Proces charakterystyki neuropeptydów od próbkowania do spektrometrii mas niezależnej od danych

Summary

Ten protokół przedstawia kompleksowy proces neuropeptidomiczny w tkance mózgowej szczura, który łączy w sobie akwizycję-równoległą akumulację-fragmentację szeregową (DDA-PASEF) zależną od danych akwizycję-akumulację szeregową (DDA-PASEF) i spektrometrię mas niezależnego od danych (DIA).

Abstract

Endogenne neuropeptydy są kluczowymi modulatorami funkcji mózgu, odgrywając kluczową rolę w zachowaniu, stresie, bólu i regulacji homeostazy, jednak ich analiza pozostaje trudna. Biologicznie są one mało liczne, szybko degradowane i przetwarzane zmiennie z białek prekursorowych, a ich ekspresja jest ograniczona do małych, zlokalizowanych populacji komórek. Z technicznego punktu widzenia ich wykrywanie jest skomplikowane ze względu na szeroki zakres dynamiki, różnorodne modyfikacje potranslacyjne i rzadkie sygnały w zestawach danych spektrometrii mas. Protokół ten przedstawia kompleksowy przepływ pracy do analizy neuropeptydów w tkance mózgowej Rattus norvegicus przy użyciu spektrometrii mas (MS) zarówno zależnej od danych (DDA), jak i spektrometrii mas (MS) niezależnie od danych (DIA) na platformie timsTOF. Po zoptymalizowanym przygotowaniu próbki mózgu, w tym sekcji, ekstrakcji peptydów i oczyszczeniu, przeprowadza się chromatografię nanocieczową (LC)-MS z frakcjonowaniem w fazie gazowej ruchliwości jonów w celu poprawy czułości i dokładności wykrywania. Biblioteka spektralna generowana przez DDA obsługuje kwantyfikację opartą na DIA w Skyline, umożliwiając pomiary na poziomie MS2 o wysokiej pewności. Ten zintegrowany przepływ pracy zwiększa pokrycie neuropeptydami i zwiększa odtwarzalność ilościową, zapewniając solidną platformę do badania neuropeptydów w złożonej tkance mózgowej.

Introduction

Neuropeptydy to funkcjonalnie zróżnicowana klasa endogennych cząsteczek sygnałowych, które służą jako krytyczne modulatory komunikacji neuronalnej, funkcji układu nerwowego i neuroendokrynnego. Działając jako neuromodulatory, hormony lub koprzekaźniki, wpływają na szeroki zakres procesów fizjologicznych, w tym modulację bólu, reakcję na stres, regulację okołodobową i kontrolę apetytu. W przeciwieństwie do klasycznych neuroprzekaźników, które są syntetyzowane jako małe cząsteczki, neuropeptydy są kodowane w dużych białkach prekursorowych, które są syntetyzowane przez translację mRNA. Białka prekursorowe lub prohormony są następnie poddawane procesowi proteolitycznemu w celu uwolnienia aktywnych peptydów, które są upakowane w pęcherzyki o gęstym rdzeniu (DCV). Po stymulacji neuropeptydy są uwalniane w celu wywarcia modulujących, zwykle wolniejszych i bardziej długotrwałych efektów poprzez interakcje z receptorami sprzężonymi z białkiem G. Ich znaczenie w utrzymaniu funkcji ośrodkowego i obwodowego układu nerwowego sprawiło, że stały się one obszarem intensywnego zainteresowania biologicznego i klinicznego^1,2,3,4,5.

Pomimo ich znaczenia, neuropeptydy są nadal trudne do scharakteryzowania z analitycznego punktu widzenia. Ich wysoce heterogeniczne struktury – od krótkich do wydłużonych sekwencji, często noszących różne modyfikacje potranslacyjne (PTM), takie jak amidacja, acetylacja, fosforylacja, izomeryzacja aminokwasów lub skrócenie -- prowadzą do zmienności zachowań jonizacji i fragmentacji w spektrometrii mas (MS)^1,6,7,8. Ponadto są one zazwyczaj obecne w niskich stężeniach w stosunku do składników macierzy biologicznej, łatwo ulegają degradacji i są zlokalizowane w sposób ograniczony przestrzennie w złożonej tkance układu nerwowego. Cechy te komplikują zarówno identyfikację, jak i kwantyfikację, szczególnie w przypadku stosowania tradycyjnych podejść proteomicznych, które opierają się na przewidywalnym trawieniu enzymatycznym i jednolitych właściwościach peptydów^9,10,11.

Tutaj prezentujemy kompleksową strategię identyfikacji i kwantyfikacji endogennych peptydów w mózgu Rattus norvegicus, ze szczególnym naciskiem na neuropeptydy. Przepływ pracy rozpoczyna się od zoptymalizowanych procedur pobierania próbek mózgu, po których następuje obszerna separacja metodą chromatografii cieczowej (LC), a kończy się analizą MS o wysokiej rozdzielczości przy użyciu równoległej akumulacji i fragmentacji szeregowej (PASEF) na platformie spektrometrii ruchliwości uwięzionych jonów (TIMS)^{12,13,14,15,16}. Dzięki włączeniu frakcjonowania w fazie gazowej ruchliwości jonów (IM-GPF) przed wyborem prekursora, podejście oparte na akwizycji zależnej od danych (PASEF) (DDA-PASEF) umożliwia lepszą separację prekursorów i lepsze wykrywanie neuropeptydów o niskiej liczebności, z których wiele w przeciwnym razie zostałoby pominiętych w jednowymiarowych przepływach pracy DDA¹⁷.

