Artykuł metodologiczny

Rozwój linii organoidalnych pochodzących z myszy z komórek nabłonkowych jajowodów do modelowania wysokopoziomowego surowiczego raka jajnika

DOI:

10.3791/68753

⸱

6 sierpnia 2025

 ,  , 
1Laura and Isaac Perlmutter Cancer Center, NYU Grossman School of Medicine, NYU Langone Health

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten szczegółowo opisuje opracowanie wysokostopieńskich modeli mysich raka surowicy (HGSOC) in vitro oraz in vivo. Od wyprowadzenia myszych jajowodów, ich modyfikacji genetycznej w celu powtórzenia genetyki ludzkiego HGSOC, aż po ich wprowadzenie do kaletki jajnikowej myszy syngenetycznych w celu in vivo rozwoju guzów.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Skuteczne modelowanie chorób w realistycznych środowiskach jest kluczowe dla lepszego zrozumienia różnorodnych patologii. W tym aspekcie organoidy oferują wierniejsze środowisko niż ich klasyczne dwuwymiarowe odpowiedniki in vitro. Podobnie, syngeniczne modele myszy pozwalają badaczom badać pełniejsze interakcje guza z gospodarzem, na przykład z układem odpornościowym, in vivo. Przedstawiamy tutaj kompletny protokół ekstrakcji komórek nabłonka jajowodów, komórek pochodzenia wysokostopieńskich surowicznych raków jajnika (HGSOC), z myszy i wyprowadzania ich jako pierwotnych hodowli organoidów, a także ich hodowli in vitro oraz utrzymania. Następnie opisujemy, jak wykorzystać techniki inżynierii genetycznej, takie jak nadekspresja genów lentiwirusalnych lub retrowirusowych, a także delecja genów CRISPR-Cas9, aby modyfikować te linie i przekształcać je w przednowotworowe nowotwory. Opisujemy również, jak wykorzystać je do walidacji in vitro , poprzez ekstrakcję materiałów genetycznych i barwienie immunofluorescencyjne. Na koniec wskazamy, jak skutecznie wstrzyknąć te nowotwory do kaletki jajnika, autochtonicznego miejsca HGSOC, w celu inicjacji guza.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wysokostopień surowicowy rak jajnika (HGSOC) pozostaje słabo poznaną i wysoce śmiertelną chorobą. Historycznie brak wiernych modeli in vitro i in vivo, które reprezentują biologię HGSOC i reakcję terapeutyczną, stanowił poważną przeszkodę w postępie. Na przykład wiele (jeśli nie większość) badań wykorzystywało linie komórkowe, które nie dzielą kluczowych cech genomicznych/genetycznych HGSOC, co poddaje wątpliwości istotności ich wyników 1,2,3,4. Na przykład powszechny syngeneiczny model myszy ID8 pochodzi z nabłonka powierzchniowego jajnika (OSE) i jest typem5 o dzikim poziomie Trp53. Dla porównania, większość, jeśli nie całość, HGSOC powstaje w nabłonku jajowodu (FTE)6, a HGSOC jest niemal zawsze mutantem TP53 lub wyciszonym7. Naukowcy próbowali od tego czasu naprawić tę linię, integrując mutacje Trp53 w jej5, ale ponieważ mutacja Trp53 jest wczesnym wydarzeniem w patogenezie HGSOC, ta modyfikacja może nastąpić zbyt późno w transformacji tej linii komórkowej i prawdopodobnie nie odzwierciedla prawidłowego rozwoju HGSOC.

W ciągu ostatniej dekady podjęto próby naprawienia tego stanu rzeczy poprzez opracowanie bardziej realistycznych modeli HGSOC. Na przykład genetycznie modyfikowane modele myszy (GEMM), które zawierają istotne mutacje na komórkach linii linii traktu Müllera, często w układzie rekombinazy Cre, aby kontrolować patogenezę, pozwalają naukowcom lepiej naśladować chorobę in vivo 8,9,10. Niestety, te modele są często skomplikowane w generowaniu i mogą mieć inne problemy, takie jak Cre-leaking, Cre-effect czy "efekty pola"11,12,13. W tym kontekście modele organoidów syngeneicznych wydają się stanowić solidny kompromis dla badaczy, którzy chcą lepiej naśladować chorobę zarówno in vitro, jak i in vivo 14,15,16,17,18,19. Rzeczywiście, choć większość dostępnych i obecnie stosowanych modeli HGSOC to modele dwuwymiarowe, niestety nie są w stanie prawidłowo symulować złożoności macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), kluczowego elementu wpływającego na biologię komórki. Organoidy to samoorganizujące się tkanki trójwymiarowe, często powstające z komórek macierzystych, które mogą odtwarzać wczesną złożoność strukturalną i funkcjonalną narządu w szalce Petriego20. Ich generowanie zazwyczaj polega na zawieszeniu pojedynczych komórek, które są pluripotentne, w macierzy błony podstawnej (BMM), takiej jak Matrigel21. In vitro modele te są stosunkowo dokładniejsze w odtwarzaniu warunków in vivo niż modele 2D. Podobnie, ze względu na ich syngeniczny charakter, modele te mogą być przeszczepione myszowi z w pełni funkcjonującym układem odpornościowym, co pozwala na wierniejszą rekonstrukcję patogenezy i rozwoju14,15. Jest to wyraźna przewaga nad ksenoprzeszczepami pochodzącymi od pacjentów, które, choć mają najbardziej realistyczną genetykę guza, wymagają wszczepienia w modelach myszy z obniżoną odpornością.

W tym protokole opisujemy, jak opracować syngeneiczne modele organoidów HGSOC. Od powstania pierwotnej dzikiej kultury organoidów FTE wyekstrahowanej z myszy, przez inżynierię genetyczną w celu generowania genotypów uwzględniających chorobę, aż po przeszczepienie z powrotem do kaletki jajnika, by uzyskać w pełni rozwinięte guzy. Uwzględniliśmy także kilka dodatkowych protokołów wspierających powszechne eksperymenty, takie jak barwienie immunofluorescencji (IF) organoidów in vitro oraz konwersja linii komórkowych 2D do produkcji komórek na dużą skalę, na przykład do zastrzyków. Protokół ten jest skierowany do badaczy, którzy chcą opracować modele syngeniczne organoidów HGSOC z kontrolą nad ich składem genetycznym, z zamiarem badania biologii HGSOC w bardziej realistycznych warunkach in vitro oraz interakcji obecnych w mikrośrodowisku nowotworowym in vivo.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie pobieranie i procedury tkanek zwierzęcych były przeprowadzane etycznie, za zgodą Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) w Alexandria Center for Life Sciences oraz Perlmutter Cancer Center przy NYU Langone Health w Nowym Jorku, Nowy Jork.

