Artykuł metodologiczny

Wytwarzanie stabilnych monodyspersyjnych mikropęcherzyków pokrytych fosfolipidami w temperaturze pokojowej przy użyciu mikroprzepływowego urządzenia skupiającego przepływ

DOI:

10.3791/68796

⸱

10 października 2025

 ,  , 
1Biomedical Engineering, Department of Cardiology, Cardiovascular Institute, Erasmus MC, 2Molecular and Nanoscale Physics Group, School of Physics and Astronomy, University of Leeds

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W artykule opisano metodę wytwarzania monodyspersyjnych mikropęcherzyków pokrytych fosfolipidami przy użyciu mikroprzepływowego urządzenia do ogniskowania przepływu w temperaturze pokojowej, w tym sposób przygotowania preparatu powłoki fosfolipidowej.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikropęcherzyki monodyspersyjne wykazały znaczny potencjał w zwiększaniu skuteczności ultradźwiękowych środków kontrastowych zarówno w obrazowaniu, jak i zastosowaniach terapeutycznych. Te mikropęcherzyki mogą być bezpośrednio wytwarzane przy użyciu mikroprzepływowej metody skupiania przepływu, co pozwala na precyzyjną kontrolę nad ich rozmiarem. Jednak zapobieganie koalescencji podczas produkcji pozostaje krytycznym wyzwaniem. Podczas gdy podwyższone temperatury produkcji (np. 55 °C) mogą hamować koalescencję, takie warunki komplikują konstrukcję urządzenia mikroprzepływowego i mogą być niekompatybilne ze środkami celującymi i koniugatami leków. Protokół ten przedstawia metodę wytwarzania monodyspersyjnych mikropęcherzyków pokrytych fosfolipidami w temperaturze pokojowej, przy utrzymaniu stabilności i monodyspersyjności mikropęcherzyków przez co najmniej 7 dni. W protokole opisano również wytwarzanie wielorazowych chipów mikroprzepływowych PDMS oraz przygotowanie preparatu powłoki fosfolipidowej zawierającej środek powierzchniowo czynny Pluronic F68. Nasze odkrycia pokazują, że mikropęcherzyki wytworzone tą metodą zachowują swój rozmiar i stabilność przez 7 dni, co potwierdza ich przyszłe zastosowanie w warunkach klinicznych, w których niezbędne są stabilne i kontrolowane ultrasonograficzne środki kontrastowe.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ultradźwiękowe środki kontrastowe (UCA) są szeroko stosowane w echografii klinicznej i zastosowaniach terapeutycznych 1,2,3. Mikropęcherzyki te, podawane dożylnie, pozostają zamknięte w układzie naczyniowym, działając jak czynniki puli krwi 4,5. Stabilizująca powłoka powleka mikropęcherzyki i zmniejsza dyfuzję gazu napędzaną ciśnieniem Laplace'a, wydłużając w ten sposób żywotność mikropęcherzykówo 3,6. Pod wpływem ultradźwięków mikropęcherzyki zaczynają oscylować i wytwarzać silne echo ze względu na ściśliwość rdzenia gazowego 7,8. Oscylacja jest najbardziej wyraźna przy częstotliwości rezonansowej mikropęcherzyka, na którą wpływa wielkość mikropęcherzyków i właściwości powłoki 9,10,11. Klinicznie zatwierdzone UCA na ogół składają się z mikropęcherzyków polidyspersyjnych o szerokim rozkładzie wielkości, zwykle w zakresie około 0,5-10 μm o średnicy 12,13,14. Ten szeroki rozkład rozmiarów prowadzi do szerokiego zakresu częstotliwości, przy których te mikropęcherzyki rezonują. Biorąc pod uwagę, że kliniczne sondy ultrasonograficzne zazwyczaj działają w wąskim paśmie częstotliwości, tylko podzbiór populacji UCA skutecznie rezonuje15. Wykazano, że mikropęcherzyki monodyspersyjne, które mają wąski rozkład wielkości (np. PDI 3~10%16,17), zwiększają diagnostykę i terapię w porównaniu z mikropęcherzykami polidyspersyjnymi. W przypadku obrazowania ultrasonograficznego ze wzmocnieniem kontrastowym intensywność wzrosła o dwa do trzech rzędów wielkości18, podczas gdy czułość nieinwazyjnego wykrywania ciśnienia za pomocą sygnałów subharmonicznych została prawie podwojona 19,20,21, a skuteczność dostarczania leków wzrosła o prawie jeden rząd wielkości 22. W związku z tym wytwarzanie mikropęcherzyków monodyspersyjnych o wąskim rozkładzie wielkości, a tym samym reakcji akustycznej, jest kluczem do maksymalizacji ich potencjału w obrazowaniu ultrasonograficznym i zastosowaniach terapeutycznych, w których kontrolowane oscylacje mikropęcherzyków mają kluczowe znaczenie.