Chociaż DDA pozostaje najczęściej używaną strategią identyfikacji peptydów ze względu na wysokiej jakości widma MS/MS, jest ona z natury ograniczona przez poleganie na selekcji jonów prekursorowych według intensywności, co faworyzuje gatunki o niskiej liczebności^18,19,20. Co więcej, jego półstochastyczne próbkowanie prowadzi do brakujących wartości w powtórzeniach, co utrudnia odtwarzalną kwantyfikację. Aby przezwyciężyć te ograniczenia, skonstruowaliśmy solidną bibliotekę spektralną przy użyciu naszych danych DDA-PASEF, które można następnie wykorzystać do analizy akwizycji niezależnej od danych (DIA). W przeciwieństwie do DDA, DIA próbkuje wszystkie jony prekursorowe w zdefiniowanych oknach m/z, zapewniając spójne próbkowanie zarówno obfitych, jak i rzadkich peptydów, a w połączeniu z biblioteką spektralną i ukierunkowaną analizą w Skyline, pozwala na czułą i powtarzalną kwantyfikację na poziomie MS2^21,22,23,24.

To integracyjne podejście -- obejmujące ekstrakcję peptydów mózgowych, chromatograficzną separację, akwizycję MS zwiększoną ruchliwością jonów oraz hybrydową kwantyfikację opartą na DDA/DIA -- zostało opracowane z myślą o złożoności neuropeptydów. Maksymalizuje pokrycie peptydami, jednocześnie minimalizując utratę danych, rozwiązując kluczowe ograniczenia prostszej peptydomiki opartej na DDA. W związku z tym prezentujemy elastyczną i potężną platformę do badania krajobrazu neuropeptydów w mózgu ssaków, którą można łatwo dostosować do szerokiego zakresu pytań eksperymentalnych i próbek tkanek.

Protocol

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach w tym badaniu zostały przeprowadzone zgodnie z protokołem użytkowania zwierząt zatwierdzonym przez Illinois Institutional Animal Care and Use Committee (23228) z ścisłym przestrzeganiem zarówno krajowych, jak i ARRIVE standardów etycznego traktowania i opieki nad zwierzętami.

1. Sekcja zwłok zwierząt i izolacja mózgu

1. Natychmiast po zamrożeniu tkanek należy przeprowadzić zimną perfuzję soli fizjologicznej, aby zachować integralność neuropeptydów, zminimalizować artefakty degradacji i poprawić jakość danych do dalszej analizy peptydomicznej.
2. Poddaj szczura eutanazji metodą CO₂ zgodnie z wytycznymi instytucji dotyczącymi opieki nad zwierzętami. Potwierdź śmierć przez brak bicia serca i brak odruchów.
3. Umieść szczura na wznak; wykonaj nacięcie, aby odsłonić klatkę piersiową.
4. Wykonaj małe nacięcie w lewej komorze serca.
5. Wykonaj małe nacięcie w prawym przedsionku, aby umożliwić odpływ krwi i roztworu perfuzyjnego.
6. Włóż przyciętą na wymiar plastikową końcówkę pipety dołączoną do strzykawki o pojemności 60 ml wypełnionej 50 ml lodowatego roztworu fizjologicznego (np. 0,9% soli fizjologicznej lub mGBSS) do lewej komory.
7. Perfuzja ciała zwierzęcia za pomocą roztworu. Odetnij głowę szczurowi za pomocą ostrych nożyczek lub gilotyny.
8. Usuń skórę i czaszkę pokrywającą mózg za pomocą rongeurs lub cienkich nożyczek.
9. Ostrożnie wyjmij mózg z jamy czaszki, w razie potrzeby przecinając nerwy czaszkowe.
10. Natychmiast zamrozić mózg na suchym lodzie lub zatrzaskowo zamrozić w izopentanie schłodzonym na suchym lodzie.
11. Przenieść do oznakowanych kriowiali lub folii, a następnie przechowywać w temperaturze -80 °C.

2. Ekstrakcja peptydów z tkanki mózgowej szczura

1. W przypadku próbek całego mózgu należy szybko zważyć każdą zamrożoną tkankę za pomocą wagi analitycznej. Homogenizować tkankę za pomocą roztworu klasy LC-MS zawierającego 10% lodowatego kwasu octowego i 1% wody w metanolu, stosując stosunek rozpuszczalnika do tkanki 10:1 (v/w).
2. Homogenizowane próbki inkubować na lodzie przez 20 minut.
3. Odwirować próbki o masie 16 000 × g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Ostrożnie zebrać supernatant, nie naruszając osadu.
4. Zawiesić osad w wodzie klasy LC-MS, stosując stosunek rozpuszczalnika do tkanki 10:1 (v/w) i powtórzyć inkubację na lodzie przez 20 minut.
5. Ponownie odwirować w tych samych warunkach (16 000 × g, 20 min, 4 °C) i zebrać drugi supernatant.
6. Połączyć oba supernatanty i przenieść 1/10 całkowitej objętości do nowej probówki w celu dalszego przetwarzania. Wysuszyć tę porcję za pomocą koncentratora próżniowego aż do całkowitego wyschnięcia. Pozostały ekstrakt należy przechowywać w temperaturze -80 °C do wykorzystania w przyszłości.