1. Przygotowanie materiałów

  1. Przygotowanie ośrodka organoidalnego myszy (MOM)
    1. Przygotuj podstawę podstawową, łącząc elementy z Tabeli 1.
      UWAGA: Ośrodki są stabilne do miesiąca w temperaturze 4 °C.
  2. Przygotowanie mediów 2D
    1. Połącz rekombinowany myszy EGF 50 ng/mL, insulin-transferynę-selen (końcowe stężenia 10 mg/L insuliny, 5,5 mg/l transferyny, 6,7 μg/L), 3% termicznie inaktywowane surowicę płodu bydła (FBS) oraz penicylinę-streptomycynę (100 U/mL) w DMEM (z pirowarianem i wysoką glukozą).
  3. Przygotowanie mieszanki trawiennej
    1. Połącz kolagenazę/hialuronidazę (3000 U/mL kolagenazy, 1000 U/mL hialuronidazy) z DMEM (z pirosurowianem i wysoką glukozą) w proporcji 1:10. Przygotuj 1 mL aliquoty w mikrorurkach 1,5 mL. Przechowuj aliquoty w temperaturze -20 °C i rozmrażaj na lodzie.
    2. Przygotuj jednorazowe alikwoty DNAse I (10 000 U/mL) i Dispase (5 U/mL).
    3. Gdy aliquot kolagenazy/hialuronidazy w DMEM zostanie rozmrożeni, należy dodać DNAseI (10 μL, 100 jednostek) i Dispazę (25 μL, 0,1 jednostki).
      UWAGA: Ten roztwór trawienny jest również przydatny do trawienia do 0,5 g guza.
  4. Obsługa BMM
    1. Przechowywaj BMM w -80 °C przez dłuższy czas. Aby uniknąć BMM mroziącego się do zamrożenia, przygotuj 1 mL aliquotów w probówkach po 1,5 mL. Rozmraź aliquot, umieszczając go w lodzie na 2 godziny lub przez noc w 4 °C.
      UWAGA: BMM zastyga w temperaturze pokojowej (RT). Dlatego zaleca się zawsze trzymać tubkę BMM na lodzie lub na stojaku na zimnych rurkach. Używaj końcówek pipet schłodzonych w zamrażarce o temperaturze -20 °C przez co najmniej 2 godziny.

2. Izolacja komórek od myszy FTE

  1. Rozmroź aliquot BMM, podgrzej enzym TrypLE Express i nałóż płytkę na 24 dołki w temperaturze 37 °C (przechowywaj ją w inkubatorze przez 24 godziny dla najlepszych efektów). Następnie przygotuj obszar operacyjny: narzędzia do sekcji i czyszczenia tkanek na mikroskopie sekcyjnym, płytkę z zimnym PBS + P/S oraz ciepłą mieszankę trawienną.
  2. Uśpienie samic myszy C57BL/6J przez uduszenie dwutlenkiem węgla. Wykonaj metodę wtórnej eutanazji (zwichnięcie szyjki macicy) zgodnie z wymaganiami IACUC.
  3. Rozciąć i usunąć jajnik oraz jajowod, a następnie przenieść je do sterylnej szalki Petriego zawierającej DMEM + P-S w temperaturze 4 °C. Za pomocą mikroskopu rozcinającym, cienki zestaw kleszczy i nożyczek usuwa pozostałą ilość tłuszczu z jajnika oraz izoluje jajowód (infundibulum i część dalszej ampułki) od jajnika i macicy.
    UWAGA: Należy uważać, aby nie dotykać skóry lub włosów myszy narzędziami, aby zapobiec skażeniu drobnoustrojami.
  4. Przenieś tkankę do rurki zawierającej całą mieszankę trawienną i użyj cienkich nożyczek, aby poćwiąć jajowód na małe kawałki (<0,5 mm). Inkubuj przez 40-50 minut w temperaturze 37 °C.
  5. Po dysocjacji wiruj komórki w 350 x g przez 5 minut i odrzucaj supernatant. Dodaj 500 μL podgrzanego TrypLE Express. Inkubuj przez 15 minut w temperaturze 37 °C.
  6. Trypsynizacja chłodzi 500 μL 3% FBS w DMEM (media 2D). Przecedź mieszankę przez sitko ogniw 70 μm do nowej mikrorurki. Wiruj przez 5 minut przy 350 g i wyrzucaj supernatant.
  7. Ponownie zawiesić granulkę komórkową (ledwo widoczną w zależności od liczby użytych FT) w 12,5 μL ośrodka organoidalnego myszy i krótko inkubować na lodzie. Wymieszaj z 37,5 μL lodowatego BMM i zasiewaj całą objętość (50 μL) na dnie dołka podgrzanej płyty z 24 dołkami.
  8. Umieść płytkę w temperaturze 37 °C przez co najmniej 20 minut, ale nie dłużej niż 48 godzin, aby ustawić BMM. Uważaj, aby nie ruszyć kopuł podczas przenoszenia płytki do inkubatora.
  9. Dodaj 500 μL wcześniej podgrzanego MOM do każdego otworu, delikatnie pipetując medium wzdłuż boku otworu. Nigdy nie dodawaj medium bezpośrednio do kopuły, bo może to spowodować uszkodzenia lub odłączenie. Przyłóż pokrywkę na płytkę hodowlową i inkubuj w temperaturze 37 °C i 5%CO2.

