Method Article

Zweryfikowany przepływ pracy do przetwarzania danych MiRNA-Seq i analizy bioinformatycznej przy użyciu R

DOI:

10.3791/68760

⸱

October 24th, 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Nephrology, 905th Hospital of PLA Navy, Naval Medical University, 2Department of Nephrology, Naval Medical Center of PLA, Naval Medical University, 3Department of Nephrology, Gongli Hospital of Shanghai Pudong New Area, 4Department of Nephrology, Shanghai Changzheng Hospital, Second Affiliated Hospital of Naval Medical University (Second Military Medical University), 5Department of Cellular Biology and Anatomy, Medical College of Georgia at Augusta University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tym miejscu przedstawiamy protokół do analizy danych miRNA-Seq za pomocą R. Przepływ pracy umożliwia naukowcom badanie sieci regulowanych miRNA i ich znaczenia w różnych kwestiach biologicznych i klinicznych. Praca ta ma służyć jako praktyczny przewodnik zarówno dla początkujących, jak i doświadczonych badaczy w dziedzinie bioinformatyki miRNA.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MikroRNA (miRNA) są krytycznymi regulatorami potranskrypcyjnymi, które wpływają na szeroki zakres procesów fizjologicznych i patologicznych. Wraz z postępem technologii sekwencjonowania o wysokiej przepustowości, miRNA-Seq stał się potężnym narzędziem do profilowania wzorców ekspresji miRNA. Jednak wiarygodna interpretacja takich danych wymaga ustandaryzowanego i powtarzalnego procesu analizy. W tym miejscu przedstawiamy zweryfikowany przepływ pracy do przetwarzania danych miRNA-Seq i analizy bioinformatycznej z wykorzystaniem R. Protokół ten obejmuje wszystkie niezbędne kroki, w tym wstępne przetwarzanie danych surowych, kontrolę jakości, dostosowanie, kwantyfikację, normalizację, analizę różnicową wyrażeń, przewidywanie celów, wzbogacanie funkcjonalne i budowę sieci regulacyjnej. Zaprojektowany z myślą o elastyczności i przejrzystości, przepływ pracy integruje powszechnie stosowane pakiety języka R i obsługuje adnotacje specyficzne dla gatunku oraz dostosowywanie modułowe. Ponadto użytkownicy są prowadzeni do przeprowadzania dalszej interpretacji biologicznej, wykorzystując wyselekcjonowane bazy danych i narzędzia do wizualizacji, takie jak Cytoscape. Protokół ten nie tylko wspiera solidną analizę statystyczną, ale także umożliwia znaczący wgląd w interakcje miRNA-mRNA i ich rolę w mechanizmach chorobowych. Szczególnie dobrze nadaje się zarówno dla początkujących, jak i doświadczonych badaczy zajmujących się odkrywaniem biomarkerów miRNA, modelowaniem chorób lub integracyjnymi badaniami multiomicznymi.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MikroRNA (miRNA) to krótkie, niekodujące cząsteczki RNA, które znacząco wpływają na ekspresję genów, działając w fazie potranskrypcyjnej1. Zazwyczaj działają poprzez wiązanie się z komplementarnymi sekwencjami w nieulegających translacji regionach 3' (UTR) docelowych informacyjnych RNA (mRNA), co prowadzi do degradacji mRNA lub represji translacyjnej1. W ciągu ostatnich dwóch dekad miRNA są coraz częściej uznawane za centralne regulatory różnych procesów biologicznych, w tym proliferacji komórek, różnicowania, apoptozy, odpowiedzi immunologicznych i rozwoju narządów2. Co więcej, rozregulowanie eks....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Materiały z linkami do oprogramowania są wymienione w Tabeli materiałów.

1. Przygotowanie próbek RNA i bibliotek sekwencji

UWAGA: Ekstrakcję i sekwencjonowanie RNA należy wykonywać poza tym obliczeniowym przepływem pracy. Istnieje więcej niż jeden sposób analizy danych sekwencjonowania miRNA. W tej sekcji przedstawiono kontekst jednego praktycznego aspektu.