3. Ekstrakcja do fazy stałej (SPE) przy użyciu kolumn wirujących C18

UWAGA: Wszystkie rozpuszczalniki powinny być klasy LC-MS. O ile nie zaznaczono inaczej, etapy wirowania przeprowadza się przy 1 500 × g w temperaturze pokojowej za pomocą wirówki stołowej.

1. Przygotowanie odczynnika
   1. Przygotować roztwór aktywacyjny (A): 50% acetonitrylu/50% 0,1% kwasu mrówkowego w wodzie.
   2. Przygotować roztwór równoważący i przemywać (B): 0,1% kwas mrówkowy w wodzie.
   3. Przygotować roztwór elucyjny (C): 50% acetonitrylu/50% 0,1% kwasu mrówkowego w wodzie.
2. Przygotowanie próbki
   1. Rozpuść wysuszony ekstrakt peptydowy w 200 μl roztworu (B).
   2. Odwirować próbkę o masie 16 000 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
   3. Ostrożnie zebrać supernatant dla SPE.
3. Kondycjonowanie i równoważenie kolumn
   1. Dodać 150 μl roztworu (A) do kolumny wirowej C18.
   2. Wirować przez 1 minutę przy 1 500 × g.
   3. Powtórz kroki 3.3.1 i 3.3.2 dwa razy, aby zapewnić pełną aktywację.
   4. Dodać 150 μl roztworu (B).
   5. Wirować przez 1 min.
   6. Powtórz kroki 3.3.4 i 3.3.5 dwa razy.
4. Ładowanie i mycie próbek
   1. Załadować 200 μl przygotowanego roztworu próbki na kolumnę.
   2. Wirować przez 1 min.
   3. Ponownie załaduj przepływ z powrotem na kolumnę trzy razy, aby zmaksymalizować retencję peptydów.
   4. Dodać 150 μl roztworu (B).
   5. Wirować przez 1 min.
   6. Powtórzyć kroki 3.4.4 i 3.4.5 trzy razy, aby usunąć niezatrzymane zanieczyszczenia.
5. Elucja peptydów
   1. Dodać 150 μl roztworu elucyjnego (C) do kolumny.
   2. Wirować przez 1 min.
   3. Powtórzyć etapy elucji 3.5.1-3.5.2 jeszcze raz.
   4. Połącz oba eluaty i przechowuj na lodzie lub przystąp do suszenia w próżni
   .

4. Analiza LC-MS/MS

1. Przygotować roztwór (A): 0,1% kwas mrówkowy w wodzie, roztworze; (B): 0,1% kwas mrówkowy w roztworze acetonitrylu; (C): 25 fmol/μL wzorcowy czas retencji (iRT) 0,1% kwas mrówkowy w wodzie.
2. Zawiesić próbki w roztworze o stężeniu 20 μl (C) przed wstrzyknięciem LC-MS.
   UWAGA: Przeanalizowano dwie próbki biologiczne, a każdej z nich wstrzyknięto pięć razy zarówno dla serii DDA, jak i DIA, co dało pięć powtórzeń technicznych na metodę na próbkę.
3. Przeprowadzić rozdzielanie peptydów przy użyciu systemu wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC), z ruchomą fazą A składającą się z roztworu (A) i ruchomą fazą B składającą się z roztworu (B).
4. Załadować 1 μl próbek do dwudziestu pięciu kolumn analitycznych C18 (150 μm × 250 mm, cząstki 1,9 μm, wielkość porów 120 A) i utrzymywać w temperaturze 40 °C przez cały cykl.
5. Przeprowadzić separację LC przy natężeniu przepływu 600 nL/min, stosując następujący profil gradientu: 0-5 min: 2-10% B; 5-85 min: 10-45% B; 85-87 min: 45-50% B; a następnie wysokie płukanie organiczne i ponowne zrównoważenie.
   UWAGA: LC był bezpośrednio sprzężony z timsTOF MS za pośrednictwem źródła jonów.
6. Do analizy DDA należy użyć domyślnej metody aplikacji DDA PASEF-standard_1.1sec_cycletime na timsTOF MS.
   1. Krótko mówiąc, uruchom spektrometr mas w trybie PASEF z włączonym wyłączaniem dynamicznym. Ustaw każdy cykl tak, aby składał się z 10 skanów PASEF MS/MS w cyklu pracy 1,1 s.
   2. Ustaw zakres masy na m/z 100-1700, a zakres ruchliwości jonów od 0,60 do 1,60 V·s/cm², używając czasu narastania 100,0 ms. Zwiększ energię zderzenia od 20,0 do 59,0 eV w funkcji ruchliwości jonów.
7. Frakcjonowanie w fazie gazowej ruchliwości jonów (IM-GPF)
   1. Podziel zakres ruchliwości jonów 0,6-1,6 V·s/^cm2 na trzy nakładające się na siebie okna: 0,6-1,0, 0,9-1,3 i 1,2-1,6 V·s/^cm2.
   2. W tym celu należy zmienić wartości początkowe i końcowe mobilności w dotknięciu ustawień TIMS w edytorze timsControl lub timsControl na odpowiednie wartości okna.
   3. Pobieranie danych dla każdego okna. Dla wszystkich okien akwizycji ruchliwości jonów należy stosować stały czas akumulacji i narastania wynoszący 100 ms.
   4. Uzyskaj dane w trybie DDA-PASEF przy użyciu tych samych parametrów, które opisano w kroku 4.6.
8. Do analizy DIA należy zastosować okno izolacyjne o szerokości 25 m/z w całym zakresie mas 400-1200 m/z. Zastosuj te same ustawienia eksperymentalnej ruchliwości jonów (IMEX), które są używane w metodzie DDA.
   1. Dodatkowe ustawienia DIA obejmują jedną rampę MS1, a następnie 16 ramp MS/MS na cykl, co daje łączny czas cyklu 1,8 s.
   2. Użyj domyślnej metody proteomicznej DIA-PASEF jako szablonu do opracowywania metody DIA. Po utworzeniu metody DIA załaduj ją do zakładki metody w Hystar. Nie jest wymagana aktywacja trybu DIA.
      UWAGA: Metoda DIA zostanie automatycznie zarejestrowana po pomyślnym załadowaniu.