3. Utrzymanie organoidów pochodzących od myszy FTE

  1. Zmieniające się media
    1. Używając nieprzefiltrowanego, sterylnego grotu 10 μL, zasysaj medium z dna studni, gdy płytka jest utrzymywana pod kątem 45°. Jeśli kopuła odłącza się od płyty, ostrożnie zasysaj medium z góry studni, gdy odłączona kopuła znajduje się na dole.
    2. Powoli dodaj 750 μL MOM, podgrzanego w 37 °C, z końcówką przyciśniętą do bocznej ściany studni.
    3. Zmieniaj podłoże co 2-3 dni lub aż kolor zmieni się z różowego na żółty. Jeśli ośrodek żółta mniej niż 24 godziny po jego zmianie, organoidy są gotowe do przepuszczenia.
  2. Organoidy przechodzące
    1. Usuń medium i przepłucz każdy dołek 500 μL zimnego (4 °C) PBS. Aspiruj PBS i dodaj 500 μL zimnego (4 °C) roztworu odzyskiwania komórek bezpośrednio do kopuły BMM, aby ją rozpuścić. Kontynuuj pipetowanie, aż BMM całkowicie się rozpuści, a następnie przelej go do probówki o pojemności 1,5 mL.
    2. Umieść tubkę na lodzie na 30 minut i odłóż płytkę do inkubatora, aby pozostała ciepła. Jeśli używasz nowej płyty, upewnij się, że jest ona wcześniej podgrzana w 37 °C przez 24 godziny.
      UWAGA: Jeśli przepuszcza się więcej niż 2x kopuły o pojemności 50 μL, na przykład podczas rozbudowy opisanych poniżej, inkubacja na lodzie może być wydłużona o więcej niż 30 minut, aby uzyskać najlepsze rezultaty.
    3. Wiruj w 350 g przez 5 minut w 4 °C. Ostrożnie usuń supernatant bez zasysania pelletu i myj 500 μL zimnego PBS. Powtórz ten krok trzy razy.
      UWAGA: Jeśli zimna wirówka jest niedostępna, pozwól tubce ostygnąć między płukaniami, umieszczając ją na lodzie lub chłodnicy.
    4. Po ostatnim płukaniu wiruj w 350 g przez 5 minut, usuń supernatant i dodaj 500 μL podgrzanego (37 °C) enzymu TrypLE Express. Aby uniknąć utraty komórek podczas pipetowania, przeciągnij rurkę o kratkę wentylacji w okapu do hodowli tkanek, aby ujednolicić komórki.
    5. Inkubuj tubkę w 37 °C przez 30 do 60 minut.
      UWAGA: Czas może być dostosowany w zależności od genotypu organoidu i czasu przejścia, ponieważ niektóre mogą wymagać dłuższej trypsynizacji, aby uzyskać zawiesiny pojedynczych komórek.
    6. Zatrzymaj proces dysocjacji komórki, dodając 500 μL DMEM + 3% HI FBS i mieszaj przez pipetowanie w górę i w dół, aż roztwór się ujednolici.
    7. Wiruj w 350 × g przez 5 minut i wsysaj supernatant, aż zostanie ~20 μL objętości. Pozostały supernatant należy ręcznie usunąć pipetą P20 zamiast aspiratorem próżniowym, ponieważ w tym etapie często zasysa granulkę.
    8. Ponownie zawiesić komórki w 100 μL zimnej (4 °C) MOM i zmierzyć stężenie komórek. Przygotowuj rozcieńczenia komórek według uznania i trzymaj je w lodzie. Następnie wymieszaj z lodowatym BMM, używając końcówek pipet przechowywanych wcześniej w temperaturze -20 °C.
      UWAGA: Zaleca się przygotowanie dwóch kopuł o pojemności 50 μL przy 2 × 105 komórek /mL, gdzie stosunek MOM do BMM wynosi 1:4. Dlatego powinieneś był; 25 μL komórek w MOM przy 8 × 105 komórek /mL oraz 75 μL BMM, co daje łącznie 100 μL, podzielonych na 2 kopuły. W ten sposób skutecznie zasije się 1 × 104 komórek na kopułę.
    9. Każdą kopułę o pojemności 50 μL należy wysiewać w środku studni na wcześniej podgrzanej 24-dołowej płytce. Umieść talerz w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5%CO2 na co najmniej 30 minut, aby BMM mógł się zastygnąć. Dodaj 500 μL MOM w temperaturze 37 °C, jak pokazano wcześniej w kroku 3.1.2, i zwróć płytkę do inkubatora.
  3. Rozbudowa
    1. Aby rozszerzyć hodowlę komórek organoidalnych do (wcześniej podgrzanej) płytki z 6 dołkami, przygotuj pięć kopuł o pojemności 50 μL w temperaturze 8 × 105 komórek /mL. Ponownie zawiesz komórki w łącznej ilości 62,5 μL MOM i wymieszaj z 187,5 μL lodowatego BMM, a następnie zasiew 5 kopuł w tym samym dołku.
    2. Przenieś płytkę do inkubatora na 30 minut, aby BMM się stwardniał. Dodaj 2 mL MOM w temperaturze 37 °C, jak pokazano wcześniej w kroku 3.1.2, i zwróć płytkę do inkubatora. Zmieniaj medium w razie potrzeby, aż komórki się zjednoczą.
      UWAGA: Aby pobrać komórki do przepuszczania, użyj 1 ml roztworu odzyskiwania komórek zamiast 500 μl i inkubuj na lodzie przez 45 minut zamiast 30 minut.
  4. Krioprezerwacja
    1. Do długotrwałego przechowywania organoidów należy przejść zgodnie z krokami 3.2.1-3.2.7. Następnie ponownie zawiesić 250 μL ośrodka zamrażającego organoidy (80% MOM, 10% FBS i 10% dimetylosulfotlenku (DMSO)) i przenieść do kriotuby. Zamroz 1 × 105 komórek na kriovial.
    2. Przechowuj tubkę w kriogenicznym pojemniku do zamrażania fiolki (np. Mr. Frosty) i pozwól jej ostygnąć w zamrażarce o temperaturze -80 °C. Do długoterminowego przechowywania należy przechowywać ogniwa w magazynie ciekłego azotu lub w zamrażarce o temperaturze -150 °C.

