Przedstawiamy protokół optymalizowanej techniki pobierania krwi u myszych osób poprzez nakłucie żył twarzy za pomocą lanceta. Stosujemy tę technikę wraz z oceną cytometryczną przepływową do charakteryzowania fenotypów komórkowych szczepów transgenicznych, kongenicznych i raportowych. Nadaje się także do analizy cytokiny w surowicy oraz badań nad cukrzycą.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Nakłucie żył twarzy do pobierania krwi myszy
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Niniejszy artykuł przedstawia zoptymalizowany protokół pobierania krwi myszy za pomocą nakłucia żył twarzy za pomocą lanceta, oferując szybką, minimalnie inwazyjną i opłacalną alternatywę dla innych powszechnych technik, takich jak pobieranie próbek żył ogonowych czy retrooczodołu. Technika ta jest szczególnie korzystna w badaniach wymagających powtarzanego pobierania próbek, takich jak fenotypowanie myszy, analiza cytokin w surowicy czy badania nad cukrzycą. Protokół jest wydajny, wymaga minimalnego specjalistycznego sprzętu i doskonale nadaje się do wysokoprzepustowych analiz komórkowych u myszy. Naszym głównym zastosowaniem jest fenotypowanie myszy transgenicznych, kongenicznych i raportujących za pomocą cytometrii przepływowej, co zostało tutaj zademonstrowane na barwieniu przeciwciał oraz myszach raportujących tdTomat. Artykuł opisuje cały proces, od przygotowania zwierząt po analizę próbek. Kluczowe kroki obejmują pobieranie krwi za pomocą lanceta 3 mm, lizę komórek, barwienie oraz profilowanie cytometryczne przepływu. Nakłucie żył twarzy zwiększa efektywność pobierania i wspiera etyczne praktyki badawcze. Ta praktyczna i adaptowalna metoda jest odpowiednia dla szerokiego zakresu protokołów eksperymentalnych obejmujących pobieranie pobierania pobierania krwi myszy oraz analizę komórkową.
Wprowadzenie
Wydajne, powtarzalne i minimalnie inwazyjne pobieranie krwi jest niezbędne w wielu badaniach na myszych, szczególnie tych wymagających wielokrotnego pobierania próbek. Protokół ten zapewnia uprościoną metodę pobierania niewielkich ilości krwi za pomocą nakłucia żył na twarzy, a następnie lizy czerwonych krwinek, barwienia przeciwciał oraz analizy cytometrycznej przepływu. Ten workflow jest dobrze przystosowany do aplikacji o wysokiej przepustowości, minimalizując jednocześnie złożoność techniczną.
Wiele metod pobierania krwi, takich jak krwawienie retroorbitalne czy nacięcie żyły ogonowej, może wymagać zabiegów z użyciem ciepła, znieczulenia1 oraz długiego czasu manipulacji, co może powodować znaczny stres u zwierzęcia2. Dla porównania, nakłucie żył twarzy lancetą oferuje prostą i szybką alternatywę, która wspiera etyczne i powtarzalne eksperymenty. Metoda ta została potwierdzona w wcześniejszych badaniach jako humanitarna alternatywa dla pobierania krwi w małych objętościach u myszy3.
Ilustrujemy tę metodę, fenotypując komórki odpornościowe myszy transgenicznych i raportujących, w tym myszy TdTomato reporter oraz myszy MD4-IgHEL. Ten ostatni wymaga barwienia przeciwciałami przeciwko CD19 i IgMa, czyli alotypowi IgM.
Chociaż protokół ten został opracowany do profilowania komórek krwi, można go łatwo dostosować do innych zastosowań, takich jak analiza cytokiny w surowicy, wykrywanie przeciwciał specyficznych czy pomiary glukozy, pomijając etap lizy czerwonych krwinek. Ogólnie rzecz biorąc, technika ta podnosi jakość danych i efektywność eksperymentów, powodując minimalny stres u zwierząt, co sprawia, że jest szeroko użyteczna w różnorodnych zastosowaniach badawczych.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Myszy były trzymane w specyficznym, wolnym od patogenów środowisku w Dartmouth Hitchcock Medical College, instytucji akredytowanej przez AAALAC, i używane zgodnie z zatwierdzonym protokołem Komitetu ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt Instytucjonalnych.