5. Przetwarzanie danych

UWAGA: Po pobraniu danych, identyfikacja peptydów powinna być przeprowadzona za pomocą narzędzi bioinformatycznych, takich jak PEAKS Online, PEAKS Studio, MSFragger, Maxquant lub podobnych platform. W tym badaniu wykorzystano Peaks Online, zdolny do pracy z surowymi danymi w formacie .d.

1. Przeszukiwanie bazy danych
   1. Do wyszukiwania peptydów należy użyć odpowiedniej referencyjnej bazy danych, takiej jak wyselekcjonowana baza danych peptydów sygnalizacyjnych dla szczurów, proteom szczura lub proteom ludzki albo wyselekcjonowana baza danych peptydów sygnałowych oparta na źródle próbki.
      UWAGA: Te bazy danych można uzyskać z wiarygodnych źródeł, takich jak NCBI lub UniProt (https://www.uniprot.org/). Należy pamiętać, że tylko białko lub peptydy w bazie danych zostaną zidentyfikowane. Dane sygnału szczura zostały wyselekcjonowane przez filtrowanie proteomu szczura za pomocą adnotacji "Peptyd sygnałowy" w UniProt. W terminologii Uniprot filtrowanie za pomocą "peptydu sygnałowego" oznacza zawężenie proteomu do białek biorących udział w wydzielaniu, lokalizacji błony lub transporcie kompartmentowym. Ta niestandardowa baza danych zawiera 5630 białek. Ograniczenie rozmiaru bazy danych białek z 50 000 do 5 000 ma kilka zalet. Po pierwsze, zwiększa pewność identyfikacji, zmniejszając prawdopodobieństwo losowych dopasowań spektrum peptydów, zwiększając w ten sposób dokładność przypisań peptydów. Po drugie, mniejsza baza danych poprawia wydajność obliczeniową, umożliwiając szybsze przetwarzanie i mniejsze zapotrzebowanie na zasoby obliczeniowe. Po trzecie, bardziej zwięzła baza danych może prowadzić do lepszej kontroli wskaźnika fałszywych odkryć (FDR), co skutkuje bardziej wiarygodną i statystycznie solidną identyfikacją białek. Jednak baza danych musi być stosunkowo duża, aby uniknąć sztucznego zawyżania wskaźników ufności i niedokładnych szacunków FDR.
   2. Skonfiguruj wyszukiwanie w bazie danych w graficznym interfejsie użytkownika programu z następującymi zalecanymi parametrami: tolerancja błędu masy prekursora: 10-25 ppm; tolerancja błędu masy fragmentu: 0,01-0,05 Da; swoistość enzymatyczna: brak (trawienie niespecyficzne); zakres długości peptydów: 4-45 aminokwasów.
   3. Zdefiniuj zestaw PTM, które mają zostać uwzględnione w wyszukiwaniu.
   4. Po zakończeniu przeszukiwania bazy danych należy wyeksportować pliki pepxml i mzXML (lub MGF) odpowiadające każdemu oknu ruchliwości jonów, w tym standardowemu pełnemu zakresowi ruchliwości (0,6-1,6 V·s/cm²).
2. Budowa biblioteki Skyline
   1. Otwórz Skyline i utwórz nowy dokument, upewnij się, że wybrano interfejs Proteomika i użyj ustawień domyślnych, chyba że określono inaczej.
   2. Przejdź do File > Import > Peptide Search.
   3. W Kreatorze wyszukiwania importu peptydów wybierz pozycję Kompiluj i dodaj odpowiednie pliki pepxml (upewnij się, że odpowiednie pliki mzXML lub MGF znajdują się w tym samym katalogu).
   4. Ustaw standardowe peptydy iRT na Automatyczne, wybierz DIA jako przepływ pracy, a następnie kliknij przycisk Dalej.
   5. Po zbudowaniu biblioteki należy wybrać około 10-15 peptydów jako wzorce iRT do wyrównania między powtórzeniami. Jeśli pojawi się monit o ponowną kalibrację iRT, kliknij przycisk OK, aby kontynuować.
   6. Na stronie Extract Chromatograms (Wyodrębnij chromatogramy) kliknij przycisk Browse (Przeglądaj), aby wybrać i zaimportować wszystkie pliki RAW DIA, a następnie kliknij przycisk Kontynuuj.
   7. W oknie Ustawienia przejścia ustaw zakres ładunków prekursora na 1-5, zakres ładunków produktu na 1-3, typy jonów na ,p,y,b i zdefiniuj wybór jonów produktu Od jonu 2 do ostatniego jonu. Inne zalecane ustawienia: tolerancja dopasowania jonowego: 0,05 Da, Piki do wyboru: 5.
