Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Przygotowanie rozprzestrzeniania chromosomów mejotycznych z oocytów myszy do oceny synapsy i rekombinacji

2.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/68749

⸱

18 lipca 2025

1Department of Biomedical Sciences, Cornell University, 2Cornell Reproductive Sciences Center, Cornell University

W tym artykule

Podsumowanie

figure-summary-1
Rysunek 1: Ramy end-to-end. Rysunek ilustruje kompleksowe ramy wiedzy multimodalnej Graf VISHAM-KG. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Streszczenie

Trzy kluczowe i współzależne procesy definiują profazę mejotyczną I: chromosomy homologiczne muszą się ze sobą sparować, białkowa struktura zwana kompleksem synaptonemalnym tworzy się, aby łączyć homologi (synapsis), a homologi przechodzą rekombinację, wzajemnie wymieniając materiał genetyczny w celu powstania krzyżowań (CO). Błędy w tych procesach mogą prowadzić do przedwczesnej niewydolności jajnika, aneuploidii, a ostatecznie do utraty ciąży i niepłodności. Rekombinacja meiotyczna jest szczególnie podatna na błędy w oocytach, gdzie ponad 7% ludzkich oocytów zawiera co najmniej jedną parę chromosomów bez krzyżowania, a od 20%-80% komórek jajowych do 2,5%-7% plemników to aneuploidy. Jednak nadal nie jest jasne, dlaczego błędy chromosomalne wykazują tak uderzające różnice płciowe. Niniejszy protokół opisuje metody przygotowania i analizy rozprzestrzeniania się chromosomów oocytu profazy I i metafazy I odpowiednio u myszy płodowych i młodocianych. Aby śledzić krytyczną dynamikę chromosomów w całej profazie meiotycznej I, protokół ten wykorzystuje barwienie immunofluorescencyjne typowych markerów dla rekombinacji mejotycznej (RAD51 dla przerw podwójnych nici, MSH4 dla pośrednich CO oraz MLH1/MLH3 do identyfikacji większości CO) i synapsy (SYCP3 dla osi chromosomów, SYCP1 dla obszarów synapsycznych oraz HORMAD1 dla obszarów asynaptycznych). Ponadto protokół ten wykorzystuje dojrzewanie in vitro pobranych oocytów do oceny liczby parowanych chromosomów (biwalentów) oraz całkowitej liczby krzyżowań (chiasmata) w metafazie I. Razem te techniki stanowią kompleksowe i ilościowe ramy do badania mechanizmów regulujących wczesną dynamikę chromosomów u mejozy żeńskiej.

Wprowadzenie

Mejoza to wyspecjalizowany podział komórkowy niezbędny do produkcji haploidalnych gamet. Podczas profazy I chromosomy homologiczne (każdy składający się z siostrzanych chromatyd połączonych przez kohezynę) muszą wykonywać trzy kluczowe zadania: 1) rozpoznać i sparować się nawzajem, 2) łączyć się poprzez utworzenie kompleksu synaptonemalnego (SC) między ich osiami bocznymi oraz 3) wymieniać DNA poprzez homologiczną rekombinację, co skutkuje krzyżowaniem (CO) między niesiostrzanymi chromatydami 1,2. Fizyczne połączenie wynikające z powstania crossovera, utrzymywane przez kohezynę, zapewnia prawidłową orientację i segregację chromosomów podczas metafazy I 3,4,5.

Profaza meiotyczna I składa się z pięciu etapów, z których każdy definiuje status synapsy6. W leptonemacie (greckie słowo na cienką nici) chromosomy kondensują się, gdy element osiowy (oznaczony SYCP3) formuje się wzdłuż osi chromosomów. Podczas zygonemy (połączonych nici) homologi zaczynają synaptyczne, gdy element poprzeczny SC (SYCP1) tworzy się między osiami7. W pachynemacie (grubej nici) chromosomy są synapsowane na całej swojej długości. SC następnie rozpada się podczas diplonemy (dwa wątki), pozostawiając homologi połączone tylko w miejscach przejścia (chiasmata). Chiasmaty są produktem homolognej rekombinacji, procesu zapoczątkowanego przez zaprogramowaną indukcję podwójnych przerw DNA (DSB). Spośród setek DSB tylko ~10% zostaje CO (CO). U myszy większość (90%-95%) tworzy się przez szlak CO klasy I ułatwiony przez MutLγ (MLH1-MLH3), a pozostałe CO powstają przez MUS81-EME1 przez szlak CO klasy II 8,9,10,11.

Parowanie, synapsa i rekombinacja to procesy ściśle regulowane i współzależne. Błędy zazwyczaj uruchamiają mechanizmy punktów kontrolnych, prowadząc do śmierci komórki. U kobiet utrata komórek rozrodczych spowodowana wczesnymi błędami profazy I może powodować przedwczesną niewydolność jajnika12,13, natomiast późne błędy (np. homologi nie tworzące CO, nieprawidłowe umiejscowienie COs lub przedwczesna utrata kohezyny) mogą prowadzić do błędnej segregacji chromosomów i aneuploidii. U ludzi błędy mejotyczne są główną przyczyną utraty ciąży i niepłodności. Samica mejoza jest szczególnie podatna na błędy. Około 20%-80% ludzkich komórek jajowych (w porównaniu do 2,5%-7% plemników) ma nieprawidłowe liczby chromosomów, z których większość wynika z błędów w pierwszym podziale meiotycznym 14,15,16,17. Chociaż wiek został uznany za największą przyczynę aneuploidii u matki, powód, dla którego oocyty są tak podatne na błędy, pozostaje niejasny.

Pomimo znaczenia zrozumienia czynników leżących u podstaw wysokich błędów w oocytach, większość naszej wiedzy na temat regulacji zdarzeń profazy I pochodzi z badań nad męską mejozą. Ponieważ niewielki fragment dorosłego materiału jądrowego dostarcza wystarczającej ilości materiału do oceny wszystkich stadiów komórek rozrodczych mejotów i postmejotycznych, mejoza męska od dawna jest łatwiej dostępna dla badaczy. Natomiast mejoza żeńska występuje w sposób nieciągły. U myszy profaza I postępuje półsynchronicznie w jajniku płodu, zaczynając około 14 dni po stosunku (DPC; Rysunek 1A), krótko po określeniu płci gonadalnej18, 19, 20. Około czasu narodzin oocyty wchodzą w zatrzymanie dyktyatu aż do owulacji po miesiącach (u myszy) lub dekadach (u ludzi)21, 22, 23 roku. W związku z tym specyficzne stadia profazy I są dostępne tylko w ograniczonych oknach rozwojowych (rysunek 1A), przy czym zdarzenia po profazie I występują tylko w kilku oocytach jednocześnie u młodocianych i dorosłych. Chociaż postęp techniczny poprawił badania nad mejozą jajek ssaków, metody te pozostają wymagające i czasochłonne w porównaniu z porównywalnymi metodami stosowanymi w badaniach mężczyzn.