1. Zbieranie materiałów
- Przygotuj probówki hodowlowane po 5 mL, każda zawierająca 1 ml buforu lizy czerwonych krwinek (RBC) (10x RBC Lysis rozcieńczony sterylną wodą). Używaj jednej rurki na mysz.
- Zbierz pudełko lancetów 3 mm (po jednym lancecie na mysz).
- Zbierz pudełko gąbek do gazy (jedna gąbka gazy na mysz).
- Zbierz pipety transferowe oraz stożkową rurkę o pojemności 50 mL zawierającą 1x HBSS z 0,5 mM EDTA (wystarczające dla maksymalnie 20 myszy).
UWAGA: Ten bufor służy do zatrzymania reakcji lizy. Jeśli bufor jest potrzebny tylko do fenotypowania, a nie do dalszej analizy, większość neutralnych buforów o pH 7,2-7,4 może być stosowana zamiast HBSS. - Weź ze sobą wiadro na lód, dodatkowy 1x bufor lizy RBC, dodatkowe probówki po 5 ml i pipety transferowe.
2. Etykietowanie myszy i rurek
- Oznacz każdą kartę klatki i mysz identyfikatorem fenotypu, który odpowiada etykietom na każdym tubie, aby lepiej rozróżnić, które wyniki odpowiadają której myszy. Powszechnie używane identyfikatory to różne trwałe kolory markerów (np. czerwony, niebieski, zielony,) na ogonach myszy, które odpowiadają oznaczeniam na tubce.
UWAGA: Zawsze dołączaj mysz kontrolną do fenotypowania. W przypadku myszy reporterów upewnij się, że masz negatywną kontrolę reportera. W przypadku myszy transgenicznych należy uwzględnić mysz typu dzikiego jako kontrolę. - Umieść oznaczone probówki w stojaku z wiadrem na lód w pobliżu, aby przechowywać je zaraz po pobraniu krwi.
- Otwórz wszystkie lancety potrzebne do zabiegu.
- Otwórz wszystkie gąbki z gazą potrzebne do zabiegu.
3. Obsługa myszy i zbieranie próbek
- Użyj dominującej ręki, aby chwycić mysz za ogon i położyć ją na stojaku do podawania drutu lub na płaskiej powierzchni.
- Użyj palca wskazującego i kciuka niedominującego, aby podrapać mysz, manewrując od ogona w stronę okolic szyjnej.
- Używaj pozostałych palców, aby zabezpieczyć ogon, minimalizując ruchy myszy.
- Użyj dominującej ręki, aby wyciągnąć otwarty lancet o średnicy 3 mm.
- Znajdź małe, bezwłose miejsce tuż za pyskiem i wyznacz prostą linię w kierunku ucha. Zatrzymaj się tam, gdzie linia przecina się z zewnętrznym rogiem oka (Rysunek 1).
- Umieść lancet na tym skrzyżowaniu, aby zapewnić odpowiedni dopływ krwi.
- Użyj płaskiej bocznej krawędzi lanceta, aby zebrać jedną kroplę krwi.
- Umieść cały lancet wraz z próbką krwi do oznaczonej probówki zawierającej bufor lizy RBC.
- Delikatnie mieszaj probówkę, aby upewnić się, że cała próbka została wymieszana z buforem. Niepełne mieszanie może powodować krzepnięcie i niską jakość danych.
- Użyj gąbki gazowej, aby delikatnie naciskać miejsce wkłucia przez 5-10 sekund.
- Wróć mysz do klatki.
- Utrzymuj stosunek bufora krew do lizy większy niż 1:10.
- Powtarzaj kroki z tej sekcji dla każdej dodatkowej myszy.
