Artykuł metodologiczny

Niestandardowe formy drukowane w 3D do obrazowania danio pręgowanego i rozwoju serca

773 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/68768

⸱

15 sierpnia 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, University of Mississippi

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj opisujemy metodę wykorzystującą tanią stereolitograficzną drukarkę 3D do tworzenia form ułatwiających powtarzalne montowanie zarodków danio pręgowanego do badań obrazowych. Za pomocą tej metody stworzyliśmy formy do obrazowania morfogenezy serca w zarodkach danio pręgowanego.

Streszczenie

Montaż zarodka jest jednym z wyzwań technicznych, jakie napotykają badacze podczas realizacji projektu obrazowania. Zarodki muszą być zorientowane w sposób powtarzalny, tak aby tkanka będąca przedmiotem zainteresowania była dostępna dla obiektywu mikroskopu przez cały okres obrazowania. Aby sprostać temu wyzwaniu, naukowcy mogą osadzać zarodki w lepkich podłożach lub tworzyć specjalistyczne naczynia i odlewy, aby utrzymać zarodki w pożądanej orientacji podczas obrazowania. Tutaj opisujemy metodę wykorzystania niedrogiej stereolitograficznej (SLA) drukarki 3D do produkcji form wielokrotnego użytku, które tworzą studzienki agarozowe, w których można zamontować zarodki w celu obrazowania. Te studzienki agarozowe zapewniają niezawodny sposób orientacji wielu zarodków do obrazowania. Metoda ta obejmuje ramy projektowe, które można łatwo dostosować do różnych tkanek, organizmów i wyzwań związanych z obrazowaniem. Za pomocą tej metody stworzyliśmy formy do obrazowania rozwoju serca u danio pręgowanego zarówno do mikroskopów pionowych, jak i odwróconych. Wykorzystując dostępne materiały i sprzęt, metoda ta pozwala naukowcom łatwo tworzyć formy dostosowane do ich potrzeb montażowych.

Wprowadzenie

Wizualizacja dynamiki komórkowej w nienaruszonym zwierzęciu jest niezbędna do zrozumienia patologii chorób wrodzonych oraz podstawowych procesów rozwoju i homeostazy. Wizualizacja ta obejmuje obrazowanie w wielu skalach przestrzennych w celu zidentyfikowania dynamiki fizjologicznej w całym organizmie, a także na poziomie tkankowym, komórkowym i subkomórkowym. Metody obrazowania stosowane do wizualizacji dynamiki komórkowej obejmują zarówno badania immunofluorescencyjne utrwalonych próbek, jak i obrazowanie poklatkowe żywych próbek. Te metody obrazowania wymagają trzymania nienaruszonych próbek w określonych orientacjach, tak aby obszar zainteresowania był dostępny dla obiektywu mikroskopu.

Zarodki zebry są idealnym organizmem modelowym do badań obrazowych ze względu na ich przejrzystość optyczną, podatność genetyczną, zewnętrzne zapłodnienie i pochodzenie kręgowców. Jednak umieszczanie zarodków danio pręgowanego w określonej orientacji w sposób spójny i powtarzalny stanowi ciągłe wyzwanie. Montowanie jest szczególnie trudne dla wizualizacji rozwoju serca w zarodkach danio pręgowanego, ponieważ morfogeneza serca zachodzi na różnych płaszczyznach1.