Analiza mejotyczna żeńska jest dodatkowo skomplikowana przez ograniczenia w podetapowaniu oocytów pachytenowych – co jest kluczowe dla badania oznaczania i dojrzewania crossoverów. Badania u mężczyzn korzystają z dobrze scharakteryzowanej dynamiki parowania chromosomów płciowych oraz obecności wariantu histonowego, H1t, który służy jako markery dla wczesnej, średniej i późnej pachynema, 24,25,26. Jednak nie sformalizowano wiarygodnej metody subsetapowania oocytów pachytenowych w stadium.

Przedstawione protokoły ułatwiają kompleksową analizę synapsy i rekombinacji w jajkach myszy od wczesnej profazy I do metafazy I. Praca ta opiera się na klasycznych technikach rozprzestrzeniania chromosomów opracowanych przez Petersa i in.27 i Tarkowskiego28 oraz wcześniejszych udoskonaleniach tych metod przez Hunta29 oraz Suna i Cohena30. Protokół ten został opracowany, aby podkreślić: 1) wzbogacenie i identyfikację konkretnych podetapów profazy I, 2) maksymalizację liczby zastosowań na parę jajników płodu oraz 3) dokładne, dostępne metryki oceny defektów synaptycznych i rekombinacji od ognisk do skrzyżów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury i obsługa zwierząt zostały wykonane po zatwierdzeniu przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Cornella (IACUC) zgodnie z protokołem 2004-0063.

1. Przygotowanie preparatu rozprzestrzeniającego się na chromosomie profazy I oocytu

  1. Późnym popołudniem zorganizuj synchronizowane gody samic myszy C57BL/6J (2–6 miesięcy) z samcami (2–12 miesięcy). Od następnego dnia codziennie rano (przed 9:00) sprawdzaj samice pod kątem zatyczki kopulacyjnej. Południe w dniu włączenia jest definiowane jako 0,5 dpc.
  2. Przygotuj następujące informacje przed poświęceniem ciężarnych myszy.
    1. Zorganizuj komorę nawilżoną z temperaturą pokojową H2O.
    2. Przygotuj 10 mL buforu ekstrakcji hipotonicznej (HEB; patrz Tabela 1) składającego się z 30 mM Tris-HCl, 50 mM sacharozy, 17 mM cytrynianu sodu, 5 mM EDTA, 2,5 mM DTT oraz 0,5 mM PMSF w wodzie Milli-Q. Przed dodaniem DTT i PMSF należy dostosować pH do 8,2 - 8,4 za pomocą 50 mM kwasu borowego. Zrób HEB świeżo i użyj w ciągu 2 godzin od dodania DTT.
    3. Przygotuj 100 mM sacharozy, dodając 342 mg sacharozy do 10 ml ultraczystego H2O. Przechowuj w 4 °C, gdy nie jest używana.
    4. Podgrzej ultraczyste H2O w standardowej mikrofalówce przez 1 minutę (do 90–95 °C). Pod okap do spalin dodaj podgrzane ultraczyste H2O do 0,5 g paradehydu (PFA). Dodaj dwie krople 1 N NaOH, wymieszaj i pozwól ostygnąć do temperatury pokojowej. Reguluj pH do 9,2 - 9,3 za pomocą 50 mM kwasu borowego i dodaj Triton X-100 do 0,15% (v/v). Dodaj ultraczyste H2Odo końcowej objętości 50 mL (1% roztwór utrwalacza PFA) i wlej utrwalacz do szklanego słoika Coplin o pojemności 50 mL
      UWAGA: Protokół ten został zoptymalizowany przy użyciu wody niemal wrzącej do przygotowania PFA; jednak podgrzewanie PFA w roztworze powyżej 65 °C może powodować degradację i uwalnianie toksycznych oparów. Alternatywnie, podgrzej ultraczyste H2O do 60 °C w kąpieli wodnej.
    5. Czyste szkiełka mikroskopowe z 70% etanolu. Użyj hydrofobowego barierowego długopisu PAP, aby narysować do trzech kwadratów (około 20 x 20 mm; patrz rysunek 1E). Pojedyncza para jajników zapewni wystarczającą ilość materiału na sześć kwadratów (lub dwa preparaty po 3 kwadraty każdy).
  3. Ofiarowanie ciężarnych myszy 14,5 - 18,5 dpc przez uduszenieCO2 i zwichnięcie szyjki macicy zgodnie z wytycznymi IACUC.
    1. Punkty czasowe wzbogacenia określonych etapów profazy I u myszy C57BL/6J przedstawiono na Rysunku 1A. Dla podanych punktów czasowych rozwoju przybliżony procent oocytów w każdym stadium profazy I został podany na podstawie danych z Evans i in. (1982)31. Dla jajów zygotenowych pobierać na 16,5 dpc; wczesny pachyten na 17,5 DPC; oraz średni pachyten - diploten w stężeniu 18,5 DPC.
  4. Użyj nożyczek do sekcji, aby otworzyć jamę brzuszną i usunąć rogi macicy.
  5. Rozdzielić myszy płodowe od rogu macicy, tkanki dziesięcialnej i worka żółtkowego. Umieść myszy płodowe w szalce Petriego o średnicy 100 mm z 1x fosforanową solą fizjologiczną (PBS).
  6. Rozcinaj jajniki jednego płodu żeńskiego na raz, zachowując pozostałe w 1x PBS. Ofiara myszy płodowych przez dekapitację zgodnie z wytycznymi IACUC. Za pomocą stalowych szpilek do próbek przymocuj brzuszną powierzchnię tułowia do krzemowej podkładki w misce do sekcji.
  7. Użyj nożyczek do mikrosekcji, aby zrobić nacięcie tuż poniżej pępka, uważając, by nie przeciąć tętnic. Użyj cienkich kleszczy, aby przesunąć jelito, aż rogi macicy płodu będą widoczne.
  8. Aby zlokalizować jajniki, podążaj za każdym rogiem macicy na zewnątrz od pęcherza w kierunku nerek. Jajnik i jajowód pojawiają się jako małe kule na końcach rogów macicy, położone tuż poniżej nerki i blisko tylnej części jamy otrzewnej (Rysunek 1B).
  9. Użyj cienkich kleszczy, aby ściskać jajniki i zbierać je w małym szkle zegarkowym wypełnionym 750 μL 1x PBS.
  10. Rozdziel jajnik od otaczających tkanek i umieść oba jajniki w szklance zegarkowej zawierającej 750 μL HEB, dbając o całkowite zanurzenie jajników (patrz Rysunki 1C i 1D). Inkubuj jajniki przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
  11. Pipeta 35 μL 100 mM sacharozy na wklęsłą szkiełkę. Użyj cienkich kleszczy, aby przenieść oba jajniki z HEB do sacharozy.
  12. Użyj igły 25G, aby przymocować jajnik do szkiełka, a drugą igłą, fazowaną w dół, wycisnąć jajniki z jajnika.
    1. Gdy jajnik stanie się przezroczysty i galaretowaty, usuń jajnik z HEB i powtórz ten proces z drugim jajnikiem. Delikatnie podaj roztwór pipetą, aby rozproszyć komórki.
  13. Zanurz szkiełko w słoiku Coplin z PFA i krótko osusz krawędź szkiełka o ręcznik papierowy. Po zebraniu PFA w małe krople wzdłuż hydrofobowej granicy każdego kwadratu (Rysunek 1E), pipetuj 5 μL roztworu oocytu i sacharozy do każdej kropli PFA.
  14. Rozłóż oocyty na kwadratowych częściach, delikatnie przechylając szkiełka tam i z powrotem. Uważaj, aby rozwiązanie z jednego pola nie rozlało się na sąsiednie kwadraty.
  15. Umieść szkiełko w wilgotnej komorze i kontynuuj tworzenie preparatów, aż roztwór jajkowo-sacharozowy się wyczerpie.
  16. Powtarzaj kroki 1,6 - 1,15, aż wszystkie płody żeńskie zostaną użyte. Inkubuj w wilgotnej komorze w temperaturze pokojowej przez 2 godziny.
  17. Po inkubacji otwórz wilgotną komorę. Ponieważ większość (jeśli nie wszystkie) cieczy/utrwalacza powinna nadal znajdować się na powierzchni szkiełka (około 10 μL w każdym sekcji kwadratowej), delikatnie przełóż szkiełka na ręcznik papierowy i pozwól im całkowicie wyschnąć na powietrzu w temperaturze pokojowej na stole laboratoryjnym (proces ten zwykle trwa 30–60 minut, w zależności od lokalnej wilgotności).
    UWAGA: Preparaty można również suszyć na powietrzu pod okapem wyparowym, aby ograniczyć potencjalne narażenie na pozostałości oparów PFA. To skróci też czas schnięcia do około 20-30 minut.
  18. Wash wsuwa 0,4% środek zwilżający w ultraczystym H2Oprzez 2 minuty. Pozwól zjeżdżalniom całkowicie wyschnąć.
    UWAGA: W tym momencie preparaty mogą być przechowywane w temperaturze -80 °C; jednak niektóre epitopy są niestabilne (np. z naszego doświadczenia wynika, że MLH1 słabo barwi, a barwienie SYCP3 ma znaczące artefakty po zamrożeniu). Zdecydowanie zaleca się natychmiastowe immunobarwienie preparatów.