Mikropęcherzyki monodyspersyjne można wytwarzać różnymi metodami, takimi jak dekantacja23 , filtracja mechaniczna24 i odwirowanie polidyspersyjnego środka mikropęcherzykowego25. Jednak osiągnięcie precyzyjnej kontroli wielkości i wysokiej monodyspersyjności pozostaje wyzwaniem w przypadku tych technik26. Alternatywnym i bardziej kontrolowanym podejściem jest bezpośrednia produkcja mikropęcherzyków monodyspersyjnych za pomocą mikroprzepływowego urządzenia skupiającego przepływ. W tym procesie gwint gazowy jest skupiany między dwoma wodnymi strumieniami liposomów na chipie mikroprzepływowym, co prowadzi do powtarzalnego ściskania gwintu gazowego, co pozwala na szybkie wytwarzanie mikropęcherzyków monodyspersyjnych o pożądanym rozmiarze27. Chociaż metody koncentracji przepływu są szeroko stosowane do wytwarzania kropel monodyspersyjnych28,29, ich zastosowanie w produkcji mikropęcherzyków monodyspersyjnych jest mniej powszechne ze względu na trudność w zapobieganiu koalescencji i prawidłowym utrzymaniu długoterminowej stabilności pod względem wielkości, monodyspersji i stężenia30. Koalescencja, w której wiele mikropęcherzyków łączy się w większe, wpływa na monodyspersjność. Wykazano, że podwyższone temperatury produkcji zmniejszają koalescencję31, ale komplikuje to projektowanie systemów mikroprzepływowych i może nie być odpowiednie dla preparatów zawierających środki celujące lub koniugaty leków. Dlatego korzystne byłoby wytwarzanie mikropęcherzyków monodyspersyjnych w temperaturze pokojowej. Równie ważna jest metoda przechowywania tych mikropęcherzyków monodyspersyjnych, ponieważ mikropęcherzyki pokryte fosfolipidami mają tendencję do kurczenia się, zapadania i utraty monodyspersji w miarę upływu czasu32. Zapewnienie długotrwałej stabilności przez kilka dni podczas przechowywania ma kluczowe znaczenie dla zastosowania technologii mikropęcherzyków monodyspersyjnych w zastosowaniach klinicznych.

W tym protokole opisujemy metodę wytwarzania monodyspersyjnych mikropęcherzyków pokrytych fosfolipidami przy użyciu platformy mikroprzepływowej skupiającej przepływ w temperaturze pokojowej. Metoda ta jest kompatybilna z natężeniami przepływu lipidów w zakresie 13-42 μl/min i jest przeznaczona do stosowania w temperaturze pokojowej, dzięki czemu jest odpowiednia dla laboratoriów, w których nie ma kontroli temperatury w systemie mikroprzepływowym. Protokół wykorzystuje preparat fosfolipidowy składający się z 1,2-distearoilo-sn-glycero-3-fosfocholiny (DSPC), 1,2-dipalmitoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloamino-N-[glikolu karbonylowo-metoksypolietylenowego] (DPPE-PEG5000) oraz Pluronic F68, który zapewnia stabilność i odtwarzalność. Protokół zawiera instrukcje krok po kroku dotyczące wytwarzania chipów mikroprzepływowych wielokrotnego użytku PDMS, przygotowania roztworów powłok fosfolipidowych oraz włączenia środka powierzchniowo czynnego Pluronic F68 w celu zapobiegania koalescencji mikropęcherzyków podczas produkcji w temperaturze pokojowej. Szczegółowo opisano w nim również procedury czyszczenia układu mikroprzepływowego, aby zapobiec zatykaniu się dyszy, regulacji ciśnienia gazu i natężenia przepływu cieczy w celu kontrolowania wielkości mikropęcherzyków oraz zbierania i przechowywania wytworzonych mikropęcherzyków w celu zapewnienia długoterminowej stabilności. Metoda ta oferuje praktyczne podejście do generowania stabilnych mikropęcherzyków monodyspersyjnych z precyzyjną kontrolą wielkości w temperaturze pokojowej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Tworzenie filmów lipidowych

UWAGA: Mieszanina lipidów do produkcji mikropęcherzyków monodyspersyjnych składa się z mieszaniny binarnej DSPC i DPPE-PEG5000 w stosunku molowym 90:10. DSPC został wybrany jako główny lipid, ponieważ wykazano, że zapewnia lepszą stabilność przed rozpuszczaniem gazów zarówno w mikropęcherzykach polidyspersyjnych33,34, jak i monodyspersyjnych31. Przypuszcza się, że ta zwiększona stabilność wynika ze stosunkowo wysokiej temperatury przemiany fazowej żelu w ciecz krystaliczną wynoszącej 55 °C35, która jest wyższa niż w przypadku innych powszechnie stosowanych lipidów, takich jak DPPC (~41 °C)35, co prowadzi do bardziej sztywnej i nieprzepuszczalnej powłoki lipidowej w temperaturze pokojowej36. W tym miejscu przedstawiono przykład przygotowania 3 ml roztworu do powlekania fosfolipidowego. Aby osiągnąć końcowe stężenie fosfolipidów 20 mg/ml, które jest stężeniem typowym dla wytwarzania mikropęcherzyków monodyspersyjnych16,17, potrzeba 60 mg fosfolipidów. Pożądana ilość każdego składnika fosfolipidowego jest podana w Tabeli 1.

