Szybka optymalizacja systemu indukowalnego światłem do kontroli ekspresji genów ssaków

Narzędzia biologii syntetycznej, takie jak systemy indukowalnej ekspresji genów, wniosły znaczący wkład w badania biologiczne. Ich zdolność do regulacji ekspresji genów w sposób dostosowalny, odwracalny i precyzyjny może poprawić kontrolę nad produkcją białek 1,2,3,4,5,6, morfologii komórek ^{7,8,9,10,11,12}, szlaków metabolicznych 13,14,15^,16,17,18 oraz inne cele do bioprodukcji i zastosowań terapeutycznych. Układy chemicznie indukowalne mogą mieć efekty resztkowe^19,20 lub niecelowe. Dodatki chemiczne mogą być również bardzo drogie i trudne do skalowania przemysłowo ze względu na dodatkowe procesy oczyszczania w dalszej fazie 21,22,23. Systemy ekspresji genów indukowalne światłem mogą zaoferować skalowalną i precyzyjną metodę praktyk bioprodukcyjnych 24,25,26,27.

Wiele systemów ekspresji genów indukowanych światłem zostało opracowanych jako użyteczne narzędzia biologii syntetycznej w różnych zastosowaniach 28,29,30,31,32,33,34,35,36 oraz długości fal niebieskiego 35,37,38, czerwonego/dalekiego czerwonego^12,39,40, czyli zielone światło⁴¹. W przypadku regulacji genów optogenetycznych opartych na CRISPR, modyfikacja liczby dostarczonych indywidualnych RNA przewodników (gRNA) może wpłynąć na ekspresję mRNA genów endogennych⁴² i będzie wymagała optymalizacji pod kątem różnych linii komórkowych. Można również stosować białka transaktywacyjne, takie jak VP64 37,42,43,44^{, VP16} 39,40,44,45,46, p65 44 lub fuzje^{ich 47}, zwiększając modułowość układów optogenetycznych. Aby zbadać złożone i splecione szlaki biologiczne 12,40,48,49,50,51,52,53, można testować różne kombinacje tych znanych składników. Dodatkowo, różne linie komórkowe mogą wykazywać różnice w indukcji z tym samym systemem⁵². Różne poziomy indukcji mogą prowadzić do niewystarczającej ekspresji genów lub czułości w precyzyjnej kontroli ekspresji genów, co wymaga rygorystycznych testów w celu znalezienia optymalnego systemu optogenetycznego w nowych lub bardziej biologicznie istotnych liniach komórkowych. Wraz z rosnącym tempem i poszerzaniem się zastosowań regulacji genów optogenetycznych, konieczne jest szybkie scharakteryzowanie tych różnych systemów.

Obecne metody charakteryzacji narzędzi optogenetycznych wykorzystują stabilną lub przejściową ekspresję genów^12,54. Generowanie stabilnie wyrażających linie komórkowe i optymalizacja dynamiki systemu dla maksymalnej ekspresji mogą być czasochłonne, a przez to kosztowne. Ekspresja przejściowa umożliwia szybkie i cenne wnioski, zwłaszcza podczas testowania wieloskładnikowych systemów optogenetycznych. Tutaj zastosowaliśmy system efektora CRISPR-dCas9 (LACE)³⁷ aktywowanego niebieskim światłem, składającego się z kryptochromu 2 (CRY2) oraz kryptochromu oddziałującego z podstawową helisową pętlą helisową helisy N-terminalem (CIBN). Stosowano go do kontroli ekspresji genów w komórkach ssaków, takich jak HEK293T (ludzkie komórki nerek embrionalnych)^37,38, CHO-DG44 (komórki jajnika chomika chińskiego)⁵⁵ oraz C2C12 (komórki myoblastu myszy)³⁸. Jego modułowy charakter jest idealny do szybkiego charakteryzowania wydajności systemu za pomocą ekspresji przejściowych i metod o wysokiej przepustowości. Na przykład systemy wieloskładnikowe, takie jak LACE, mogą wymagać optymalizacji stosunków mas, aby poprawić indukcję, co jest krokiem rzadko stosowanym w charakteryzacji systemów optogenetycznych.

