Tutaj opisujemy metodę wykorzystującą tanią stereolitograficzną drukarkę 3D do tworzenia form ułatwiających powtarzalne montowanie zarodków danio pręgowanego do badań obrazowych. Za pomocą tej metody stworzyliśmy formy do obrazowania morfogenezy serca w zarodkach danio pręgowanego.
Artykuł metodologiczny
Niestandardowe formy drukowane w 3D do obrazowania danio pręgowanego i rozwoju serca
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Montaż zarodka jest jednym z wyzwań technicznych, jakie napotykają badacze podczas realizacji projektu obrazowania. Zarodki muszą być zorientowane w sposób powtarzalny, tak aby tkanka będąca przedmiotem zainteresowania była dostępna dla obiektywu mikroskopu przez cały okres obrazowania. Aby sprostać temu wyzwaniu, naukowcy mogą osadzać zarodki w lepkich podłożach lub tworzyć specjalistyczne naczynia i odlewy, aby utrzymać zarodki w pożądanej orientacji podczas obrazowania. Tutaj opisujemy metodę wykorzystania niedrogiej stereolitograficznej (SLA) drukarki 3D do produkcji form wielokrotnego użytku, które tworzą studzienki agarozowe, w których można zamontować zarodki w celu obrazowania. Te studzienki agarozowe zapewniają niezawodny sposób orientacji wielu zarodków do obrazowania. Metoda ta obejmuje ramy projektowe, które można łatwo dostosować do różnych tkanek, organizmów i wyzwań związanych z obrazowaniem. Za pomocą tej metody stworzyliśmy formy do obrazowania rozwoju serca u danio pręgowanego zarówno do mikroskopów pionowych, jak i odwróconych. Wykorzystując dostępne materiały i sprzęt, metoda ta pozwala naukowcom łatwo tworzyć formy dostosowane do ich potrzeb montażowych.
Wprowadzenie
Wizualizacja dynamiki komórkowej w nienaruszonym zwierzęciu jest niezbędna do zrozumienia patologii chorób wrodzonych oraz podstawowych procesów rozwoju i homeostazy. Wizualizacja ta obejmuje obrazowanie w wielu skalach przestrzennych w celu zidentyfikowania dynamiki fizjologicznej w całym organizmie, a także na poziomie tkankowym, komórkowym i subkomórkowym. Metody obrazowania stosowane do wizualizacji dynamiki komórkowej obejmują zarówno badania immunofluorescencyjne utrwalonych próbek, jak i obrazowanie poklatkowe żywych próbek. Te metody obrazowania wymagają trzymania nienaruszonych próbek w określonych orientacjach, tak aby obszar zainteresowania był dostępny dla....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Opisane tutaj protokoły, eksperymenty i wyniki zostały przeprowadzone zgodnie z przepisami i wytycznymi dotyczącymi dobrostanu zwierząt oraz Instytucjonalnym Komitetem ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt na Uniwersytecie Missisipi (protokół #24-008).
Aby stworzyć studzienki agarozowe o różnych kształtach, w których można zorientować zarodki do obrazowania, opracowaliśmy projekt, który wykorzystuje podstawę przymocowaną do kołków (Rysunek 1A). Kształt tych kołków (patrz strzałka wskazująca na kołki w kolorze fioletowym w Rysunek 1A) może być dostosowany do orientacji zarodków w różnych ....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Powyższy protokół został wykorzystany do zaprojektowania form do obrazowania różnych etapów rozwoju serca u danio pręgowanego, w tym fuzji serca, tworzenia rurki serca, pętli serca i tworzenia komór. Ponieważ rozwój serca nie zachodzi wzdłuż głównych osi anatomicznych zarodka, kształt kołków został dostosowany do różnych etapów rozwoju, aby prawidłowo ustawić zarodki. Na przykład przednie wewnętrzne umieszczenie serca danio pręgowanego w 48 godzin po zapłodnieniu (hpf) w stosunku do kulistego żółtka wymaga nachylonej ori.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W tym protokole przedstawiamy metodę projektowania drukowanych w 3D form, które tworzą studzienki agarozowe, które mogą ułatwić montowanie zarodków lub tkanek do badań obrazowych. Formy te mogą być wykonane do obrazowania za pomocą mikroskopów pionowych lub odwróconych, a studzienki agarozowe wykonane przy użyciu tych niestandardowych form mogą być używane do zastosowań obrazowania, które obejmują badania immunofluorescencyjne utrwalonych zarodków po obrazowanie poklatkowe żywych zarodków.
