Artykuł metodologiczny

Szybka optymalizacja systemu indukowalnego światłem do kontroli ekspresji genów ssaków

DOI:

10.3791/68779

⸱

4 listopada 2025

 ,  ,  , 
1Department of Chemical Engineering, University of California, Davis, 2Department of Microbiology and Molecular Genetics, University of California, Davis

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badanie opisuje metodę eksperymentów o wysokiej przepustowości z wykorzystą matrycę LED drukowaną w 3D, aby zoptymalizować ekspresję genów indukowanych światłem w HEK293T komórkach.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Narzędzia do indukowalnej ekspresji genów mogą otworzyć nowe zastosowania w zdrowiu ludzi i biotechnologii, ale obecne opcje są często kosztowne, trudne do odwrócenia i mają niepożądane, niecelne efekty. Systemy optogenetyczne wykorzystują białka reagujące na światło do kontrolowania aktywności regulatorów tak, że ekspresja jest kontrolowana za pomocą "przełącznika". Badanie to optymalizuje uproszczony system efektora CRISPR aktywowanego światłem (2pLACE), który zapewnia regulowaną, odwracalną i precyzyjną kontrolę ekspresji genów ssaków. OptoPlate-96 umożliwia wysokoprzepustowe przesiewanie za pomocą cytometrii przepływowej do analizy pojedynczych komórek oraz szybkiej optymalizacji 2pLACE. Badanie to pokazuje, jak wykorzystać system 2pLACE z OptoPlate-96 w komórkach HEK293T do identyfikacji optymalnych stosunków składowych maksymalizujących zakres dynamiczny oraz do znalezienia krzywej odpowiedzi intensywności niebieskiego światła. Podobne procesy można opracować dla innych komórek ssaków oraz dla innych systemów optogenetycznych i długości fal światła. Te postępy zwiększają precyzję, skalowalność i elastyczność narzędzi optogenetycznych do zastosowań bioprodukcyjnych.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Narzędzia biologii syntetycznej, takie jak systemy indukowalnej ekspresji genów, wniosły znaczący wkład w badania biologiczne. Ich zdolność do regulacji ekspresji genów w sposób dostosowalny, odwracalny i precyzyjny może poprawić kontrolę nad produkcją białek 1,2,3,4,5,6, morfologii komórek 7,8,9,10,11,12, szlaków metabolicznych 13,14,15,16,17,18 oraz inne cele do bioprodukcji i zastosowań terapeutycznych. Układy chemicznie indukowalne mogą mieć efekty resztkowe19,20 lub niecelowe. Dodatki chemiczne mogą być również bardzo drogie i trudne do skalowania przemysłowo ze względu na dodatkowe procesy oczyszczania w dalszej fazie 21,22,23. Systemy ekspresji genów indukowalne światłem mogą zaoferować skalowalną i precyzyjną metodę praktyk bioprodukcyjnych 24,25,26,27.

Wiele systemów ekspresji genów indukowanych światłem zostało opracowanych jako użyteczne narzędzia biologii syntetycznej w różnych zastosowaniach 28,29,30,31,32,33,34,35,36 oraz długości fal niebieskiego 35,37,38, czerwonego/dalekiego czerwonego12,39,40, czyli zielone światło41. W przypadku regulacji genów optogenetycznych opartych na CRISPR, modyfikacja liczby dostarczonych indywidualnych RNA przewodników (gRNA) może wpłynąć na ekspresję mRNA genów endogennych42 i będzie wymagała optymalizacji pod kątem różnych linii komórkowych. Można również stosować białka transaktywacyjne, takie jak VP64 37,42,43,44, VP16 39,40,44,45,46, p65 44 lub fuzjeich 47, zwiększając modułowość układów optogenetycznych. Aby zbadać złożone i splecione szlaki biologiczne 12,40,48,49,50,51,52,53, można testować różne kombinacje tych znanych składników. Dodatkowo, różne linie komórkowe mogą wykazywać różnice w indukcji z tym samym systemem52. Różne poziomy indukcji mogą prowadzić do niewystarczającej ekspresji genów lub czułości w precyzyjnej kontroli ekspresji genów, co wymaga rygorystycznych testów w celu znalezienia optymalnego systemu optogenetycznego w nowych lub bardziej biologicznie istotnych liniach komórkowych. Wraz z rosnącym tempem i poszerzaniem się zastosowań regulacji genów optogenetycznych, konieczne jest szybkie scharakteryzowanie tych różnych systemów.