Protokół ten opisuje szybką optymalizację i charakterystykę systemu 2pLACE38 z dwoma plazmidami. W tym układzie 2pLACE kontroluje ekspresję fluorescencyjnego reportera, eGFP (wzmocnionego zielonego białka fluorescencyjnego), w HEK293T komórkach. Aktywacja odbywa się na czarnych płytach 96-dołkowych z czarnym szklanym dnem za pomocą OptoPlate-96, drukowanej w 3D matrycy LED zaprojektowanej i zbudowanej przez Lukasza Bugaja i współpracowników^{56, 57, 58, 59}. Protokół ten w szczególności optymalizuje maksymalną ekspresję przy różnych stosunkach mas układu dwuplazmidowego. Zawiera także przyjazny dla użytkownika kod do sterowania różnymi natężeniami światła, aby sprawdzić możliwość strojenia systemu i jego pełny zakres dynamiczny. Cytometria przepływowa jest stosowana do zbierania i analizy danych. Protokoły generowania konstrukcji plazmidowych i materiałów do druku 3D dla matrycy LED można znaleźć w poprzednich publikacjach ^54,56. Metody te podkreślają szybki, wysokoprzepustowy proces charakteryzowania systemów ekspresji genów indukowanych światłem.

1. Powlekanie HEK293T komórek w formacie 96-dołkowy

1. W szafce na bezpieczeństwo biologiczne zbierz pojemnik na odpady wybielacze, pipety serologiczne, pipetę pipetową, solankę Dulbecco z buforem fosforanowym (DPBS), podłoże Dulbecco zmodyfikowane Eagle's Medium (DMEM) z 10% surowicy płodowej bydła (FBS) oraz kolbkę do hodowli komórek T-75 z mieszanką komórek HEK293T. Podgrzewanie podłoża do 37 °C.
2. W kolbie T-75 sprawdź, czy zbieżność jest około 80%-100% zbiegająca się za pomocą odwróconego mikroskopu.
3. W szafce biobezpieczeństwa użyj pipety serologicznej, aby aspirować zużyte podłoże z kolby do hodowli komórek. Unikaj dotykania powierzchni lub plastiku kolby. Zutylizuj zużyte materiały i aspirator do pojemnika na odpady.
4. Delikatnie umyj komórki około 10 ml DPBS, wciągając go do rogu kolby i delikatnie mieszając wokół powierzchni. Zassaj DPBS z kolby i wyrzuć płukacz oraz aspirator do pojemnika na odpady.
5. Dodaj 1,5 ml 0,05% trypsyny-EDTA, aby pokryć powierzchnię kolby i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 1 minutę. Delikatnie stuknij w kolbę, aby poluzować komórki z powierzchni.
6. Dodaj 8,5 mL świeżego DMEM do kolby. Ponownie zawiesić i wymieszać komórki pipetą serologiczną, aż wszystkie agregaty zostaną rozbite przez aspirację w górę i w dół.
7. Zbierz 9 mL zawiesiny ogniwowej do stożkowej rurki o pojemności 15 mL.
   1. Dodaj 9 ml świeżego DMEM do kolby i umieść ją w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5%_CO2
8. Za pomocą hemocytometru wymieszaj 10 μL zawieszonych komórek z 10 μL barwnika Trypana w proporcji 1:1, aby obliczyć stężenie komórek. Użyj tej wartości, aby przygotować wystarczającą liczbę komórek do zasiewania na płytce.
9. Nasiać ~35 000 komórek w 100 μL dla każdej studni wysokowydajnej czarnej szklanej płyty dnej #1.5 z 96 dołkami i umieścić w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5%_CO2 przez 24 godziny.

2. Optymalizacja transfekcji 2pLACE

1. Dla jednego dołku i 10% nadmiaru należy zapodać 11 μL ciepłego, wolnego od surowicy DMEM (SFM) do rurki mikrowirówki o pojemności 1,5 mL.
2. Stosując CRY2-eGFP: stosunki mas plazmidów CIBN-gRNA równe 1:9, 2:8, 3:7, 4:6, 5:5, 6:4, 7:3, 8:2 i 9:1, aliquotują 110 ng dla każdego dołka całkowitego DNA do aliquotów SFM (Tabela 1).
3. Jako kontrolę dodatnią, aliquotuj tę samą masę plazmidu CMV-eGFP do różnych aliquotów SFM.
4. Dla każdego dołka należy zaznaczyć 11 μL SFM na rozcieńczenie odczynników transfekcyjnych.
5. Przygotuj odczynnik transfekcyjny w stosunku masy (μg) do objętości (μL) DNA i reagenta transfekcyjnego.
6. Dodaj rozcieńczony odczynnik transfekcyjny do rozcieńczonego DNA i inkubuj przez 12 minut w temperaturze pokojowej, aby uzyskać kompleksy transfekcyjne.
7. Dodaj ~20 μL kompleksu transfekcyjnego do każdego dołku. Upewnij się, że nie dotyka ścian studni.
8. Owiń talerz folią aluminiową i umieść w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5%_CO2 na 24 godziny.

