowujących i eGFP. Słupki skali = 100 μm. (D) Reprezentatywne wykresy cytometrii przepływowej przedstawiające strategię bramkowania w celu ilościowego określenia stosunku komórek eGFP⁺. Żywe komórki bramkowano w celu zapewnienia żywotności populacji ujemnej pod względem barwnika (DAPI), a następnie wykluczenia dubletowego. (E) Kwantyfikacja wydajności transdukcji za pomocą cytometrii przepływowej wraz ze wzrostem dawek wirusa w celu określenia optymalnej objętości dla uzyskania komórek 1:1 GFP⁺/GFP^-. Zarówno w przypadku lentiwirusa PIB-eGFP, jak i lentiwirusa eGFP, objętość 2 μl na 10⁵ komórek osiągnęła pożądany stosunek. Skróty: cDC1s = konwencjonalne ogniwa dendrytyczne typu 1; DAPI = 4',6-diamidyn-2-fenyloindol; PIB = PU.1, IRF8 i BATF3; PEI = polietyleninina. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Ocena skuteczności przeprogramowania cDC1 in vivo . (A) Schematyczne przedstawienie eksperymentalnego przepływu pracy do oceny skuteczności przeprogramowania in vivo cDC1. Komórki rakowe są początkowo transdukowane lentiwirusem eksprymującym mCherry w celu wytworzenia znakowanej fluorescencyjnie linii komórkowej (YUMM1.7-mCherry), a następnie transdukcji zoptymalizowaną dawką lentiwirusa PIB-eGFP w dniu -1. Komórki są następnie wstrzykiwane podskórnie w stosunku 1:1 komórek eGFP⁺ / eGFP^- w dniu 0, aby ustalić guzy u myszy CD45.1 i umożliwić komórkom transdukowanym PIB przeprogramowanie się w komórki podobne do cDC1 w TME. Guzy są następnie izolowane we wskazanych punktach czasowych, dysocjowane i barwione pod kątem CD45.1, CD45.2 i MHC-II za pomocą cytometrii przepływowej. Pozwala to na wykluczenie komórek odpornościowych gospodarza CD45.1 w celu ilościowego określenia skuteczności przeprogramowania cDC1 in vivo poprzez ekspresję CD45.2 i MHC-II. Równoległe hodowle in vitro są utrzymywane przez wszystkie punkty czasowe w porównaniu z przeprogramowaniem in vivo . (B) Reprezentatywne wykresy cytometrii przepływowej ilustrujące strategię bramkowania w dniu 9. Komórki bramkowano na mCherry⁺ i GFP⁺ w celu zidentyfikowania pomyślnie transdukowanych komórek rakowych. Komórki odpornościowe gospodarza zostały wykluczone przez bramkowanie komórek CD45.1 ⁺ . (C) Kwantyfikacja skuteczności przeprogramowania in vivo (po lewej) komórek YUMM1.7-mCherry za pomocą cytometrii przepływowej jako procent komórek CD45⁺ MHC-II⁺ (całkowicie przeprogramowanych) i komórek CD45.2⁺ HLA-DR^- lub CD45.2^- HLA-DR⁺ cDC1 (częściowo przeprogramowanych) bramkowanych w eGFP^{+ mCherry+} Komórek. Reprezentatywne wykresy cytometrii przepływowej (po prawej) przedstawiające stopniowe nabywanie ekspresji CD45.2 i MHC-II w komórkach YUMM1.7-mCherry transdukowanych przez PIB-eGFP we wskazanych punktach czasowych. Komórki YUMM1.7-mCherry transdukowane eGFP wykorzystano jako kontrolę, a do porównania wykorzystano przeprogramowane komórki podobne do cDC1 przeprogramowane in vitro . Dane w (C) wskazują na średnią ± SD z 3-5 biologicznych powtórzonych eksperymentów. Analizę statystyczną w (C) przeprowadzono dla komórek CD45 ⁺ MHC-II ⁺ przy użyciu testu Manna-Whitneya. *P < 0,05. Skróty: cDC1s = konwencjonalne ogniwa dendrytyczne typu 1; PIB = PU.1, IRF8 i BATF3; TME = mikrośrodowisko guza. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 4: Analiza infiltracji immunologicznej w mikrośrodowisku guza po przeprogramowaniu cDC1 in vivo . (A) Reprezentatywne obrazy konfokalne przedstawiające komórki CD45 ⁺ w guzach YUMM1.7 po podskórnej implantacji komórek transdukowanych PIB-eGFP lub kontrolnych eGFP (stosunek transdukcji do komórek rodzicielskich 1:1) w dniach 3 i 9. Słupki skali = 500 μm. (B) Kwantyfikacja MFI dla barwienia CD45 w guzach YUMM1.7 leczonych PIB i kontrolnych transdukowanych eGFP w dniach 3 i 9. Dane w (B) wskazują na średnią ± SD z 3-6 biologicznych powtórzonych eksperymentów. Analizę statystyczną w (B) przeprowadzono za pomocą testu Manna-Whitneya. *P < 0,05 i ***P < 0,001. Skróty: cDC1s = konwencjonalne ogniwa dendrytyczne typu 1; PIB = PU.1, IRF8 i BATF3; MFI = średnia intensywność fluorescencji. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

W tym protokole opisujemy wykonalną metodę generowania komórek podobnych do cDC1 w oparciu o przeprogramowanie in vivo komórek rakowych z guzów litych. Nasze wyniki pokazują, że nadekspresja PU.1, IRF8 i BATF3 napędza stopniowe nabywanie fenotypu cDC1 w TME do 9 dnia, po czym komórki podobne do cDC1 są zubożone z guzów. Ostatecznie prowadzi to do wzrostu infiltracji komórek CD45 do TME do 3 dnia, powodując przebudowę "immunologicznie zimnego" TME na "immunologicznie gorący".

