Method Article

Trójwymiarowa ilościowa identyfikacja śluzu jelitowego za pomocą obrazowania tkanek w całości

DOI:

10.3791/68789

⸱

September 12th, 2025

 ,  ,  , 
1Laboratory of Host-Microbe Interactions and Cell Dynamics, Department of Medical Biotechnology and Laboratory Science, College of Medicine, Chang Gung University, 2Institute of Microbiology and Immunology, National Yang Ming Chiao Tung University, 3Program in Molecular Medicine, National Yang Ming Chiao Tung University and Academia Sinica, 4Graduate Institute of Biomedical Sciences, College of Medicine, Chang Gung University, 5Center for Molecular and Clinical Immunology, Chang Gung University, 6Division of General Surgery, Department of Surgery, Chang Gung Memorial Hospital

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badanie to przedstawia metodę obrazowania 3D z wykorzystaniem tkanek jelitowych w całości oraz mikroskopii wielofotonowej do ilościowego określenia wydzielanego śluzu, umożliwiając precyzyjną analizę objętościową i wizualizację dynamiki śluzu w odpowiedzi na bodźce takie jak chlorek karbamoilocholiny.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Śluz odgrywa kluczową rolę w utrzymaniu homeostazy jelit, ułatwiając trawienie, tworząc barierę przeciw mikroorganizmom oraz regulując odpowiedzi immunologiczne w jelitach. Jego wydzielanie jest modulowane przez różne czynniki wewnętrzne i zewnętrzne, w tym infekcje drobnoustrojowe i stany zapalne. Podczas gdy tradycyjne metody analizy śluzu opierają się na względnej ilościowości, takiej jak pomiar grubości śluzu w przekrojach histologicznych, te podejścia dają ograniczony wgląd w rzeczywistą objętość i przestrzenny rozkład wydzielanego śluzu w świetle jelit. Przedstawiamy tutaj szczegółową metodologię absolutnej, trójwymiarowej ilościowej analizy śluzu z wykorzystaniem tkanek jelit z pełnym montażem oraz mikroskopii wielofotonowej. Protokół ten obejmuje przygotowanie podwiązanych pętli jelitowych, leczenie chlorkiem karbamoylcholiny jako bodźcem do aktywacji komórek pucharowych, utrwalenie tkanek oraz barwienie do obrazowania. Za pomocą mikroskopii wielofotonowej wykonujemy obrazy powierzchni luminalnej w stosach Z. Są one przetwarzane w oprogramowaniu Imaris, aby ilościowo określić objętość i przestrzenny rozkład wydzielanego śluzu. Wykazujemy, że chlorek karbamoilocholiny silnie indukuje wydzielanie śluzu zarówno w tkankach jelitowych, jak i okrężnych w ciągu 30 minut. Wydzielany śluz pojawia się sporadycznie i nieciągło w całym świetle, podkreślając znaczenie analizy objętościowej w porównaniu z tradycyjnymi podejściami dwuwymiarowymi. Protokół ten umożliwia badaczom uzyskanie absolutnych danych ilościowych oraz wizualizację rozkładu śluzu na miejscu, stanowiąc potężne narzędzie do badania dynamiki śluzu jelit w warunkach fizjologicznych i patologicznych.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Środowisko śluzowe przewodu pokarmowego ssaków jest bardzo dynamiczne, wspierając kolonizację różnorodnej społeczności mikroorganizmów. Nabłonek jelitowy składa się z różnych wyspecjalizowanych komórek, które współpracują, aby wchłaniać składniki odżywcze, utrzymywać integralność bariery oraz komunikować się z układem odpornościowym1. Wśród nich komórki pucharowe magazynują granulki śluzu i wydzielają śluz do lumenu w warunkach ustabilizowanych. Ta śluz tworzy kluczową barierę fizyczną, uniemożliwiając bezpośredni kontakt mikroorganizmów z warstwą nabłonkową, modulując stan zapalny tkanek i utrzymując homeostazę jelit. 2,3. Zaburzenia wydzielania śluzu osłabiają funkcję bariery i są związane ze stanem zapalnym oraz nowotworem 4,5,6,7.