4. Modyfikacja genetyczna organoidów pochodzących od myszy FTE w celu opracowania nowych linii komórkowych

  1. Transdukcja spinokulacja (lentiwirusowa lub retrowirusowa)
    1. Przygotuj mieszankę 25 μL MOM i 75 μL BMM i dodaj ją do jednego z dołków zimnej (4 °C, pozwala BMM całkowicie "zwilżyć" odwiert) 48-dołowej płyty. Inkubuj w 37 °C przez 30 do 60 minut, aby BMM stwardniała przed zasiewem komórek.
    2. Pobierz pojedyncze komórki pochodzące z organoidów (krok 3.2.5) i nasiew około 2 × 10/4 na BMM. Dodaj 200 μL ciepłej (37 °C) MOM i inkubuj w temperaturze 37 °C oraz 5%CO2 przez 48 godzin.
    3. Dodaj wirusa w pożądanym stężeniu. Określ MOI eksperymentalnie; sugeruje się przybliżony MOI poniżej 30%.
      UWAGA: Organoidy są szczególnie trudne do zakażenia w porównaniu z liniami komórkowymi 2D i spodziewaj się niskich MOI nawet przy wysokim mianie wirusa. Komórki wirówkowe w 600 × g przez 60 minut w 32 °C. Po zakończeniu spinokulacji należy zwrócić płytę do inkubatora.
    4. Po 8 godzinach usuń podłoże i dodaj mieszankę 25 μL MOM i 75 μL BMM na komórki, aby "zablokować" je w BMM, co pozwala organoidom naturalnie rosnąć w 3 wymiarach. Pozwól BMM stwardnieć, wkładając talerz do inkubatora na 30-60 minut. Następnie dodaj 250 μL ciepłej (37 °C) MOM.
    5. Gdy komórki się zjednoczą, przejdź do ich przepuszczenia zgodnie z krokiem 3.2, rozszerzając całą objętość komórek do 2 kopuł w płytkach z 24 dołkami.
      UWAGA: W przypadku stosowania selekcji antybiotykowej zaleca się przeprowadzenie selekcji bezpośrednio w dołku 48-dołkowym, rozpoczynając 48 godzin po początkowej spinokulacji. W przypadku sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS) zaleca się dalsze rozszerzanie płytki z 6 dołkami, jak opisano powyżej, aby uzyskać wystarczającą liczbę komórek. Zaleca się również dłuższy (1 godzinę) czas trypsynizacji, aby zapewnić pojedyncze komórki przed filtracją próbek pod kątem przepływu.
  2. Transformacja przez elektroporację CRISPR-Cas9
    UWAGA: W przypadku stężeń i przygotowania złożonego rybonukleoproteiny (RNP) należy zapoznać się z przewodnikiem IDT Homology-Directed Repair Guide (s. 9-11)22. Jednak pomijam HDR Enhancer V2 dla knockoutów, ponieważ jest on zalecany tylko do edycji genomu wymagającej homolognej rekombinacji.
    1. Przygotuj zawiesinę jednokomórkową pochodzącą z organoidów (krok 3.2.7). Przemyj PBS i zmierz stężenie komórek. Przenieś zawiesinę komórkową zawierającą ilość mieszczącą się w zakresie 104 rzędów wielkości (1 × 104 × 10 4 ogniw) do rurki o pojemności 1,5 mL.
    2. Wirówka 350 × g przez 5 minut. Usuń supernatant i ponownie zawiesij w 10 μL bufora edycji genomu. Jeśli do elektroporacji potrzebne są >1 × 104 ogniw, przygotuj odpowiednią objętość do elektroporacji szeregowej, zapewniając, że każde 10 μL zawiera 1 × 104 do 9 × 104 ogniw.
    3. Stosując system pipety elektroporacyjne, zbieraj 10 μL zawiesiny ogniwa, zapewniając, że nie pojawią się pęcherzyki. Elektroratian w następujących warunkach: napięcie 1200 V, czas trwania impulsu 20 ms, łącznie 4 impulsy. Umieść komórki w rurce z zimnym MOM.
    4. Po elektroporacji ogniw wiruj całą zawiesinę w napięciu 350 × g przez 5 minut. Ponownie zawiesić pellet w lodowato zimnym MOM i BMM (stosunek 1:4), przygotowując tyle, by zasiać jedną kopułę na cykl elektroporacji (1 kopuła na 1104 ogniw).
    5. Umieść talerz w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5%CO2 na co najmniej 30 minut, aby BMM mógł się zastygnąć. Dodaj 500 μL MOM w temperaturze 37 °C, jak pokazano wcześniej w kroku 3.1.2, i zwróć płytkę do inkubatora.
  3. Wybór pojedynczych klonów
    1. Aby uzyskać klona pochodzącego z pojedynczej komórki, należy komórki przejściowe jak opisano powyżej, ale zasiać 50 do 100 komórek na kopułę (4 × 103 do 8 × 103 komórek /mL w zawiesinie komórkowej przed wymieszaniem z BMM).
    2. Zmieniaj MOM co 3 dni. Sprawdź, czy organoidy odpowiednio rosną i zanotuj, które są dobrze oddzielone od innych.
    3. Gdy organoidy osiągną widoczny rozmiar (około 500 μm), użyj mikroskopu świetlnego, aby zidentyfikować 4-5 dużych organoidów oddalonych od siebie na tyle.
      UWAGA: Powinny być widoczne gołym okiem, ale warto zaznaczyć spód płytki markerem cienkim końcówką, rysując okrąg wokół obszaru, w którym znajduje się organoid.
    4. Używając pipety 20-μL w sterylnym kapturze, delikatnie włóż końcówkę do BMM i aspiruj pojedynczy organoid (zasysaj objętość około 12,5 μL). Umieść organoid w probówce o pojemności 1,5 mL z 500 μL MOM.
    5. Wirówka na 350 × g przez 5 minut. Usuń supernatant i ponownie zawiesij w 500 μL enzymu TrypLE Express. Inkubuj w 37 °C przez 30 minut.
    6. Reakcję dysocjacji komórki stłumić 500 μL 3% FBS w DMEM (ośrodku 2D) i wirować w 350 × g przez 5 minut. Bardzo ostrożnie usuń supernatant, ponownie zawiesz 12,5 μL zimnego MOM, wymieszaj z 37,5 μL lodowatego BMM i zasiew całą zawiesinę jako pojedynczą kopułę 50 μL w płytce z 24 dołkami, jak opisano powyżej.
    7. Umieść talerz w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5%CO2 na co najmniej 30 minut, aby BMM mógł się zastygnąć. Dodaj 500 μL MOM w temperaturze 37 °C, jak pokazano wcześniej w kroku 3.1.2, i zwróć płytkę do inkubatora.
    8. Zmieniaj medium co 3-4 dni i przepuszczaj, gdy kopuła się łączy.

