Zweryfikowany przepływ pracy do przetwarzania danych MiRNA-Seq i analizy bioinformatycznej przy użyciu R

Summary

W tym miejscu przedstawiamy protokół do analizy danych miRNA-Seq za pomocą R. Przepływ pracy umożliwia naukowcom badanie sieci regulowanych miRNA i ich znaczenia w różnych kwestiach biologicznych i klinicznych. Praca ta ma służyć jako praktyczny przewodnik zarówno dla początkujących, jak i doświadczonych badaczy w dziedzinie bioinformatyki miRNA.

Abstract

MikroRNA (miRNA) są krytycznymi regulatorami potranskrypcyjnymi, które wpływają na szeroki zakres procesów fizjologicznych i patologicznych. Wraz z postępem technologii sekwencjonowania o wysokiej przepustowości, miRNA-Seq stał się potężnym narzędziem do profilowania wzorców ekspresji miRNA. Jednak wiarygodna interpretacja takich danych wymaga ustandaryzowanego i powtarzalnego procesu analizy. W tym miejscu przedstawiamy zweryfikowany przepływ pracy do przetwarzania danych miRNA-Seq i analizy bioinformatycznej z wykorzystaniem R. Protokół ten obejmuje wszystkie niezbędne kroki, w tym wstępne przetwarzanie danych surowych, kontrolę jakości, dostosowanie, kwantyfikację, normalizację, analizę różnicową wyrażeń, przewidywanie celów, wzbogacanie funkcjonalne i budowę sieci regulacyjnej. Zaprojektowany z myślą o elastyczności i przejrzystości, przepływ pracy integruje powszechnie stosowane pakiety języka R i obsługuje adnotacje specyficzne dla gatunku oraz dostosowywanie modułowe. Ponadto użytkownicy są prowadzeni do przeprowadzania dalszej interpretacji biologicznej, wykorzystując wyselekcjonowane bazy danych i narzędzia do wizualizacji, takie jak Cytoscape. Protokół ten nie tylko wspiera solidną analizę statystyczną, ale także umożliwia znaczący wgląd w interakcje miRNA-mRNA i ich rolę w mechanizmach chorobowych. Szczególnie dobrze nadaje się zarówno dla początkujących, jak i doświadczonych badaczy zajmujących się odkrywaniem biomarkerów miRNA, modelowaniem chorób lub integracyjnymi badaniami multiomicznymi.

Introduction

MikroRNA (miRNA) to krótkie, niekodujące cząsteczki RNA, które znacząco wpływają na ekspresję genów, działając w fazie potranskrypcyjnej¹. Zazwyczaj działają poprzez wiązanie się z komplementarnymi sekwencjami w nieulegających translacji regionach 3' (UTR) docelowych informacyjnych RNA (mRNA), co prowadzi do degradacji mRNA lub represji translacyjnej¹. W ciągu ostatnich dwóch dekad miRNA są coraz częściej uznawane za centralne regulatory różnych procesów biologicznych, w tym proliferacji komórek, różnicowania, apoptozy, odpowiedzi immunologicznych i rozwoju narządów². Co więcej, rozregulowanie ekspresji miRNA jest związane z patogenezą wielu chorób, takich jak nowotwory, choroby układu krążenia, zaburzenia neurologiczne i choroby nerek³. Odkrycia te podkreślają potencjał miRNA nie tylko jako celów terapeutycznych, ale także jako minimalnie inwazyjnych biomarkerów w diagnostyce klinicznej.