  1. Wyjąć proszek fosfolipidowy z zamrażarki o temperaturze -20 °C i pozostawić do rozmrożenia w temperaturze pokojowej na 1 godzinę.
  2. Zważyć potrzebny proszek lipidowy w oddzielnych kolbach miarowych o pojemności 2 ml.
  3. Przygotować 100 ml mieszaniny chloroformu/metanolu w proporcji 90:10 v/v w dygestorium, odmierzając 90 ml chloroformu za pomocą szklanego cylindra miarowego o pojemności 100 ml, a następnie przenosząc go do szklanego cylindra Erlenmeyera o pojemności 250 ml. Następnie odmierzyć 10 ml metanolu za pomocą szklanego cylindra miarowego o pojemności 100 ml i wlać go do szklanego Erlenmeyera o pojemności 250 ml, który zawiera już chloroform. Zamknąć szklankę Erlenmeyera szklanym korkiem i wymieszać oba rozpuszczalniki, delikatnie obracając Erlenmeyera, aż roztwór stanie się klarowny.
    UWAGA: Chloroform i metanol są toksycznymi chemikaliami. Chloroform jest potencjalnym czynnikiem rakotwórczym i może powodować podrażnienie dróg oddechowych, skóry i oczu. Metanol jest wysoce łatwopalny, toksyczny w przypadku wdychania, spożycia lub wchłonięcia przez skórę i może powodować ślepotę w przypadku spożycia. Zawsze pracuj z mieszaninami chloroformu/metanolu w dobrze wentylowanym dygestorium, aby uniknąć wdychania oparów. Nosić odpowiednie środki ochrony osobistej, w tym rękawice, okulary ochronne i fartuch laboratoryjny. Upewnij się, że podczas obchodzenia się z metanolem nie ma otwartego ognia ani źródeł zapłonu. Odpady rozpuszczalnikowe należy utylizować zgodnie z protokołami dotyczącymi odpadów niebezpiecznych instytucji.
  4. Aby całkowicie rozpuścić proszki lipidowe zważone w kroku 1.2, dodać ml mieszaniny chloroformu/metanolu do każdej szklanej kolby miarowej o pojemności 2 ml i szybko zamknąć szklaną pokrywkę, aby zapobiec parowaniu.
    UWAGA: Upewnij się, że proszek lipidowy jest całkowicie rozpuszczony. W razie potrzeby delikatnie zakręcić kolbą, aby ułatwić rozpuszczenie.
  5. Wymieszać rozpuszczone roztwory lipidów ze szklaną fiolką o pojemności 30 ml, wlewając kolejno każdy roztwór.
  6. Odparować rozpuszczalnik pod stałym przepływem argonu, obracając fiolkę, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie filmu lipidowego na powierzchni szkła.
    UWAGA: Końcowe ślady rozpuszczalnika mogą być trudne do odparowania przy użyciu samego argonu. Pozostawić fiolkę w dygestorium na 2 godziny, aby umożliwić dalsze wyschnięcie. Jeżeli argon gazowy jest niedostępny, do odparowania rozpuszczalnika chloroform/metanol można użyć gazowego azotu37 lub próżniowej wyparki obrotowej pracującej w temperaturze 6 °C 31,38 (tj. powyżej temperatury przemiany fazowej DSPC wynoszącej 55 °C35).
  7. Po odparowaniu rozpuszczalnika mieszaninę lipidów należy poddać działaniu próżni w celu usunięcia wszelkich pozostałych pozostałości rozpuszczalnika organicznego. Uszczelnij szklaną fiolkę warstwą parafilmu i przebij kilka otworów igłą, aby umożliwić przepływ powietrza podczas podciśnienia.
    UWAGA: Celem stosowania parafilmu jest zapobieganie dyspersji lipidów ze szklanej fiolki podczas procesu liofilizacji.
  8. Umieścić fiolki w liofilizatorze pod próżnią na noc, aby usunąć wszelkie pozostałości rozpuszczalnika organicznego.
  9. Przejdź do następnego kroku lub przechowuj film lipidowy w temperaturze -20 °C do czasu, gdy będzie potrzebny.
    UWAGA: W tej sekcji ani w żadnym innym miejscu protokołu nie stosuje się etapu wirowania.

2. Wytwarzanie chipów mikroprzepływowych skupiających przepływ

UWAGA: Mikropęcherzyki monodyspersyjne są wytwarzane przy użyciu chipa mikroprzepływowego skupiającego przepływ, jak pokazano na rysunku 1A. Schemat geometrii kanału mikroprzepływowego, w tym wymiary dyszy i wylotu, znajduje się na rysunku uzupełniającym S1. Szczegółowy protokół produkcyjny dla fotolitografii opartej na SU-8 używanej do przygotowania tych form został opisany wcześniej37 i można go znaleźć jako informacje uzupełniające do tego protokołu. Proces wytwarzania chipa PDMS jest opisany w poniższych krokach.