Obecne metody charakteryzacji narzędzi optogenetycznych wykorzystują stabilną lub przejściową ekspresję genów12,54. Generowanie stabilnie wyrażających linie komórkowe i optymalizacja dynamiki systemu dla maksymalnej ekspresji mogą być czasochłonne, a przez to kosztowne. Ekspresja przejściowa umożliwia szybkie i cenne wnioski, zwłaszcza podczas testowania wieloskładnikowych systemów optogenetycznych. Tutaj zastosowaliśmy system efektora CRISPR-dCas9 (LACE)37 aktywowanego niebieskim światłem, składającego się z kryptochromu 2 (CRY2) oraz kryptochromu oddziałującego z podstawową helisową pętlą helisową helisy N-terminalem (CIBN). Stosowano go do kontroli ekspresji genów w komórkach ssaków, takich jak HEK293T (ludzkie komórki nerek embrionalnych)37,38, CHO-DG44 (komórki jajnika chomika chińskiego)55 oraz C2C12 (komórki myoblastu myszy)38. Jego modułowy charakter jest idealny do szybkiego charakteryzowania wydajności systemu za pomocą ekspresji przejściowych i metod o wysokiej przepustowości. Na przykład systemy wieloskładnikowe, takie jak LACE, mogą wymagać optymalizacji stosunków mas, aby poprawić indukcję, co jest krokiem rzadko stosowanym w charakteryzacji systemów optogenetycznych.

Protokół ten opisuje szybką optymalizację i charakterystykę systemu 2pLACE38 z dwoma plazmidami. W tym układzie 2pLACE kontroluje ekspresję fluorescencyjnego reportera, eGFP (wzmocnionego zielonego białka fluorescencyjnego), w HEK293T komórkach. Aktywacja odbywa się na czarnych płytach 96-dołkowych z czarnym szklanym dnem za pomocą OptoPlate-96, drukowanej w 3D matrycy LED zaprojektowanej i zbudowanej przez Lukasza Bugaja i współpracowników56, 57, 58, 59. Protokół ten w szczególności optymalizuje maksymalną ekspresję przy różnych stosunkach mas układu dwuplazmidowego. Zawiera także przyjazny dla użytkownika kod do sterowania różnymi natężeniami światła, aby sprawdzić możliwość strojenia systemu i jego pełny zakres dynamiczny. Cytometria przepływowa jest stosowana do zbierania i analizy danych. Protokoły generowania konstrukcji plazmidowych i materiałów do druku 3D dla matrycy LED można znaleźć w poprzednich publikacjach 54,56. Metody te podkreślają szybki, wysokoprzepustowy proces charakteryzowania systemów ekspresji genów indukowanych światłem.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Powlekanie HEK293T komórek w formacie 96-dołkowy

  1. W szafce na bezpieczeństwo biologiczne zbierz pojemnik na odpady wybielacze, pipety serologiczne, pipetę pipetową, solankę Dulbecco z buforem fosforanowym (DPBS), podłoże Dulbecco zmodyfikowane Eagle's Medium (DMEM) z 10% surowicy płodowej bydła (FBS) oraz kolbkę do hodowli komórek T-75 z mieszanką komórek HEK293T. Podgrzewanie podłoża do 37 °C.
  2. W kolbie T-75 sprawdź, czy zbieżność jest około 80%-100% zbiegająca się za pomocą odwróconego mikroskopu.
  3. W szafce biobezpieczeństwa użyj pipety serologicznej, aby aspirować zużyte podłoże z kolby do hodowli komórek. Unikaj dotykania powierzchni lub plastiku kolby. Zutylizuj zużyte materiały i aspirator do pojemnika na odpady.
  4. Delikatnie umyj komórki około 10 ml DPBS, wciągając go do rogu kolby i delikatnie mieszając wokół powierzchni. Zassaj DPBS z kolby i wyrzuć płukacz oraz aspirator do pojemnika na odpady.
  5. Dodaj 1,5 ml 0,05% trypsyny-EDTA, aby pokryć powierzchnię kolby i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 1 minutę. Delikatnie stuknij w kolbę, aby poluzować komórki z powierzchni.
  6. Dodaj 8,5 mL świeżego DMEM do kolby. Ponownie zawiesić i wymieszać komórki pipetą serologiczną, aż wszystkie agregaty zostaną rozbite przez aspirację w górę i w dół.
  7. Zbierz 9 mL zawiesiny ogniwowej do stożkowej rurki o pojemności 15 mL.
    1. Dodaj 9 ml świeżego DMEM do kolby i umieść ją w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5%CO2
  8. Za pomocą hemocytometru wymieszaj 10 μL zawieszonych komórek z 10 μL barwnika Trypana w proporcji 1:1, aby obliczyć stężenie komórek. Użyj tej wartości, aby przygotować wystarczającą liczbę komórek do zasiewania na płytce.
  9. Nasiać ~35 000 komórek w 100 μL dla każdej studni wysokowydajnej czarnej szklanej płyty dnej #1.5 z 96 dołkami i umieścić w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5%CO2 przez 24 godziny.