Opracowano wiele podejść do rozwiązywania problemów związanych z montażem embrionów do obrazowania. Jedna z najprostszych metod polega na umieszczeniu zarodków danio pręgowanego między dwoma szkiełkami nakrywkowymi z warstwami taśmy między szkiełkami nakrywkowymi, aby zapobiec zgnieceniu. Metoda ta pozwala na obrazowanie zarówno na mikroskopach odwróconych, jak i pionowych2. Zarodki danio pręgowanego można również umieścić w pożywce lub żelu o wysokiej lepkości, takim jak metyloceluloza lub agaroza o niskiej temperaturze topnienia 0,1-0,8%, aby utrzymać zarodki w określonych orientacjach2,3,4. Te niskoprzepustowe podejścia sprawdzają się w wielu projektach obrazowania; Jednak zapewnienie integralności zarodka i powtarzalne uzyskanie określonych orientacji może być kłopotliwe. Aby zwiększyć wydajność obrazowania i ułatwić montaż, z zestalonej agarozy w naczyniu do obrazowania można utworzyć regularnie rozmieszczone studzienki w naczyniu do obrazowania5,6,7,8. Aby ułatwić tworzenie tych studni agarozowych, stworzono plastikowe formy9,10,11. Chociaż te formy mogą być stosowane do obrazowania wzdłuż standardowych osi grzbietowo-brzuszno-bocznych10,12, często są one tworzone z myślą o konkretnych wyzwaniach związanych z obrazowaniem, takich jak użycie w płytkach 96-dołkowych13 lub do wykrywania pierwszego bicia serca14. W szczególnych przypadkach stworzono całe naczynia do obrazowania5,15,16. Na przykład komora mikroprzepływowa (o nazwie ZEBRA) wykonana z PDMS ułatwia zarówno obrazowanie, jak i ekspozycję zarodków na działanie substancji chemicznych17. Formy te są często wykonane z silikonu lub wykonane z lucite10,18,19. Jednak pojawienie się stosunkowo niedrogich drukarek trójwymiarowych (3D) zdemokratyzowało tworzenie niestandardowych form, które są używane do tworzenia studzienek do obrazowania agarozy.

Druk 3D, zwany również wytwarzaniem przyrostowym lub warstwowym, polega na tworzeniu obiektu 3D z projektu cyfrowego poprzez sekwencyjne dodawanie i łączenie poszczególnych warstw20,21. Stereolitografia (SLA) wykorzystuje światło ultrafioletowe (UV) do utwardzania światłoczułej płynnej żywicy w sekwencyjnych warstwach22. Drukarki SLA są ekonomiczne, szybkie i bardzo dokładne i mogą być używane z różnymi żywicami, w tym tymi, które zapewniają gładką powierzchnię16. Proces rozpoczyna się od oprogramowania do projektowania wspomaganego komputerowo (CAD), w którym cyfrowe modele obiektu mogą być projektowane de novo lub modyfikowane na podstawie wcześniej istniejących projektów. Model cyfrowy jest następnie wirtualnie dzielony na warstwy nadające się do druku. Korzystając z tych warstw cyfrowych, drukarka 3D konstruuje obiekt, warstwa po warstwie. W tym miejscu przedstawiamy metodę i ramy do niestandardowego projektowania i tworzenia form obrazowania przy użyciu taniej, dostępnej na rynku drukarki 3D SLA. Dodatkowo używamy tej ramy do tworzenia form do obrazowania różnych etapów rozwoju serca danio pręgowanego pod mikroskopami odwróconymi lub pionowymi oraz do obrazowania zarodków danio pręgowanego wzdłuż ich osi bocznej, grzbietowej lub brzusznej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Opisane tutaj protokoły, eksperymenty i wyniki zostały przeprowadzone zgodnie z przepisami i wytycznymi dotyczącymi dobrostanu zwierząt oraz Instytucjonalnym Komitetem ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt na Uniwersytecie Missisipi (protokół #24-008).

Aby stworzyć studzienki agarozowe o różnych kształtach, w których można zorientować zarodki do obrazowania, opracowaliśmy projekt, który wykorzystuje podstawę przymocowaną do kołków (Rysunek 1A). Kształt tych kołków (patrz strzałka wskazująca na kołki w kolorze fioletowym w Rysunek 1A) może być dostosowany do orientacji zarodków w różnych stadiach rozwojowych i skupienia się na różnych tkankach. Poniżej opisujemy protokół dostosowywania tych kołków i używania tego systemu do tworzenia studzienek agarozowych.