Wraz z pojawieniem się technologii sekwencjonowania nowej generacji (NGS) badanie miRNA wkroczyło w nową erę. W przeciwieństwie do metod opartych na mikromacierzach, które są ograniczone do znanych miRNA, sekwencjonowanie miRNA (miRNA-Seq) umożliwia kompleksowe, wysokoprzepustowe i bezstronne profilowanie zarówno znanych, jak i nowych miRNA w różnych typach próbek i warunkach⁴. miRNA-Seq zapewnia doskonałą czułość, dokładność i zakres dynamiki, co czyni go preferowaną metodą badania wzorców ekspresji miRNA i odkrywania mechanizmów regulacyjnych w warunkach fizjologicznych i patologicznych⁵. Jednak analiza danych miRNA-Seq wiąże się ze szczególnymi wyzwaniami obliczeniowymi, w tym obsługą krótkich długości odczytu, usuwaniem sekwencji adapterów, rozróżnianiem blisko spokrewnionych członków rodziny miRNA i zarządzaniem wysoką nadmiarowością w liczbie odczytów⁶. Cechy te wymagają starannie zaprojektowanego i ustandaryzowanego przepływu pracy analitycznej.

Chociaż do analizy danych miRNA-Seq opracowano różne potoki i narzędzia programowe, wiele z nich opiera się na graficznych interfejsach użytkownika lub stałych przepływach pracy, które ograniczają elastyczność i odtwarzalność⁷. W przeciwieństwie do tego, środowisko programistyczne R zapewnia potężną i konfigurowalną platformę do analizy bioinformatycznej⁸. R oferuje bogaty ekosystem pakietów do modelowania statystycznego, wizualizacji danych i integracji z biologicznymi bazami danych. Dzięki temu użytkownicy mogą przeprowadzać kompleksowe i powtarzalne analizy w sposób przejrzysty i oparty na skryptach. Co więcej, modułowy charakter przepływów pracy języka R pozwala badaczom dostosować każdy krok do konkretnych wymagań eksperymentalnych, od wstępnego przetwarzania surowych danych po interpretację funkcjonalną.

W tym protokole przedstawiamy zweryfikowany i kompletny przepływ pracy analizy miRNA-Seq zaimplementowany w całości w R, w celu zapewnienia powtarzalnego i adaptowalnego przez użytkownika rozwiązania dla badaczy pracujących z danymi dotyczącymi ekspresji miRNA. Przepływ pracy rozpoczyna się od kontroli jakości i przycinania adapterów surowych odczytów sekwencjonowania, a następnie dopasowywania do genomu referencyjnego lub znanych sekwencji miRNA. Kolejne kroki obejmują kwantyfikację liczby odczytów, normalizację, różnicową analizę ekspresji, przewidywanie docelowych genów, wzbogacanie funkcjonalne i wizualizację sieci. Przepływ pracy obejmuje kilka powszechnie używanych i dobrze utrzymywanych pakietów języka R, zapewniając zarówno niezawodność, jak i zgodność z przyszłymi aktualizacjami i rozszerzeniami.

Jedną z głównych zalet tego protokołu jest jego zdolność do wyjścia poza zróżnicowane wyniki ekspresji i zapewnienia znaczącej interpretacji biologicznej. Dzięki integracji wyselekcjonowanych baz danych zwalidowanych i przewidywanych interakcji miRNA-mRNA, przepływ pracy umożliwia użytkownikom identyfikację biologicznie istotnych genów docelowych. Cele te można następnie poddać ontologii genów i analizom wzbogacania szlaków w celu odkrycia dotkniętych procesów biologicznych i szlaków molekularnych. W ostatnim etapie sieci interakcji miRNA-mRNA można wizualizować za pomocą zewnętrznych narzędzi, takich jak Cytoscape⁹, zapewniając wgląd w krajobraz regulacyjny i identyfikując kluczowe miRNA o potencjalnym znaczeniu funkcjonalnym.

Metoda ta została z powodzeniem zastosowana w kontekstach badań klinicznych, w tym w badaniach nad chorobami nerek, w których krążące miRNA służą jako obiecujące biomarkery do diagnozowania i rokowania¹⁰. Jednak modułowa i elastyczna konstrukcja przepływu pracy sprawia, że nadaje się on do szerokiego zakresu zastosowań, w tym modelowania chorób, badań odpowiedzi na leki, biologii rozwojowej i genomiki porównawczej. Badacze mogą łatwo dostosować przepływ pracy, aby uwzględnić adnotacje specyficzne dla gatunku, warunki eksperymentalne lub dodatkowe warstwy danych omicznych.