2. Optymalizacja transfekcji 2pLACE

  1. Dla jednego dołku i 10% nadmiaru należy zapodać 11 μL ciepłego, wolnego od surowicy DMEM (SFM) do rurki mikrowirówki o pojemności 1,5 mL.
  2. Stosując CRY2-eGFP: stosunki mas plazmidów CIBN-gRNA równe 1:9, 2:8, 3:7, 4:6, 5:5, 6:4, 7:3, 8:2 i 9:1, aliquotują 110 ng dla każdego dołka całkowitego DNA do aliquotów SFM (Tabela 1).
  3. Jako kontrolę dodatnią, aliquotuj tę samą masę plazmidu CMV-eGFP do różnych aliquotów SFM.
  4. Dla każdego dołka należy zaznaczyć 11 μL SFM na rozcieńczenie odczynników transfekcyjnych.
  5. Przygotuj odczynnik transfekcyjny w stosunku masy (μg) do objętości (μL) DNA i reagenta transfekcyjnego.
  6. Dodaj rozcieńczony odczynnik transfekcyjny do rozcieńczonego DNA i inkubuj przez 12 minut w temperaturze pokojowej, aby uzyskać kompleksy transfekcyjne.
  7. Dodaj ~20 μL kompleksu transfekcyjnego do każdego dołku. Upewnij się, że nie dotyka ścian studni.
  8. Owiń talerz folią aluminiową i umieść w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5%CO2 na 24 godziny.

3. Aktywacja 2pLACE

  1. Zmodyfikuj kod wejściowy mikrokontrolera, aby oświetlać pożądane otwory za pomocą tych ustawień (Supplementary Coding File 1, linie 147 - 158).
    1. Natężenie LED: 9,27 mW/cm2 (Plik kodowania uzupełniający 1, linie 200 - 215).
    2. Długość impulsu: 1 s (Plik kodujący uzupełniający 1, linie 280 - 290).
    3. Częstotliwość impulsów: 0,067 Hz (co 15 s) (Plik kodujący uzupełniający 1, linie 264 - 278).
      UWAGA: Ustawienia długości fali zależą od rodzaju zainstalowanych diod LED.
  2. Spryskaj pokrywkę OptoPlate wydrukowaną w 3D 70% etanolem i pozwól wyschnąć w szafce z zabezpieczeniem biologicznym.
  3. Włącz lampę z ciemni z czerwonym światłem i umieść płytkę z 96 dołkami do szafki zabezpieczeń biologicznych, a pokrywkę zamień na wysuszoną pokrywkę wydrukowaną w 3D.
    UWAGA: Ogniwa CMV-eGFP można opcjonalnie obejrzeć za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, aby oszacować efektywność transfekcji.
  4. Weź płytę z 96 dołkami i umieść ją na matrycy LED, aby zbudować aparat LED. Upewnij się, że płytka zatrzasnęła się na miejscu.
  5. Podłącz mikrokontroler, diodę LED i porty wentylatora do źródła zasilania.
  6. Ostrożnie spryskaj przewody 70% etanolem i wytrzyj do sucha.
  7. Umieść aparat z matrycą LED w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5%CO2 na 24 godziny. Upewnij się, że diody LED świecą się zgodnie z przeznaczeniem i że przewody nie są napięte podczas uszczelniania inkubatora.

4. Przygotowanie cytometrii przepływowej

  1. W środowisku czerwonych latarni wyjmij OptoPlate i umieść ją w szafce zabezpieczającej się biologicznie
    UWAGA: Komórki można opcjonalnie obejrzeć za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, aby wizualnie potwierdzić indukcję światła.
  2. Ostrożnie zasysaj wszystkie media z każdego dołku.
  3. Odłącz komórki za pomocą 30 μL 0,05% trypsyny-EDTA i inkubuj przez 1 minutę w temperaturze pokojowej.
  4. Każdą studnię mieszać z 100 μL zimnym buforem FACS (1% FBS w PBS) aż do pojedynczej komórki.
  5. Przełóż każdą próbkę na płytkę z 96 dołkami w kształcie litery V.
  6. Wiruj płytkę V-bottom z 96 dołkami w temperaturze 164 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
  7. Aspiruj 80 μL supernatantu bez naruszania granulki.
  8. Dodaj 200 μL zimnego bufora FACS, aby ponownie zawiesić pellet.
  9. Owiń płytkę V-bottom z 96 dołkami folią aluminiową dla lekkiej izolacji.
  10. Włóż talerz do styropianowego pudełka z lodem do transportu.