1. Tworzenie indywidualnie zaprojektowanej formy obrazowania

  1. Utwórz wstępny szkic próbki lub zarodka umieszczonego w pożądanej orientacji. Należy wziąć pod uwagę pożądaną orientację zarodka i to, czy mikroskop, który ma być używany, zawiera obiektywy pionowe czy odwrócone. Weź również pod uwagę rozmiar naczynia, liczbę zarodków do zamontowania i odstępy między nimi.
  2. Zmierz wymiary zarodka (np. długość, szerokość i wysokość) za pomocą mikroskopu w połączeniu z narzędziem programowym, takim jak FIJI23. Użyj tych wymiarów, aby upewnić się, że zarodki mieszczą się w dołkach utworzonych przez kołki.
  3. Zidentyfikuj kształt, który odpowiada geometrii zarodka. Korzystając z pomiarów z kroku 1.2 w połączeniu z oprogramowaniem do projektowania wspomaganego komputerowo (CAD), stwórz kołek, który w przybliżeniu kształtuje i rozmiar próbki.
    UWAGA: Ten kształt można utworzyć w podstawowym oprogramowaniu CAD, łącząc i nakładając na siebie różne wstępnie zaprojektowane kształty, lub kształt można utworzyć de novo za pomocą zaawansowanego programu CAD. Dodatkowo można zmodyfikować jeden z naszych wstępnie zaprojektowanych kołków (patrz Plik uzupełniający 1). Zwężanie kołka, jak w Rysunek 1A, może pomóc w orientacji zarodków, aby upewnić się, że tkanka będąca przedmiotem zainteresowania jest najbliżej celu.
  4. Połącz konstrukcję kołków z konstrukcją podstawy:
    1. W oprogramowaniu CAD dodaj specjalnie zaprojektowany kołek do jednej z wstępnie zaprojektowanych podstaw (plik uzupełniający 1). Następnie zduplikuj i równomiernie umieść kołki w całej podstawie, aby uzyskać obrazowanie o wysokiej przepustowości, korzystając z narzędzi w zaawansowanym programie CAD. Dokładnie sprawdź, czy wszystkie kołki osiągają tę samą wysokość z dala od podstawy.
  5. Przygotuj projekt do druku 3D:
    1. Przenieś niestandardowy projekt formy lub jedną ze wstępnie zaprojektowanych form (plik uzupełniający 2) do oprogramowania slicer, które przekształca projekt w polecenia dla drukarki 3D.
    2. W oprogramowaniu krajalnicy należy obrócić projekt tak, aby krytyczne elementy, takie jak kołki, były umieszczone z dala od stolika drukarki. W przypadku uchwytu na szkiełko nakrywkowe, które jest drukowane na drukarce FDM (Fused Deposition Modeling), ustaw wydruk poziomo.
      UWAGA: Obrót wzoru zapobiegnie wypaczaniu, które może wystąpić, gdy delikatne części są umieszczone blisko sceny drukowania.
    3. Dodaj podpory w oprogramowaniu slicera, aby upewnić się, że delikatne aspekty formy nie pękną podczas drukowania. Funkcja automatycznego umieszczania podpór w oprogramowaniu wraz z ręcznym kuratorstwem zapewnia dobre rozłożenie podpór bez dużych przerw. Strategia 100% wypełnienia służy do stworzenia solidnej formy.
    4. Drukuj wiele elementów jednocześnie, używając jednego pliku STL zawierającego wszystkie formy lub układając poszczególne pliki STL razem za pomocą oprogramowania slicer.
  6. Drukowanie
    UWAGA: Drukarki SLA są naszym preferowanym typem drukarki 3D do form obrazowych ze względu na ich wykonalność, precyzję i tworzenie gładkich powierzchni. Drukarka FDM jest używana do wykonania uchwytu na szkiełko nakrywkowe, ponieważ tworzy lekkie, sztywniejsze wydruki niż drukarki SLA.
    1. Zacznij od następujących ustawień drukowania i optymalizuj od tego momentu: wysokość warstwy 0,05 mm, liczba 5 warstw dolnych, czas naświetlania 2,5 s, czas naświetlania dołu 35 s, odległość podnoszenia i podnoszenia od dołu 5 mm, prędkość podnoszenia od dołu 60 mm/min, prędkość podnoszenia 80 mm/min i prędkość chowania 210 mm/min.
      UWAGA: Ustawienia drukowania prawdopodobnie będą musiały zostać zoptymalizowane przez użytkownika, ponieważ zależą one od rodzaju żywicy, temperatury pokojowej i modelu drukarki.
  7. Po wydrukowaniu umyj formy w wodzie, usuń podpory i umieść formy pod światłem UV w kapturze do hodowli tkankowej, aby zapewnić zestalenie żywicy.
    UWAGA: Dokładne mycie i utwardzanie form jest ważne, aby zapobiec łuszczeniu się żywicy i zniekształceniu formy.
    Podczas pracy z nieutwardzoną żywicą i czyszczenia form należy nosić rękawice i fartuch laboratoryjny, ponieważ nieutwardzona żywica może działać drażniąco na skórę. Drukarki SLA wykorzystują światło UV do utwardzania żywicy, która może być szkodliwa dla oczu i skóry. Upewnij się, że komora drukowania jest bezpiecznie zamknięta i unikaj patrzenia bezpośrednio na źródło światła UV.