  1. Wymieszaj bazę PDMS (23. g) i utwardzacz (2,3 g) w stosunku wagowym 10:1, aby uzyskać łącznie 25,5 g PDMS.
  2. Umieść formę wzorcową na szalce Petriego i zalej ją mieszaniną PDMS.
  3. Odgazuj mieszaninę w próżni (2 ~ 7 mbar) przez 40 minut, aby usunąć uwięzione pęcherzyki powietrza.
    UWAGA: W przypadku większych objętości może być wymagany dłuższy czas odgazowania, aby zapewnić całkowite usunięcie pęcherzyków.
  4. Umieść formę na płycie grzejnej o temperaturze 75 °C na 1 godzinę.
    UWAGA: W przypadku większych objętości może być wymagany dłuższy czas utwardzania.
  5. Pozwól PDMS ostygnąć do temperatury pokojowej. Za pomocą skalpela ostrożnie przetnij utwardzony PDMS i oderwij go, aby uwolnić wiór.
  6. Przytnij chip PDMS do żądanego rozmiaru i przebij otwory wlotowe/wylotowe za pomocą dziurkacza o średnicy 1 mm.
  7. Wyczyść chip PDMS taśmą samoprzylepną, aby usunąć cząsteczki kurzu.
  8. Wyczyść zarówno chip PDMS, jak i szkiełko izopropanolem, a następnie wodą dejonizowaną.
  9. Przymocuj PDMS do szkiełka podstawowego, poddając je działaniu oczyszczarki plazmowej przez 1 minutę przy mocy 60% (60 W).
  10. Umieść klejony wiór na płycie grzejnej o temperaturze 95 °C na 3 minuty, aby wzmocnić wiązanie.
  11. Poczekaj, aż chip PDMS ostygnie do temperatury pokojowej. W pełni wyprodukowany chip pokazano na rysunku 1C, a mikroskopijny obraz dyszy w jasnym polu pokazano na rysunku 1D.
  12. Umieść połączony chip w czyszczalni plazmowej na 5 minut przy mocy 80% (80 W), aby przywrócić hydrofilowość powierzchni kanału mikroprzepływowego.
  13. Natychmiast napełnij chip wodą Milli-Q, aby zachować hydrofilowość.
  14. Przechowuj frytki w temperaturze pokojowej w wodzie Milli-Q do czasu użycia.

3. Przygotowanie roztworu powłoki fosfolipidowej

  1. Usuń przygotowany film lipidowy z zamrażarki w temperaturze -20 °C i rozmrażaj w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
  2. Dodać 3 ml wstępnie podgrzanej (55 °C) soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) do filmu lipidowego (60 mg), aby osiągnąć końcowe stężenie lipidów 20 mg/ml. Umieścić fiolki w łaźni wodnej o temperaturze 55 °C na 40 minut, wirując co 15 minut ze średnią prędkością (poziom 3 z 5 na mieszaczu wirowym).
    UWAGA: Ten etap służy do wstępnego rozpuszczenia i równomiernego rozproszenia składników lipidowych w PBS przed sonikacją w kroku 3.5. Temperatura ta jest temperaturą przemiany fazowej DSPC39, sprzyjającą częściowej solubilizacji i zmniejszającej agregację lipidów. Chociaż sonikacja w kroku 3.6 jest wymagana do osiągnięcia pełnej przejrzystości optycznej, wstępna inkubacja termiczna ułatwia bardziej wydajną i powtarzalną sonikację poprzez zminimalizowanie tworzenia się dużych agregatów lipidowych i zwiększenie jednorodności dyspersji.
  3. Dodać 0,43 ml roztworu Pluronic F68 do mieszaniny lipidów, aby osiągnąć stężenie molowe 10%, a mianowicie DSPC: DPPE-PEG5000: Pluronic F68 = 81: 9: 10 mol%. Następnie próbka powinna wizualnie przypominać rysunek 2A, który jest mętnym roztworem.
    UWAGA: Pluronic F68 to środek powierzchniowo czynny stosowany w celu zapobiegania koalescencji podczas produkcji mikropęcherzyków monodyspersyjnych16,40. W przypadku braku Pluronic F68 nie można tworzyć mikropęcherzyków monodyspersyjnych przy użyciu urządzenia mikroprzepływowegoHorizon 37i preparatu lipidowego opisanego w niniejszym protokole16. W preparacie lipidowym nie zastosowano glikolu propylenowego, ponieważ zgłoszono, że związek ten pogarsza zarówno monodyspersyjność, jak i stabilność powstałej monodyspersyjnej zawiesiny mikropęcherzyków38.
  4. W celu przygotowania znakowanych fluorescencyjnie mikropęcherzyków monodyspersyjnych, na tym etapie należy wprowadzić do mieszaniny barwnik lipidowy, taki jak lipofilowy barwnik karbocyjaninowy.
  5. Sonikować mieszaninę lipidów w łaźni wodnej o mocy 100% przez 20 minut, utrzymując temperaturę wody na poziomie 55 °C. Po 20 minutach roztwór lipidowy powinien przypominać rysunek 2B , który jest mniej mętny niż w kroku 3.4. Kontynuuj sonikację w 10-minutowych odstępach, aż roztwór będzie klarowny, jak pokazano na rysunku 2C.
    UWAGA: W przypadku roztworu na rysunku 2C potrzeba było 30 minut sonikacji, aby uzyskać klarowny roztwór. Charakterystykę roztworu lipidowego można przeprowadzić, mierząc wielkość liposomu za pomocą, na przykład, dynamicznego rozpraszacza światła.
  6. Pozwól roztworowi lipidów ostygnąć do temperatury pokojowej przed dalszym przetwarzaniem.