5. Wyprowadzenie linii komórkowych 2D z organoidów

  1. Hodowla komórek przejściowych
    1. Zacznij od zawiesiny pojedynczej komórki, jak po przepuszczeniu organoidów.
    2. Postępuj tak, jak przy siewaniu płyty z 6 dołkami (krok 3.3), ale zamiast tego użyj wcześniej schłodzonej (4 °C przez 24 godziny). Nasiaj kopuły na 6-dołkowej płycie przechowywanej przez noc w 4 °C i pozostaw ją na 5-10 minut w sterylnym kapturze przed wprowadzeniem do inkubatora.
      UWAGA: Ten etap pozwoli komórkom delikatnie osadzić się na dnie płyty, aby dostosować się do warunków wzrostu 2D, jednocześnie mając dostęp do komponentów ECM BMM.
    3. Inkubuj płytkę w temperaturze 37 °C i 5%CO2 przez 30 minut, następnie dodaj 2 mL MOM w temperaturze 37 °C. Zmień podłoże w razie potrzeby.
    4. Gdy organoidy osiągają zbiórkę, przejście opisane w krokach 3.2.1-3.2.7. Po ostatecznym płukaniu PBS studni, aby usunąć pozostałe BMM, należy dodać 2 mL wcześniej podgrzanego medium 2D do odwiertu.
      UWAGA: Usunięcie BMM nie usuwa komórek przymocowanych do studni, które mogą teraz swobodnie inwazować resztę studni, jednocześnie dostosowując się do warunków dwuwymiarowych/ośrodków.
    5. Gdy zostanie osiągnięte zawiesina pojedynczych komórek z komórkami pozostającymi w BMM, zasiewaj połowę objętości komórek, powtarzając krok 5.1.2. Dodaj drugą połowę oryginalnego dołu, co pozwala na zasiewanie większej liczby komórek, co przyspieszy zbieg komórek.
    6. Zmień medium 2D po 24 godzinach, aby usunąć nieprzyczepione komórki.
      UWAGA: Powinno być wiele komórek nieprzyczepionych, ponieważ komórki hodowane w BMM nie są przyzwyczajone do plastikowych podłoży i nie przyczepiają się łatwo.
    7. Powtórz krok 5.1.4. Następnie ponownie zawiesij całą objętość komórek w 4 mL podłoża 2D i zasiew 2 mL w każdym z wcześniej używanych dołków. Zmieniaj media 2D co 3-4 dni.
  2. Hodowla komórek 2D do rozszerzania
    1. Gdy komórki osiągną około 80% zbiegu się, przejdź do pierwszego passage'u.
    2. Aby przepuścić, zasysaj podłoże, raz umyj 1 ml PBS i dodaj 1 ml 0,25% trypsyny. Inkubuj komórki w temperaturze 37 °C przez 5 do 10 minut.
      UWAGA: Różne linie komórkowe mogą mieć różne właściwości adherentne, co powoduje różny czas trwania trypsynizacji. Sprawdź pod mikroskopem, czy komórki się odłączyły, zanim przejdziesz do kolejnego kroku. Delikatne stuknięcie dłonią w płytkę hodowlę komórek może pomóc w odłączeniu komórek.
    3. Gdy wszystkie komórki się odłączą, stłum dysocjację DMEM + 10% FBS i wiruj w 350 × g przez 5 minut.
    4. Przy pierwszym rozszerzeniu (gdy 80-100% się łączy), ponownie zasiewaj w stosunku 1:1. Powtarzaj krok 5.1.6 i zmieniaj nośniki 2D co 2-3 dni.
    5. Podczas drugiej ekspansji (80-100% konfluencja) zasiewaj wszystkie komórki do naczynia o średnicy 100 mm, ponownie zawieszając komórki w 10 mL podłoża 2D w temperaturze 37 °C. Powtórz krok 5.1.6 i wymień podłoże co 2-3 dni.
      UWAGA: Proces ten jest czasochłonny i może trwać nawet do pełnego miesiąca. Jeśli pracujesz z liniami komórkowymi zawierającymi geny zintegrowane z wirusem do nadekspresji białek, zaleca się utrzymywanie antybiotyków selekcyjnych w podłożu wzrostu przez cały czas. Jeśli markerem jest białko fluorescencyjne, jak najszybciej przeprowadź sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (czyli na końcu rozszerzania anteny o średnicy 100 mm).
  3. Krioprezerwacja
    1. Do przechowywania tych komórek należy przejść zgodnie z krokami 5.2.1-5.2.3. Następnie ponownie zawiesić ~1 × 106 komórek w 1 mL 2D nośnika zamrażającego, który składa się w 80% z mediów 2D, 10% FBS i 10% DMSO, i przenieść do kriotuby. Przechowuj komórki zgodnie z krokiem 3.5.2.

6. Weryfikacja linii organoidalnych

  1. Izolowanie materiału genetycznego od organoidów
    1. Zaczynając od zawiesiny jednokomórkowej, zasiewaj dwie kopuły o dwukrotności zwykłej gęstości komórek (1× 106 komórek /mL). Zmień MATKĘ 3 dnia.
    2. Piątego dnia usuń podłoże, raz przemyj PBS i dodaj 350 μL preferowanego buforu lizy bezpośrednio na kopuły. Po 5 minutach inkubacji w RT – lub do rozpuszczenia BMM – przenieś lizat do probówki o pojemności 1,5 mL.
    3. Do długotrwałego stosowania przechowywać lizat w temperaturze -80 °C. W przeciwnym razie należy stosować protokół ekstrakcji DNA i/lub RNA, stosując preferowaną technikę ekstrakcji lub zestaw komercyjny.
  2. Barwienie immunofluorescencyjne (IF)
    1. Aby przygotować komórki, należy przejść zgodnie z krokami 3.2.1-3.2.5. Ponownie zawiesz w mieszance 37,5 μL MOM i 112,5 μL lodowatego BMM (wystarczy na trzy kopuły po 50 μL, które będą działać jako biologiczne replikaty). Postępuj zgodnie z krokiem 3.2.6 i zmień media w dniu 3 i 5.
    2. Na 7. dzień aspiruj MOM i płucz komórki 500 μL PBS. Każdą kopułę należy osobno umocnić, dodając 500 μL roztworu podgrzanego (37 °C) 4% paraformaldehydu (PFA) w PBS bezpośrednio do kopuły. Inkubuj w temperaturze 37 °C przez 60 minut, aż BMM zostanie rozpuszczony.
    3. Używając szerokiej końcówki pipety P1000 (jeśli nie jest dostępna, wystarczy wyciąć zwykłą końcówkę P1000 około 0,5 cm od cienkiego końca), zebrać organoidy w 4% PFA i przenieść objętość do rurki 1,5 mL.
      UWAGA: Użycie standardowej końcówki pipety powoduje pęknięcie organoidów.
    4. Poczekaj 2 do 3 minut, aż organoidy opadną na dno rurki. Aspiruj 4% PFA (pozostawiając bezpieczną objętość, aby nie zasysać organoidów) i dodaj 500 μL PBS, aby przemyć organoidy. Powtórz ten krok jeszcze dwa razy, co daje łącznie 3 prania.
      UWAGA: Czekanie, aż organoidy opadną na dno, jest lepsze niż wirowanie, aby zachować kształt organoidów.
    5. Do długotrwałego przechowywania (4-6 tygodni) trzymaj organoidy w PBS w temperaturze 4 °C. Aby kontynuować barwienie, przepuszczaj PBS + 1% Triton-X przez 30 minut w RT. Przepraj raz PBS.
    6. Blokuj PBS + 0,2% Triton-X + 4% FBS + 1% mysich serum przez 60 minut w RT. Raz umyj PBS i pozostawij 100 μL objętości w tubce.
    7. Przygotuj bufor roboczy do barwienia przeciwciał: PBS + 0,2% Triton-X, 0,4% FBS, 0,1% surowica szczura. Ten bufor działa zarówno na przeciwciała pierwotne, jak i wtórne.
    8. Aby przygotować pierwotne barwienie przeciwciał, oblicz rozcieńczenie na dwa razy większe niż faktycznie potrzebne rozcieńczenie. Przygotuj wystarczającą ilość roztworu, aby dodać 100 μL przeciwciał do 100 μL PBS pozostałych w każdej probówce. Na przykład, dla pierwotnego rozcieńczenia 1:1000, przygotuj 100 μL roztworu 1:500.
    9. Inkubuj przez noc w temperaturze 4 °C. Następnie myj trzy razy z 500 μL PBS.
    10. Przygotuj barwnik przeciwciał wtórnych, jak wyjaśniono w kroku 6.2.8. Inkubuj przez 1 godzinę w RT.
      UWAGA: Od tego etapu upewnij się, że powierzchnię roboczą przykrywasz folią aluminiową lub preferowaną ciemną skrzynką, aby uniknąć fotobielenia fluorescencyjnej przeciwciał.
    11. Po zakończeniu wtórnego barwienia przepłukaj trzy razy 500 μL PBS. Po ostatnim przemyciu usuń jak najwięcej płynu z probówki, aby przygotować próbkę do montażu. Użyj pipety 20 μL, aby zapobiec zasysaniu organoidów.
    12. Używając końcówki pipety o szerokim przewiercie lub cięcia, dodaj 20 μL wybranego nośnika montażowego i dobrze ujednolic roztwór, unikając powstawania pęcherzyków.
    13. Włóż kroplę organoidów do roztworu montażowego na prostokątnej pokrywce. Za pomocą kleszczy umieść okrągłą pokrywkę na kroplu, unikając pęcherzyków, i pozostawij na noc do wyschnięcia w ciemności w RT. Powtórz ten krok na tym samym szkiełku, jeśli ma być umieszczona więcej niż jedna próbka na jednym preparatie.
    14. Dodaj kolejne 20 μL materiału montażowego bezpośrednio na okrągłą pokrywę. Teraz stwórz montażową "kanapkę", odwracając prostokątny pokrywak o 180° i umieszczając go na wierzchu szkiełka mikroskopu. Pozostawić do wyschnięcia w ciemności na RT przez co najmniej 8 godzin.
      UWAGA: Preparat powinien być ułożony w następującej kolejności od dołu do góry: szkiełko mikroskopowe, okrągłe okrętowe szkiełko, organoidy, prostokątne szkiełko pokrywowe. To tworzy optymalne warunki obrazowania.