Obecne protokoły generowania cDC1 obejmują wzbogacanie autologicznych DC z krwi obwodowej, różnicowanie z hematopoetycznymi komórkami progenitorowymi CD34 ⁺ lub różnicowanie z pluripotencjalnymi komórkami macierzystymi 14,15,16,17,18,19. Jednak metody te mają czynniki ograniczające: niewystarczające dojrzewanie, zmniejszoną prezentację antygenu i zdolność do produkcji cytokin/chemokin in vivo, podatność na immunosupresję, wysoką heterogeniczność DC i małą liczbę generowanych komórek⁷. W tym miejscu udostępniamy protokół, który umożliwia skalowalne generowanie komórek podobnych do cDC1 in vivo do badań funkcjonalnych i mechanistycznych.

Za pomocą tej metody sprawdziliśmy, czy ekspresja kombinacji czynników transkrypcyjnych PU.1, IRF8 i BATF3 była wystarczająca do przeprowadzenia przeprogramowania in vivo . Protokół ten umożliwia precyzyjną kontrolę nad efektywnością podawania, ponieważ zmiana dawki wszczepianych komórek zmodyfikowanych genetycznie bezpośrednio wpływa na skuteczność leczenia. Wcześniej wykazaliśmy, że 2% transdukowanych komórek, które odpowiadają 0,15% komórek podobnych do CD45 ⁺ i MHC-II ⁺ cDC1, jest wystarczające do wywołania odporności przeciwnowotworowej²⁰. Co więcej, szybka infiltracja immunologiczna obserwowana w dniu 3 sugeruje, że częściowo przeprogramowane komórki podobne do cDC1 są funkcjonalnie aktywne in vivo, ponieważ w tym momencie nie ma znacznego wzrostu w pełni przeprogramowanych komórek podobnych do cDC1. W przyszłości interesujące będzie odkrycie funkcjonalnej roli częściowo i w pełni przeprogramowanych komórek podobnych do cDC1 w skuteczności przeciwnowotworowej przy użyciu zmodyfikowanych wektorów zawierających gen samobójczy w celu wywołania śmierci komórki w wybranych populacjach komórek w określonych punktach czasowych²⁴. Protokół ten może być dalej wykorzystywany do badania kombinacji z adiuwantami epigenetycznymi, które mogą zwiększyć wydajność przeprogramowywania²⁵. Wreszcie, metodę tę można również zaadaptować do generowania innych podtypów DC in vivo, uruchamiając różne typy odpowiedzi immunologicznych, na przykład odpowiedzi przeciwwirusowe lub tolerogenne¹⁴. Ponadto możemy wykorzystać przeprogramowanie in vivo jako platformę do wykonywania badań przesiewowych z kodami kreskowymi dla kombinacji czynników transkrypcyjnych w celu wygenerowania różnych typów komórek odpornościowych. Możliwość ta może zwiększyć elastyczność leczenia poprzez wykorzystanie różnorodnych właściwości funkcjonalnych określonych podzbiorów immunologicznych.