  1. Ekstrakcja całkowitego RNA: Ekstrakcja całkowitego RNA z próbek biologicznych za pomocą zestawu zoptymalizowanego pod kątem izolacji małych RNA (np. Zestaw do izolacji miRNA). Postępuj zgodnie z protokołem p....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pobraliśmy matrycę ekspresji mikroRNA z GSE133530 i przeprowadziliśmy bezpośrednio analizę ekspresji różnicowej. Udostępniliśmy przykładowy analityczny skrypt języka R dla zestawu danych w pliku uzupełniającym 1. W zestawie danych przeprowadzono globalne profilowanie miRNA na 16 torbielach nerek o różnych rozmiarach (torbiele minimalne: mniej niż 1-5 ml, n = 10; torbiele średnie: między 10-25 ml, n = 4; duże torbiele: większe niż 50 ml, n = 4) i minimalnie torbielowatej t.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Analiza danych miRNA-Seq stanowi wyraźne wyzwanie ze względu na mały rozmiar i nadmiarowość odczytów, co sprawia, że rygorystyczna kontrola jakości i wstępne przetwarzanie mają kluczowe znaczenie. Jednym z najważniejszych kroków w przepływie pracy jest przycinanie adaptera. Ponieważ miRNA mają około 22 nukleotydy długości, sekwencje adapterowe mogą łatwo zdominować odczyty, jeśli nie zostaną odpowiednio usunięte. Niewykonanie dokładnego przycinania może spowodować niewspółosiowość i napompowanie wyników fałszywie dodatni.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy agencjom finansującym i współpracownikom wspierającym ten projekt. Plan działania na rzecz innowacji naukowych i technologicznych w Szanghaju (22Y11905500, 24142201800), Projekt instytucjonalny szpitala Marynarki Wojennej ChALW nr 905 (2024Q021), projekt badawczy młodzieży Komitetu Zdrowia Dystryktu Changning (2024QN29) oraz projekt badawczy Uniwersytetu Medycznego Marynarki Wojennej (2024QN040).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Agilent-021827 Ludzka mikromacierz miRNAAgilent/Komercyjna matryca do profilowania mikroRNA próbek pobranych od ludzi
MuszkaUniwersytet Johnsa Hopkinsahttp://bowtie-bio.sourceforge.net/index.shtmlNarzędzie programowe do wyrównywania odczytów sekwencjonowania do długich sekwencji referencyjnych
clusterProfiler (pakiet języka R)Bioprzewodnikhttps://bioconductor.org/packages/clusterProfiler/Pakiet R przeznaczony do funkcjonalnej analizy wzbogacania i wizualizacji wysokoprzepustowych danych biologicznych.
Cutadapt (Cięcie)Otwarty kod źródłowyhttps://cutadapt.readthedocs.ioNarzędzie wiersza polecenia, które usuwa sekwencje adapterów, startery, ogony poly-A i inne niechciane fragmenty z odczytów sekwencjonowania o wysokiej przepustowości.
Cytoscape (Cytokrajobraz)Konsorcjum Cytoscapehttps://cytoscape.org/Platforma oprogramowania typu open source przeznaczona do wizualizacji i analizy złożonych sieci biologicznych.
DESeq2 (pakiet R)Bioprzewodnikhttps://bioconductor.org/packages/DESeq2/Pakiet R przeznaczony do różnicowej analizy ekspresji genów w danych zliczeniowych
Ulepszony wulkan (pakiet R)Bioprzewodnikhttps://bioconductor.org/packages/EnhancedVolcano/  Pakiet R przeznaczony do tworzenia wykresów wulkanicznych o jakości publikacji.
Szybka kontrola jakościBabraham Bioinformatykahttps://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/Narzędzie do kontroli jakości typu open source do sekwencjonowania danych o wysokiej przepustowości.
featureCounts (liczba elementów)Pododczyt / SourceForgehttp://subread.sourceforge.net/Program używany do zliczania odczytów zmapowanych na cechy genomowe
Liczba HTSeqPakiet Pythonahttps://htseq.readthedocs.ioNarzędzie wiersza polecenia, które zlicza, ile wyrównanych odczytów sekwencjonowania o wysokiej przepustowości nakłada się na cechy genomowe, takie jak geny lub eksony. Ja
Illumina Human v2 Chip do ekspresji mikroRNAIluminacja /Komercyjna matryca do profilowania mikroRNA próbek pobranych od ludzi
multiMiR (pakiet R)Bioprzewodnikhttps://bioconductor.org/packages/multiMiR/Pakiet R, który zapewnia największą zintegrowaną kolekcję przewidywanych i eksperymentalnie zwalidowanych mikroRNA– docelowych interakcji wraz z ich powiązaniami z chorobami i lekami.
Org. Hs.eg.db (pakiet R)Bioprzewodnikhttps://bioconductor.org/packages/org.Hs.eg.db/Pakiet adnotacji przeznaczony do badań genomicznych człowieka (Homo sapiens).
Oprogramowanie RProjekt Rhttps://www.r-project.org/Projekt typu open source do obliczeń statystycznych
Rstudio (rstudio)Załóżmy, że PBC/Zintegrowane środowisko programistyczne pomaga zwiększyć produktywność w językach R i Python
Narzędzia SAMtoolsOtwarty kod źródłowyhttp://www.htslib.org/Pakiet oprogramowania do manipulowania danymi sekwencjonowania nowej generacji (NGS).

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hsu, P. W., et al. miRNAMap: genomic maps of microRNA genes and their target genes in mammalian genomes. Nucleic Acids Res. 34 (Database issue), D135-D139 (2006).
  2. Fragiadaki, M. Lessons from....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

MiRNA SeqMiRNA ExpressionData ProcessingBioinformatics AnalysisDifferential ExpressionTarget PredictionFunctional EnrichmentRegulatory NetworkR PackagesCytoscape Visualization

Related Articles