7. Rozwój modeli nowotworowych u myszy

  1. Przygotowanie komórek
    1. Rozmroź jedną fiolkę z wybranymi komórkami 2D w mediach 2D. Pozwól tym komórkom rosnąć i rozszerzać się do płytki o średnicy 150 mm. Jeśli komórki mają markery selekcji antybiotykowej, należy wybrać komórki przed wstrzyknięciem, aby zapewnić czystą populację pożądanych komórek.
    2. Dla 5 zastrzyków myszy powiększ komórki do dwóch płytek o średnicy 150 mm. Gdy płytki są w 80% zbiegające, pobierz komórki, wykonując kroki 5.2.2-5.2.3. Ponownie zawieś komórki w 1 mL ośrodka Opti-MEM I o obniżonej surowicy i zmierz stężenie komórek.
      UWAGA: Każdy zastrzyk zawiera 4 × 106 komórek; Zaleca się jednak przygotowanie się do dodatkowego zastrzyku, aby uwzględnić martwą objętość strzykawek. W takim przypadku przygotuj 24 × 106 komórek zamiast 20 × 106 komórek.
    3. Umieść całą objętość komórek do wszystkich zastrzyków w probówce o pojemności 1,5 mL. Przygotuj łącznie 44 μL na zastrzyk, składających się z 1 części komórek w nieuzupełnionym Opti-MEM I oraz 1 części lodowatego BMM. Na przykład dla 24 × 106 komórek (6 zastrzyków) należy ponownie zawiesić 132 μL Opti-MEM I i 132 μL BMM.
    4. Dokładnie wymieszaj komórki i trzymaj na lodzie do czasu wykonania zastrzyku.
  2. Przygotowania do zabiegu
    1. Przygotuj myszy, goląc miejsce wstrzykiwania maszynką lub pianką do golenia.
    2. Wydmuchaj pęcherzyki powietrza z martwej objętości strzykawki (insulina U-100 28 G) za pomocą zimnego PBS.
    3. Używając komórek z probówki 1,5 mL, przygotuj pięć zastrzyków po 40 μL, powoli ładując strzykawkę, aby uniknąć lizacji komórek spowodowanych siłami ścinającymi w igle. Trzymaj się na lodzie, aż myszy zostaną uśpione.
    4. Gdy wszystko jest gotowe do zastrzyków, umieść strzykawki obok lampy grzewczej, aby stolica nagrzewała się i stała się lepka, ułatwiając wstrzykiwanie i wszczepienie. Nie umieszczaj ich bezpośrednio pod lampą grzewczą, ponieważ nadmiernie zastygły wypływ nie przejdzie przez strzykawkę prawidłowo. Ogólnie rzecz biorąc, pracuj szybko, aby temu uniknąć.
  3. Iniekcja intrabursalna (IBI) do jajnika
    1. Znieczulaj mysz C57BL/6J za pomocą roztworu koktajlowego ketaminy (10 mg/mL) i ksylazyny (1 mg/mL). Podawaj 0,1 mL na 10 g masy ciała przez iniekcję otrzewną.
      UWAGA: Młode samice myszy często wymagają zastrzyków tylko 0,2 mL, ale mogą potrzebować więcej, jeśli są starsze. Zapewnia znieczulenie przez 20-40 minut, ale nie zapewnia żadnego analgezji.
    2. Umieść mysz w klatce podgrzanej lampą grzewczą.
      UWAGA: Nie umieszczaj myszy bezpośrednio pod lampą grzewczą, ponieważ może to powodować martwicę ogona i hipertermię, co może być śmiertelne.
    3. Gdy pierwsza mysz jest całkowicie znieczulona, dezynfekuj miejsce wstrzyknięcia przy użyciu 70% EtOH. Techniką aseptyczną wytnij nacięcie o średnicy <1 cm wzdłuż boku myszy C57BL/6J w okolicy jamy brzusznej i powyżej uda. Upewnij się, że przejdziesz przez naskórek i podskórkę, zanim dotrzesz do okolicy kaletki.
    4. Ostrożnie wyciągnij jajnik (łatwo go znaleźć po przymocowanej do niego poduszce tłuszczowej). Weź jedną z przygotowanych strzykawek i powoli wstrzykuj komórki przez tłuszczową poduszkę tuż za jajnikiem, przez sam jajnik, do worka jajowódowego.
      UWAGA: Udany zastrzyk sprawi, że woreczek jajowodny zostanie objęty balonem z BMM. Mieszanka prawdopodobnie będzie też przeciekać na tłuszczową poduszkę, co jest normalne.
    5. Ostrożnie włóż jajnik z powrotem do kaletki i zamknij warstwę mięśniową za pomocą szwów nieplecionych. Następnie zamknąć nacięcie skórne za pomocą chirurgicznych zszywek.
    6. Przed wybudzeniem się z narkozy podaj 200 μL bezpłodnej soli fizjologicznej oraz 0,1 mg/kg buprenorfiny podskórnie jako środek przeciwbólowy, a także aby myszy były odpowiednio nawodnione po zabiegu.
    7. Włóż mysz z powrotem do klatki. Używaj lampy grzewczej, aby myszy były ciepłe podczas rekonwalescencji po operacji, aż staną się półprzytomne (>15 min). Ponadto podanie 200 μL bezpłodnej soli fizjologicznej oraz 0,1 mg/kg buprenorfiny podskórnie jako środek przeciwbólowy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Schemat podsumowujący proces generowania i walidacji raka jajnika HGSOC pokazano na Rysunku 1. Proces ten rozpoczyna się od usunięcia tkanki jajowodu od samicy myszy typu dzikiego typu C57BL/6J (Rysunek 2A). Zaleca się rozpoczęcie od hojnej ilości chusteczki, aby zapewnić prawidłowe zbieranie. Użycie mikroskopu rozcinującego pozwala na precyzyjną izolację jajowodu dystalnego przy jednoczesnym usuwaniu otaczających tkanek, takich jak tłuszcz i jajnik. Jak pokazan...