W naszym poprzednim badaniu wykazaliśmy, że immunosupresyjne środowisko in vivo nie utrudnia przeprogramowania ludzkich komórek nowotworowych w immunogenne cDC1²⁰. W tym artykule pokazujemy, że u myszy przeprogramowanie jest szybsze i wydajniejsze in vivo niż in vitro, co sugeruje, że zwiększone przeprogramowanie obserwowane in vivo jest zjawiskiem konserwatywnym u obu gatunków. Jednak jednym z ograniczeń tej metody jest brak środowiska in vivo podczas początkowego dostarczania wektora; W związku z tym nie jest w stanie stwierdzić, czy sygnały środowiskowe wpływają na wydajność dostarczania in vivo. Należy to ustalić in situ, porównując różne cząstki. Wektory adenowirusowe, które zidentyfikowaliśmy jako bardziej wydajne niż wektory lentiwirusowe do dostarczania in situ ²⁰, można porównać z ugrupowaniami niewirusowymi, takimi jak liniowe, kołowe i samowzmacniające się RNA lub koktajle małocząsteczkowe^{2 6,27}.

Wcześniej wykazaliśmy, że przeprogramowanie cDC1 wyposaża komórki rakowe w cytokiny prozapalne i wydzielanie chemokiny rekrutujące limfocyty oraz profesjonalne przetwarzanie i prezentację antygenów na MHC-I i MHC-II w modelach czerniaka^23,28. Powoduje to przebudowę TME ze stanu "immunologiczno-zimnego" do "immunologicznie gorącego" poprzez indukowanie tworzenia TLS, co zwiększa infiltrację cytotoksycznych efektorowych limfocytów T, komórek NK i limfocytów B oraz zmniejsza populacje immunosupresyjne, takie jak regulatorowe i wyczerpane limfocyty T²⁰. U pacjentów pozytywne odpowiedzi na immunoterapię zostały powiązane z obecnością TLS w guzach, w których utrzymujące się pobudzanie komórek T i B przeciwko antygenom nowotworowym generuje odpowiedzi przeciwciał specyficzne dla nowotworu^29,30. W przyszłości przewidujemy zastosowanie tego wykonalnego protokołu przeprogramowania cDC1 in vivo do rozwikłania mechanizmów indukowanej neogenezy TLS, przebudowy TME i odporności przeciwnowotworowej w różnych typach nowotworów oraz scharakteryzowania, czy stymulowana jest produkcja przeciwciał specyficznych dla nowotworu.

Wcześniej zaobserwowaliśmy synergizm między przeprogramowaniem in vivo cDC1 a ICB z anty-PD-1 lub anty-CTLA-4²⁰. Sugeruje to, że "immunologicznie gorący" TME stworzony przez przeprogramowanie cDC1 może stanowić korzystne środowisko dla możliwych kombinacji z innymi immunoterapiami, takimi jak ACT, w tym receptorem limfocytów T (TCR)-T, chimerycznymi receptorami antygenowymi (CAR)-T lub limfocytami naciekającymi nowotwór (TIL). Kolejną zaletą tej metody jest możliwość wykonywania dużych, bezstronnych badań kombinatorycznych lub CRISPR, w których receptory immunologiczne, cytokiny, chemokiny lub limfotoksyny mogą ulegać nadekspresji lub zubożeniu w komórkach podobnych do cDC1 w opornych typach nowotworów, odkrywając w ten sposób rolę odrębnych szlaków we wzmacnianiu odporności za pośrednictwem cDC1. Podsumowując, obecny protokół stanowi cenne źródło informacji dla szerokiej społeczności naukowej, ponieważ przeprogramowanie cDC1 in vivo jest elastyczną i potężną platformą do badań mechanistycznych i innowacji terapeutycznych w immunoterapii nowotworów.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
0,45 μ m niskobiałkowy filtr wiążący, 150 ml filtr próżniowy do butelki	Fisher naukowy	15983297
2-merkaptoetanol 50 mM	ThermoFisher Naukowy	31350010
Przeciwciało monoklonalne anty-mysie CD45 (klon: 30-F11), szczurze IgG2b i kappa;	ThermoFisher Naukowy	14-0451-82
Klasa B6. SJL-PtprcaPepcb/BoyCrl (CD45.1)	Laboratorium Jacksona	002014
Strzykawki do insuliny BD Micro-Fine U-100 (0,5 ml)	Fisher Naukowy	11395751
Myszy C57BL/6J	Laboratorium Jacksona	000664
Kolagenaza D	Sigma Aldrich	11088882001
Sitko Corning Falcon Cell do użytku z probówkami stożkowymi o pojemności 50 ml	Sigma Aldrich	CLS352340