Oferując rozwiązanie oparte na skryptach typu open source, ten potok skoncentrowany na języku R rozwiązuje kilka głównych ograniczeń związanych z istniejącymi narzędziami miRNA-Seq, w tym ograniczoną personalizację, zależność od nieprzezroczystych interfejsów graficznych, brak wsparcia dla organizmów niemodelowych, słabą odtwarzalność z powodu braku kontroli wersji oraz trudności w integracji z ramami analizy statystycznej i funkcjonalnej. Umożliwia pełną kontrolę nad parametrami przetwarzania danych, zachęca do odtwarzalności dzięki kodowi sterowanemu wersją i promuje przejrzystość w badaniach bioinformatycznych. Ponieważ znaczenie miRNA w kontekście biologii systemowej i medycyny translacyjnej stale rośnie, dostęp do wiarygodnych i elastycznych ram analizy staje się coraz bardziej istotny.

Protocol

UWAGA: Materiały z linkami do oprogramowania są wymienione w Tabeli materiałów.

1. Przygotowanie próbek RNA i bibliotek sekwencji

UWAGA: Ekstrakcję i sekwencjonowanie RNA należy wykonywać poza tym obliczeniowym przepływem pracy. Istnieje więcej niż jeden sposób analizy danych sekwencjonowania miRNA. W tej sekcji przedstawiono kontekst jednego praktycznego aspektu.

1. Ekstrakcja całkowitego RNA: Ekstrakcja całkowitego RNA z próbek biologicznych za pomocą zestawu zoptymalizowanego pod kątem izolacji małych RNA (np. Zestaw do izolacji miRNA). Postępuj zgodnie z protokołem producenta. Upewnij się, że używasz materiałów eksploatacyjnych wolnych od RNaz i przechowuj próbki na lodzie, aby zminimalizować degradację.
2. Oceń integralność i ilość RNA: Uruchom 1-2 μl wyekstrahowanego RNA na bioanalizatorze lub równoważnym urządzeniu. Sprawdź numer integralności RNA (RIN) i upewnij się, że wynosi on ≥ 7,0, aby zapewnić niezawodne sekwencjonowanie. Zapisać stężenie za pomocą spektrofotometru lub fluorometru.
3. Zbuduj małe biblioteki RNA: Przygotuj biblioteki sekwencjonowania z 1 μg całkowitego RNA za pomocą komercyjnego zestawu do przygotowywania małych bibliotek sekwencyjnych RNA. Postępuj zgodnie z protokołem zestawu, aby podwiązywać adaptery, dokonywać odwrotnej transkrypcji i amplifikować cDNA. Oczyść produkty PCR z wyborem wielkości (np. Wstawka 18-30 nt), aby wzbogacić o fragmenty miRNA.
4. Biblioteki sekwencji: Załaduj biblioteki na platformę sekwencjonowania o wysokiej przepływności. Ustaw konfigurację uruchamiania dla sekwencjonowania pojedynczego końca z długością odczytu ~50 bp. Upewnij się, że każda próbka generuje około 10 milionów nieprzetworzonych odczytów, aby osiągnąć wystarczającą głębokość.
5. Eksport danych wyjściowych sekwencjonowania: Po sekwencjonowaniu wyeksportuj surowe dane jako pliki FASTQ za pomocą oprogramowania do wyprowadzania danych instrumentu. Sprawdź, czy katalog wyjściowy zawiera zarówno odczyty sekwencji, jak i skojarzone pliki oceny jakości. Przechowuj pliki FASTQ w ustrukturyzowanym katalogu do dalszej analizy.