2. Procedura użycia drukowanych w 3D form do tworzenia studzienek agarozowych

  1. Wykonywanie studzienek agarozowych
    1. Przygotować studzienki agarozowe, rozpuszczając 2% (g / ml) agarozy w pożywce E3 (1,578 mM NaCl, 0,169 mM KCl, 0,249 mM CaCl2*2H2O, 0,161 mM MgSO4*7H2O). Umieść formę na środku dolnego naczynia z szkiełka nakrywkowego ze strzałką skierowaną w dół w kierunku dołka (patrz Rysunek 2A,B). Odpipetować 750 μl 2% stopionej agarozy/E3 wzdłuż połowy obwodu formy obrazowej (patrz Rysunek 2C).
      UWAGA: Stopiona agaroza powinna być nielepka, ale wystarczająco chłodna, aby można było pipetować bez tworzenia pęcherzyków. Używamy naczyń 60 mm z 30 mm dnem nakrywkowym, natomiast do form przeznaczonych do mikroskopów pionowych można użyć standardowej czaszy 60 mm. Nieco inny protokół jest używany do formy przesiewającej (patrz poniżej).
    2. Odpipetować kolejne 750 μl 2% stopionej agarozy/E3 wzdłuż drugiej połowy obwodu formy obrazowej (patrz Rysunek 2D).
    3. Odczekaj 5-7 minut, aż agaroza stężeje, obserwując przejście od klarownej cieczy do nieprzezroczystego niebieskiego żelu (patrz Rysunek 2E).
    4. Dodaj cienką warstwę stopionej agarozy na obwodzie zestalonej agarozy centralnej.
      UWAGA: Chociaż nie jest to bezwzględnie wymagane, ten krok pomaga zakotwiczyć zestaloną agarozę w naczyniu i zapobiec oderwaniu spowodowanemu przez podłoże.
    5. Umieść zewnętrzny pierścień (rysunek uzupełniający S1B) nad zespołem formy agarozowej ze strzałką skierowaną w stronę agarozy (patrz Rysunek 2F).
    6. Delikatnie przytrzymując zewnętrzny pierścień, ostrożnie pociągnij wewnętrzną formę prosto do góry, aby odłączyć ją od agarozy (patrz Rysunek 2G).
      UWAGA: Aby uniknąć pęknięcia lub uszkodzenia studzienek agarozowych, nie należy zbyt mocno naciskać na pierścień zewnętrzny i nie skręcać ani nie przesuwać wewnętrznej formy podczas ciągnięcia w górę.
    7. Zdejmij zewnętrzny pierścień, odsłaniając dołki agarozy w dolnym naczyniu szkiełka nakrywkowego (Rysunek 2H).
    8. Sprawdź studzienki agarozowe pod mikroskopem, aby potwierdzić prawidłowe rozmiary i produkcję.
      UWAGA: W przypadku obrazowania pod mikroskopem odwróconym cienka warstwa agarozy często musi zostać podniesiona z dna studzienki. Można to zrobić za pomocą kleszczy.
  2. Zmodyfikowany protokół korzystania z formy przesiewającej
    1. Wlej stopioną 2% agarozę/E3 do szalki Petriego, aż będzie mniej więcej do połowy wypełniona.
    2. Przytrzymaj formę kołkami skierowanymi do góry i odpipetuj stopioną 2% agarozę/E3 na kołki, aż zostaną pokryte (~ 3 ml).
      UWAGA: Upewnij się, że nie wprowadzają się pęcherzyków powietrza, uwalniając tylko 90% stopionej agarozy, która została wciągnięta do pipety.
    3. Wykonując ruch przechylający, umieść jeden koniec, a następnie całą formę z kołkami skierowanymi w dół na szalce Petriego zawierającej stopioną agarozę (rysunek uzupełniający S2).
    4. Pozostaw agarozę do zastygnięcia na 5-7 minut.
    5. Ostrożnie usuń formę, używając uchwytu, aby podważyć jeden koniec, a następnie drugi koniec.