Wydzielanie śluzu jelitowego może być wywołane przez czynniki wewnętrzne, takie jak neuroprzekaźnik acetylocholina, oraz przez składniki drobnoustrojowe pochodzące z komensali 8,9. Biorąc pod uwagę złożoność środowiska jelitowego, wiele czynników wpływających na wydzielanie śluzu z pucharów pozostaje niezbadanych. Dlatego precyzyjna metoda ilościowego określania śluzu świetlnego jest niezbędna do badania, jak różne bodźce wpływają na dynamikę wydzielania. Tradycyjne podejścia opierają się głównie na względnej ilościowości: na przykład pomiarze gęstości śluzu za pomocą cząstek fluorescencyjnych lub węgla drzewnego w systemach ex vivo jelitowego explant10,11 lub ocenie odległości między drobnoustrojami luminalnymi a nabłonkiem w przekrojach tkanki barwionej12,13. Chociaż te metody są wygodne do porównań względnych, mogą nie oddawać pełnego rozmieszczenia lub trójwymiarowej struktury wydzielanego śluzu, zwłaszcza że wydzielany śluz nie zawsze pokrywa nabłonek jednolicie.

W tym badaniu przedstawiamy metodę trójwymiarowej wizualizacji i bezwzględnej ilościowej ilościowej wykorzystości tkanek jelitowych z całokształtnymi mocowaniami. To podejście wymaga utrwalania świeżej tkanki odpowiednim utrwalaczem, aby zachować integralność strukturalną i morfologię, a następnie fluorescencyjnego barwienia i obrazowania za pomocą mikroskopu konfokalnego lub wielofotonowego. Poprzez podawanie środków testowych bezpośrednio do podwiązanych pętli jelitowych głęboko znieczulonych myszy, a następnie natychmiastowe utrwalenie, metoda zachowuje natywną architekturę śluzu i umożliwia analizę kinetyki wydzieliny. W porównaniu do tkanek przeciętych, gdzie głębokość obrazowania jest głównie ograniczona grubością tkanki, głębokość obrazowania tkanek całych (bez delipidacji) osiąga około 200-300 μm, ograniczoną przez rozpraszanie światła i nieprzezroczystość tkanek. Stosując tę technikę, wykazujemy, że chlorek karbamoilocholiny (CCh), analog acetylocholiny, którego receptory są ekspresjonowane na komórkach pucharowych14, silnie indukuje szybkie wydzielanie śluzu. Warto zauważyć, że wydzielany śluz tworzy zarówno ciągłą warstwę wzdłuż nabłonka, jak i nieciągłe struktury wewnątrz lumenu, co jest trudne do wykrycia w konwencjonalnych przekrojach tkanek. Protokół ten zapewnia solidną platformę do ilościowego określania trójwymiarowego rozkładu śluzu jelitowego oraz do porównywania potencjału wywołującego śluz różnych bodźców.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach są zatwierdzane przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Chang Gung. Placówka zwierzęca Uniwersytetu Chang Gung posiada akredytację Stowarzyszenia ds. Oceny i Akredytacji Opieki nad Zwierzętami Laboratoryjnymi (AAALAC). W tych badaniach nie zaobserwowano żadnych zagrożeń zdrowotnych zwierząt.

1. Przygotowanie bazy fiksacyjnej

  1. Wymieszaj proszek agarozowy z ddH2O do stężenia 4% (w/v) w kolbie podgrzewanej w mikrofalówce. Podgrzej w mikrofalówce przez 2-3 minuty, aż zacznie się gotować bez drobnych bąbelków.
    UWAGA: Objętość zależy od liczby próbek; około 10 mL na naczynie o średnicy 6 cm.
  2. Pozwól roztworowi agarozy ostygnąć do ~60 °C w ciągu ~3 minut. Wlej agarozę ostrożnie do misek o średnicy 6 cm, aż wysokość płynu osiągnie połowę pojemności (około 10 ml dla naczynia o średnicy 6 cm).
  3. Umieść naczynie z pokrywką w zamkniętej przestrzeni na 20-30 minut, aż agaroza całkowicie stwardnieje.