2. Wstępnie przetwarzaj surowe odczyty i przeprowadzaj kontrolę jakości

1. Sekwencje adapterów przycinania
   1. Zainstaluj i skonfiguruj Cutadapt lub fastp.
   2. Uruchom przycinanie adaptera dla każdego pliku FASTQ za pomocą następującego polecenia:
      cutadapt -a XXXX -o trimmed_reads.fastq raw_reads.fastq
      UWAGA: Sekwencja adaptera następująca po '-a' powinna mieć zastosowanie do określonego zestawu do przygotowania biblioteki sRNA. '-o' definiuje nazwę pliku wyjściowego z następującym plikiem wejściowym.
2. Oceń jakość odczytu
   1. Użyj FastQC do generowania raportów kontroli jakości:
      fastqc trimmed_reads.fastq
   2. Przeglądanie podstawowych wyników jakości, rozkładu długości odczytu i zanieczyszczenia adaptera: Otwórz raport HTML FastQC wygenerowany dla każdego pliku FASTQ w przeglądarce internetowej. Sprawdź krok po kroku następujące moduły:
      1. Jakość sekwencji na bazę: Upewnij się, że większość zasad mieści się w zielonej strefie (wynik Phred ≥30). Zwróć uwagę na wszelkie spadki jakości na końcu 3′, które mogą wskazywać na błędy sekwencjonowania.
      2. Odczyt rozkładu długości: Upewnij się, że rozkład odpowiada oczekiwanemu rozmiarowi insertu (np. 18-30 nt dla miRNA). Sprawdź, czy nie występują nieoczekiwane szczyty.
      3. Zawartość adaptera: Sprawdź, czy sekwencje adaptera zostały skutecznie przycięte. Upewnij się, że procent zanieczyszczenia adaptera jest bliski zeru po przycięciu.
   3. Zapisz raport podsumowujący FastQC i oznacz wszystkie próbki o niskiej jakości do ponownego przycięcia lub wykluczenia z dalszej analizy.

3. Mapa odczytuje i generuje macierze zliczania

1. Wyrównaj odczyty do odwołania
   1. Pobierz plik FASTA z genomem referencyjnym lub dojrzałymi sekwencjami miRNA (np. z miRBazy)¹¹. Przykład:
      wget ftp://mirbase.org/pub/mirbase/CURRENT/mature.fa
   2. Indeksuj genom referencyjny za pomocą muszki.
      1. Otwórz terminal i uruchom następujące polecenie, aby skompilować indeks:
         bowtie-build reference.fa reference_index
      2. Zastąp reference.fa rzeczywistą nazwą pliku FASTA.
      3. Zastąp reference_index żądanym prefiksem indeksu.
      4. Upewnij się, że Bowtie generuje wiele plików indeksu (np. .ebwt). Sprawdź, czy te pliki znajdują się w katalogu roboczym, ponieważ są wymagane do wyrównania.
   3. Wyrównaj odczyty za pomocą muszki z odpowiednimi parametrami dla krótkich odczytów. Przykład:
      bowtie -v 0 -a --best --strata reference_index trimmed_reads.fastq > aligned_reads.sam
      UWAGA: Plik wejściowy to trimmed_reads.fastq, a plik wyjściowy to aligned_reads.sam. '-v 0' oznacza, że nie dopuszczamy do błędu w całym odczycie. '-a -best -strata' oznacza, że odrzucamy każde wyrównanie, które ma więcej niezgodności niż najlepsze.
2. Ilościowe określenie ekspresji miRNA
   1. Konwertuj pliki SAM do formatu BAM za pomocą SAMtools.
      samtools view -S -b aligned_reads.sam > aligned_reads.bam
      UWAGA: Plik wejściowy aligned_reads.sam jest wynikiem ostatniego polecenia. Plik wyjściowy aligned_reads.bam jest przygotowywany do późniejszej analizy.
      1. Użyj narzędzi SAMtools, aby skompresować i posortować plik wyrównania:
         samtools sort aligned_reads.bam -o aligned_reads_sorted.bam
samtools index aligned_reads_sorted.bam
      2. Upewnij się, że pierwsze polecenie konwertuje plik SAM na format BAM.
      3. Upewnij się, że drugie polecenie sortuje plik BAM według współrzędnych genomowych.
      4. Upewnij się, że trzecie polecenie generuje plik indeksu (.bai), który jest wymagany do dalszych analiz.
      5. Upewnij się, że zarówno posortowany plik BAM, jak i jego indeks zostały pomyślnie utworzone przed przystąpieniem do kwantyfikacji.
   2. Użyj featureCounts lub HTSeq-count, aby wygenerować macierz zliczania przy użyciu adnotacji miRNA GTF:
      featureCounts -a miRNA.gtf -o counts.txt aligned_reads.bam
      UWAGA: featureCounts kwantyfikuje odczyty w pliku wejściowym aligned_reads.bam na podstawie miRNA.gtf i wyprowadza counts.txt.