2. Barwienie immunofluorescencyjne rozprzestrzeniania się chromosomu profazy I

  1. Przygotuj 10x bufor rozcieńczający przeciwciała (ADB; patrz Tabela 2) zawierający 10% (v/v) prawidłowego surowicy koziej, 3% (w/v) albuminy surowicy bydłej (BSA) oraz 0,05% Triton X-100 w 1x PBS. Filtruj filtr za pomocą filtra 0,45 μm i przechowywaj w temperaturze 4 °C do 2 tygodni.
  2. Wash w słoiku Coplin z 0,4% środkiem zwilżającym w 1x PBS przez 10 minut. Wash slide w słoiku Coplin o stężeniu 0,1% Triton X-100 w 1x PBS przez 10 minut. Blokowe preparaty w słoiku Coplin z 1x ADB przez 10 minut.
  3. Rozcieńcz wybrane przeciwciała pierwotne w 10x ADB (zobacz Tabelę Materiałów dla listy przeciwciał i ich rozcieńczeń).
    1. Przygotuj cztery kombinacje przeciwciał do immunobarwienia multiplexowego: (1) SYCP332, 33, SYCP133, HORMAD133; (2) SYCP332,33, RAD5132,33, MLH332; (3) SYCP3 32, 333, MSH432, MLH332; oraz (4) SYCP334, MLH132, 33, 34, CREST35.
  4. Usuń szkiełki z ADB, usuń nadmiar płynu i umieść szkiełki w nawilżonej komorze z wodą o temperaturze pokojowej. Należy nałożyć 30 μL rozcieńczonych przeciwciał na przekrój kwadratowy każdego preparatu, uważając, aby przeciwciała z jednego kwadratu nie przelały się do sąsiednich kwadratów.
  5. Zamknij komorę nawilżoną i pozwól szkiełkom inkubować się przez noc w temperaturze pokojowej.
  6. Następnego ranka otwórz wilgotną komorę i usuń rozcieńczone przeciwciała ze szkiełek. Powtórz krok 2.2.
  7. Rozcieńcz wybrane przeciwciała wtórne w 10x ADB (patrz Tabela materiałów).
    UWAGA: Od tego momentu preparaty i przeciwciała są fotoczułe. Wykonaj wszystkie kolejne inkubacje w ciemności.
  8. Usuń preparaty z ADB, wysusz nadmiar płynu i umieść je w nawilżonej komorze z wodą w temperaturze pokojowej. Nakładaj 30 μL wybranych rozcieńczonych przeciwciał na przekrój kwadratowy każdego preparatu, uważając, aby przeciwciała z jednego kwadratu nie przelały się do sąsiednich kwadratów.
  9. Zamknij komorę nawilżoną i pozwól szkiełkom inkubować się przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.
  10. Płucz szkiełki 3 razy po 5 minut w słoikach Coplin z 0,4% środkiem zwilżającym w 1x PBS. Płucz szkiełki przez 5 minut w słoiku Coplin z 0,4% środkiem zwilżającym w ultraczystej H2O.
  11. Nałóż niewielką kroplę (około 10 μL) nośnika antyfade z barwnikiem 4', 6-diamidino-2-fenylindolem (DAPI) lub równoważnym kwasem nukleinowym. Na każdym szkiecie załóż szklaną pokrywkę o wymiarach 60 mm x 24 mm nr 1,5 i ostrożnie wytłucz nadmiar płynu.
    UWAGA: Slajdy mogą być uszczelniane przezroczystym lakierem do paznokci lub gumowym klejem. Jeśli używasz montantu do utwardzania, uszczelnianie szkieł nie jest konieczne. Slajdy powinny być przechowywane w pudełku lub teczce na slajdy w temperaturze 4 °C. Chociaż najlepszą praktyką jest fotografowanie preparatów krótko po barwieniu, z naszego doświadczenia wynika, że preparaty przechowywane w ciemności w temperaturze 4 °C mogą zachowywać intensywność sygnału przez kilka miesięcy do roku. Do dłuższego przechowywania preparaty mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C przez kilka lat bez znaczącej utraty jakości sygnału.
  12. Komórki obrazujące 63x za pomocą mikroskopii epifluorescencyjnej (patrz Tabela materiałów). Użyj oprogramowania do analizy obrazów (np. Zen of ImageJ, patrz Tabela materiałów) do pomiaru długości SC i intensywności fluorescencji wszystkich kanałów wzdłuż osi. Przerysuj długość każdej osi chromosomu (SYCP3), zaczynając od centromeru (obszar gęstości CREST lub DAPI).
    1. Do analizy HORMAD1 i SYCP1 zapisz długości szczytów sygnału fluorescencyjnego. Oblicz całkowite długości szczytów HORMAD1 lub SYCP1 i podziel je przez długość osi chromosomu.
    2. Do analizy MSH4 określ liczbę pików sygnału fluorescencyjnego dla każdego pomiaru SYCP3. Zarejestruj zarówno łączną liczbę szczytów MSH4 na jądro, jak i liczbę szczytów MSH4 nakładających się na szczyty MLH3. Potwierdź liczbę MSH4, porównując piki z odpowiadającą im liczbą ognisk.