4. Liza, przygotowanie i analiza próbki
- Poczekaj 7-10 minut po rozpoczęciu lizy, dodaj około 2 ml 1x HBSS z 0,5 mM EDTA (lub innym medium).
- Rurki do wirówek o pojemności 400 g przez 5 minut. Przygotuj koktajle przeciwciał w tym czasie.
- Usuń nadmiar.
- Wyjmij lancety z rurek za pomocą kleszczy.
- Dodaj 30 μL koktajlu przeciwciał zaprojektowanego do identyfikacji pożądanych populacji komórkowych.
UWAGA: Do fenotypu myszy MD4 IgHEL, nasz koktajl składał się z 1 mL HBSS, 25 μL IgMa PerCP cy-5.5 oraz 25 μL CD19 APC. - Ponownie zawiesij komórki przez wirowanie przez 2-3 sekundy i inkubuj przez 25-30 minut w temperaturze 4 °C.
- Włącz cytometr przepływowy i dostosuj wykresy przepływu do potrzeb eksperymentu.
UWAGA: Nie ma potrzeby spinowania komórek po barwieniu, jeśli celem jest fenotypowanie. - Dodaj 150-25 μL HBSS lub innych mediów do każdej próbki za pomocą pipety transferowej. W razie potrzeby DAPI można dodać w końcowym stężeniu 1. μg/mL (używa się 10 μL ośrodka zawierającego DAPI).
- Wykonaj Vortex każdej próbki przez 2-3 sekundy tuż przed akwizycją.
- Zdobyć dane 8 000-10 000 zdarzeń/s, celując w 100 000 komórek, jeśli liza była skuteczna.
- Przeanalizuj zebrane dane, zilustrowane na Rysunkach 2 i 3.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Korzystając z cytometrii przepływowej, Rysunek 2 pokazuje lizowaną krew myszy reporterów typu dzikiego (WT) i PF4-Cre TdTomat, przygotowaną według opisanego powyżej protokołu. Pierwszy zestaw wykresów przepływu pokazuje rozpraszanie boczne (SSC), które odzwierciedla granularność komórek, w przeciwieństwie do rozpraszania w kierunku przodu (FSC), które wskazuje rozmiar komórki. W pobliżu początku osii obserwuje się zanieczyszczenia komórkowe i płytki krwi, pod...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Ten zoptymalizowany protokół pobierania krwi z żył twarzy stanowi efektywną i prostą alternatywę dla innych powszechnie stosowanych metod, takich jak krwawienie z żyły ogonowo-ogonowej czy retrooczodołowe. Chociaż protokół jest prosty i przejrzysty, należy dokładnie przestrzegać kilku kluczowych kroków. Najważniejszym krokiem do prawidłowego wykonania jest prawidłowe umiejscowienie miejsca wkłucia4. Celowanie w odpowiednie miejsce na policzku zapewnia odpowiedni przepływ krwi przy minimalnym stres...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy deklarują brak konkurencyjnych interesów.
Podziękowania
Prace te zostały sfinansowane z grantu National Institutes of Health: R35 HL155458 (C.V.J.)