4. Przygotowanie fiolki do pobierania mikropęcherzyków

UWAGA: Aby zapewnić długotrwałe przechowywanie mikropęcherzyków monodyspersji, jako fiolka do pobierania potrzebna jest gazoszczelna fiolka medyczna.

  1. Szczelnie zamknąć szklaną fiolkę medyczną o pojemności 5 ml gumowym korkiem i napełnić fiolkę gazem C4F10 . Następnie zacisnąć aluminiową nakrętkę wokół fiolki, aby zapewnić szczelność gazową. Fiolka do pobierania próbek jest teraz gotowa do użycia.

5. Przygotowanie platformy mikroprzepływowej

UWAGA: Jak pokazano na rysunku 3A, system składa się z platformy mikroprzepływowejHorizon 37 (zwanej dalej "platformą mikroprzepływową"), komputera sterującego, szybkiej kamery do monitorowania procesu produkcyjnego, zewnętrznego źródła światła z diodą elektroluminescencyjną (LED) do oświetlania podczas obrazowania z dużą prędkością oraz generatora przebiegów funkcyjnych do wyzwalania obrazowania z dużą prędkością w określonych odstępach czasu podczas produkcji. Przed rozpoczęciem produkcji mikropęcherzyków urządzenie należy wyczyścić, aby zmniejszyć prawdopodobieństwo zatkania dyszy. Procedura czyszczenia obejmuje zarówno rurkę, jak i chip mikroprzepływowy.

  1. Procedura czyszczenia przewodów
    1. Włącz wyłącznik zasilania platformy mikroprzepływowej, który znajduje się po prawej stronie (Rysunek 3A).
      UWAGA: "Wyłącznik zasilania" odnosi się do głównej jednostki sterującej zasilaniem platformy Horizon, która aktywuje wewnętrzny mikrokontroler systemu, pompy i czujniki.
    2. Umieść szklaną fiolkę o pojemności 4 ml wypełnioną 70% etanolem po lewej stronie komory pompy P platformy mikroprzepływowej (Rysunek 3). Rozpocznij przepływ cieczy od 100 μl/min, aby rurka wlotowa cieczy została przepłukana 70% etanolem z fiolki. Zatrzymaj spłukiwanie, zatrzymując przepływ cieczy po 5 minutach.
      UWAGA: Pompa P odnosi się do sterowanej ciśnieniem jednostki dostarczania gazu zintegrowanej z układem mikroprzepływowym. Ten krok ma na celu wyłącznie wyczyszczenie przewodów; Na tym etapie rurki nie należy podłączać do chipa mikroprzepływowego. Proces ten usuwa rozpuszczalny w etanolu pył i zanieczyszczenia z układu fluidalnego.
    3. Zastąp fiolkę wypełnioną etanolem fiolką wypełnioną wodą Milli-Q.
    4. Przepłucz rurkę wodą Milli-Q o stężeniu 100 μl/min przez 5 minut, aby usunąć resztki etanolu z systemu.
  2. Procedura czyszczenia wiórów
    1. Włącz wewnętrzny włącznik światła LED platformy mikroprzepływowej.
    2. Włóż chip PDMS do uchwytu.
    3. Umieść kolektor nad chipem i zabezpiecz go za pomocą regulowanego koła.
    4. Przymocuj rurki gazowe, cieczowe i wylotowe do chipa PDMS za pomocą pęsety. Konfiguracja połączenia jest pokazana na rysunku 3B. Upewnij się, że rurka wylotowa prowadzi do fiolki w celu zebrania roztworu odpadowego z procesu czyszczenia.
    5. Dostosuj platformę, aby ustawić dyszę chipa w polu view obiektywu.
    6. Czyść chip wodą Milli-Q przez 5 minut przy użyciu ciśnienia gazu 1000 mbar i natężenia przepływu cieczy 100 μl/min. Najpierw uruchom przepływ gazu, a następnie przepływ cieczy.
      UWAGA: Ten krok ma na celu oczyszczenie chipa mikroprzepływowego przed dyszą.
    7. Zatrzymaj przepływ cieczy, a następnie przepływ gazu.
    8. Podłącz ponownie rurkę gazową i wylotową, jak pokazano na (Rysunek 3C).
    9. Powtórz procedurę mycia wodą Milli-Q przez kolejne 5 minut, używając ciśnienia gazu 1000 mbar i natężenia przepływu cieczy 50 μl/min. Najpierw uruchom przepływ gazu, a następnie przepływ cieczy.
      UWAGA: Ta konfiguracja czyści chip mikroprzepływowy za dyszą.
    10. Zatrzymaj przepływ cieczy, a następnie przepływ gazu. Chip PDMS jest teraz gotowy do produkcji mikropęcherzyków.