3. Umieszczanie zarodków w studzienkach agarozowych z agarozą o niskiej temperaturze topnienia i bez niej

  1. Dekorionat i znieczulenie zarodków w roztworze trikainy o stężeniu 200 μg/ml przed montażem.
    UWAGA: Do zatrzymania bicia serca wymagany jest roztwór trikainy ~400 μg/ml, aby zatrzymać bicie serca.
    1. Bez użycia agarozy o niskiej temperaturze topnienia: Napełnij naczynie do obrazowania 1x E3 i trikainą (200 μg/ml), dodaj zdekorionowane, znieczulone zarodki do naczynia do obrazowania, użyj kleszczy, aby umieścić i zorientować zarodki w dołkach agarozowych, a następnie zobrazuj (patrz Rysunek 2I, J).
      UWAGA: Ponieważ kleszcze mogą łatwo uszkodzić zarodek, zamiast tego można użyć pogrzebacza do zarodków, w którym żyłka o średnicy 0,41 mm jest włożona do rurki kapilarnej lub końcówki pipety i zabezpieczona superglue24.
    2. Korzystanie z agarozy o niskiej temperaturze topnienia:
      UWAGA: Podczas gdy formy są zaprojektowane do umieszczania zarodków w określonych orientacjach, użycie agarozy o niskiej temperaturze topnienia do utrzymania zarodków na miejscu może zapewnić, że zarodki nie będą dryfować podczas obrazowania lub podczas transportu naczynia do obrazowania z zamontowanymi zarodkami do mikroskopu. Poniższe kroki pochodzą z naszego poprzedniego protocol6.
      1. Stwórz probówki z agarozy o niskiej temperaturze topnienia, rozpuszczając 0,1-0,8% agarozy o niskiej temperaturze topnienia w 5 ml pożywki E3 i podgrzewając do 65-70 °C w łaźni wodnej. Od czasu do czasu należy odwrócić probówkę, aż agaroza o niskiej temperaturze topnienia się rozpuści. Roztwór agarozy o niskiej temperaturze topnienia rozdzielić do probówek do mikrofuzy i umieścić je na bloku grzewczym ustawionym na 42 °C. Pozostawić roztwór do zrównoważenia do 42 °C przez co najmniej 1 h.
        UWAGA: Generalnie zaleca się stosowanie świeżo przygotowanego roztworu agarozy o niskiej temperaturze topnienia.
      2. Za pomocą szklanej pipety Pasteura o szerokim otworze przenieś pojedynczy zarodek do probówki zawierającej roztwór agarozy o niskiej temperaturze topnienia. Aby uniknąć dodawania nadmiaru płynu do roztworu agarozy o niskiej temperaturze topnienia, należy przenosić tylko zarodek i płyn bezpośrednio go otaczający. Natychmiast przenieś zarodek, który jest teraz w niskotopliwej agarozie, do jednej z studzienek agarozowych. Zwróć roztwór agarozy o niskiej temperaturze topnienia do bloku grzewczego w celu ponownego użycia.
      3. Za pomocą kleszczy lub pogrzebacza do zarodków (patrz krok 3.1.1) umieść zarodek w studzience w celu obrazowania.
      4. Powtórz kroki 3.1.2.2-3.1.2.3 dla pozostałych studzienek. Jeśli poprzednie studzienki zaczną wysychać, użyj pipety p200, aby dodać niewielką ilość E3 (~50-100 μL) na wierzch studzienki.
  2. Po umieszczeniu zarodków we wszystkich studzienkach i zestaleniu się agarozy o niskiej temperaturze topnienia, za pomocą pipety powoli dodaj roztwór trikainy/E3 do naczynia do obrazowania.
  3. Po obrazowaniu ostrożnie wyekstrahuj zarodki ze studzienek za pomocą kleszczy i pozwól im dalej się rozwijać, aby upewnić się, że obrazowanie nie spowodowało wad rozwojowych.
    UWAGA: Studzienki agarozowe można wyjąć z naczynia do obrazowania, które można wypłukać i ponownie wykorzystać. Płukanie dostępnym w handlu środkiem do czyszczenia szkła, a następnie wielokrotne spłukiwanie ddH2O pomaga usunąć osady soli z szkiełek nakrywkowych. Chociaż nie doświadczyliśmy toksyczności z powodu resztkowych śladów środka do czyszczenia szkła, zaleca się, aby badacz potwierdził te wyniki we własnych warunkach laboratoryjnych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Powyższy protokół został wykorzystany do zaprojektowania form do obrazowania różnych etapów rozwoju serca u danio pręgowanego, w tym fuzji serca, tworzenia rurki serca, pętli serca i tworzenia komór. Ponieważ rozwój serca nie zachodzi wzdłuż głównych osi anatomicznych zarodka, kształt kołków został dostosowany do różnych etapów rozwoju, aby prawidłowo ustawić zarodki. Na przykład przednie wewnętrzne umieszczenie serca danio pręgowanego w 48 godzin po zapłodnieniu (hpf) w stosunku do kulistego żółtka wymaga nachylonej ori...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym protokole przedstawiamy metodę projektowania drukowanych w 3D form, które tworzą studzienki agarozowe, które mogą ułatwić montowanie zarodków lub tkanek do badań obrazowych. Formy te mogą być wykonane do obrazowania za pomocą mikroskopów pionowych lub odwróconych, a studzienki agarozowe wykonane przy użyciu tych niestandardowych form mogą być używane do zastosowań obrazowania, które obejmują badania immunofluorescencyjne utrwalonych zarodków po obrazowanie poklatkowe żywych zarodków.