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Przeciwciało APC przeciwmysie CD19 | Biolegenda | 152410 | CD19 APC |
| Wirówka 5810 R, bez wirnika, 120 V, 50/60 Hz | Eppendorf | 22625501 | Wirówka |
| Gąbki do gazy dermacea 8 warstw 2" x 2" | Covidien | 441211 | Guaze Ponges |
| Jednorazowe pipety transferowe z gradacją | Fisherbrand | 13-711-91 | Pipet transferowy |
| ErgoOne pipeta jednokanałowa (200 &; L) | USA Scientific | 7100-2200 | Pipeta |
| Kwas etylendiaminetetraoctowy (roztwór 0,5 m/pH 8,0) | Fisherbrand | BP2482-100 | EDTA 5 M |
| FACSymphony A3 Analizator Komórek | BD Biosciences | 660937 | Cytometr przepływowy |
| Fisherbrand Analogowy mikser wirów | Fisherbrand | 02-215-414 | Wir |
| Goldenrod Animal Lancet 3 mm Sterile 5 tac po 200 | Nawłoć | GR 3MM | Lancet 3 mm |
| Kleszcze Graefe | Narzędzia Nauki Ścisłej | 11051-10 | Kleszcze |
| Hank' Zrównoważony roztwór soli, 1x bez wapnia i magnezu | Corning | 21-021-CVR | HBSS |
| PerCP/Cyjanina 5.5 anty-myszy IgMa Przeciwciała | Biolegenda | 408612 | IgMa PerCP cy-5.5 |
| Bufor lizy RBC (10x) | Biolegenda | 420301 | Bufor lizyczny RBC |
| Probówki polistyrenowe z okrągłym dnem bez korek | Fisherbrand | FB1496110 | Probówki hodowlane |
| Markery permanentne markery Marker, końcówka dłuta | Sharpie | 38254PP | Markery markery |
| Testowano pod kątem USP Sterile Water | Corning | 25-055-CI | Woda jakości do hodowli komórkowych |
| Wkłady TipOne do końcówek pipetowych (200 i mikro; L naturalnie fazowany) | USA Scientific | 1111-1730 | Końcówki pipety |
Bibliografia
- Harikrishnan, V. S., Hansen, A. K., Abelson, K. S., Sorensen, D. B. A comparison of various methods of blood sampling in mice and rats: Effects on animal welfare. Lab Anim. 52 (3), 253-264 (2018).
- Jo, E. J., Bae, E., Yoon, J. H., Kim, J. Y., Han, J. S. Comparison of murine retroorbital plexus and facial vein blood collection to mitigate animal ethics issues. Lab Anim Res. 37 (1), 12(2021).
- Golde, W. T., Gollobin, P., Rodriguez, L. L. A rapid, simple, and humane method for submandibular bleeding of mice using a lancet. Lab Anim (NY). 34 (9), 39-43 (2005).
- Francisco, C. C., Howarth, G. S., Whittaker, A. L. Effects on animal wellbeing and sample quality of 2 techniques for collecting blood from the facial vein of mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 54 (1), 76-80 (2015).
- Ng, M. S., Ng, A. S., Chan, J., Tung, J. P., Fraser, J. F. Effects of packed red blood cell storage duration on post-transfusion clinical outcomes: a meta-analysis and systematic review. Intensive Care Med. 41 (12), 2087-2097 (2015).
- Hoggatt, J., Hoggatt, A. F., Tate, T. A., Fortman, J., Pelus, L. M. Bleeding the laboratory mouse: Not all methods are equal. Exp Hematol. 44 (2), 132-137.e1 (2016).
- Navarro, K. L., et al. Mouse anesthesia: The art and science. ILAR J. 62 (1-2), 238-273 (2021).
- Ahrens Kress, A. P., Zhang, Y., Kaiser-Vry, A. R., Sauer, M. B. A comparison of blood collection techniques in mice and their effects on welfare. J Am Assoc Lab Anim Sci. 61 (3), 287-295 (2022).
- Lavin, E. S., Feldman, E. R., Soprano, S. M., Moore, E. S. Venipuncture site influences blood-drop volume in C57BL/6 mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 63 (3), 325-332 (2024).
- Forbes, N., et al. Morbidity and mortality rates associated with serial bleeding from the superficial temporal vein in mice. Lab Anim (NY). 39 (8), 236-240 (2010).
- Moore, E. S., et al. Comparing phlebotomy by tail tip amputation, facial vein puncture, and tail vein incision in C57BL/6 mice by using physiologic and behavioral metrics of pain and distress. J Am Assoc Lab Anim Sci. 56 (3), 307-317 (2017).
- Gong, S., et al. Dynamics and correlation of serum cortisol and corticosterone under different physiological or stressful conditions in mice. PLoS One. 10 (2), e0117503(2015).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