Ta .......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.
Podziękowania
Chcielibyśmy podziękować członkom laboratorium Bloomekatz, szczególnie Sasmithie Singh i Allison Holmes, a także rdzeniowi obrazowania GlyCORE (wspieranemu przez P20GM130460), laboratorium IDEA Uniwersytetu Mississippi, dr Yiwei Han i laboratorium Han, a także członkom społeczności University of Mississippi Glycoscience and Developmental Biology. Prace te są wspierane przez fundusze z NIH (R15HD108782, P20GM130460).
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Drukarka 3D SLA | Elegoo | MARS 2 PRO | |
| Agaroza | Badania biologiczne Apex; Genesee Scientific | 20-102QD | Można zastąpić dowolną markę |
| Autodesk Fusion 360 | Autodesk Inc. | https://www.autodesk.com/products/fusion-360/ | Oprogramowanie do komputerowego wspomagania projektowania (CAD) - bardziej zaawansowane |
| Mikroskop pionowy Axio-Zoom | Zeiss | Axio Zoom.V16 | |
| Chitubox | CBD-Tech | https://www.chitubox.com/ | oprogramowanie Slicer |
| Nakrywka dolna (miska 60 mm z dołkiem dennym 30 mm) | Cellvis | D60-30-1.5N | |
| F59 Ciężki łańcuch miozyny (wszystkie szybkie izoformy) | DHSB | F59 | Rozcieńczenie 1:50 |
| Filamenty FDM | Bambu | PLA filamenty | |
| Drukarka FDM | Bambu | Bambu X1 Carbon FDM | 0,4 mm dysza ekstrudera |
| Kleszcze | Fisher | 16-100-121 | Inne marki prawdopodobnie będą odpowiednie |
| Kozioł anty-mysz Alexa 488 | ThermoFisher | #A28175 | Rozcieńczenie 1:300 |
| Imaris | Andor | 10.2 | Oprogramowanie |
| Odwrócony mikroskop konfokalny | Leica | Leica SP8 X | |
| Agaroza Złoto o niskiej temperaturze topnienia | Nr katalogu biotechnologicznego | : A-204-25 | Inne marki prawdopodobnie będą odpowiednie |
| Pompka do pipet | Bel-Art | F37898 | |
| Żywica do drukarki SLA | Elegoo | Elegoo P05BB028 | Zmywalna wodą żywica fotopolimerowa V2.0 |
| Ricinus communis aglutynina (RCA-120) | Vector labs | #RLK-2200 (zestaw lektyn) | Rozcieńczenie 1:300 |
| TinkerCAD | Autodesk Inc. | https://www.tinkercad.com/ | Oprogramowanie do komputerowego wspomagania projektowania (CAD) - podstawowe |
| Tricaine S | Western Chemical, Inc. | ANADA #200-226 | |
| Aglutynina z kiełków pszenicy (WGA) | Vector | labs#RLK-2200 (zestaw lektyn | Rozcieńczenie 1:300 |
| Szklana pipeta Pasteura o szerokim otworze | Duran Wheaton Kimble (DWK) | 63A53WT |
Bibliografia
- Shrestha, R., Lieberth, J., Tillman, S., Natalizio, J., Bloomekatz, J. Using zebrafish to analyze the genetic and environmental etiologies of congenital heart defects. Adv Exp Med Biol. 1236, 189-223 (2020).
- Westerfield, M. The zebrafish b....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE
Poproś o pozwolenie