Ta ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów.

Podziękowania

Chcielibyśmy podziękować członkom laboratorium Bloomekatz, szczególnie Sasmithie Singh i Allison Holmes, a także rdzeniowi obrazowania GlyCORE (wspieranemu przez P20GM130460), laboratorium IDEA Uniwersytetu Mississippi, dr Yiwei Han i laboratorium Han, a także członkom społeczności University of Mississippi Glycoscience and Developmental Biology. Prace te są wspierane przez fundusze z NIH (R15HD108782, P20GM130460).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Drukarka 3D SLAElegooMARS 2 PRO
Agaroza Badania biologiczne Apex; Genesee Scientific 20-102QDMożna zastąpić dowolną markę
Autodesk Fusion 360Autodesk Inc.https://www.autodesk.com/products/fusion-360/ Oprogramowanie do komputerowego wspomagania projektowania (CAD) - bardziej zaawansowane
Mikroskop pionowy Axio-ZoomZeissAxio Zoom.V16
ChituboxCBD-Techhttps://www.chitubox.com/oprogramowanie Slicer
Nakrywka dolna (miska 60 mm z dołkiem dennym 30 mm)CellvisD60-30-1.5N
F59 Ciężki łańcuch miozyny (wszystkie szybkie izoformy)DHSBF59Rozcieńczenie 1:50
Filamenty FDMBambuPLA filamenty
Drukarka FDMBambuBambu X1 Carbon FDM0,4 mm dysza ekstrudera
KleszczeFisher16-100-121Inne marki prawdopodobnie będą odpowiednie
Kozioł anty-mysz Alexa 488ThermoFisher#A28175Rozcieńczenie 1:300
ImarisAndor10.2Oprogramowanie
Odwrócony mikroskop konfokalnyLeicaLeica SP8 X
Agaroza Złoto o niskiej temperaturze topnieniaNr katalogu biotechnologicznego: A-204-25Inne marki prawdopodobnie będą odpowiednie
Pompka do pipetBel-ArtF37898
Żywica do drukarki SLAElegooElegoo P05BB028Zmywalna wodą żywica fotopolimerowa V2.0
Ricinus communis aglutynina (RCA-120)Vector labs#RLK-2200 (zestaw lektyn)Rozcieńczenie 1:300
TinkerCADAutodesk Inc. https://www.tinkercad.com/Oprogramowanie do komputerowego wspomagania projektowania (CAD) - podstawowe
Tricaine S Western Chemical, Inc. ANADA #200-226
Aglutynina z kiełków pszenicy (WGA)Vectorlabs#RLK-2200 (zestaw lektynRozcieńczenie 1:300
Szklana pipeta Pasteura o szerokim otworze Duran Wheaton Kimble (DWK)63A53WT
)