4. Wykonaj analizę wyrażeń różnicowych w R

1. Załaduj dane dotyczące liczby
   1. Zaimportuj macierz liczb i przykładowe metadane do języka R:
      library(DESeq2)
countData <- read.csv("counts.csv", row.names=1)
colData <- read.csv("metadata.csv", row.names=1)
dds <- DESeqDataSetFromMatrix(countData = countData, colData = colData, design = ~ condition)
      UWAGA: Dane dotyczące zliczania (counts.csv) i grupy próbek (metadata.csv) należy dostarczyć do DESeq2. "Warunek" w tym miejscu wyjaśnia grupę dostarczonych próbek. W przypadku indywidualnych wymagań zapoznaj się z instrukcją DESeq2¹².
2. Normalizowanie i przekształcanie danych
   1. Normalizuj dane zliczania przy użyciu domyślnej metody DESeq2:
      dds <- DESeq(dds)
   2. Wykonaj transformację stabilizującą wariancję:
      vsd <- vst(dds, blind=FALSE)
   3. Wizualizacja grupowania próbek przy użyciu PCA:
      plotPCA(vsd, intgroup="condition")
3. Identyfikacja miRNA o zróżnicowanej ekspresji
   1. Wyodrębnianie i sortowanie wyników wyrażeń różnicowych:
      res <- results(dds)
resOrdered <- res[order(res$pvalue), ]
      UWAGA: Zmieniamy kolejność pliku wyników "res" na podstawie wartości pvalue.
      summary(res)
   2. Filtr do miRNA o istotnej zróżnicowanej ekspresji (wartość p < 0,05, |log2FC| > 1).
      sig_miRNA <- subset(res, pvalue < 0.05 & abs(log2FC) > 1)
      UWAGA: Istnieje wiele progów filtrowania znacznie zmienionych miRNA. Wymagania 'wartość p < 0,05, |log2FC| > 1' są szeroko stosowane. Progi można dostosować do poszczególnych danych.
4. Wizualizacja zmian wyrażeń
   1. Zainstaluj i załaduj pakiet EnhancedVolcano.
   2. Utwórz działkę wulkanu:
      library(EnhancedVolcano)
EnhancedVolcano(res,
lab = rownames(res),
x = 'log2FoldChange',
y = 'pvalue',
title = 'Differentially Expressed miRNAs')

5. Przewiduj docelowe geny miRNA

1. Wykonywanie zapytań dotyczących baz danych
   1. Korzystaj z zasobów online, takich jak TargetScan, miRDB i miRTarBase, aby wyszukać określone mikroRNA i pobrać docelowe geny.
   2. Skoncentruj się na eksperymentalnie potwierdzonych celach, aby uzyskać większą pewność.
2. Automatyzowanie przewidywania w języku R
   1. Załaduj pakiet multiMiR i wykonaj zapytanie o zweryfikowane cele:
      library(multiMiR)
target_results <- get_multimir(mirna = c("hsa-miR-21-5p"), table = "validated")
      UWAGA: Tutaj bierzemy na przykład "has-miR-21-5p" i otrzymujemy zweryfikowane cele.
   2. Wyodrębnij unikalne symbole genów docelowych do analizy wzbogacenia:
      genes <- unique(target_results@data$target_symbol)