5. Bramkowanie i zbieranie danych cytometrią przepływową

  1. Włącz cytometr przepływowy za pomocą przełącznika z tyłu i otwórz odpowiednie oprogramowanie do cytometrii przepływowej na komputerze.
  2. Uruchom program startowy systemu i załaduję 2 mL wody DI do ładowarki próbek (Ilustracja uzupełniająca 1A).
  3. Uruchom kontrolę jakości (QC) z wykorzystaniem dostarczonych kulek QC (Ilustracja Uzupełniająca 1B).
  4. Upewnij się, że cytometr przepływowy jest w trybie pobierania próbek płytowych (Rysunek Uzupełniający 1C).
  5. Ustaw i określ studnie próbkowe (Rysunek Uzupełniający 1D).
  6. Stwórz następujące wykresy rozrzutowe i tabele (Rysunek uzupełniający 2A).
    1. Rozpraszanie boczne (SSC-A) vs rozpraszanie w kierunku przodu (FSC-A).
    2. SSC-H kontra SSC-A.
    3. SSC-A kontra FITC-A.
    4. Tabela statystyk FITC-A (Rysunek Uzupełniający 2B).
  7. Zatrzaskaj płytkę V-dolną do ładowarki płytowej cytometru.
  8. Wybierz nietransfektowany dół i kliknij Inicjalizuj, a następnie kliknij Uruchom. Upewnij się, że częstotliwość próbkowania objętości wynosi 10 μL/min (Ilustracja uzupełniająca 2C).
  9. Dostosuj napięcia SSC i FITC, aby skoncentrować populację zainteresowania na wykresie SSC-A vs FSC-A (Rysunek Uzupełniający 2C).
    1. Stwórz wielokąt, aby zbudować populację zdrowych komórek zainteresowanych (Rysunek uzupełniający 2D).
    2. Stwórz wielokąt do bramki dla dyskryminacji podwójnej na wykresie SSC-H vs SSC-A.
    3. Dostosuj napięcie FITC, aby umieścić nietransfekowane ogniwa w lewej stronie wykresu SSC-A vs FITC-A (Ilustracja uzupełniająca 2D).
  10. Powtórz to dla pozostałych nieprzetworzonych odwiertów i zapisz dane Średniej FITC-A.
  11. Wybierz studnię CMV-eGFP przetransfektowaną i kliknij Uruchom.
  12. Dostosuj napięcie FITC, aby uchwycić zarówno ogniwa autofluorescencyjne, jak i fluorescujące na wykresie SSC-A vs FITC-A.
    1. Stwórz wielokąt, który zbliża się do komórek fluorescencyjnych względem komórek niefluorescencyjnych, jednocześnie odwołując się do początkowej bramki w komórkach nietransfekowanych (Rysunek uzupełniający 2E).
  13. Automatyczne nagrywanie próbek z prędkością 60 μL/min aż do osiągnięcia 200 sekund i/lub liczba zdarzeń do 10 000 (Rysunek uzupełniający 2F).
  14. Eksportuj Mean FITC jako plik CSV i analizuj dane.
  15. Wyczyść cytometr przepływowy przez opcję Daily Clean (Ilustracja uzupełniająca 2G).

6. Optymalizacja intensywności LED

  1. Edytuj skrypt mikrokontrolera, aby przetestować pożądane natężenia diod LED (Supplementary Coding File 1, linie 200-215).
    UWAGA: Równoważne natężenia LED względem wartości w skrypcie mikrokontrolera są podawane w innych miejscach38. Samokalibracja może być konieczna przy użyciu różnych diod LED.
  2. Upewnij się, że skrypt zawiera następujące wartości w (Supplementary Coding File 1, linie 200-215) zgodnie z Tabelą 2, i prześlij kod do mikrokontrolera.
  3. Powtórz kroki 1-5.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Korzystając z elementów przepływu pracy z wcześniejszej literatury37, 38, 55, dodaliśmy jednoczesne oświetlenie o wysokiej przepustowości z OptoPlate-96 i zademonstrowaliśmy pipeline umożliwiający szybkie optymalizowanie systemu ekspresji genów indukowalnego światłem w komórkach ssaków (rysunek 1).

W systemach indukowalnej ekspresji genów wysokie zakresy dynamiczne są klu...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten demonstruje optogenetyczną kontrolę wieloskładnikowej ekspresji przejściowej genów w komórkach ssaków, umożliwiając innym badaczom szybkie i jednoczesne charakteryzowanie modułowych systemów optogenetycznych za pomocą fluorescencyjnego reportera.

W tym przypadku zoptymalizowano dwuplazmidowy system indukowalny światłem do ekspresji eGFP w HEK293T komórkach. Aby uzyskać skuteczną współtransfekcję, niezbędne jest optymalizacja gęstości siewu i stosunków mas dla maksymalnej efektywno...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konkurencyjnych interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prace te są wspierane przez Instytut Badań Translacyjnych poprzez NASA Cooperative Agreement NNX16AO69A oraz przez Good Foods Institute. Projekt ten był wspierany przez Laboratorium Współdzielonych Zasobów Przepływowej Cytometrii UC Davis, przy wsparciu technicznym Bridget McLaughlin, Jonathana Van Dyke'a i Ashley'a Karajeh, a także ze środków NCI P30 CA093373 (Comprehensive Cancer Center) oraz S10OD018223 (cytometr Beckman Coulter "Cytoflex").