Bibliografia

  1. Shrestha, R., Lieberth, J., Tillman, S., Natalizio, J., Bloomekatz, J. Using zebrafish to analyze the genetic and environmental etiologies of congenital heart defects. Adv Exp Med Biol. 1236, 189-223 (2020).
  2. Westerfield, M. The zebrafish book: a guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 5th edn, Univ. of Oregon Press. (2007).
  3. Upadhyay, S., et al. A layered mounting method for extended time-lapse confocal microscopy of whole zebrafish embryos. J Vis Exp. (155), e60321(2020).
  4. Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope. Development. 139 (17), 3242-3247 (2012).
  5. Cooper, M. S., D'Amico, L. A., Henry, C. A. Confocal microscopic analysis of morphogenetic movements. Methods Cell Biol. 59, 179-204 (1999).
  6. McCann, T., Shrestha, R., Graham, A., Bloomekatz, J. Using live imaging to examine early cardiac development in zebrafish. Methods Mol Biol. 2438, 133-145 (2022).
  7. Hirsinger, E., Steventon, B. A versatile mounting method for long term imaging of zebrafish development. J Vis Exp. (119), e55210(2017).
  8. Kleinhans, D. S., Lecaudey, V. Standardized mounting method of zebrafish embryos using a 3D-printed stamp for high-content, semi-automated confocal imaging. BMC Biotechnol. 19 (1), 68(2019).
  9. Alessandri, K., et al. All-in-one 3D printed microscopy chamber for multidimensional imaging, the universlide. Sci Rep. 7, 42378(2017).
  10. Megason, S. G. In toto imaging of embryogenesis with confocal time-lapse microscopy. Methods Mol Biol. 546, 317-332 (2009).
  11. Wühr, M., Obholzer, N. D., Megason, S. G., Detrich, H. W. III, Mitchison, T. J. Live imaging of the cytoskeleton in early cleavage-stage zebrafish embryos. Methods Cell Biol. 101, 1-18 (2011).
  12. Masselink, W., Wong, J. C., Liu, B., Fu, J., Currie, P. D. Low-cost silicone imaging casts for zebrafish embryos and larvae. Zebrafish. 11 (1), 26-31 (2013).
  13. Wittbrodt, J. N., Liebel, U., Gehrig, J. Generation of orientation tools for automated zebrafish screening assays using desktop 3D printing. BMC Biotechnol. 14, 36(2014).
  14. Jia, B. Z., Qi, Y., Wong-Campos, J. D., Megason, S. G., Cohen, A. E. A bioelectrical phase transition patterns the first vertebrate heartbeats. Nature. 622 (7981), 149-155 (2023).
  15. Ellett, F., Irimia, D. Microstructured devices for optimized microinjection and imaging of zebrafish larvae. J Vis Exp. 130, e56498(2017).
  16. Tan, S., Zhu, X., Zartman, J. J., Deng, Q. Low-cost polyethylene terephthalate lamination microfluidics designs for multiplexed zebrafish imaging. J Vis Exp. (211), e67313(2024).
  17. Bischel, L. L., Mader, B. R., Green, J. M., Huttenlocher, A., Beebe, D. J. Zebrafish entrapment by restriction array (ZEBRA) device: a low-cost, agarose-free zebrafish mounting technique for automated imaging. Lab Chip. 13 (9), 1732-1736 (2013).
  18. Peravali, R., et al. Automated feature detection and imaging for high-resolution screening of zebrafish embryos. Biotechniques. 50 (5), 319-324 (2011).
  19. Weijts, B., Tkachenko, E., Traver, D., Groisman, A. A four-well dish for high-resolution longitudinal imaging of the tail and posterior trunk of larval zebrafish. Zebrafish. 14 (5), 489-491 (2017).