3. Przygotowania diakinezy/prometafazy do obserwacji chiasmatów

  1. Aby zmaksymalizować wydajność mejotycznie kompetentnych oocytów, użyj młodych samic myszy (25–28 dni).
    UWAGA: Stymulacja przez podanie dootrównowej 5 IU gonadotropiny gonadotropiny (PMSG) w surowicy gonadotropiny (PMSG) u samic myszy w celu zwiększenia wydajności może być przeprowadzona przez podanie dotrwowej u samic myszy w ciąży. Jednak na potrzeby analiz chiasmatów można pobrać wystarczającą ilość oocytów pęcherzyków zarodkowych (GV) od samic niestymulowanych.
  2. Przed poświęceniem myszy przygotuj następujące odczynniki i roztwory.
    1. Pozwól, by M2 (3 mL na mysz) i KSOM (1 mL na mysz) wyrównały się w inkubatorze hodowli komórkowych (37 °C, 5%CO2) przez co najmniej godzinę.
      UWAGA: Probówki z mrożonymi ośrodkami można umieścić w inkubatorze z rozluźnionymi pokrywkami wieczorem przed pobraniem oocytów, co pozwala na około 14 godzin równowagi.
    2. Przygotuj ośrodek M2 z 2,5 μM milinonu (inhibitor izoenzymu fosfodiesterazy zapobiegający wznowieniu mejotycznego)36. Pipetą włóż pięć kropli po 20 μL M2 + milrynon do 35 mm szalki Petriego i nałóż lekki olej mineralny (Rysunek 2C).
    3. Pipetuj pięciokrotną 20 μL KSOM do szalki Petriego o średnicy 35 mm i nałóż lekki olej mineralny (rysunek 2C).
      UWAGA: Kontrola temperatury i pH jest kluczowa dla dojrzewania oocytów in vitro. Pobieranie oocytów powinno odbywać się na podgrzewanym (37 °C) blacie stołowym. Wszystkie media powinny być przechowywane w inkubatorze do czasu użycia, a misy z mediami powinny być usuwane pojedynczo, aby ograniczyć zakłócenia spowodowane ekspozycją na powietrze otoczenia.
    4. Czyść szkiełka mikroskopowe z 70% etanolem i pozwól wyschnąć na powietrzu. Na odwrocie szkiełek mikroskopowych lekko narysuj (piórem z diamentowym końcówką) lub narysuj (wodoodpornym tuszem) siatkę 5 x 5 o wymiarach ~ 4 mm x 4 mm kwadratów (przykład pokazano na Rysunku 2B i można go wykorzystać do odrysowania siatki).
  3. Zbieraj oocyty od jednej myszy na raz. Ofiara u samicy myszy przez uduszenieCO2 i zwichnięcie szyjki macicy zgodnie z wytycznymi IACUC.
  4. Użyj nożyczek do sekcji, aby otworzyć jamę brzuszną. Użyj cienkich kleszczy, aby przesunąć jelita.
  5. Podążaj za każdym rogiem macicy od pęcherza w kierunku nerek. Jajniki i jajowody są połączone z małym poduszkiem tłuszczowym w pobliżu nerek.
  6. Użyj nożyczek do mikrosekcji, aby usunąć jajniki i umieść je w gazowym medium M2 z milinonem.
  7. Użyj nożyczek do mikrosekcji, aby usunąć cały tłuszcz i inne tkanki (w tym kaletkę) z jajników. Użyj igieł 25G, aby przerwać pęcherzyki antralne.
  8. Użyj pipety transferowej, aby rozprowadzić oocyty w M2 + milrynon w cienkiej warstwie w szalce Petriego o średnicy 100 mm, uważając, by ośrodek nie dotykał boków naczynia (Rysunek 2C).
  9. Użyj mikroskopu rozcinanego (powiększenie 25x - 50x), aby zobrazować oocyty GV (Rysunek 2F). Oocyty GV mogą być powiązane z komórkami kumulusowymi w kompleksie kumulato-oocytowym (COC). Usuwam komórki kroszyste poprzez powtarzające pipetowanie.
  10. Pobieranie oocytów GV za pomocą szklanej pipety sterowanej ustami (średnica 100–150 μm; Rysunek 2A). Przenieś oocyty GV do kropli 20 μL M2 + milironu pokrytej lekkim olejem mineralnym (Rysunek 2C). Nie wkładaj więcej niż 30 oocytów do jednej kropli.
  11. Gdy wszystkie oocyty GV zostaną zebrane, należy je przepuścić przez dwie lub trzy krople po 20 μL M2+ milrynonu pokryte lekkim olejem mineralnym, aby usunąć komórki somatyczne.
  12. Przenieś oocyty GV (z jak najmniejszą ilością ośrodka) do kropli KSOM o pojemności 30 μL. Płucz milrynon, przechodząc oocyty przez pięć kropel KSOM (rysunek 2C).
  13. Przełóż wszystkie oocyty GV do kropli 20 μL KSOM nakładanych na lekki olej mineralny, maksymalnie 30 oocytów na kroplę KSOM (rysunek 2C). Umieść oocyty w inkubatorze do hodowli komórkowej (37 °C, 5%CO2).