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Rurki mikrowirówkowe o pojemności 1,5 mLVWR10025-724
Zbiorniki odczynników 10 mLVWR77395-252
10 mL pipety serologiczneVWR75816-100
1000 i mu; Końcówki filtrów LVWR76322-154
15 mL  Wysokowydajne rury wirówkowe, płaska pokrywaVWR89039-664
Miernik mocy optycznej z 1931-CNewport1931-C
2 mL pipety serologiczneVWR75816-104
20 & mu; Końcówki filtrów LVWR76322-134
200 μ Końcówki filtrów LVWR76322-150
50 mL wysokowydajne rurki do wirówek z płaskim zakrętemVWR89039-656
Płyty V-bottom z 96 dołkamiBRANDplates781661
A21, czerwona żarówka LEDŻarówki BluexNie maŹródło czerwonego światła
Oprogramowanie IDE ArduinoArduinoNie ma
Szafka Biosafety, klasa IINuAireNie ma
Hemocytometr jasnej liniiHausser Scientific3110
Slajdy liczące komórkiBioRad1450016
Płytka do hodowli komórek 96-dołek, szklana płyta dolna #1.5HCellvisP96-1.5H-N
Oprogramowanie CytExpertBeckman CoulterNie ma
CytoFLEX gotowy do użycia fluorosfer kontroli jakości na dzieńBeckman CoulterC657194 stopnie; C
Cytometr przepływowy CytoFLEX-S (4 kanały fioletowe, 2 niebieskie, 4 żółtozielone, 3 czerwone)Beckman CoulterC09766
Fosforanowy puforowany proszek solny fizjologicznej Dulbecco, bez kaliku, bez magnezuFisher Scientific21600069Temperatura pokojowa
Wirówka Eppendorf 5804Eppendorf  022622501Etap wirówki płyty V-bottom
Wirówka Eppendorf 5810REppendorf22625501
Eppendorf Research plus, 8-kanałowy, zmienna objętość, 30 - 300 & mu; LEppendorf3125000052
Eppendorf Research plus, jednokanałowy, zmienna objętość, 100 - 1000 μ LEppendorf3123000063
Eppendorf Research plus, jednokanałowy, zmienna głośność, 2 - 20 μ LEppendorf3123000039
Eppendorf Research plus, jednokanałowy, zmienna objętość, 20 - 200 μ LEppendorf3123000055
Taśma do etykietowania laboratoryjnego ogólnego przeznaczeniaVWR89097-920
Gibco DMEM, proszek, wysoka glukozaFisher Scientific121000614 stopnie; C
Gibco Trypan Blue Solution, 0,4%Fisher Scientific15-250-061Temperatura pokojowa
Gibco Value Heat Inactivated FBSFisher ScientificA5256901-20 &°C; C
Gibco, trypsyna-EDTA (0,05%), z EDTA, pochodzenie zwierzęce, 1X, Phenol Red, 500 mLGibco25300062-20 &°C; C
HEK293T KomórkiATCCCRL-11268-80 &°; C, Ciekły azot
Markery laboratoryjne, mikronowaVWR89205-944
Metalowa lampa biurkowaProste projektyNie maLampa na czerwone światło
OptoPlate-96LABmakerNie ma
Pipet-aid XPDrummond4-000-101
Plazmid: CIBN-gRNANie maNie ma-20 &°C; C
Plazmid: CMV-eGFPNie maNie ma-20 &°C; C
Plazmid: CRY2-eGFPNie maNie ma-20 &°C; C
Reagent transfekcyjny in vitro DNA PolyJetFisher ScientificNC15361174 stopnie; C
Kolba do hodowli komórek T-75VWR10062-860
Inkubator CO2 z okładziną wodnąVWR10810-884