6. Konfiguracja szybkiego obrazowania

UWAGA: Aby monitorować i kontrolować produkcję mikropęcherzyków monodyspersyjnych, zaleca się zintegrowanie szybkiej kamery z platformą mikroprzepływową, ponieważ mikropęcherzyki będą wytwarzane z szybkością produkcji wyższą niż 105 mikropęcherzyków/s. Szybka kamera umożliwia pomiar rozmiaru mikropęcherzyków na chipie i szybkości produkcji, a także monitorowanie koalescencji mikropęcherzyków na chipie.

  1. Zamontuj źródło światła LED nad platformą montażową (Rysunek 3A), aby oświetlić chip mikroprzepływowy podczas obrazowania z dużą prędkością.
  2. Podłącz szybką kamerę do bocznego portu obrazowania platformy mikroprzepływowej.
  3. Wykorzystaj zewnętrzny generator przebiegów funkcyjnych, aby wyzwalać szybkie nagrania w odstępach 10 s przez cały czas produkcji mikropęcherzyków. Podłącz wyjście wyzwalacza TTL generatora przebiegów do zewnętrznego wejścia wyzwalającego szybkiej kamery za pomocą standardowego kabla BNC, aby zapewnić zsynchronizowaną akwizycję. Monitorowanie to jest potrzebne do oceny kształtu gwintu gazowego i stabilności wielkości mikropęcherzyków podczas produkcji.
    UWAGA: Ciągłe monitorowanie jest ważne, ponieważ podczas produkcji może dojść do zatkania. Ponadto szybkie sekwencje obrazów są wykorzystywane do wyodrębniania czasowo-rozdzielczych rozkładów wielkości mikropęcherzyków na chipie. Ten 10-sekundowy interwał można dostosować w zależności od wymagań użytkownika".