3. Aktywacja 2pLACE

1. Zmodyfikuj kod wejściowy mikrokontrolera, aby oświetlać pożądane otwory za pomocą tych ustawień (Supplementary Coding File 1, linie 147 - 158).
   1. Natężenie LED: 9,27 mW/cm² (Plik kodowania uzupełniający 1, linie 200 - 215).
   2. Długość impulsu: 1 s (Plik kodujący uzupełniający 1, linie 280 - 290).
   3. Częstotliwość impulsów: 0,067 Hz (co 15 s) (Plik kodujący uzupełniający 1, linie 264 - 278).
      UWAGA: Ustawienia długości fali zależą od rodzaju zainstalowanych diod LED.
2. Spryskaj pokrywkę OptoPlate wydrukowaną w 3D 70% etanolem i pozwól wyschnąć w szafce z zabezpieczeniem biologicznym.
3. Włącz lampę z ciemni z czerwonym światłem i umieść płytkę z 96 dołkami do szafki zabezpieczeń biologicznych, a pokrywkę zamień na wysuszoną pokrywkę wydrukowaną w 3D.
   UWAGA: Ogniwa CMV-eGFP można opcjonalnie obejrzeć za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, aby oszacować efektywność transfekcji.
4. Weź płytę z 96 dołkami i umieść ją na matrycy LED, aby zbudować aparat LED. Upewnij się, że płytka zatrzasnęła się na miejscu.
5. Podłącz mikrokontroler, diodę LED i porty wentylatora do źródła zasilania.
6. Ostrożnie spryskaj przewody 70% etanolem i wytrzyj do sucha.
7. Umieść aparat z matrycą LED w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5%_CO2 na 24 godziny. Upewnij się, że diody LED świecą się zgodnie z przeznaczeniem i że przewody nie są napięte podczas uszczelniania inkubatora.

4. Przygotowanie cytometrii przepływowej

1. W środowisku czerwonych latarni wyjmij OptoPlate i umieść ją w szafce zabezpieczającej się biologicznie
   UWAGA: Komórki można opcjonalnie obejrzeć za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, aby wizualnie potwierdzić indukcję światła.
2. Ostrożnie zasysaj wszystkie media z każdego dołku.
3. Odłącz komórki za pomocą 30 μL 0,05% trypsyny-EDTA i inkubuj przez 1 minutę w temperaturze pokojowej.
4. Każdą studnię mieszać z 100 μL zimnym buforem FACS (1% FBS w PBS) aż do pojedynczej komórki.
5. Przełóż każdą próbkę na płytkę z 96 dołkami w kształcie litery V.
6. Wiruj płytkę V-bottom z 96 dołkami w temperaturze 164 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
7. Aspiruj 80 μL supernatantu bez naruszania granulki.
8. Dodaj 200 μL zimnego bufora FACS, aby ponownie zawiesić pellet.
9. Owiń płytkę V-bottom z 96 dołkami folią aluminiową dla lekkiej izolacji.
10. Włóż talerz do styropianowego pudełka z lodem do transportu.