   8. W oknie Ustawienia peptydów ustaw modyfikacje, które pasują do ustawienia wyszukiwania Pików opisanego w 4.1.3.
   9. Na stronie Schemat izolacji wprowadź nazwę izolacji i schematu, a następnie wybierz opcję Wstępnie określone okna izolacji. Kliknij pozycję importuj i załaduj jeden z plików DIA, aby automatycznie zaimportować konfigurację okna izolacji eksperymentu.
   10. Ustaw ustawienia akwizycji pełnego skanowania z następującymi parametrami. Metoda pozyskiwania: DIA; Analizator masy produktu: Centroidalny; Schemat izolacji: Użyj schematu zdefiniowanego powyżej; Dokładność masy: 10-20 ppm; Zdolność rozdzielcza mobilności: 30-50; Opcja Włącz Użyj tylko skanów w ciągu 5 minut od przewidywanego RT; Opcjonalnie zmodyfikuj filtrowanie MS1, jeśli wymagane jest importowanie chromatogramów MS1. Wybierz odpowiedni analizator masy i rozdzielczość, aby uzyskać optymalną ekstrakcję chromatogramu MS1.
   11. Importuj FASTA i generuj wabiki. Ustaw metodę generowania przynęty: Sekwencja losowa.
   12. Wybierz enzym: trawienie jest niespecyficzne w analizie endogennych peptydów. Edytuj enzym, wybierając pozycję dodaj z rozwijanego menu enzymu. Ustaw nazwę enzymu, wpisz oba, rozszczep c-koniec na KR i rozszczep N-koniec na KR, zezwól na półpodział i kliknij OK. Ustaw nietrafione dekolty na 3.
   13. Zaimportuj docelowy plik FASTA, a następnie kliknij przycisk Zakończ. Potwierdź stronę Powiązane białka, jeśli zostanie wyświetlony monit.
   14. Upewnij się, że biblioteka spektralna została pomyślnie utworzona i że dane DIA zostały zaimportowane. Ręcznie sprawdź listę zidentyfikowanych peptydów i przystąp do dalszej analizy ilościowej i jakościowej.
3. Pomiary jakościowe i ilościowe
   UWAGA: Analizy jakościowe i ilościowe wykonywane są w Skyline. Szczegółowe informacje na temat analizy danych DIA w Skyline można znaleźć na stronie https://skyline.ms/wiki/home/software/Skyline/page.view?name=tutorial_dia_swath.
   1. Jeśli załadowane są dane atrybucji, wybierz z menu Ustawienia > Ustawienia przejścia, wybierz DDA w Metoda pozyskiwania; w Ustawienia > Ustawienia peptydu wybierz poziom MS 1 do kwantyfikacji.
   2. Jeśli załadowane są dane DIA, Ustawienia > Ustawienia przejścia, wybierz DIA w Metoda akwizycji; w Ustawieniach > Ustawienia peptydów wybierz poziom MS 2 do kwantyfikacji.
   3. W polu View > Document Grid (Widok siatki dokumentu) wybierz opcję Peptide Quantification (Kwant Peptide), a następnie pozycję Eksportuj arkusz kalkulacyjny. Połącz arkusze kalkulacyjne z wyników atrybucji opartej na danych i wyników DIA.
      UWAGA: Arkusz kalkulacyjny podsumowuje obszary pików dla wszystkich peptydów w bibliotece we wszystkich próbkach. W tym eksperymencie obszary pików peptydowych zostały znormalizowane do standardowego peptydu czasu retencji GISNEGQNASIK, który jest częścią mieszaniny czasu retencji Pierce'a. Normalizację przeprowadzono poprzez obliczenie stosunku powierzchni piku każdego peptydu do powierzchni wzorca.

Results

Reprezentatywny schemat eksperymentalny jest pokazany w Rysunek 1. Analiza danych DDA-PASEF (Rysunek 2) uzyskanych przy użyciu zarówno standardowego zakresu ruchliwości jonów, jak i IM-GPF, ujawniła znacznie wyższe pokrycie peptydami dla podejścia IM-GPF (Rysunek 2B). Warto zauważyć, że większość peptydów zidentyfikowanych za pomocą standardowej metody DDA-PASEF pokrywała się z peptydami znalezionymi w zbiorze danych IM-GPF. Aby zmaksymalizować zakres identyfikacji peptydów, stworzono obszerną bibliotekę spektralną, integrując identyfikacje z obu podejść.