  14. Inkubuj oocyty przez około 5 godzin.
    UWAGA: Przebicie GV (oznaczające zniknięcie otoczki jądrowej i wznowienie meiotyczne; Rysunek 2G) Zazwyczaj występuje po 2 godzinach w hodowli, ale tempo dojrzewania oocytów może się różnić w zależności od szczepu myszy lub stymulacji hormonalnej. Z naszego doświadczenia wynika, że łącznie 5 godzin w hodowli najlepiej optymalizuje rozprzestrzenianie się chiasmat w większości szczepów myszy. Jeśli pozostawiono zbyt długo dojrzewania, może nastąpić pierwszy podział mejotyczny i wytłoczenie ciała biegunowego (Rysunek 2H).
  15. Przelej 5 - 10 oocytów (z jak najmniejszą liczbą KSOM) do kropli 30 μL roztworu hipotonicznego (0,9 % cytryninu sodu w ultraczystym H2O). Inkubuj jajki w roztworze hipotonicznym przez 5–10 minut.
  16. Pipetą nałóż małą kroplę (~ 1 μL) zakwaszonej wody (8 kropel kwasu octowego lodowcowego w 50 mL ultraczystego H2O) na jeden z kwadratów przygotowanych preparatów (rysunek 2B).
  17. Użyj szklanej pipety o średnicy 100–150 μm, obsługiwanej ustnie, aby szybko przenieść jeden oocyt z ootu do zakwaszonej krople wody. Przenieś jak najmniej roztworu hipotonicznego z oocytem. Użyj tej samej pipety, aby usunąć część płynu, aż oocytum przyklei się do szkiełka.
    UWAGA: Objętość cieczy wokół oocytu jest krytyczna. Powinno być wystarczająco dużo płynu, aby oocyt nie wyschł przed utrwaleniem, ale nie na tyle, by oocyt nie mógł przykleić się do szkiełka.
  18. Szybko przełącz na szklaną pipetę o średnicy 150 μm. Dodaj jedną kroplę świeżego utrwalacza Carnoya (trzy części metanolu bezwzględnego na jedną część kwasu octowego lodowca) do oocytu. Pozwól utrwalacowi rozproszyć się po szkiełku. Oocyt powinien wydawać się mniej wyraźny i topnieć, gdy kwas z utrwalacza rozpuszcza zona pellucida i komórki pękają.
  19. Gdy przód utrwalacza zacznie się kurczyć, szybko dodaj 2-3 krople utrwalającego. Delikatnie dmuchnij w suwak, żeby przyspieszyć schnięcie.
  20. Powtórz kroki 3.16 - 3.19 z dodatkowymi oocytami z roztworu hipotonicznym.
  21. Powtarzaj kroki 3.15 - 3.20, aż wszystkie oocyty zostaną utrwalone. Sprawdź rozprzestrzenianie się chromosomów za pomocą mikroskopu z kontrastem fazowym.
  22. Gdy preparat całkowicie wyschnie na powietrzu, umieść go w słoiku do barwienia Coplin z 50 mL 4% Giemsa (v/v) w ddH2O. Preparat w Giemsa stosuje się przez 6 minut w temperaturze pokojowej.
  23. Płucz 3 razy przez 3 minuty w ddH2Ow temperaturze pokojowej. Pozwól zjeżdżalniom całkowicie wyschnąć.
  24. Nałóż cienką warstwę (~60 μL) Permount na szklaną pokrywę o wymiarach 60 mm x 24 mm No. 1.5. Zamontuj szkiełka, odwracając je na pokrywkach i starannie zacierając nadmiar płynów. Pozwól slajdom wyschnąć przez noc przed zdjęciem w 63x na brightfield.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Ocena defektów synaptycznych w komórkach podobnych do pachytenu
Eksperyment ten ocenia defekty synaptyczne w oocytach pachytenowych oraz monitoruje postęp profazy I (Rysunek 3A). Immunobarwienie dla SYCP3 (osiowo/boczne elementy SC), SYCP1 (centralny element SC) oraz HORMAD1 (osie chromosomów niesynaptycznych/odsynapsowanych) umożliwiają zaawansowanie i ocenę synapsis. HORMAD1 współlokalizuje się z SYCP3 podczas zygonemy i diplonemy (prz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Oocyty ssaków są szczególnie podatne na błędy w porównaniu do plemników. Chociaż mniej wydajny punkt kontrolny zespołu wrzeciona (SAC) oocytu przyczynia się do tej podatności 14,52,53, Hassold i Hunt sugerują, że wielokrotne trafienia prowadzą do aneuploidii, przy czym defektowa rekombinacja jest głównym czynnikiem 54. Badania na ludziach łączą aneuploidię z niewystarczającą pewnością przejścia i nieoptym...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autor nie ma żadnych konfliktów do ujawnienia.