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pomimo znaczących postępów w badaniach onkologicznych, HGSOC pozostaje najbardziej agresywnym typem nowotworów ginekologicznych i główną przyczyną śmiertelności wśród wszystkich raków jajnika 23,24. Wraz z rozwojem badań nad onkologią ginekologiczną, powinny się rozwijać także modele w nich wykorzystywane. Rzeczywiście, wiele historycznych modelowych linii komórek raka jajnika zostało odkrytych jako nieoptymalnych do badania tej choroby z kilku powodów, w tym ze ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają żadnych konfliktów interesów do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badanie to zostało wsparte przez National Institutes of Health w ramach grantu o numerze R01(CA257507). Schematy figurek zostały stworzone za pomocą BioRender. Chcemy podziękować dr Benjaminowi Neelowi za wsparcie przez cały ten projekt, dr Shuang Zhang za opracowanie oryginalnego protokołu oraz dr Kiyomi Araki za pomoc w jego optymalizacji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,25% trypsyny, 0,1% EDTA w HBSS bez wapnia, magnezu i wodorowęglanu soduCorning25053CI
A83-01Tocris Bioscience2939
Zaawansowane DMEM/F12Gibco12-634-028
Wiek C57BL/6J (kobieta)Laboratorium Jacksona000664
Mini zestaw DNA/RNA AllPrepQIAGEN80204Do ekstrakcji DNA/RNA
Alt-R S.p. Cas9-GFP V3Zintegrowane technologie DNA10008100
Przeciwciało przeciw Ki67Abcamab15580
AutoClip SystemNarzędzia Nauki Ścisłej12020-00Do zamykania rany po IBI
Suplement B-27 (50x), bez surowicyGibco17-504-001
Blastycydyna HCl (10 mg/mL) 50 mgInvivoGenANT-BL-05
Albumina surowicy bydlęcejSigma AldrichA9647
Bufor RLT PlusQIAGEN1053393Do lizy komórek przed ekstrakcją DNA/RNA
Roztwór do odzyskiwania komórekCorning354253
Kolagenaza/HialuronidazaSTEMCELL Technologies07912
CoraLite 594-Phalloidin (czerwony)ProteintechPF00003
Szyba osłonowa 15CIR-1Fisherbrand12-545-83
Szkło pokrywowe 24 mm i ostre; 40 mm-1Fisherbrand12-544-12
Suplement N-2 CTS (Cell Therapy Systems)GibcoA1370701
DAPIRoche10236276001
Deoksyrybonukleaza I (DNAse I) z trzustki bydłaSigma AldrichD5025
Mleko odtłuszczone DifcoBecton Dickinson232100
DysposSTEMCELL Technologies07913
DMEM z L-glutaminą, 4,5 g/l glukozy i pirorowinianianem soduCorning10013CV
DNaza I rekombinowana, wolna od RNazRoche04716728001
Roztwór buforowany fosforanem DulbeccoSigma AldrichD8537
Dumont #5 - Kleszcze powlekane ceramicznieNarzędzia Nauki Ścisłej11252-50Do rozwarstwiania jajowodów
Serum bydlęce płodoweCorning35-010-CVInaktywacja ciepła w 56 stopniach; C przez 60 min.
Nożyczki cienkie - ToughCutNarzędzia Nauki Ścisłej14058-09Do pobierania jajowodu i nacięcia IBI
Selektywny antybiotyk genetycyny (siarczan G418) (50 mg/mL)Gibco10131027
Suplement GlutaMAX (100x)Gibco35-050-061
Przeciwciało przeciw kozie IgG (H+L) z adsorbacją krzyżową wtórną, cyjanina3InvitrogenA10520
Kleszcze GraefeNarzędzia Nauki Ścisłej11053-10Do obsługi tkanek
Bufor HEPESCorning25060CI
Ludzkie białko R-Spondin 1 rekombinowanePeproTech120-38
Strzykawka insulinowa, U-100 0,5 mL 0,36 mm (28 G) x 12,7 mm (1/2")BDBD329461
Insulina-transferyna-selen (ITS -G) (100x)Gibco41-400-045
L-Glutamina 200 mM (100x)Gibco25-030-081
Matryca bazalna membrany Matrigel GFRCorning356231BMM
Myszy EGF Rekombinowany BiałkoPeproTech315-09
Mysie FGF-zasadowe białko rekombinantowePeproTech450-33
Mysie Białko Noggina RekombinowanePeproTech250-38
Mysze białko Wnt-3a rekombinowanePeproTech315-20
Suplement N2Gibco17502048
Amid N-acetylocysteinySigma AldrichA0737
Neon NxT System ElektroporacjiInvitrogenNEON1SDla elektroporacji CRISPR-Cas9
Neon NxT System Elektroporacji 10-μ Zestaw L z lampami jednokanałowymiInvitrogenN1025Materiały do elektroporacji, w tym bufor edycji genomu
NikotynamidSigma AldrichN3376
Normalne serum myszyInvitrogen10410
Normalne Serum SzczurzeSTEMCELL Technologies13551
Opti-MEM I Zredukowane Medium SerumGibco31985070
Przeciwciało poliklonalne PAX8Proteintech10336-1-AP
Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/mL)Gibco15-140-122
PuromycynaSigma AldrichP8833
Selectfrost 25 mm i ostry; 75 mm i ostre; 1,0 mmFisherbrand12-550-003
Triton X-100Bioreagenty FisheraBP151
Enzym TrypLE Express (1x), bez fenolu czerwonegoGibco12-604-013
Nożyczki sprężynowe Vannas – krawędź tnąca 4 mmNarzędzia Nauki Ścisłej15019-10Do rozwarstwiania jajowodów
Y27632STEMCELL Technologies72304inhibitor rhokinazy (ROCK) &