5. Bramkowanie i zbieranie danych cytometrią przepływową

1. Włącz cytometr przepływowy za pomocą przełącznika z tyłu i otwórz odpowiednie oprogramowanie do cytometrii przepływowej na komputerze.
2. Uruchom program startowy systemu i załaduję 2 mL wody DI do ładowarki próbek (Ilustracja uzupełniająca 1A).
3. Uruchom kontrolę jakości (QC) z wykorzystaniem dostarczonych kulek QC (Ilustracja Uzupełniająca 1B).
4. Upewnij się, że cytometr przepływowy jest w trybie pobierania próbek płytowych (Rysunek Uzupełniający 1C).
5. Ustaw i określ studnie próbkowe (Rysunek Uzupełniający 1D).
6. Stwórz następujące wykresy rozrzutowe i tabele (Rysunek uzupełniający 2A).
   1. Rozpraszanie boczne (SSC-A) vs rozpraszanie w kierunku przodu (FSC-A).
   2. SSC-H kontra SSC-A.
   3. SSC-A kontra FITC-A.
   4. Tabela statystyk FITC-A (Rysunek Uzupełniający 2B).
7. Zatrzaskaj płytkę V-dolną do ładowarki płytowej cytometru.
8. Wybierz nietransfektowany dół i kliknij Inicjalizuj, a następnie kliknij Uruchom. Upewnij się, że częstotliwość próbkowania objętości wynosi 10 μL/min (Ilustracja uzupełniająca 2C).
9. Dostosuj napięcia SSC i FITC, aby skoncentrować populację zainteresowania na wykresie SSC-A vs FSC-A (Rysunek Uzupełniający 2C).
   1. Stwórz wielokąt, aby zbudować populację zdrowych komórek zainteresowanych (Rysunek uzupełniający 2D).
   2. Stwórz wielokąt do bramki dla dyskryminacji podwójnej na wykresie SSC-H vs SSC-A.
   3. Dostosuj napięcie FITC, aby umieścić nietransfekowane ogniwa w lewej stronie wykresu SSC-A vs FITC-A (Ilustracja uzupełniająca 2D).
10. Powtórz to dla pozostałych nieprzetworzonych odwiertów i zapisz dane Średniej FITC-A.
11. Wybierz studnię CMV-eGFP przetransfektowaną i kliknij Uruchom.
12. Dostosuj napięcie FITC, aby uchwycić zarówno ogniwa autofluorescencyjne, jak i fluorescujące na wykresie SSC-A vs FITC-A.
    1. Stwórz wielokąt, który zbliża się do komórek fluorescencyjnych względem komórek niefluorescencyjnych, jednocześnie odwołując się do początkowej bramki w komórkach nietransfekowanych (Rysunek uzupełniający 2E).
13. Automatyczne nagrywanie próbek z prędkością 60 μL/min aż do osiągnięcia 200 sekund i/lub liczba zdarzeń do 10 000 (Rysunek uzupełniający 2F).
14. Eksportuj Mean FITC jako plik CSV i analizuj dane.
15. Wyczyść cytometr przepływowy przez opcję Daily Clean (Ilustracja uzupełniająca 2G).

6. Optymalizacja intensywności LED

1. Edytuj skrypt mikrokontrolera, aby przetestować pożądane natężenia diod LED (Supplementary Coding File 1, linie 200-215).
   UWAGA: Równoważne natężenia LED względem wartości w skrypcie mikrokontrolera są podawane w innych miejscach³⁸. Samokalibracja może być konieczna przy użyciu różnych diod LED.
2. Upewnij się, że skrypt zawiera następujące wartości w (Supplementary Coding File 1, linie 200-215) zgodnie z Tabelą 2, i prześlij kod do mikrokontrolera.
3. Powtórz kroki 1-5.

Korzystając z elementów przepływu pracy z wcześniejszej literatury37, 38, 55, dodaliśmy jednoczesne oświetlenie o wysokiej przepustowości z OptoPlate-96 i zademonstrowaliśmy pipeline umożliwiający szybkie optymalizowanie systemu ekspresji genów indukowalnego światłem w komórkach ssaków (rysunek 1).

W systemach indukowalnej ekspresji genów wysokie zakresy dynamiczne są kluczowym markerem wydajności, oprócz absolutnej ekspresji włączonej i wyłączonej (nieszczelnej). Dzięki obrazowaniu fluorescencyjnemu komórek transfekowanych można jakościowo zaobserwować różnicę w ekspresji eGFP między komórkami aktywowanymi światłem a komórkami utrzymywanymi w ciemności (Rysunek 2). Stosunek 1:9 wyraźnie skutkuje mniejszą maksymalną ekspresją eGFP w porównaniu do stosunku 5:5. Można również zauważyć wzrost nieszczelności w stosunku 5:5. Obrazowanie fluorescencyjne konstytutywnie wyrażających komórki eGFP (CMV-eGFP) oraz komórek nietransfekowanych jest cennym dodatnim i negatywnym mechanizmem kontrolnym, pozwalającym kontekstualizować efektywność transfekcji oraz odpowiednio indukowaną i nieszczelną ekspresję systemu. Wykorzystanie obrazowania fluorescencyjnego pozwala użytkownikom szybko zobaczyć i potwierdzić skuteczną transfekcję oraz aktywację ekspresji genów za pomocą niebieskiego światła, co stanowi cenny punkt kontrolny przed cytometrią przepływową. Cytometria przepływowa może być następnie użyta do ilościowego określenia średniej intensywności fluorescencji (MFI) oraz zakresu dynamicznego.