6. Przeprowadź analizę wzbogacenia funkcjonalnego

1. Wykonywanie wzbogacania języka GO
   1. Narzędzia do wzbogacania ładunku:
      library(clusterProfiler)
library(org.Hs.eg.db)
      UWAGA: W tym miejscu ładujemy bazę danych zawierającą adnotacje ludzkiego genomu, które są przydatne do konwersji typowych identyfikatorów genów.
   2. Uruchom analizę wzbogacania GO dla procesów biologicznych:
      ego <- enrichGO(gene = genes,
OrgDb = org.Hs.eg.db,
keyType = "SYMBOL",
ont = "BP",
pAdjustMethod = "BH",
pvalueCutoff = 0.05)
dotplot(ego)
      UWAGA: Na potrzeby korzystania z enrichGO udostępniamy listę genów i wyjaśniamy, że są one oznaczone jako "SYMBOL" tutaj. Przeprowadziliśmy wzbogacanie procesu biologicznego, co odpowiada parametrowi 'ont ="BP" '. Wykonujemy wielokrotną korektę testów, dlatego oznaczamy pAdjustMethod = "BH". W przypadku znaczącego progu wybieramy pvalueCutoff = 0.05.dotplot przedstawia zwizualizowany wynik. Aby uzyskać bardziej szczegółowe opcje, zapoznaj się z podręcznikiem clusterProfiler¹³.
2. Wykonaj wzbogacanie szlaku KEGG
   1. Uruchom wzbogacanie KEGG:
      ekegg <- enrichKEGG(gene = genes, organism = 'hsa')
dotplot(ekegg)
      UWAGA: Na potrzeby korzystania z enrichKEGG udostępniamy listę genów i wyjaśniamy, że organizm jest człowiekiem ("ma"). dotplot przedstawia zwizualizowany wynik. Aby uzyskać bardziej szczegółowe opcje, zapoznaj się z podręcznikiem clusterProfiler¹³.

7. Zbuduj i zwizualizuj sieć interakcji miRNA - mRNA

1. Eksport danych do wizualizacji sieci
2. Utwórz ramkę danych par genów miRNA-cel na podstawie celów wygenerowanych przez TargetScan, miRDB lub miRTarBase.
3. Zapisz tabelę sieciową w pliku CSV:
   write.csv(miRNA_target_pairs, "network.csv")
4. Importuj do Cytoscape
   1. Otwórz Cytoscape i zaimportuj tabelę sieciową.
   2. Wizualizacja sieci za pomocą układu wymuszonego lub kołowego.
   3. Analizuj właściwości topologiczne (np. centralność stopnia) w celu identyfikacji miRNA piasty.

Results

Pobraliśmy matrycę ekspresji mikroRNA z GSE133530 i przeprowadziliśmy bezpośrednio analizę ekspresji różnicowej. Udostępniliśmy przykładowy analityczny skrypt języka R dla zestawu danych w pliku uzupełniającym 1. W zestawie danych przeprowadzono globalne profilowanie miRNA na 16 torbielach nerek o różnych rozmiarach (torbiele minimalne: mniej niż 1-5 ml, n = 10; torbiele średnie: między 10-25 ml, n = 4; duże torbiele: większe niż 50 ml, n = 4) i minimalnie torbielowatej t...