Podziękowania

Finansowanie tego projektu zapewniono z nagrody K99 od Eunice Kennedy Shriver National Institute for Child Health and Development (HD112986 do TH).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,45 μ m Filtr StrzykawkowyMillipore SigmaSLHAR33SBdo produkcji pipety sterowanej ustami
0,5 M EDTA, pH 8,0Corning46-034-CI dla HEB
1 mL sterylna strzykawka z igłą 25 gauge 16 mmFisher Scientific14-817-125 Za pęknięcie jajników
Szalka Petriego 100 x 15 mmVWR25384-302 
Jednorazowe pipety Pasteur z jednorazowego szkła borosilikatowego o rozmiarze 14,6 cmFisher Scientific13-678-20B do produkcji pipety sterowanej ustami
35 x 10 mm szalka PetriegoCorning351008
40 mm x 0,45 mm #3 stalowe kołki do entomologiiAmazonB0CSSPW5S7do przypinania myszy płodowych do sekcji
Kwas octowy, lodowiecFisher ScientificA38-212dla fiksatora Carnoya
Zespoły rurek aspiratorowych do skalibrowanych mikrokapilarnych pipetMillipore SigmaA5177-5EAdo produkcji pipety sterowanej ustami
B.P.I. Watch GlassNDS Technologies 1580-00Alternatywnie można użyć talerza zarodka o wymiarach 30 mm x głębokości 12 mm (Electron Microscopy Sciences SKU: 70543-30)
Kwas borowyFisher ScientificBP168-1do regulacji pH HEB, PFA
Albumina surowicy bydlęcejMillipore SigmaA7906-100Gdla ADB
Zbiornik CO2dla inkubatora
Szkiełka mikroskopowe CorningaMillipore SigmaCLS294875X25Długość x Szerokość 75 mm x 25 mm, matowa strona
Szkiełka mikroskopu Corning, z jedną stroną matową, z drugiej stronyVWR294875X25
Pokrywa szkło prostokątne. 60 x 24 mm, #1,5VWR48393-251
Misa do rozcinaniaNauki o mikroskopii elektronowej70540
Mikroskop sekcjonującyKażdy model standardowy
Nożyczki do sekcji, ostry końcówka, 4,5"VWR82027-578
Bardzo drobne, ostre szczypceVWR76548-836
Giemsa StainMillipore SigmaGS500-500do barwienia rozprzestrzenień chiasmata
ImmEdge Hydrofobowy Barierowy Długopis PAPLaboratoria VectorH-4000
InkubatorKażdy standardowy model z technologią CO2 i wodnym szalem
Stacja robocza IVFK-SystemsKażdy model z podgrzewanym blatem stołowym
Rozwiązanie Kodak Photo-Flo 200Zdjęcie BH & Wideo1464510dla washów ślizgowych
MetanolFisher ScientificA412-4dla fiksatora Carnoya
Słoik do barwienia Coplin MP BiomedicalsFisher ScientificICN17006201
Normalne surowiczki kozyGibco16210-072dla ADB
Paraformaldehyd, EM Grade, oczyszczony PrillNauki o mikroskopii elektronowej19200
PermountFisher ScientificSP15-100for  Do montażu slajdów do rozkładów chiasmata
ProLong szklany uchwyt antyfade z bejcą NucBlueThermo ScientificP36985do montażu preparatów immunobarwnych
Rurka silikonowa, średnica wewnętrzna: 0,125", średnica zewnętrzna: 0,25"VWR89068-474do produkcji pipety sterowanej ustami
Cytrynian sodu dwuwęglanuFisher ScientificS279-500dla HEB, roztwór hipotoniczny
System barwienia na wysuwakach StainTrayNauki o mikroskopii elektronowej71396-BDo użytku jako komora nawilżająca. Trzeba używać czarnej pokrywki do barwienia immunofluorescencyjnego. Alternatywnie można wyłożyć dno nieprzezroczystego pudełka na slajdy lub naczynia z wilgociami papierowymi do użytku jako nawilżona komora 
Końcówki do striptizerów - 100Cooper SurgicalMXL3-100dla pipety sterowanej ustami
Końcówki do striptizerów - 150Cooper SurgicalMXL3-150dla pipety sterowanej ustami
SacharozaMillipore SigmaS-8501dla HEB, hipotoniczny roztwór sacharozy
Baza TrisFisher ScientificBP152-5dla HEB
Triton X-100Fisher ScientificBP151-100 dla PFA, ADB i Triton-PBS
Słoik do barwienia Coplin United ScientificFisher ScientificS17495ANieprzezroczysty biały plastik do mycia i blokowania szkiełek po dodaniu światłoczułych przeciwciał wtórnych
Szkiełka wklęsłe United ScientificFisher ScientificS1395331,3 mm grubości, 2 odwierty
Vannas Microdissection Scissors 5mm prosteVWR76457-358
Zeiss Axio Imager.Z2, Colibri 7Carl Zeiss000000-2624-307
Oprogramowanie Zen Blue 3.11Carl ZeissOprogramowanie do akwizycji i analizy obrazów
Przeciwciała
Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')? Fragment kozy anty-myszy IgG, specyficzny dla fragmentów FcJackson ImmunoResearch Laboratories Inc.115-546-071zastosowano rozcieńczenie 1:1 000
Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')? Fragment kozy antykróliczy IgG, specyficzny dla fragmentów FcJackson ImmunoResearch Laboratories Inc.111-546-046zastosowano rozcieńczenie 1:1 000
Alexa Fluor 647 AffiniPure F(ab')? Fragment kozy antyludzki IgG, Fcγ specyficzne dla fragmentówJackson ImmunoResearch Laboratories Inc.109-606-170zastosowano rozcieńczenie 1:1 000
Alexa Fluor 647 AffiniPure Goat Anti-Guinea Pig IgG, fragment Fc SpecificJackson ImmunoResearch Laboratories Inc.106-605-008zastosowano rozcieńczenie 1:1 000
Świnka morska anty-MLH3 pAbWykonany na zamówienie z użyciem Thermo-Fishera, stosowany rozcieńczenie 1:500
Świnka morska anty-SYCP1 pAbod Christer Hö ö g (Kouznetsova i in. 2005), zastosowano rozcieńczenie 1:200
Ludzki antycentromerowy protein pAbAntibodies Inc.15-234zastosowano rozcieńczenie 1:1 000
Mysz anty-MLH1 mAbBD Biosciences550838zastosowano rozcieńczenie 1:100
Mysz anty-SYCP3 mAbAbcamab97672zastosowano rozcieńczenie 1:1 000
Królik anty-HORMAD1 pAbProteintech13917-1-APZastosowano rozcieńczenie 1:500
Rabbit anty-MSH4 pAbAbclonalA8556zastosowano rozcieńczenie 1:100
Rabbit anty-RAD51 pAbMilliporePC130Zastosowano rozcieńczenie 1:500
Rabbit anty-SYCP3 pAbAbcamab15093zastosowano rozcieńczenie 1:1 000
Rhodamine Red-X (RRX) AffiniPure F(ab')? Fragment kozy anty-myszy IgG, specyficzny dla fragmentów FcJackson ImmunoResearch Laboratories Inc.115-296-071zastosowano rozcieńczenie 1:1 000
Rhodamine Red-X (RRX) AffiniPure F(ab')? Fragment kozy antykróliczy IgG, specyficzny dla fragmentów FcJackson ImmunoResearch Laboratories Inc.111-296-046zastosowano rozcieńczenie 1:1 000