7. Wytwarzanie i charakterystyka mikropęcherzyków monodyspersyjnych

  1. Przed rozpoczęciem produkcji należy ustawić fiolkę do pobierania w sposób pokazany na rysunku 4A. Przekłuć jedną igłę przez gumowy korek, aby służyła jako igła do zbierania, a drugą igłę przez korek jako igłę wentylacyjną, przy czym końcówka igły powinna znajdować się blisko dna fiolki. Podczas produkcji należy trzymać fiolkę do pobierania odwróconą za pomocą zacisku.
    UWAGA: Igła wentylacyjna zapewnia stałe ciśnienie wewnątrz fiolki podczas pobierania. Ponieważ C4F10 jest cięższy od powietrza, nie wydostaje się spontanicznie z fiolki.
  2. Załadować przygotowany roztwór fosfolipidów do pompy P platformy mikroprzepływowej.
  3. Przesuń część dyszy chipa w pole view obiektywu.
    UWAGA: Platforma mikroprzepływowa zawiera wewnętrzny moduł optyczny z regulowanym zoomem i ostrością oraz zewnętrzny łącznik z mocowaniem F do mocowania szybkiej kamery.
  4. Aby rozpocząć produkcję mikropęcherzyków, należy ustawić ciśnienie gazu na 800 mbar, a natężenie przepływu cieczy na 40 μl/min.
    UWAGA: Platforma mikroprzepływowa integruje dwa kanały cieczowe o kontrolowanym przepływie, 1-5 μl/min po lewej stronie i 1-100 μl/min po prawej stronie, oraz jeden kanał gazowy sterowany ciśnieniem. W tym protokole zastosowano kanał ciekły 1-100 μl/min i kanał gazowy sterowany ciśnieniem.
  5. Gdy ciecz dotrze do dyszy, gwint gazu odcina się i uwalnia monodyspersyjne mikropęcherzyki przez wylot (rysunek 4A).
  6. Ustaw szybkie nagrywanie na liczbę klatek na sekundę ≥ 200 000 kl./s i użyj szybkich nagrań do pomiaru rozmiaru wytworzonych mikropęcherzyków za pomocą funkcji imfindcircles w MATLAB.
  7. Dostosuj ciśnienie gazu i natężenie przepływu cieczy, aby kontrolować rozmiar mikropęcherzyków.
    UWAGA: Po dostosowaniu natężenia przepływu i/lub ciśnienia gazu użyj skryptu MATLAB, aby wykreślić rozkład wielkości na chipie z szybkiego nagrania. Dopasowując rozkład wielkości do rozkładu Gaussa, można wyprowadzić średnią μ i σ odchylenia standardowego. μ reprezentuje rozmiar na chipie wytworzonych mikropęcherzyków monodyspersji. Koalescencja mikropęcherzyków może wystąpić na początkowym etapie produkcji z powodu resztkowej wody Milli-Q w rurce, która rozcieńcza stężenie lipidów. Ten problem zwykle ustępuje, gdy nierozcieńczony roztwór lipidowy dotrze do dyszy. Tabela 2 podsumowuje wynikowe średnice mikropęcherzyków dla kilku zastosowanych natężeń przepływu przy stałym ciśnieniu gazu 800 mbar; Różne kombinacje ciśnienia gazu i natężenia przepływu cieczy mogą wytwarzać podobne rozmiary mikropęcherzyków, chociaż różne kombinacje parametrów również wpływają na szybkość produkcji. Wiadomo, że przy stałym natężeniu przepływu gazu szybkość produkcji jest dodatnio skorelowana z natężeniem przepływu cieczy41. Szybkość produkcji mikropęcherzyków w tym protokole jest rzędu ~105 mikropęcherzyków na sekundę, w oparciu o analizę klatka po klatce szybkich zapisów, co jest zgodne z wcześniej podawanymi wartościami dla podobnych geometrii skupiających przepływ37.
  8. Po osiągnięciu pożądanego rozmiaru mikropęcherzyków należy zebrać wytworzone mikropęcherzyki, podłączając rurkę wylotową do fiolki zbiorczej.
  9. Podczas odbioru ustaw szybkie nagrywanie tak, aby wyzwalało się co 10 sekund, aby monitorować proces produkcji.
    UWAGA: Odstęp między nagraniami można dostosować w zależności od konkretnych wymagań.
  10. Po zebraniu wystarczającej ilości zawiesiny mikropęcherzyków należy wyjąć z fiolki zbiorczej zarówno igłę wentylacyjną, jak i igłę do zbierania.
  11. Zatrzymaj przepływ cieczy, a następnie przepływ gazu.
  12. Zebrane mikropęcherzyki należy przechowywać w pozycji pionowej w temperaturze pokojowej, upewniając się, że fiolka jest w minimalnym stopniu poruszona mechanicznie.
    UWAGA: Roztwór mikropęcherzyków będzie miał trzy warstwy, jak pokazano na rysunku 5A: warstwę piany, monodyspersyjną warstwę mikropęcherzyków i subnatant. Najlepiej pozostawić warstwę pianki w fiolce, ponieważ wcześniejsze badania wykazały, że pęcherzyki związane z pianą mogą stopniowo kurczyć się do wielkości monodyspersji 16,38. Mikropęcherzyki wytworzone przy użyciu tego protokołu nie zostały poddane regulacyjnej ocenie bezpieczeństwa. Jednak lipidy składowe (DSPC, DPPE-PEG5000) i środki powierzchniowo czynne (Pluronic F68) są powszechnie stosowane w zatwierdzonych przez FDA preparatach do wstrzykiwań i są uważane za biokompatybilne42,43. Konieczna jest dalsza ocena przedkliniczna w celu ustalenia bezpieczeństwa stosowania medycznego.
  13. Po 2 godzinach od produkcji (tj. 2 godziny po wyprodukowaniu mikropęcherzyków monodyspersyjnych) należy scharakteryzować ostateczną wielkość i stężenie mikropęcherzyków za pomocą maszyny do charakteryzacji cząstek.
    UWAGA: Mikropęcherzyki monodyspersyjne wytwarzane metodą ogniskowania przepływu wymagają około 90 minut, aby ustabilizować się do ostatecznego rozmiaru44. Dlatego zaleca się odczekanie co najmniej 2 godzin stabilizacji przed użyciem mikropęcherzyków.
  14. Podłączyć igłę 19 G do strzykawki o pojemności 19 ml, zwanej dalej "strzykawką ekstrakcyjną".
  15. Wprowadzić oddzielną igłę 19 G do fiolki z mikropęcherzykami jako igłę wentylacyjną. Upewnij się, że końcówka igły pozostaje w pobliżu górnej części fiolki, aby umożliwić dopływ powietrza i utrzymać ciśnienie wewnętrzne podczas ekstrakcji mikropęcherzyków.
  16. Delikatnie zamieszać fiolkę w celu homogenizacji zawiesiny. Zawiesina zostanie podzielona na trzy warstwy: górną warstwę pianki, środkową warstwę zawierającą monodyspersyjne mikropęcherzyki i dolną warstwę wodną.
  17. Szybko włożyć strzykawkę ekstrakcyjną i ostrożnie umieścić końcówkę igły w środku warstwy mikropęcherzyków monodyspersji, omijając pianę i dolną warstwę wodnego subnatantu. Pobrać żądaną objętość zawiesiny mikropęcherzyków i wyjąć strzykawkę ekstrakcyjną z fiolki. Po zakończeniu ekstrakcji mikropęcherzyków wyjmij igłę wentylacyjną.