  20. Bozkurt, Y., Karayel, E. 3D printing technology; methods, biomedical applications, future opportunities and trends. J Mater Res Technol. 14, 1430-1450 (2021).
  21. Murr, L. E. Frontiers of 3D printing/additive manufacturing: from human organs to aircraft fabrication. J Mater Sci Technol. 32 (10), 987-995 (2016).
  22. Gu, Z., Fu, J., Lin, H., He, Y. Development of 3D bioprinting: from printing methods to biomedical applications. Asian J Pharm Sci. 15 (5), 529-557 (2020).
  23. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  24. Beck, A. P., Watt, R. M., Bonner, J. Dissection and lateral mounting of zebrafish embryos: analysis of spinal cord development. J Vis Exp. (84), e50703(2014).
  25. Huang, C. J., Tu, C. T., Hsiao, C. D., Hsieh, F. J., Tsai, H. J. Germ-line transmission of a myocardium-specific GFP transgene reveals critical regulatory elements in the cardiac myosin light chain 2 promoter of zebrafish. Dev Dyn. 228 (1), 30-40 (2003).
  26. Bloomekatz, J., et al. Platelet-derived growth factor (PDGF) signaling directs cardiomyocyte movement toward the midline during heart tube assembly. eLife. 6, (2017).
  27. Cummings, R. D., et al. Essentials of Glycobiology. Varki, A., et al. Ch 48, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. 645-661 (2022).
  28. Gallagher, J. T., Morris, A., Dexter, T. M. Identification of two binding sites for wheat-germ agglutinin on polylactosamine-type oligosaccharides. Biochem J. 231 (1), 115-122 (1985).
  29. Yamamoto, K., Tsuji, T., Matsumoto, I., Osawa, T. Structural requirements for the binding of oligosaccharides and glycopeptides to immobilized wheat germ agglutinin. Biochemistry. 20 (20), 5894-5899 (1981).
  30. Wright, C. S., Jaeger, J. Crystallographic refinement and structure analysis of the complex of wheat germ agglutinin with a bivalent sialoglycopeptide from glycophorin A. J Mol Biol. 232 (2), 620-638 (1993).
  31. Lawson, N. D., Weinstein, B. M. In vivo imaging of embryonic vascular development using transgenic zebrafish. Dev Biol. 248 (2), 307-318 (2002).
  32. Isogai, S., Lawson, N. D., Torrealday, S., Horiguchi, M., Weinstein, B. M. Angiogenic network formation in the developing vertebrate trunk. Development. 130 (21), 5281-5290 (2003).
  33. Illi, J., et al. Translating imaging into 3D printed cardiovascular phantoms: a systematic review of applications, technologies, and validation. JACC Basic Transl Sci. 7 (10), 1050-1062 (2022).
  34. George, E., Liacouras, P., Rybicki, F. J., Mitsouras, D. Measuring and establishing the accuracy and reproducibility of 3D printed medical models. Radiographics. 37 (5), 1424-1450 (2017).
  35. Elegoo Mars 2 Pro Mono LCD 3D Printer. , https://us.elegoo.com/products/elegoo-mars-2-pro-mono-lcd-3d-printer (2025).
  36. Shrestha, R., et al. The myocardium utilizes a platelet-derived growth factor receptor α (PDGFRα)-phosphoinositide 3-kinase (PI3K) signaling cascade to steer toward the midline during zebrafish heart tube formation. ELife. 12, e85930(2023).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

formy drukowane w technologii 3Dmonta zarodk wdo ki agarozowedruk stereolitograficznymikroskopy prostemikroskopy odwr coneorientacja tkankiformy wielokrotnego u ytku
Film wkrótce dostępny

Powiązane artykuły