Dalsza analiza bazy danych replik uzyskanych za pomocą DDA- i DIA-PASEF (Rysunek 3), przy użyciu wyselekcjonowanej bazy danych peptydów sygnalizacyjnych dla szczurów, ujawniła 217 białek wspólnych dla obu metod. Ponadto 115 białek zostało jednoznacznie zidentyfikowanych przez DIA-PASEF, podczas gdy 69 było wyłącznie dla DDA-PASEF. Analizy eksploracyjne z wykorzystaniem bibliotek spektralnych pochodzących z danych DDA i IM-GPF wykazały, że DIA-PASEF umożliwił pewne wykrycie neuropeptydów, takich jak NPAFLFQPQRF (neuropeptyd SF) i YGGFMRRVGRPEWWMDYQ (pochodzący z proenkefaliny). Te neuropeptydy nie zostały wiarygodnie wykryte w odpowiednich zestawach danych DDA-PASEF z powodu słabego przypisania pików (Rysunek 3B, C).

Z ilościowego punktu widzenia, wykres punktowy w Rysunek 4A ujawnia umiarkowaną dodatnią korelację między intensywnością prekursora DDA a intensywnością jonów fragmentacyjnych DIA, zgodnie z oczekiwaniami, biorąc pod uwagę, że oba podejścia kwantyfikują te same peptydy, ale wychwytują różne typy jonów. Wykresy pudełkowe dla wybranych peptydów pokazane na Rysunek 4B dodatkowo ilustrują odtwarzalność pomiarów ilościowych uzyskanych za pomocą obu podejść. Wykresy pudełkowe pokazują względne obszary pików dla każdego peptydu mierzonego za pomocą DIA i DDA, ze słupkami błędów reprezentującymi zmienność pomiaru w powtórzeniach technicznych. Wybrane peptydy pochodzą z prohormonów opioidowych, w tym proenkefaliny (PENK) i prodynorfiny (PDYN), które odgrywają kluczową rolę w modulowaniu bólu i przeciwbólu.

Rysunek 1: Przegląd procesu peptydomicznego do identyfikacji i kwantyfikacji endogennych peptydów z tkanki mózgowej szczura. Przepływ pracy obejmuje sekcję tkanek, ekstrakcję i oczyszczanie peptydów, akwizycję danych LC-ion mobility-MS (LC-IM-MS) przy użyciu frakcjonowania w fazie gazowej (IM-GPF) oraz przetwarzanie danych w celu wygenerowania bibliotek spektralnych i przeprowadzenia analizy ilościowej. Fragmenty figury zostały stworzone w BioRender. Tan, Y. (2025) https://BioRender.com/vrejrsk. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Identyfikacja peptydów i białek w bazie danych. (A) Wykres słupkowy porównujący całkowitą liczbę prekursorów, dopasowań widma peptydów (PSM) i unikalnych peptydów zidentyfikowanych w różnych oknach ruchliwości jonów. (B) Wykres kołowy przedstawiający odsetek peptydów powszechnie identyfikowanych we wszystkich oknach mobilności oraz peptydów wykrywanych jednoznacznie w poszczególnych oknach. (C,D) Mapy cieplne przedstawiające rozkład sygnałów jonów w wymiarach m/z i ruchliwości jonów dla pełnego zakresu mobilności (0,6-1,6 V·s/cm²) (C) i okna ograniczonej mobilności (0,6-1,0 V·s/cm²) (D). (E) Wykres niespodzianki przedstawiający liczbę białek zidentyfikowanych w zestawach danych uzyskanych przy użyciu metod DDA i DIA, z podkreśleniem wspólnych i unikalnych identyfikacji białek. (F) Mapa cieplna przedstawiająca peptydy pochodzące z prekursora proenkefaliny zidentyfikowanego w kontrpróbach nabytych przez DIA (górny panel) i kontrpróbach nabytych przez DDA (dolny panel). Leu-enkefaliny nie wykryto w dwóch z czterech powtórzeń DDA, co wskazuje na potencjalne brakujące wartości w akwizycji opartej na DDA. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Analiza porównawcza i eksploracyjna danych DDA-PASEF i DIA-PASEF przy użyciu bibliotek spektralnych. (A) Wyrównanie czasu retencji neuropeptydu SF w replikacjach DIA i DDA-PASEF. (B) EIC PENK (212-229) fragmentuje jony ze zbiorów danych DIA (na górze) i DDA (na dole). (C) Chromatogramy jonów fragmentacyjnych neuropeptydu SF z kontrprób DIA wykazujące wysoką jakość koelucji i spektralną. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Porównanie pomiarów ilościowych pomiędzy DIA-PASEF (poziom MS2) i DDA-PASEF (poziom MS1). (A) Ten wykres punktowy porównuje intensywności sygnału peptydowego uzyskane przy użyciu trybów DIA i DDA. W szczególności oś x reprezentuje obszar piku prekursora przekształcony logarytmicznie₁₀ z DDA, podczas gdy oś y pokazuje obszar piku fragmentu przekształconego logarytmicznie₁₀ z DIA dla każdego peptydu. (B) Wykresy pudełkowe reprezentują względne powierzchnie pików czterech reprezentatywnych peptydów: PENK 107-133, PENK 188-195, PDYN 221-233 i PDYN 235-248. Słupki błędów reprezentują zmienność między powtórzeniami technicznymi. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Discussion