2. Przygotowanie materiału do utrwalania

  1. Przygotuj nowe przewody miedziane i przetnij je na długości 5 mm. Każdy kawałek tkanki wymaga 6-8 kawałków drutu.

3. Przygotowanie roztworu CCh

  1. Rozpuszczać krystaliczne CCh w sterylnym buforze PBS do końcowego stężenia 10 μM (200 μL dla jednej pętli jelitowej).

4. Przygotowanie środków znieczulanych do zastrzyków

  1. Aby przygotować roztwór zapasowy do znieczulenia, rozpuścić 2,2,2-tribrometanol w 2-metylo-2-butanolu.
  2. Użyj sterylnej soli fizjologicznej do rozcieńczenia roztworu zapasowego, tak aby końcowy roztwór roboczy zawierał 30 mg/mL 2,2,2-tribrometanolu oraz 3% (v/v) 2-metylo-2-butanolu.
  3. Dokładnie przeprowadź wir przez ~1 minutę, aż żaden granulat nie zostanie w roztworze (maksymalna szybkość: 8).
  4. Przechowuj roztwór wywarowy w ciemności w temperaturze 4 °C, aby uniknąć degradacji; Usuń bulion miesiąc po przygotowaniu.
  5. Przed znieczuleniem wciągnij roztwór wywarczy do sterylnego PBS i dobrze wymieszaj, aby zapewnić równomierną dyspersję, uzyskując ostateczną dawkę 250 mg/kg na mysz.
    UWAGA: 2,2,2-Tribrometanol ma neurotoksyczność, a 2-metylo-2-butanol jest lotny i ma drażniący zapach. Należy stosować odpowiedni sprzęt ochronny. Do utylizacji należy zebrać odpady w szczelnym pojemniku i stosować się do procedur utylizacji niebezpiecznych substancji chemicznych obowiązujących w instytucji.

5. Szczepienie jelit za pomocą wstrzyknięcia pętli

  1. Znieczulaj mysz w wieku 6-8 tygodni wstrzykiem do otrzewnowej 200 μL 2,2,2-tribrometanolu (250 mg/kg na mysz) i umieść mysz na termoforze, aby utrzymać temperaturę ciała. Potwierdź głębokość znieczulenia za pomocą uszczypnięcia palca.
  2. Po zdezynfekowaniu powierzchni skóry alkoholem wykonaj nacięcie w lewej dolnej części brzucha myszy nożyczkami do pracy i odsłonić cecum pod znieczuleniem.
  3. Zidentyfikuj jelita jelimowego lub okrężnicę bliższą, umieść pętlę jelitową na sterylnej gazie i użyj zacisków tętniczych, aby zabezpieczyć oba końce, tworząc zamkniętą pętlę o długości 3 cm.
  4. Płucz organ na gazie sterylnym PBS.
  5. Wstrzyknąć sterylny odczynnik PBS lub CCh w objętości nie większej niż 200 μL do podwiązanej pętli jelitowej pod znieczuleniem.
    UWAGA: Regularnie płucz odsłonięte jelito solą fizjologiczną przez cały okres leczenia, aby utrzymać wilgotność. Regularnie monitoruj głębokość znieczulenia (uszczypanie palca) oraz monitorowanie parametrów życiowych.

6. Pobieranie, utrwalanie i barwienie tkanek

  1. Po 30 minutach leczenia uśpij mysz przez zwichnięcie szyjki i pobierz pętlę jelitową.
  2. Użyj kleszczy, aby przytrzymać pętlę jelitową i delikatnie ją spłukać sterylnym PBS.
  3. Delikatnie rozciąć pętlę jelitową podłużnie i spłukać tkankę sterylnym PBS.
  4. Spłaszcz tkankę i użyj miedzianych drutów, aby zakotwiczyć ją na agarozie w misce o średnicy 6 cm.
  5. Utrwalić tkankę 10 mL roztworu paradehydu 4% na 12-24 godziny w naczyniu.
  6. Przemyj tkankę PBS co najmniej 3 razy, aby usunąć pozostałości paraformaldehydu.
  7. Zanurz tkankę w 10 mL buforu blokującego (PBS uzupełniony 0,4% Triton X-100 i 3% albuminy surowicy bydłej [BSA]) w temperaturze 4 °C przez 12-24 godziny w naczyniu.
  8. Barw tkankę aglutininą z kiełków pszennych (WGA, 1:200) i falloidyną (1:500) w buforze blokującym, potrząsając w 120 obr./min przy 4 °C przez 12-24 godziny w naczyniu.
    UWAGA: Aby zminimalizować zużycie barwnika, tkankę można zakotwiczyć na stwardniałej agarozie w naczyniu o średnicy 3 cm zanurzonej w 2 mL buforu barwnika do barwienia.
    UWAGA: Paradehyd stanowi zagrożenie wdychania. Podczas obsługi należy stosować odpowiedni sprzęt ochronny, na przykład podczas pracy w okapie wyparowym. Do utylizacji należy zebrać odpady w szczelnym pojemniku i stosować się do procedur utylizacji niebezpiecznych substancji chemicznych obowiązujących w instytucji.