Po aktywacji światłem komórki przygotowuje się je za pomocą buforu FACS i analizuje za pomocą cytometrii przepływowej. HEK293T komórek mają około 11-15 μm, co skutkuje przyrostem FSC o 500 i SSC o 125 (Ilustracja uzupełniająca 2C), aby skoncentrować zdrowe populacje komórek. Wyższe napięcia powodują analizę szczątków, a nie zdrowych populacji komórek. Nasze przejazdy regularnie mają ponad ~60% zdarzeń w pierwszej bramie populacji (P1) (rysunek 3A-D). Gdy populacje zdrowych komórek stanowią większość zdarzeń w wykresie SSC-A vs FSC-A, można również sprawdzić gęstość zdarzeń, aby zidentyfikować większość populacji (Rysunek uzupełniający 3A). Następnie można przeprowadzić rozróżnienie dubletów za pomocą wykresu SSC-H vs SSC-A, co jest kluczowe dla wiarygodnych i powtarzalnych wyników60,61. W tym systemie zazwyczaj ponad 95% zdarzeń zamkniętych w P1 to singlelety (Rysunek 3A-D). Na wykresie SSC-A vs FITC-A komórki nietransfekowane zazwyczaj znajdują się w lewej części środka wykresu i są ograniczone do populacji <0,1% (Rysunek 3A). Następnie komórki eGFP-dodatnie wypełnią bramkę, która była pusta w nietransfekowanej próbce, co skutkuje analizą pojedynczych komórek MFI (Rysunek 3B). Po zebraniu kontroli ujemnej i dodatniej w celu ustawienia właściwych bramek i napięć, próbki z 2pLACE można analizować przy użyciu tych samych bramek, aby niezawodnie wykluczyć komórki autofluorescujące (rysunek 3C,D). Tutaj procent populacji komórek eGFP-dodatnich wynosił ~99% dla CMV-eGFP i ~57% dla komórek transfekowanych przez 2pLACE. Na kanale PE-A można również użyć końcowej bramki, aby zapewnić wychwyt silnie fluorescencyjnym ogniw (Rysunek Dodatkowy 3B).

Inny stosunek testowany to 3:7. Jako etap walidacyjny wykonano obrazy mikroskopii fluorescencyjnej przed cytometrią przepływową i zaobserwowano skuteczną transfekcję indukcji ekspresji eGFP z 2pLACE, co spodziewano było mniejsze niż CMV-eGFP (rysunek 4A). Po zebraniu danych z cytometrii przepływowej 2pLACE, ekspresję genów aktywowaną światłem niebieskim można porównać z ekspresją genów nieszczelnych (Rysunek 4B). Korzystając z ustawień opisanych w kroku 3.1, mogliśmy zaobserwować ~3-krotny wzrost ekspresji po aktywacji niebieskiego światła, odpowiadając zwiększonej sygnale fluorescencji obserwowanej jakościowo przez mikroskopię. Dodatkowo, efektywność transfekcji można pośrednio obserwować, mierząc procent populacji eGFP-dodatniej, czyli procent rodziców, na poziomie ~60% zdrowych pojedynczych komórek (Rysunek 4C).