W peptydomikach, szczególnie podczas analizy peptydów endogennych, zachowanie natywnego profilu peptydowego ma zasadnicze znaczenie dla integralności danych i interpretacji biologicznej. Perfuzja zimnej soli fizjologicznej nie tylko usuwa krew, ale także chłodzi mózg, co znacznie zmniejsza pośmiertną degradację proteolityczną zachodzącą szybko w wyniku aktywności endogennych proteaz. Obniżając temperaturę mózgu, aktywność enzymatyczna zostaje spowolniona, a krążące proteazy są wypłukiwane z naczyń krwionośnych, jednocześnie zmniejszając pośmiertne zmiany metaboliczne^25,26. Perfuzja lodowatą solą fizjologiczną wypłukuje również krew z układu naczyniowego mózgu. Ten etap jest szczególnie ważny, ponieważ krew zawiera białka o dużej obfitości (takie jak albuminy i globuliny) oraz krążące proteazy, które mogą zakłócać wykrywanie neuropeptydów. Pośmiertna degradacja obfitych białek krwi może zwiększyć złożoność ekstraktów neuropeptydowych i maskować sygnały o niskiej obfitości, ostatecznie zagrażając zarówno identyfikacji, jak i kwantyfikacji 25,26,27. Natychmiastowe zamrożenie tkanki mózgowej, czy to na suchym lodzie, czy poprzez błyskawiczne zamrożenie w schłodzonym izopentanie, niemal natychmiast zatrzymuje procesy enzymatyczne. Zachowanie to jest szczególnie ważne dla wykrywania dojrzałych neuropeptydów o niskiej liczebności i pełnej długości oraz zapewnienia wiarygodnej oceny ilościowej. Bez tych etapów degradacja peptydów może prowadzić do zwiększonej zmienności i artefaktów, które utrudniają zarówno identyfikację, jak i kwantyfikację. Tak więc usuwanie krwi, zimna perfuzja i szybkie schładzanie mózgu są podstawowymi technikami, które bezpośrednio wpływają na jakość, czułość i odtwarzalność danych peptydomicznych przed pomiarami.

Analiza peptydów wyekstrahowanych z mózgu szczura ujawniła obecność dwóch odrębnych pióropuszy ruchliwości jonów (ryc. 2C,D). Zjawisko to można przypisać różnym klasom molekularnym lub różnym stanom naładowania peptydów. Jeśli pióropusze odpowiadają odrębnym klasom molekularnym, koeluujące gatunki niepeptydowe mogą konkurować z peptydami o selekcję i fragmentację. Ponadto, jeśli separacja wynika z różnic w stanach naładowania, oczekuje się, że pióropusz zawierający wysoce naładowane peptydy zapewni widma MS / MS o wyższej jakości, ułatwiając bardziej pewną identyfikację peptydów.

Aby to zbadać, wdrożyliśmy strategię frakcjonowania ruchliwości jonów, pozyskując dane w trzech dyskretnych oknach mobilności: 0,6-1,0, 0,9-1,3 i 1,2-1,6 V·s/cm². Okna te łącznie obejmują pełny zakres ruchliwości jonów, zwykle analizowany w standardowych eksperymentach DDA-PASEF dla peptydów. Jak pokazano na rysunku 2, chociaż całkowita liczba wykrytych prekursorów była najwyższa w pełnym zakresie skanowania (0,6-1,6 V·s/cm²), w oknie 0,6-1,0 V·s/cm² zaobserwowano znacznie większą liczbę dopasowań widma peptydów (PSM). Odkrycie to sugeruje, że obecność dwóch pióropuszy może być rzeczywiście spowodowana interferencją ze strony innych cząsteczek.

Frakcjonowanie prekursorów oparte na ruchliwości jonów spowodowało 30% wzrost pokrycia peptydów w porównaniu z konwencjonalną metodą pełnego skanowania. Około 82% peptydów zidentyfikowanych w zbiorze danych pełnego skanowania pokrywało się z peptydami zidentyfikowanymi za pomocą frakcjonowania (ryc. 2B), co podkreśla spójność i solidność strategii frakcjonowania. Opierając się na tych obserwacjach, zastosowaliśmy frakcjonowanie ruchliwości jonów i dane z pełnego skanowania do skonstruowania bibliotek spektralnych do analizy ilościowej peptydów neuroendokrynnych przy użyciu DIA-PASEF.

Analiza bazy danych replikowanych zestawów danych uzyskanych za pośrednictwem DDA i DIA ujawniła większą liczbę identyfikacji peptydów i białek w danych DIA, w tym 115 białek jednoznacznie zidentyfikowanych przez DIA (Figura 2E). Obejmowały one neuropeptydy, takie jak peptydy związane z pro-FMRFamidem FF i VF. Natomiast 69 białek zostało zidentyfikowanych wyłącznie przez DDA, z których wiele jest związanych z adhezją komórek i rozwojem neuronów. Wyniki te sugerują, że metodologie DDA i DIA mogą być stosowane w sposób komplementarny w celu uzyskania szerszego pokrycia peptydów.