7. Przechwytywanie obrazów za pomocą mikroskopii wielofotonowej

  1. Zmyj pozostałe środki do bejcowania co najmniej 3 razy PBS.
  2. Zakotwicz tkankę na agarozie za pomocą miedzianych drutów w 6-cm misce w 10 mL PBS.
  3. Pobierz 100 sekcji optycznych (o głębokości 99 μm) tkanki jelitowej i powiązanego śluzu za pomocą mikroskopu wielofotonowego wyposażonego w obiektyw o wysokiej zawartości NA do głębokiego obrazowania tkanek. Do mikroskopii wielofotonowej użyj źródła wzbudzenia ustawionego na długość fali 750 nm. Zbieraj sygnały emisyjne za pomocą filtrów pasmowych BP500-550 nm oraz BP565-610 nm. Ustaw prędkość skanowania na 8.
    UWAGA: W mikroskopii wielofotonowej maksymalna prędkość skanowania wynosi 9, a wyższe wartości oznaczają szybsze pozyskiwanie. Ustawienie prędkości zależy od pojemności mikroskopu. Korzystając z platformy obrazowania używanej do pozyskiwania stosów 3D, zalecamy prędkość skanowania 8, aby zrównoważyć czas akwizycji i jakość obrazu.

8. Analiza obrazów i ilościowa ilościowa analiza śluzu (Rysunek 1)

  1. Aby zmierzyć objętość każdej cząstki śluzu (w kanale WGA), otwórz stos obrazów w Imaris, przeciągając i upuszczając plik na stronę Areny. Kliknij ikonę Powierzchnia , aby rozpocząć proces tworzenia powierzchni. Postępuj zgodnie ze standardowymi krokami segmentacji i ilościowej ilości objętości cząstek w z-stacku. Szczegółowe parametry i kroki przetwarzania opisano na Rysunku 1.
  2. Wyklucz cząstki śluzu mniejsze niż 1 000 μm3, które są głównie komórkami pucharowymi (Rysunek 2A,B).
  3. Podsumuj objętość wydzielanego śluzu dla każdej grupy.

9. Analiza statystyczna

  1. Przeanalizuj i porównaj całkowity wolumen dla każdej grupy. Wprowadź wartość objętości śluzu w kolumnie i przeanalizuj za pomocą nieparametrycznego testu Manna-Whitneya.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W tej metodzie zmierzyliśmy objętość śluzu jelitowego na podstawie ułożonych obrazów tkanek całkowitych uzyskanych za pomocą mikroskopii wielofotonowej. Tkanki jelit zostały zabarwione fluorescencyjną falloidyną i aglutyniną zarodków pszenicy (WGA), aby zobrazować komórkę F-aktyny i śluzu, odpowiednio15,16. W tkankach jelita i jelita grubego leczone PBS, śluz WGA+ był wykrywany głównie w komórkach pucharowych na powierzchni nabłonka. Po podaniu chlorku...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiamy tutaj metodę trójwymiarowej ilościowej ilościowej wykorzystywania barwienia tkanek całokształtnych, mikroskopii wielofotonowej oraz analizy za pomocą oprogramowania Imaris. Procedura ta pozwala obserwować nieciągły rozkład śluzu w błonie jelitowej i zapewnia bezwzględny pomiar objętości śluzu.

Nieciągły rozkład śluzu po stymulacji zaobserwowano również w systemach hodowli tkanek z roślin8. W poprzednich badaniach z wykorzystaniem ex vivo explant, ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają żadnych konfliktów interesów do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy Laboratorium Rdzenia Mikroskopii w Szpitalu Pamięci Chang Gung w Linkou za pomoc techniczną. Chcielibyśmy również podziękować Imaging Core Facility Narodowego Uniwersytetu Yang Ming Chiao Tung za usługę Zeiss LSM 7 MP Multi-Photon Microscope, a szczególnie panią Pei-jun Chen i Yung-yu Lu za wsparcie techniczne. Autorzy pragną podziękować za wsparcie NSTC 110-2320-B-A49A-544-MY3 oraz 113-2628-B-182-002-MY3 (dla YHT).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
2,2,2-tribrometanolSigma-AldrichT48402
2-metylo-2-butanolSigma-Aldrich240486
6 cm miseczki  Alpha Plus16021-1
Agarose HispanagarA02599
BSABioShopALB001
chlorek karbamoylcholiny ≥ 98% (miareczkowanie), krystaliczneSIGMASI-C4382-1G
Przewód miedziany (nowy)TOP TECH WIRE & PRZEMYSŁOWY KABELIW00125Przewód miedziany bez warstwy izolacyjnej
KleszczeShinetehST-M110
Gaza, sterylnaGMTHMay-40
GraphPad Prism 8 Oprogramowanie GraphPad
Poduszka grzewczaCONFORTSY-666
IMARIS 10.0.0OXFORD INSTRUMENTS
ParaformaldehydBIOVOVASBL0415-1000
PBSGENESTARBL0180-1000
Sondy znakowania falloidynyInvitrogenA12379
NożyczkiShineteh02-1250.18
Triton X-100Merck1.08603.1000
Aglutininy i zarodków pszenicy (WGA) SprzęganeBiot29027
Zeiss 7MP z W Plan-Apochromat 20 x/1.0 DIC III do zanurzenia w wodzie (NA 1.0), Spectra-Physics Mai Tai HP ti szafirowy laser femtosekundowy (bez modułu DeepSee) z detektorami BP500 nm-550 nm i BP565 nm-610 nm oraz laserową długością fali 750 nmplatforma obrazowania używana do pozyskiwania stosów 3D z obiektywem o wysokiej zawartości NA do głębokiego obrazowania tkanek; Źródło wzbudzenia do mikroskopii wielofotonowej ustawionej na długość fali 750 nm