Wdrożenie tego protokołu w całości pozwala zidentyfikować optymalne stosunki mas (rysunek 5A) i natężenia światła (rysunek 5B) dla maksymalnego zakresu dynamicznego i wyrażenia regulowanego. Stosunki mas niższe niż 6:4 wykazywały większy zakres dynamiczny (3,5-4,5), natomiast stosunki mas powyżej 6:4 wykazywały zmniejszony zakres dynamiczny z powodu zwiększonego tła i zmniejszonej maksymalnej ekspresji eGFP. Dla maksymalnego wyrażenia i wysokiego zakresu dynamicznego preferowany jest stosunek 3:7. Stosunki poniżej 3:7 wykazywały podobne indukcje fałdów, ale ogólną maksymalną ekspresję mniejszą. Korzystając z wcześniej skalibrowanych wartości natężenia światła38 (Tabela 2), można scharakteryzować poziom ekspresji genów względem różnych natężeń światła. Natężenie światła kontrolowało również poziom ekspresji eGFP, podczas gdy MFI nasyca się przy ~3 mW/cm2. Intensywność światła powyżej tego poziomu może mieć różne wartości MFI, prawdopodobnie z powodu fotobielenia w niektórych próbkach, jak w temperaturach ~9 i 11 mW/cm2.

Rysunek 1: Ogólny tok eksperymentów o wysokiej przepustowości testujących systemy optogenetyczne. Komórki są zasiewane w czarnej płytce z 96 dołkami na 24 godziny. Następnie komórki są transfekowane przez 12-minutowy okres inkubacji DNA i odczynnika transfekcyjnego. 24 godziny po transfekcji płytka jest umieszczana na OptoPlate-96 w celu aktywacji niebieskiego światła. Po oczekiwanym czasie aktywacji niebieskiego światła komórki są przygotowywane w środowisku czerwonego światła do cytometrii przepływowej. Dane z cytometrii przepływowej są reprezentowane jako wykresy średniej intensywności fluorescencji komórek eGFP-dodatnich w ciemności lub poddanych niebieskiemu światłu. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 2: Reprezentatywne obrazy mikroskopii fluorescencyjnej 2pLACE w stanie włączonym i wyłączonym w HEK293T komórkach. Różne stosunki masowe CRY2-eGFP: CIBN-gRNA zostały przebadane pod kątem poziomu ekspresji eGFP. Komórki były wystawiane na działanie niebieskiego światła (WŁĄCZONE) lub pozostawane w ciemności (WYŁĄCZONE) przez 24 godziny. Pasek skali oznacza 100 μm. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego wykresu.