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Poulain, A., Perret, S., Malenfant, F., Mullick, A., Massie, B., Durocher, Y. Rapid protein production from stable CHO cell pools using plasmid vector and the cumate gene-switch. J Biotechnol. 255, 16-27 (2017).
  2. Li, Y., et al. A cross-species inducible system for enhanced protein expression and multiplexed metabolic pathway fine-tuning in bacteria. Nucleic Acids Res. 53 (2), gkae1315(2025).
  3. De Baets, J., De Paepe, B., De Mey, M. Delaying production with prokaryotic inducible expression systems. Microb Cell Fact. 23, 249(2024).
  4. Wang, J., et al. Design and characterization of allantoin-inducible expression systems in budding yeast. Biotechnol Biofuels Bioprod. 18 (1), 26(2025).
  5. De Carluccio, G., Fusco, V., di Bernardo, D. Engineering a synthetic gene circuit for high-performance inducible expression in mammalian systems. Nat Commun. 15 (1), 3311(2024).
  6. Wurm, F. M. Production of recombinant protein therapeutics in cultivated mammalian cells. Nat Biotechnol. 22 (11), 1393-1398 (2004).
  7. Bibek, G. C., Zhou, P., Naha, A., Gu, J., Wu, C. Development of a xylose-inducible promoter and riboswitch combination system for manipulating gene expression in Fusobacterium nucleatum. Appl Environ Microbiol. 89 (9), e00667-e00723 (2023).
  8. Hockemeyer, D., et al. A drug-inducible system for direct reprogramming of human somatic cells to pluripotency. Cell Stem Cell. 3 (3), 346-353 (2008).
  9. Villegas, L. D., et al. Generation of three isogenic gene-edited Huntington's disease human embryonic stem cell lines with DOX-inducible NGN2 expression cassette in the AAVS1 safe locus. Stem Cell Res. 77, 103408(2024).
  10. Lange, L., et al. Inducible forward programming of human pluripotent stem cells to hemato-endothelial progenitor cells with hematopoietic progenitor potential. Stem Cell Rep. 14 (1), 122-137 (2020).
  11. Gupta, S., Schoer, R. A., Egan, J. E., Hannon, G. J., Mittal, V. Inducible, reversible, and stable RNA interference in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (7), 1927-1932 (2004).
  12. Beyer, H. M., et al. Genetically-stable engineered optogenetic gene switches modulate spatial cell morphogenesis in two- and three-dimensional tissue cultures. Nat Commun. 15 (1), 10470(2024).
  13. Lee, S. H., Hu, Y., Chou, A., Chen, J., Gonzalez, R. Metabolic flux optimization of iterative pathways through orthogonal gene expression control: application to the β-oxidation reversal. Metab Eng. 82, 262-273 (2024).
  14. Lan, M. S., Wang, H. W., Chong, J., Breslin, M. B. Coupling of glucose response element from L-type pyruvate kinase and G6Pase promoter enhances glucose-responsive activity in hepatoma cells. Mol Cell Biochem. 300 (1), 191-196 (2007).
  15. Zhang, J., Liu, Y. J., Cui, G. Z., Cui, Q. A novel arabinose-inducible genetic operation system developed for Clostridium cellulolyticum. Biotechnol Biofuels. 8 (1), 36(2015).
  16. Mukherjee, P., Sivaprakasam, S. Engineering the D-lactic acid responsive promoter/repressor system as dynamic metabolic engineering tool in Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus for controlled D-lactic acid biosynthesis. Enzyme Microb Technol. 185, 110606(2025).
  17. Sathesh-Prabu, C., Tiwari, R., Kim, D., Lee, S. K. Inducible and tunable gene expression systems for Pseudomonas putida KT2440. Sci Rep. 11 (1), 18079(2021).
  18. Banerjee, A., Leang, C., Ueki, T., Nevin, K. P., Lovley, D. R. Lactose-inducible system for metabolic engineering of Clostridium ljungdahlii. Appl Environ Microbiol. 80 (8), 2410-2416 (2014).
  19. Stout, A. J., et al. Engineered autocrine signaling eliminates muscle cell FGF2 requirements for cultured meat production. Cell Rep Sustain. 1 (1), 100009(2024).
  20. Shahini, A., et al. NANOG restores the impaired myogenic differentiation potential of skeletal myoblasts after multiple population doublings. Stem Cell Res. 26, 55-66 (2018).
  21. Torres, M., et al. Engineering mammalian cell growth dynamics for biomanufacturing. Metab Eng. 82, 89-99 (2024).
  22. Shupe, J., Zhang, A., Odenwelder, D. C., Dobrowsky, T. Gene therapy: Challenges in cell culture scale-up. Curr Opin Biotechnol. 75, 102721(2022).
  23. Siddiqui, M., Tous, C., Wong, W. W. Small molecule-inducible gene regulatory systems in mammalian cells: progress and design principles. Curr Opin Biotechnol. 78, 102823(2022).
  24. Minami, S. A., Garimella, S. S., Shah, P. S. Computational evaluation of light propagation in cylindrical bioreactors for optogenetic mammalian cell cultures. Biotechnol J. 19 (1), 2300071(2024).
  25. Das, M., Maiti, S. K. Employment of light-inducible promoter in genetically engineered cyanobacteria for photosynthetic isobutanol production with simulated diurnal sunlight and CO2. J Biotechnol. 393, 31-40 (2024).
  26. Borella, L., Sforza, E., Bertucco, A. An internally LED illuminated photobioreactor to increase energy conversion efficiency: design and operation. Energy Convers Manag. 270, 116224(2022).