Discussion

Analiza danych miRNA-Seq stanowi wyraźne wyzwanie ze względu na mały rozmiar i nadmiarowość odczytów, co sprawia, że rygorystyczna kontrola jakości i wstępne przetwarzanie mają kluczowe znaczenie. Jednym z najważniejszych kroków w przepływie pracy jest przycinanie adaptera. Ponieważ miRNA mają około 22 nukleotydy długości, sekwencje adapterowe mogą łatwo zdominować odczyty, jeśli nie zostaną odpowiednio usunięte. Niewykonanie dokładnego przycinania może spowodować niewspółosiowość i napompowanie wyników fałszywie dodatni...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agilent-021827 Ludzka mikromacierz miRNA	Agilent	/	Komercyjna matryca do profilowania mikroRNA próbek pobranych od ludzi
Muszka	Uniwersytet Johnsa Hopkinsa	http://bowtie-bio.sourceforge.net/index.shtml	Narzędzie programowe do wyrównywania odczytów sekwencjonowania do długich sekwencji referencyjnych
clusterProfiler (pakiet języka R)	Bioprzewodnik	https://bioconductor.org/packages/clusterProfiler/	Pakiet R przeznaczony do funkcjonalnej analizy wzbogacania i wizualizacji wysokoprzepustowych danych biologicznych.
Cutadapt (Cięcie)	Otwarty kod źródłowy	https://cutadapt.readthedocs.io	Narzędzie wiersza polecenia, które usuwa sekwencje adapterów, startery, ogony poly-A i inne niechciane fragmenty z odczytów sekwencjonowania o wysokiej przepustowości.
Cytoscape (Cytokrajobraz)	Konsorcjum Cytoscape	https://cytoscape.org/	Platforma oprogramowania typu open source przeznaczona do wizualizacji i analizy złożonych sieci biologicznych.
DESeq2 (pakiet R)	Bioprzewodnik	https://bioconductor.org/packages/DESeq2/	Pakiet R przeznaczony do różnicowej analizy ekspresji genów w danych zliczeniowych
Ulepszony wulkan (pakiet R)	Bioprzewodnik	https://bioconductor.org/packages/EnhancedVolcano/	Pakiet R przeznaczony do tworzenia wykresów wulkanicznych o jakości publikacji.
Szybka kontrola jakości	Babraham Bioinformatyka	https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/	Narzędzie do kontroli jakości typu open source do sekwencjonowania danych o wysokiej przepustowości.
featureCounts (liczba elementów)	Pododczyt / SourceForge	http://subread.sourceforge.net/	Program używany do zliczania odczytów zmapowanych na cechy genomowe
Liczba HTSeq	Pakiet Pythona	https://htseq.readthedocs.io	Narzędzie wiersza polecenia, które zlicza, ile wyrównanych odczytów sekwencjonowania o wysokiej przepustowości nakłada się na cechy genomowe, takie jak geny lub eksony. Ja
Illumina Human v2 Chip do ekspresji mikroRNA	Iluminacja	/	Komercyjna matryca do profilowania mikroRNA próbek pobranych od ludzi
multiMiR (pakiet R)	Bioprzewodnik	https://bioconductor.org/packages/multiMiR/	Pakiet R, który zapewnia największą zintegrowaną kolekcję przewidywanych i eksperymentalnie zwalidowanych mikroRNA– docelowych interakcji wraz z ich powiązaniami z chorobami i lekami.
Org. Hs.eg.db (pakiet R)	Bioprzewodnik	https://bioconductor.org/packages/org.Hs.eg.db/	Pakiet adnotacji przeznaczony do badań genomicznych człowieka (Homo sapiens).
Oprogramowanie R	Projekt R	https://www.r-project.org/	Projekt typu open source do obliczeń statystycznych
Rstudio (rstudio)	Załóżmy, że PBC	/	Zintegrowane środowisko programistyczne pomaga zwiększyć produktywność w językach R i Python
Narzędzia SAMtools	Otwarty kod źródłowy	http://www.htslib.org/	Pakiet oprogramowania do manipulowania danymi sekwencjonowania nowej generacji (NGS).