Rysunek 3: Reprezentatywne wykresy rozpraszania cytometrii przepływowej komórek nietransfekowanych (UT), CMV-eGFP oraz 2pLACE HEK293T. Cytometria przepływowa była wykonywana z użyciem funkcji ładowarki płytowej. (A) HEK293T komórki były glatowane na podstawie rozpraszania w kierunku przód (FSC-A) i rozpraszania bocznego (SSC-A). Koncentrację zdarzeń na wykresach SSC-A vs. FSC-A można zobrazować za pomocą wykresu konturowego (Rysunek Uzupełniający 3A), który pomaga w ograniczaniu zdrowych populacji. Rozróżnianie podwójne wykonano na wykresie SSC-H vs. SSC-A za pomocą bramki liniowej. Ostateczny wykres ograniczył komórki fluorescencyjne, odwołując się do nieprzekontraktowanej próbki. (B) Komórki były zamknięte jak w (A), co pokazuje populację fluorescencyjną i intensywność fluorescencji w tabeli statystycznej (Rysunek Uzupełniający 2B). (C,D) Komórki transfekowane przez 2pLACE były oddzielnie oddzielane przez bramkę P3. Populacja magenty obejmuje wszystkie komórki eGFP-dodatnie (Rysunek uzupełniający 3B). Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 4: Analiza jakościowa i ilościowa ekspresji eGFP indukowanej światłem w komórkach HEK293T. (A) Obrazy mikroskopii fluorescencyjnej HEK293T komórek transfekowanych plazmidami 2pLACE lub CMV-eGFP. (B) Ilościowe określenie średniej intensywności fluorescencji (MFI) eGFP w komórkach utrzymywanych w warunkach niebieskiego światła lub ciemności. (C) Procent komórek pozytywnych z eGFP mierzony za pomocą analizy gating cytometrii przepływowej. Gating powodował, że <0,1% nietransfekowanych komórek mieściło się w progu eGFP-dodatnim. Dane z cytometrii przepływowej reprezentują wartości średnie, a paski błędu wskazują odchylenia standardowe od czterech technicznych replikacji. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 5: Cytometria przepływowa reprezentatywnych stosunków mas 2pLACE i intensywności niebieskiego światła. (A) Różne stosunki masowe CRY2-eGFP: CIBN-gRNA zostały transfekowane do HEK293T komórek, które następnie były wystawione na działanie niebieskiego światła lub utrzymywane w ciemności przy tych samych ustawieniach, co opisane w kroku 3 protokołu. Każdy warunek jest średnią 3 biologicznych replikacji. (B) Reprezentatywny trend ekspresji genów w zależności od intensywności niebieskiego światła. Każdy warunek jest średnią 6 technicznych replik. Średnie intensywności fluorescencji są ilościowo określane za pomocą bramki cytometrem przepływowym komórek wyrażających eGFP. Wszystkie paski błędu reprezentują odchylenie standardowe. Dla stosunków plazmidów istotność statystyczna MFI została obliczona za pomocą jednokierunkowego testu t porównującego jasny i ciemny stosunek plazmidów. Dla natężeń światła istotność statystyczną obliczono za pomocą jednokierunkowej ANOVA oraz testu T2 Tamhane'a po posprzedaży, w porównaniu do stanu ciemnego (OFF). *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p <0,0001, *****p < 0,00001 oraz ns nie jest istotne. Ten wykres został zaadaptowany z Garimella i in.38. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Tabela 1: Ilość plazmidów CRY2-eGFP i CIBN-gRNA na dołek na przykładzie stężeń. Objętość jest dostępna na dołek i może być modyfikowana w zależności od liczby próbek lub replikacji w eksperymencie. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela 2: Zalecane wartości dla natężenia niebieskiego światła. Kod znajduje się w Pliku Uzupełniającym Kodowania nr 1 (linie 215-228). Równoważne wartości intensywności oblicza się na podstawie danych kalibracyjnych wcześniej zgłoszonych za pomocą miernika mocy optycznej. Każdy poziom intensywności ma 6 technicznych replik. Rzędy G i H przeznaczone są dla CMV-eGFP oraz nietransfekowanych studni kontrolnych. Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Rysunek uzupełniający 1: Kroki 5.1-5.5 protokołu. (A) Uruchamiam program uruchamiania systemu. (B) Standaryzacja kontroli jakości z wykorzystaniem kulek fluoroforowych. (C) Przełączenie z próbkowania z lamp na tryb ładowania płytowego. (D) Wybór studni do oznaczania jako studnie próbkowe; Do tego przykładu wybrano 35 studni. Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 2: Kroki 5.6-5.14 protokołu. (A) Tworzenie wykresów rozpraszania światła: FSC-A vs. SSC-A dla zdrowego blokowania populacji komórek, SSC-A vs. SSC-H dla rozróżniania podwójnych oraz SSC-A vs. FITC-A dla bramek autofluorescencyjnych i komórek eGFP-dodatnich. (B) Przygotowanie tabeli statystycznej do pozyskiwania danych FITC-A do pomiaru średniej intensywności fluorescencji. (C) Podświetlenie zasad zatrzymania w zakładce Events to Display. Zapewnij wolny przepływ próbki, wyrzuć i załaduj płytę, zainicjować sondę cytometru przepływowego oraz dostosować napięcia akwizycji. (D) Tworzenie wielokątów do blokowania każdej populacji, jak pokazano. (E) Dodanie odpowiedniej liczby studni. (F) Kliknięcie na automatyczne nagrywanie po zakończeniu ustawień i bramek. (G) Kliknięcie na Daily Clean po zebraniu wszystkich próbek i wyeksportowaniu statystyk. Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Ilustracja uzupełniająca 3: Walidacja wszystkich komórek w przejętej bramce, zobrazowana przez zielone zdarzenia w P4 (magenta). (A) Wykres konturowy zdrowej populacji w ramach bramki populacji eGFP-dodatniej (P3). Komórki koncentrują się głównie w strefach czerwonych, a na zewnątrz maleją. (B) wykres SSC-A vs. PE-A do blokowania P4, zapewniający dodatkową kontrolę zapewniającą, że wszystkie zdarzenia fluorescencyjne są uwzględnione na wykresie FITC-A. Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Plik Dodatkowego Kodowania 1: Przykładowy kod Arduino implementujący wszystkie właściwości opisane w powyższym protokole. Ten plik aktywuje wszystkie pozycje diod LED używając zalecanych wartości intensywności LED w Tabeli 2. Proszę kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Autorzy deklarują brak konkurencyjnych interesów.