Bibliografia

  1. Gray, S., Cohen, P. E. Control of Meiotic Crossovers: From Double-Strand Break Formation to Designation. Annu Rev Genet. 50, 175-210 (2016).
  2. Hunter, N. Meiotic Recombination: The Essence of Heredity. Cold Spring Harb Perspect Biol. 7, a016618(2015).
  3. Kudo, N. R., et al. Resolution of Chiasmata in Oocytes Requires Separase-Mediated Proteolysis. Cell. 126, 135-146 (2006).
  4. Murdoch, B., et al. Altered Cohesin Gene Dosage Affects Mammalian Meiotic Chromosome Structure and Behavior. PLoS Genet. 9, 1003241(2013).
  5. Hodges, C. A., Revenkova, E., Jessberger, R., Hassold, T. J., Hunt, P. A. SMC1β-deficient female mice provide evidence that cohesins are a missing link in age-related nondisjunction. Nat Genet. 37, 1351-1355 (2005).
  6. Zickler, D., Kleckner, N. Meiosis: Dances Between Homologs. Ann Rev Genet. 57, 1-63 (2023).
  7. Billmyre, K. K., et al. SYCP1 head-to-head assembly is required for chromosome synapsis in mouse meiosis. Sci Adv. 9, eadi1562(2023).
  8. Kolas, N. K., et al. Localization of MMR proteins on meiotic chromosomes in mice indicates distinct functions during prophase I. J Cell Biol. 171, 447-458 (2005).
  9. Lipkin, S. M., et al. Meiotic arrest and aneuploidy in MLH3-deficient mice. Nat Genet. 31, 385-390 (2002).
  10. Oh, S. D., Lao, J. P., Taylor, A. F., Smith, G. R., Hunter, N. RecQ Helicase, Sgs1, and XPF Family Endonuclease, Mus81-Mms4, Resolve Aberrant Joint Molecules during Meiotic Recombination. Mol Cell. 31, 324-336 (2008).
  11. Holloway, J. K., Booth, J., Edelmann, W., McGowan, C. H., Cohen, P. E. MUS81 generates a subset of MLH1-MLH3-independent crossovers in mammalian meiosis. PLoS Genet. 4, e1000186(2008).
  12. Edelmann, W., et al. Mammalian MutS homologue 5 is required for chromosome pairing in meiosis. Nat Genet. 21, 123-127 (1999).
  13. Kneitz, B., et al. MutS homolog 4 localization to meiotic chromosomes is required for chromosome pairing during meiosis in male and female mice. Genes Dev. 14, 1085-1097 (2000).
  14. Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem. Nat Rev Genet. 13, 493-504 (2012).
  15. Capalbo, A., Hoffmann, E. R., Cimadomo, D., Ubaldi, F. M., Rienzi, L. Human female meiosis revised: new insights into the mechanisms of chromosome segregation and aneuploidies from advanced genomics and time-lapse imaging. Hum Reprod Update. 23, 706-722 (2017).
  16. Gruhn, J. R., et al. Chromosome errors in human eggs shape natural fertility over reproductive life span. Science. 365, 1466-1469 (2019).
  17. Gruhn, J. R., Hoffmann, E. R. Errors of the Egg: The Establishment and Progression of Human Aneuploidy Research in the Maternal Germline. Ann Rev Genet. 56, null(2022).
  18. Soygur, B., et al. Intercellular bridges coordinate the transition from pluripotency to meiosis in mouse fetal oocytes. Sci Adv. 7, eabc6747(2021).
  19. Bowles, J., et al. Retinoid Signaling Determines Germ Cell Fate in Mice. Science. 312, 596-600 (2006).
  20. Bullejos, M., Koopman, P. Germ cells enter meiosis in a rostro-caudal wave during development of the mouse ovary. Mol Reprod Dev. 68, 422-428 (2004).
  21. Borum, K. Oogenesis in the mouse: A study of the meiotic prophase. Exp Cell Res. 24, 495-507 (1961).
  22. Grive, K. J., Freiman, R. N. The developmental origins of the mammalian ovarian reserve. Development. 142, 2554-2563 (2015).
  23. Hu, M., et al. PRC1-mediated epigenetic programming is required to generate the ovarian reserve. Nat Commun. 13, 4510(2022).
  24. Drabent, B., Bode, C., Bramlage, B., Doenecke, D. Expression of the mouse testicular histone gene H1t during spermatogenesis. Histochem Cell Biol. 106, 247-251 (1996).
  25. Goetz, P., Chandley, A. C., Speed, R. M. Morphological and temporal sequence of meiotic prophase development at puberty in the male mouse. J Cell Sci. 65, 249-263 (1984).
  26. Solari, A. J. The spatial relationship of the X and Y chromosomes during meiotic prophase in mouse spermatocytes. Chromosoma. 29, 217-236 (1970).
  27. Peters, A. H., Plug, A. W., van Vugt, M. J., de Boer, P. A drying-down technique for the spreading of mammalian meiocytes from the male and female germline. Chromosome Res. 5, 66-68 (1997).
  28. Tarkowski, A. K. An Air-Drying Method for Chromosome Preparations from Mouse Eggs. Cytogenetics. 5, 394-400 (2008).
  29. Susiarjo, M., Rubio, C., Hunt, P. Analyzing mammalian female meiosis. Methods Mol Biol. 558, 339-354 (2009).
  30. Sun, X., Cohen, P. E. Studying Recombination in Mouse Oocytes. Mammalian Oocyte Reg Meth Protoc. , 1-18 (2013).
  31. Evans, C. W., Robb, D. I., Tuckett, F., Challoner, S. Regulation of meiosis in the foetal mouse gonad. Development. 68, 59-67 (1982).
  32. Horan, T. S., et al. The DNA helicase FANCJ (BRIP1) functions in double strand break repair processing, but not crossover formation during prophase I of meiosis in male mice. PLoS Genet. 20, e1011175(2024).
  33. Wood, A. J., et al. CNTD1 is crucial for crossover formation in female meiosis and for establishing the ovarian reserve. J Cell Biol. 224, e202401021(2025).
  34. Horan, T. S., et al. Replacement Bisphenols Adversely Affect Mouse Gametogenesis with Consequences for Subsequent Generations. Curr Biol. 28, 2948-2954.e3 (2018).
  35. Lee, C., Oh, J. S. Novel BRCA1-PLK1-CIP2A axis orchestrates homologous recombination-mediated DNA repair to maintain chromosome integrity during oocyte meiosis. Nuc Acid Res. 53, gkae1207(2025).