Okulary nakrywkowe Corning 24 x 50 mm	Sigma Aldrich	CLS2975245
DAPI (4',6-diamidyno-2-fenyloindol, dichlorowodorek)	ThermoFisher Naukowy	Zobacz materiał D1306
DNaza I	Sigma Aldrich	10104159001
eBioscience Możliwy do naprawienia barwnik żywotności eFluor 450	Invitrogen	65-0863-14
eBioscience Roztwór do odzyskiwania antygenu IHC - niskie pH (10x)	ThermoFisher Naukowy	00-4955-58
Płodowa surowica bydlęca (FBS)	ThermoFisher Naukowy	A5256701
Medium montażowe Fluoromount-G	ThermoFisher Naukowy	00-4958-02
Przeciwciało GFP [Alexa Fluor 594]	Novus Biologicals	NB600-308AF594
Gibco DMEM/Mieszanka składników odżywczych F-12 (DMEM/F-12)	ThermoFisher Naukowy	31331028
Gibco MEM Roztwór aminokwasów endogennych (100x)	ThermoFisher Naukowy	11140035
Gibco Opti-MEM I	ThermoFisher Naukowy	11058021
Gibco Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Średni	ThermoFisher Naukowy	52400025
Pirogronian sodu Gibco (100 mM)	ThermoFisher Naukowy	11360070
Gibco Roztwór błękitu trypanowego, 0,4%	ThermoFisher Naukowy	15250061
Suplement GlutaMAX	ThermoFisher Naukowy	35050061
Kozie przeciwciało anty-szczurze IgG (H + L) adsorbowane krzyżowo przeciwciało drugorzędowe, poliklonalne, Alexa Fluor 488	ThermoFisher Naukowy	A-11006
Ogniwa HEK 293T	ATTC (Kontroler Nadzoru)	CRL-11268
Bromek heksadimetryny (Polybrene)	Sigma Aldrich	Zobacz materiał H9268
HyClone Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) o wysokiej zawartości glukozy	Cytiva (Cytiwa)	SH30243.01
HyClone Penicylina Streptomycyna 100x roztwór (długopis/paciorkowiec)	Cytiva (Cytiwa)	SV30010
Hyklon Roztwór soli fizjologicznej buforowany fosforanem (PBS)	Cytiva (Cytiwa)	SH30028.02
Ketaminol weterynarz. Roztwór do wstrzykiwań 100 mg/ml	MSD Zdrowie Zwierząt Szwecja	QN01AX03
Ostrze mikrotomowe - C35	Medyczne zarządzanie finansami publicznymi (PFM	207500005
Mysz anty-CD45.2 (104), Surface, APC, monoklonalna	Legenda biologiczna	109814
Mysi anty-MHCII (M5/114.15.2), Powierzchniowy, PE-Cy7, Monoklonalny	Legenda biologiczna	107630
Normalna kozia surowica	Księga Abcam	ab7481 powiedział:
Normalna surowica szczura (sterylna)	Księga Abcam	ab7488 powiedział:
Cienkościenne rurki polipropylenowe z otwartą górą	Beckman Coulter Nauki Przyrodnicze	326823
Paraformaldehyd, 16% w/v aq. soln., bez metanolu	ThermoFisher Naukowy	043368.9 mln
pFUW-tetO-Batf3, monocistroniczna mysz kodująca kasetę Batf3	Addgene powiedział:	139837
pFUW-tetO-Irf8, monocistroniczna mysz kodująca kasetę Irf8	Addgene powiedział:	139838
pFUW-tetO-Pu.1, monocistroniczna mysz kodująca kasetę Pu.1	Addgene powiedział:	139839
Plazmid pMD2.G	Addgene powiedział:	12259
Plazmid psPAX2	Addgene powiedział:	12260
Plazmid SFFV-eGFP (eGFP)	Klonowanie w domu	-
Plazmid SFFV-mCherry (mCherry)	Klonowanie w domu	-
Plazmid SFFV-PIB-eGFP,  policytroniczna mysz kodująca kasetę PU.1, IRF8 i BATF3 (PIB)	Klonowanie w domu	-	Konstrukty i wektory wykorzystywane do przeprogramowania są dostępne w Asgard Therapeutics na podstawie umowy o transferze materiałów zawartej z firmą
Polietylenina (PEI), Liniowa, MW 25000, Stopień transfekcji	Nauki polilogiczne	23966
ReadyProbes Długopis do badania z hydrofobową barierą	ThermoFisher Naukowy	Czynnik R3777
Maślan sodu	Sigma Aldrich	303410
Sacharoza	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał S7903
Szkiełka mikroskopowe SuperFrost Plus Adhesion	Epredia	J1800AMNZ
Związek Tissue-Tek OCT	Sakura Finetek	4583
TrypLE Express Enzyme (1x) bez czerwieni fenolowej	ThermoFisher Naukowy	12604021
TT Cryomold Intermediate, kwadratowy (15 x 15 x 5 mm)	Sakura Finetek	4566
UltraPure 0,5 M EDTA, pH 8,0	Invitrogen	15575020
Xysol weterynarz. Roztwór do wstrzykiwań 20 mg/ml	VM Pharma	QN05CM92
Ogniwa YUMM1.7	Antineo (antyneo)