Dalsza analiza wykazała, że akwizycja DIA skutecznie rozwiązuje niektóre problemy z brakującą wartością, często spotykane w analizie peptydów endogennych z wykorzystaniem DDA. Na przykład Leu-enkefalinę wykryto tylko w dwóch z czterech powtórzeń DDA (Figura 2F, dolny panel), podczas gdy konsekwentnie zidentyfikowano ją we wszystkich czterech powtórzeniach DIA (Figura 3F, górny panel).

Skyline, platforma szeroko stosowana w proteomice ilościowej, została wykorzystana do analizy zarówno zestawów danych DDA, jak i DIA-PASEF²⁸. Oprogramowanie ułatwia identyfikację peptydów poprzez dopasowanie biblioteki spektralnej, koelucję jonów fragmentowych i wyrównanie czasu retencji. Aby ocenić zdolność DIA-PASEF do zmniejszenia brakującej identyfikacji, przeprowadziliśmy jakościową ocenę peptydów wykrytych wyłącznie w zestawie danych DIA.

Jak pokazano na rysunku 3D, neuropeptyd SF był konsekwentnie wykrywany we wszystkich powtórzeniach DIA w tym samym oknie czasu retencji. Wykrywanie w powtórzeniach DDA wykazywało znaczną zmienność, z czasami retencji wahającymi się od 25 min do 45 min (ryc. 3A). Zaobserwowane niespójności, w tym błędne przypisania pików z niskimi wynikami ufności, były prawdopodobnie spowodowane ograniczonym lub niskiej jakości pokryciem jonów fragmentacyjnych, jak pokazano na rysunku 3B. Z kolei rysunek 3C pokazuje, że jony fragmentacyjne odpowiadające neuropeptydowi SF były dobrze wyrównane we wszystkich powtórzeniach DIA, co wspiera pewną automatyczną identyfikację.

Porównanie jakości spektralnej MS/MS dla peptydu PENK (212-229) pochodzącego z proenkefaliny wykazało dalsze zalety DIA-PASEF. Widma uzyskane z DIA wykazywały wyższą intensywność i lepszą jakość jonów fragmentacyjnych w porównaniu z DDA (ryc. 3), co jest szczególnie korzystne w wykrywaniu endogennych peptydów o niskiej obfitości.

Analiza ilościowa potwierdziła, że w ramach projektu DIA-PASEF uzyskano spójne i powtarzalne pomiary we wszystkich kontrpróbach biologicznych, z wydajnością porównywalną z DDA (ryc. 4). Co więcej, projekt DIA umożliwił kwantyfikację na poziomie MS2, oferując swoistość na poziomie jonów fragmentów i zwiększając pewność identyfikacji peptydów w porównaniu z DDA opartym na MS1. Wyniki te przemawiają za zastosowaniem DIA-PASEF jako wiarygodnego i skutecznego podejścia do celowanej kwantyfikacji neuropeptydów w złożonych matrycach biologicznych, szczególnie gdy kompletność danych i odtwarzalność mają kluczowe znaczenie.

Protokół ten nakreśla kompleksową strategię analizy neuropeptydowej i kwantyfikacji. Podejście IM-GPF ułatwia budowę wysokiej jakości bibliotek spektralnych. Podczas gdy DIA-PASEF oferuje lepszą odtwarzalność i zwiększone pokrycie peptydami w porównaniu z DDA-PASEF, poprawia również kwantyfikację opartą na MS2. Połączenie obu strategii akwizycji zwiększa ogólne pokrycie peptydami, ponieważ każda metoda w unikalny sposób przyczynia się do identyfikacji odrębnych peptydów (ryc. 2E). Ograniczeniem tego protokołu jest wymóg posiadania dużej ilości materiału próbki, który obsługuje zarówno generowanie biblioteki spektralnej, jak i pozyskiwanie danych za pomocą metod DDA i DIA-PASEF.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,1% Kwas mrówkowy	Woda Fisher Scientific	LS118-500	Kwas octowy klasy LC/MS
	Fisher Naukowy	A11350	Acetonitryl klasy LC/MS
	Fisher Scientific	Kwas	klasy AA47138K7 LC/MS
	Fisher Scientific	PI28905	klasy LC/MS
	Fisher Scientific	AA47192K7	Kolumny
nanoELute2	Bruker	N/A
Pierce C18	Fisher Scientific
Mieszanina kalibracyjna czasu retencji peptydów	Pierce Koncentrator próżniowy Thermo Fisher	A11351	LC/MS klasy
SpeedVac	Genevac	https://scientificproducts.com/product_cat/benchtop-solvent-evaporators/	Konkretny model używany w tym badaniu nie jest już dostępny u producenta. Link do aktualnego modelu równoważnego znajduje się dla referencyjnego
timsTOF Pro2	Bruker	https://www.bruker.com/en/products-and-solutions/mass-spectrometry/timstof/timstof-pro-2.html
Water	Fisher Scientific	AA47146M6	Klasa LC/MS