  36. Thomas, R. E., Thompson, J. G., Armstrong, D. T., Gilchrist, R. B. Effect of specific phosphodiesterase isoenzyme inhibitors during in vitro maturation of bovine oocytes on meiotic and developmental capacity. Biol Reprod. 71, 1142-1149 (2004).
  37. Wojtasz, L., et al. Mouse HORMAD1 and HORMAD2, Two Conserved Meiotic Chromosomal Proteins, Are Depleted from Synapsed Chromosome Axes with the Help of TRIP13 AAA-ATPase. PLoS Genet. 5, e1000702(2009).
  38. Kogo, H., et al. Differential phosphorylation of two serine clusters in mouse HORMAD1 during meiotic prophase I progression. Exp Cell Res. 440, 114133(2024).
  39. Jiao, X., et al. Aberrant activation of chromosome asynapsis checkpoint triggers oocyte elimination. Nat Commun. 16, 2260(2025).
  40. Cloud, V., Chan, Y. L., Grubb, J., Budke, B., Bishop, D. K. Rad51 Is an Accessory Factor for Dmc1-Mediated Joint Molecule Formation During Meiosis. Science. 337, 1222-1225 (2012).
  41. Lan, W. H., et al. Rad51 facilitates filament assembly of meiosis-specific Dmc1 recombinase. Proc Natl Acad Sci. 117, 11257-11264 (2020).
  42. Hinch, A. G., et al. The Configuration of RPA, RAD51, and DMC1 Binding in Meiosis Reveals the Nature of Critical Recombination Intermediates. Mol Cell. 79, 689-701.e10 (2020).
  43. Snowden, T., Acharya, S., Butz, C., Berardini, M., Fishel, R. hMSH4-hMSH5 recognizes Holliday Junctions and forms a meiosis-specific sliding clamp that embraces homologous chromosomes. Mol Cell. 15, 437-451 (2004).
  44. Rinaldi, V. D., Bolcun-Filas, E., Kogo, H., Kurahashi, H., Schimenti, J. C. The DNA Damage Checkpoint Eliminates Mouse Oocytes with Chromosome Synapsis Failure. Mol Cell. 67, 1026-1036.e2 (2017).
  45. Premkumar, T., et al. Genetic dissection of crossover mutants defines discrete intermediates in mouse meiosis. Mol Cell. 83, 2941-2958.e7 (2023).
  46. Polani, P. E., Crolla, J. A., Seller, M. J., Moir, F. Meiotic crossing over exchange in the female mouse visualised by BUdR substitution. Nature. 278, 348-349 (1979).
  47. Imai, H. T., Moriwaki, K. A re-examination of chiasma terminalization and chiasma frequency in male mice. Chromosoma. 85, 439-452 (1982).
  48. Kanda, N., Kato, H. Analysis of crossing over in mouse meiotic cells by BrdU labelling technique. Chromosoma. 78, 113-121 (1980).
  49. Hultén, M., Lawrie, N. M., Laurie, D. A. Chiasma-based genetic maps of chromosome 21. Am J Med Genet. 37, 148-154 (1990).
  50. Lawrie, N. M., Tease, C., Hultén, M. A. Chiasma frequency, distribution and interference maps of mouse autosomes. Chromosoma. 104, 308-314 (1995).
  51. Speed, R. M. The effects of ageing on the meiotic chromosomes of male and female mice. Chromosoma. 64, 241-254 (1977).
  52. Gui, L., Homer, H. Spindle assembly checkpoint signalling is uncoupled from chromosomal position in mouse oocytes. Development. 139, 1941-1946 (2012).
  53. Sebestova, J., Danylevska, A., Dobrucka, L., Kubelka, M., Anger, M. Lack of response to unaligned chromosomes in mammalian female gametes. Cell Cycle. 11, 3011-3018 (2012).
  54. Hassold, T. J., Hunt, P. A. Missed connections: recombination and human aneuploidy. Prenatal Diagnos. 41, 584-590 (2021).
  55. Oliver, T. R., et al. New Insights into Human Nondisjunction of Chromosome 21 in Oocytes. PLoS Genet. 4, e1000033(2008).
  56. Ghosh, S., Feingold, E., Dey, S. K. Etiology of Down syndrome: Evidence for consistent association among altered meiotic recombination, nondisjunction, and maternal age across populations. Am J Med Genet A. 149A, 1415-1420 (2009).
  57. Wang, S., et al. Inefficient crossover maturation underlies elevated aneuploidy in human female meiosis. Cell. 168, 977-989.e17 (2017).
  58. Shin, Y. H., McGuire, M. M., Rajkovic, A. Mouse HORMAD1 Is a Meiosis I Checkpoint Protein That Modulates DNA Double-Strand Break Repair During Female Meiosis. Biol Reprod. 89, 29(2013).
  59. Kogo, H., et al. HORMAD1-dependent checkpoint/surveillance mechanism eliminates asynaptic oocytes. Genes Cells. 17, 439-454 (2012).
  60. Ward, J. O., et al. Mutation in Mouse Hei10, an E3 Ubiquitin Ligase, Disrupts Meiotic Crossing Over. PLoS Genet. 3, e139(2007).
  61. Holloway, J. K., Sun, X., Yokoo, R., Villeneuve, A. M., Cohen, P. E. Mammalian CNTD1 is critical for meiotic crossover maturation and deselection of excess precrossover sites. J Cell Biol. 205, 633-641 (2014).
  62. Hodges, C. A., Hunt, P. A. Simultaneous analysis of chromosomes and chromosome-associated proteins in mammalian oocytes and embryos. Chromosoma. 111, 165-169 (2002).
  63. Chambon, J. P., Hached, K., Wassmann, K. Chromosome Spreads with Centromere Staining in Mouse Oocytes. Mammal Oocyte Regul Method Protoc. , 203-212 (2013).
  64. Yun, Y., Ito, M., Sandhu, S., Hunter, N. Cytological Monitoring of Meiotic Crossovers in Spermatocytes and Oocytes. Homologous Recomb Method Protoc. , 267-286 (2021).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Kompleks synaptonemalnyrekombinacja meiotycznabarwienie immunofluorescencyjnesynapsis chromosom wtworzenie si crossing overdojrzewanie oocyt wocena aneuploidiidynamika chromosom w
Przygotowanie rozprzestrzeniania chromosomów mejotycznych z oocytów myszy do oceny synapsy i rekombinacji
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.