  27. Choi, S. Y., et al. Scalable cultivation of engineered cyanobacteria for squalene production from industrial flue gas in a closed photobioreactor. J Agric Food Chem. 68 (37), 10050-10055 (2020).
  28. Müller, K., Zurbriggen, M. D., Weber, W. An optogenetic upgrade for the Tet-OFF system. Biotechnol Bioeng. 112 (7), 1483-1487 (2015).
  29. Wang, X., Chen, X., Yang, Y. Spatiotemporal control of gene expression by a light-switchable transgene system. Nat Methods. 9 (3), 266-269 (2012).
  30. Shimizu-Sato, S., Huq, E., Tepperman, J. M., Quail, P. H. A light-switchable gene promoter system. Nat Biotechnol. 20 (10), 1041-1044 (2002).
  31. Müller, K., et al. A red/far-red light-responsive bi-stable toggle switch to control gene expression in mammalian cells. Nucleic Acids Res. 41 (7), e77(2013).
  32. Motta-Mena, L. B., et al. An optogenetic gene expression system with rapid activation and deactivation kinetics. Nat Chem Biol. 10 (3), 196-202 (2014).
  33. Polstein, L. R., Gersbach, C. A. Light-inducible spatiotemporal control of gene activation by customizable zinc finger transcription factors. J Am Chem Soc. 134 (40), 16480-16483 (2012).
  34. Müller, K., Naumann, S., Weber, W., Zurbriggen, M. D. Optogenetics for gene expression in mammalian cells. Biol Chem. 396 (2), 145-152 (2015).
  35. Kennedy, M. J., et al. Rapid blue-light-mediated induction of protein interactions in living cells. Nat Methods. 7 (12), 973-975 (2010).
  36. Qiao, L., et al. A sensitive red/far-red photoswitch for controllable gene therapy in mouse models of metabolic diseases. Nat Commun. 15, 10310(2024).
  37. Polstein, L. R., Gersbach, C. A. A light-inducible CRISPR-Cas9 system for control of endogenous gene activation. Nat Chem Biol. 11 (3), 198-200 (2015).
  38. Garimella, S. S., et al. A simplified two-plasmid system for orthogonal control of mammalian gene expression using light-activated CRISPR effector. BMC Biotechnol. 25 (1), 58(2025).
  39. Kaberniuk, A. A., Shemetov, A. A., Verkhusha, V. V. A bacterial phytochrome-based optogenetic system controllable with near-infrared light. Nat Methods. 13 (7), 591-597 (2016).
  40. Redchuk, T. A., Omelina, E. S., Chernov, K. G., Verkhusha, V. V. Near-infrared optogenetic pair for protein regulation and spectral multiplexing. Nat Chem Biol. 13 (6), 633-639 (2017).
  41. Chatelle, C., et al. A green-light-responsive system for the control of transgene expression in mammalian and plant cells. ACS Synth Biol. 7 (5), 1349-1358 (2018).
  42. Nihongaki, Y., Yamamoto, S., Kawano, F., Suzuki, H., Sato, M. CRISPR-Cas9-based photoactivatable transcription system. Chem Biol. 22 (2), 169-174 (2015).
  43. Konermann, S., et al. Optical control of mammalian endogenous transcription and epigenetic states. Nature. 500 (7463), 472-476 (2013).
  44. Konermann, S., et al. Optical control of mammalian endogenous transcription and epigenetic states. Nature. 500 (7463), 472-476 (2013).
  45. Baloban, M., Kasatkina, L. A., Verkhusha, V. V. iLight2: A near-infrared optogenetic tool for gene transcription with low background activation. Protein Sci. 33 (5), e4993(2024).
  46. Kaberniuk, A. A., Baloban, M., Monakhov, M. V., Shcherbakova, D. M., Verkhusha, V. V. Single-component near-infrared optogenetic systems for gene transcription regulation. Nat Commun. 12 (1), 3859(2021).
  47. Zhou, X. X., et al. A single-chain photoswitchable CRISPR-Cas9 architecture for light-inducible gene editing and transcription. ACS Chem Biol. 13 (2), 443-448 (2018).
  48. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  49. Tak, Y. E., et al. Inducible and multiplex gene regulation using CRISPR-Cpf1-based transcription factors. Nat Methods. 14 (12), 1163-1166 (2017).
  50. Varma, S., Gulati, K. A., Sriramakrishnan, J., Ganla, R. K., Raval, R. Environment signal dependent biocontainment systems for engineered organisms: Leveraging triggered responses and combinatorial systems. Synth Syst Biotechnol. 10 (2), 356-364 (2025).
  51. Chen, X., Li, T., Wang, X., Yang, Y. A light-switchable bidirectional expression module allowing simultaneous regulation of multiple genes. Biochem Biophys Res Commun. 465 (4), 769-776 (2015).
  52. Nihongaki, Y., Yamamoto, S., Kawano, F., Suzuki, H., Sato, M. CRISPR-Cas9-based photoactivatable transcription system. Chem Biol. 22 (2), 169-174 (2015).
  53. Muench, P., et al. A modular toolbox for the optogenetic deactivation of transcription. Nucleic Acids Res. 53 (3), gkae1237(2025).
  54. Guinn, M. T., Coraci, D., Guinn, L., Balázsi, G. Reliably engineering and controlling stable optogenetic gene circuits in mammalian cells. J Vis Exp. (173), e62109(2021).
  55. Minami, S. A., Shah, P. S. Transient light-activated gene expression in Chinese hamster ovary cells. BMC Biotechnol. 21 (1), 13(2021).
  56. Bugaj, L. J., Lim, W. A. High-throughput multicolor optogenetics in microwell plates. Nat Protoc. 14 (7), 2205-2228 (2019).
  57. Chen, S. Y., et al. Optogenetic control reveals differential promoter interpretation of transcription factor nuclear translocation dynamics. Cell Syst. 11 (4), 336-353.e24 (2020).