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Haber, A. L., et al. A single-cell survey of the small intestinal epithelium. Nature. 551 (7680), 333-339 (2017).
  2. Bergstrom, K., et al. Proximal colon-derived O-glycosylated mucus encapsulates and modulates the microbiota. Science. 370 (6515), 467-472 (2020).
  3. Johansson, M. E., et al. The inner of the two muc2 mucin-dependent mucus layers in colon is devoid of bacteria. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (39), 15064-15069 (2008).
  4. Nyström, E. E., et al. An intercrypt subpopulation of goblet cells is essential for colonic mucus barrier function. Science. 372 (6539), eabb1590(2021).
  5. Van Der Post, S., et al. Structural weakening of the colonic mucus barrier is an early event in ulcerative colitis pathogenesis. Gut. 68 (12), 2142-2151 (2019).
  6. Van Der Sluis, M., et al. Muc2-deficient mice spontaneously develop colitis, indicating that muc2 is critical for colonic protection. Gastroenterology. 131 (1), 117-129 (2006).
  7. Velcich, A., et al. Colorectal cancer in mice genetically deficient in the mucin muc2. Science. 295 (5560), 1726-1729 (2002).
  8. Birchenough, G. M., Nyström, E. E., Johansson, M. E., Hansson, G. C. A sentinel goblet cell guards the colonic crypt by triggering NLRP6-dependent Muc2 secretion. Science. 352 (6293), 1535-1542 (2016).
  9. Dolan, B., Ermund, A., Martinez-Abad, B., Johansson, M. E., Hansson, G. C. Clearance of small intestinal crypts involves goblet cell mucus secretion by intracellular granule rupture and enterocyte ion transport. Sci Signal. 15 (752), eabl5848(2022).
  10. Gustafsson, J. K., et al. An ex vivo method for studying mucus formation, properties, and thickness in human colonic biopsies and mouse small and large intestinal explants. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 302 (4), G430-G438 (2012).
  11. Sawaed, J., et al. Antibiotics damage the colonic mucus barrier in a microbiota-independent manner. Sci Adv. 10 (37), eadp4119(2024).
  12. Bergstrom, K., et al. Core 1-and 3-derived o-glycans collectively maintain the colonic mucus barrier and protect against spontaneous colitis in mice. Mucosal Immunol. 10 (1), 91-103 (2017).
  13. Cortez, V., et al. Astrovirus infects actively secreting goblet cells and alters the gut mucus barrier. Nat Commun. 11 (1), 2097(2020).
  14. Knoop, K. A., Mcdonald, K. G., Mccrate, S., Mcdole, J. R., Newberry, R. D. Microbial sensing by goblet cells controls immune surveillance of luminal antigens in the colon. Mucosal Immunol. 8 (1), 198-210 (2015).
  15. Nikitas, G., et al. Transcytosis of Listeria monocytogenes across the intestinal barrier upon specific targeting of goblet cell accessible E-cadherin. J Exp Med. 208 (11), 2263-2277 (2011).
  16. Tsai, Y. H., Disson, O., Bierne, H., Lecuit, M. Murinization of internalin extends its receptor repertoire, altering Listeria monocytogenes cell tropism and host responses. PLoS Pathog. 9 (5), e1003381(2013).
  17. Birchenough, G. M., Johansson, M. E., Gustafsson, J. K., Bergstrom, J. H., Hansson, G. C. New developments in goblet cell mucus secretion and function. Mucosal Immunol. 8 (4), 712-719 (2015).
  18. Maheras, K. J., Gow, A. Increased anesthesia time using 2,2,2-tribromoethanol-chloral hydrate with low impact on mouse psychoacoustics. J Neurosci Methods. 219 (1), 61-69 (2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Intestinal MucusThree Dimensional QuantificationWhole Mount ImagingMulti Photon MicroscopyGoblet Cell SecretionMucus VolumeCarbamoylcholine ChlorideIntestinal Loop PreparationMucus DistributionTissue Staining

Related Articles