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Korch, C., et al. DNA profiling analysis of endometrial and ovarian cell lines reveals misidentification, redundancy and contamination. Gynecol. Oncol. 127 (1), 241-248 (2012).
  2. Domcke, S., Sinha, R., Levine, D. A., Sander, C., Schultz, N. Evaluating cell lines as tumour models by comparison of genomic profiles. Nat Commun. 4, 2126(2013).
  3. Anglesio, M. S., et al. Type-specific cell line models for type-specific ovarian cancer research. PLoS One. 8 (9), e72162(2013).
  4. Beaufort, C. M., et al. Ovarian cancer cell line panel (OCCP): Clinical importance of in vitro morphological subtypes. PLoS One. 9 (9), e103988(2014).
  5. Walton, J., et al. CRISPR/Cas9-mediated Trp53 and Brca2 knockout to generate improved murine models of ovarian high-grade serous carcinoma. Cancer Res. 76 (20), 6118-6129 (2016).
  6. Labidi-Galy, S. I., et al. High grade serous ovarian carcinomas originate in the fallopian tube. Nat. Commun. 8 (1), 1093(2017).
  7. Cancer Genome Atlas Research Network. Integrated genomic analyses of ovarian carcinoma. Nature. 474 (7353), 609-615 (2011).
  8. Kim, J., Coffey, D. M., Creighton, C. J., Yu, Z., Hawkins, S. M., Matzuk, M. M. High-grade serous ovarian cancer arises from fallopian tube in a mouse model. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (10), 3921-3926 (2012).
  9. Sherman-Baust, C. A., et al. A genetically engineered ovarian cancer mouse model based on fallopian tube transformation mimics human high-grade serous carcinoma development. J Pathol. 233 (3), 228-237 (2014).
  10. Perets, R., et al. Transformation of the fallopian tube secretory epithelium leads to high-grade serous ovarian cancer in Brca;Tp53;Pten models. Cancer Cell. 24 (6), 751-765 (2013).
  11. Vooijs, M., Berns, J. A. A highly efficient ligand-regulated Cre recombinase mouse line shows that LoxP recombination is position dependent. EMBO Rep. 2 (4), 293-297 (2001).
  12. Semprini, S., et al. Cryptic loxP sites in mammalian genomes: genome-wide distribution and relevance for the efficiency of BAC/PAC recombineering techniques. Nucleic Acids Res. 35 (5), 1402-1410 (2007).
  13. Loonstra, A., et al. Growth inhibition and DNA damage induced by Cre recombinase in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (16), 9209-9214 (2001).
  14. Zhang, S., et al. Genetically defined, syngeneic organoid platform for developing combination therapies for ovarian cancer. Cancer Discov. 11 (2), 362-383 (2021).
  15. Yver, S., et al. Genetically defined syngeneic mouse models of ovarian cancer as tools for the discovery of combination immunotherapy. Cancer Discov. 11 (2), 384-407 (2021).
  16. Lõhmussaar, K., et al. Assessing the origin of high-grade serous ovarian cancer using CRISPR-modification of mouse organoids. Nat. Commun. 11 (1), 2660(2020).
  17. Maniati, E., et al. Mouse ovarian cancer models recapitulate the human tumor microenvironment and patient response to treatment. Cell Reports. 30 (2), 525-540.e7 (2020).
  18. Ford, M. J., Harwalkar, K., Yamanaka, Y. Protocol to generate mouse oviduct epithelial organoids for viral transduction and whole-mount 3D imaging. STAR Protoc. 3 (1), 101164(2022).
  19. Xie, Y., Park, E. -S., Xiang, D., Li, Z. Long-term organoid culture reveals enrichment of organoid-forming epithelial cells in the fimbrial portion of mouse fallopian tube. Stem Cell Res. 32, 51-60 (2018).
  20. Zhao, Z., et al. Organoids. Nat Rev Methods Primers. 2, 94(2022).
  21. Orkin, R. W., et al. A murine tumor producing a matrix of basement membrane. J Exp Med. 145 (1), 204-220 (1977).
  22. Homology-directed repair using the Alt-R CRISPR-Cas9 System and HDR Donor Oligos. , Integrated DNA Technologies (IDT). https://idtsfprod.blob.core.windows.net/sitefinity/docs/default-source/protocol/homology-directed-repair-using-the-alt-r-crispr-cas9-system-and-hdr-donor-oligos.pdf?sfvrsn=47121607_6 (2022).
  23. Santoro, A., et al. The multiple facets of ovarian high grade serous carcinoma: A review on morphological, immunohistochemical and molecular features. Crit Rev Oncol Hematol. 208, 104603(2025).
  24. Lisio, M. -A., Fu, L., Goyeneche, A., Gao, Z., Telleria, C. High-grade serous ovarian cancer: Basic sciences, clinical and therapeutic standpoints. Int J Mol Sci. 20 (4), 952(2019).
  25. Silva-Pedrosa, R., Salgado, A. J., Ferreira, P. E. Revolutionizing disease modeling: The emergence of organoids in cellular systems. Cells. 12 (6), 930(2023).
  26. Claassen, D. A., Desler, M. M., Rizzino, A. ROCK inhibition enhances the recovery and growth of cryopreserved human embryonic stem cells and human induced pluripotent stem cells. Mol Reprod Dev. 76 (8), 722-732 (2009).
  27. Leibowitz, M., et al. Chromothripsis as an on-target consequence of CRISPR-Cas9 genome editing. Nat Genet. 53 (6), 895-905 (2021).
  28. Kopper, O., et al. An organoid platform for ovarian cancer captures intra- and interpatient heterogeneity. Nat Med. 25 (5), 838-849 (2019).
  29. Kossaï, M., Leary, A., Scoazec, J. -Y., Genestie, C. Ovarian cancer: A heterogeneous disease. Pathobiology. 85 (1-2), 41-49 (2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Organoidy jajowod wmysi model nowotworuhodowla organoid win ynieria genetycznadelecja CRISPR Cas9nadekspresja lentiwirusowainterakcje z uk adem odporno ciowyminiekcja do gie dy jajnika

Powiązane artykuły