  58. Meyer, K., Lammers, N. C., Bugaj, L. J., Garcia, H. G., Weiner, O. D. Optogenetic control of YAP reveals a dynamic communication code for stem cell fate and proliferation. Nat Commun. 14 (1), 6929(2023).
  59. Benman, W., et al. A temperature-inducible protein module for control of mammalian cell fate. Nat Methods. 22 (3), 539-549 (2025).
  60. Stadinski, B. D., Huseby, E. S. How to prevent yourself from seeing double. Cytometry A. 97 (11), 1102-1104 (2020).
  61. Merah-Mourah, F., Cohen, S. O., Haziot, A. A two-stage flow cytometry strategy to distinguish single cells from doublets in heterogeneous cell mixtures and improve cell cluster identification: Application to human monocyte subpopulations. Curr Protoc. 1 (8), e229(2021).
  62. Cheng, Y. S., et al. A protocol for culture and characterization of human induced pluripotent stem cells after induction. Curr Protoc. 3 (8), e866(2023).
  63. Wu, S. H., Liao, Y. T., Huang, C. H., Chen, Y. C., Chiang, E. R., Wang, J. P. Comparison of the confluence-initiated neurogenic differentiation tendency of adipose-derived and bone marrow-derived mesenchymal stem cells. Biomedicines. 9 (11), 1503(2021).
  64. Yang, B., Cao, L., Liu, B., McCaig, C. D., Pu, J. The transition from proliferation to differentiation in colorectal cancer is regulated by the calcium activated chloride channel A1. PLoS One. 8 (4), e60861(2013).
  65. Chua, K. H., et al. Effects of serum reduction and VEGF supplementation on angiogenic potential of human adipose stromal cells in vitro. Cell Prolif. 46 (3), 300-311 (2013).
  66. Messmer, T., et al. A serum-free media formulation for cultured meat production supports bovine satellite cell differentiation in the absence of serum starvation. Nat Food. 3 (1), 74-85 (2022).
  67. Li, V. C., Kirschner, M. W. Molecular ties between the cell cycle and differentiation in embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (26), 9503-9508 (2014).
  68. Binder, B. Y. K., Sagun, J. E., Leach, J. K. Reduced serum and hypoxic culture conditions enhance the osteogenic potential of human mesenchymal stem cells. Stem Cell Rev Rep. 11 (3), 387-393 (2015).
  69. Vincent, R. K., Odorico, J. S. Reduced serum concentration is permissive for increased in vitro endocrine differentiation from murine embryonic stem cells. Differentiation. 78 (1), 24-34 (2009).
  70. An-adirekkun, J., et al. A yeast optogenetic toolkit (yOTK) for gene expression control in Saccharomyces cerevisiae. Biotechnol Bioeng. 117 (3), 886-893 (2020).
  71. Zhou, X. X., et al. A single-chain photoswitchable CRISPR-Cas9 architecture for light-inducible gene editing and transcription. ACS Chem Biol. 13 (2), 443-448 (2018).
  72. Hashemi, A., et al. Optimization of transfection methods for Huh-7 and Vero cells: a comparative study. Cytol Genet. 46 (6), 347-353 (2012).
  73. Nihongaki, Y., Kawano, F., Nakajima, T., Sato, M. Photoactivatable CRISPR-Cas9 for optogenetic genome editing. Nat Biotechnol. 33 (7), 755-760 (2015).
  74. Jayaraman, P., Devarajan, K., Chua, T. K., Zhang, H., Gunawan, E., Poh, C. L. Blue light-mediated transcriptional activation and repression of gene expression in bacteria. Nucleic Acids Res. 44 (14), 6994-7005 (2016).
  75. Nicoletti, I., Migliorati, G., Pagliacci, M. C., Grignani, F., Riccardi, C. A rapid and simple method for measuring thymocyte apoptosis by propidium iodide staining and flow cytometry. J Immunol Methods. 139 (2), 271-279 (1991).
  76. Riccardi, C., Nicoletti, I. Analysis of apoptosis by propidium iodide staining and flow cytometry. Nat Protoc. 1 (3), 1458-1461 (2006).
  77. Choi, S., et al. Protective effect of melatonin against blue light-induced cell damage via the TRPV1-YAP pathway in cultured human epidermal keratinocytes. Biofactors. 51 (2), e70015(2025).
  78. Alghamdi, R. A., Exposito-Rodriguez, M., Mullineaux, P. M., Brooke, G. N., Laissue, P. P. Assessing phototoxicity in a mammalian cell line: How low levels of blue light affect motility in PC3 cells. Front Cell Dev Biol. 9, 738786(2021).
  79. Yokoi, Y., et al. Potential consequences of phototoxicity on cell function during live imaging of intestinal organoids. PLoS One. 19 (11), e0313213(2024).
  80. Flores-Ibarra, A., et al. Light-oxygen-voltage (LOV)-sensing domains: activation mechanism and optogenetic stimulation. J Mol Biol. 436 (5), 168356(2024).
  81. Motta-Mena, L. B., et al. An optogenetic gene expression system with rapid activation and deactivation kinetics. Nat Chem Biol. 10 (3), 196-202 (2014).
  82. Lan, T. H., He, L., Huang, Y., Zhou, Y. Optogenetics for transcriptional programming and genetic engineering. Trends Genet. 38 (12), 1253-1270 (2022).
  83. Baloban, M., Kasatkina, L. A., Verkhusha, V. V. iLight2: A near-infrared optogenetic tool for gene transcription with low background activation. Protein Sci. 33 (5), e4993(2024).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Systemy optogenetyczneindukowalna ekspresja gen wefektor CRISPRcytometria przep ywowawysokoprzepustowe przesiewanieaktywacja wiat em niebieskimkom rki HEK293Tobrazowanie fluorescencyjne

Powiązane artykuły