8. Procedura czyszczenia i wyłączania

UWAGA: Po wyprodukowaniu mikropęcherzyków platforma mikroprzepływowa i chip muszą być dokładnie oczyszczone, aby zapewnić prawidłowe działanie i umożliwić ponowne użycie chipa. Poniższe kroki opisują proces czyszczenia.

  1. W przypadku chipa wykonaj następujące czynności:
    1. Zastąp fiolkę z lipidami fiolką z wodą Milli-Q.
    2. Przepłukiwać chip mikroprzepływowy za pomocą ciśnienia gazu 800 mbar i natężenia przepływu cieczy 40 μl/min przez 5 minut.
    3. Najpierw zatrzymaj przepływ cieczy, a następnie zatrzymaj przepływ gazu.
    4. Odłącz tylko rurkę doprowadzającą gaz od chipa mikroprzepływowego.
    5. Napełnij chip mikroprzepływowy wodą Milli-Q, aby utrzymać hydrofilowość powierzchni wewnętrznych.
    6. Zatrzymaj przepływ cieczy i odłącz wszystkie pozostałe rurki od chipa.
    7. Przechowuj chip w wodzie Milli-Q, aż będzie potrzebny do wykorzystania w przyszłości.
  2. W przypadku układu mikroprzepływowego należy postępować w następujący sposób:
    1. Zastąp fiolkę z wodą Milli-Q na fiolkę z 70% etanolem w platformie mikroprzepływowej.
    2. Przepłukać rurkę doprowadzającą ciecz 70% etanolem przy natężeniu przepływu 100 μl/min przez 5 minut, aby usunąć wszelkie pozostałości lipidów.
    3. Wymień fiolkę etanolu na fiolkę z wodą Milli-Q w pompie P-Pump1.
    4. Przepłucz rurkę wodą Milli-Q o stężeniu 100 μl/min przez 5 minut, aby usunąć resztki etanolu z systemu. System jest teraz czysty.
    5. Wyłącz platformę mikroprzepływową i system kamer szybkoobrotowych.

9. Kroki rozwiązywania problemów

  1. Zablokowanie dyszy
    UWAGA: Biorąc pod uwagę mały rozmiar dyszy (5 μm), podczas procesu produkcyjnego mogą wystąpić blokady. Aby usunąć blokadę, wykonaj poniższe czynności.
    1. Natychmiast zatrzymaj przepływ cieczy, a następnie przepływ gazu.
    2. Podłącz ponownie rurkę zgodnie z konfiguracją pokazaną na rysunku 3B.
    3. Zastąp fiolkę wypełnioną fosfolipidami fiolką wypełnioną wodą Milli-Q w P-Pump1.
    4. Zastosuj ciśnienie gazu 1000 mbar i ustaw natężenie przepływu cieczy na 100 μl/min na 5 minut, aby przepłukać dyszę.
      UWAGA: W większości przypadków zatory są usuwane po 5 minutach płukania. Jeśli jednak blokada będzie się utrzymywać, może być konieczna wymiana chipa PDMS na nowy.
    5. Po usunięciu blokady ponownie podłącz rurkę, jak pokazano na rysunku 3C.
    6. Ponownie przepłukać wiór wodą Milli-Q przez 5 minut, używając ciśnienia gazu 1000 mbar i natężenia przepływu cieczy 50 μl/min, aby zapewnić całkowite opróżnienie.
    7. Zastąp fiolkę wypełnioną wodą Milli-Q fiolką wypełnioną fosfolipidami w pompie P-Pump1 i wznowij produkcję mikropęcherzyków.
      UWAGA: Jeśli podczas produkcji utrzymują się blokady, może to oznaczać niewystarczające czyszczenie rurki lub chipa mikroprzepływowego. W takim przypadku odłącz rurkę od chipa i postępuj zgodnie z procedurą czyszczenia opisaną w kroku 5. Jeśli po dokładnym wyczyszczeniu całego układu nadal występują zatory mogą sugerować awarię filtra wewnętrznego w platformie mikroprzepływowej. Wymiana filtra na nowy może rozwiązać problem.
  2. W razie potrzeby użyj ponownie chipa mikroprzepływowego.
    UWAGA: Jeśli chip nie jest prawidłowo przechowywany, może stracić hydrofilowość. W takim przypadku zaciskanie gwintu gazowego może przypominać wzór pokazany na rysunku 5E. W takich przypadkach zaleca się przejście na nowy chip, który jest hydrofilowy, aby zapewnić stałą i niezawodną produkcję mikropęcherzyków.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W niniejszym protokole przedstawiamy metodę wytwarzania stabilnych, monodyspersyjnych mikropęcherzyków w temperaturze pokojowej za pomocą chipa mikroprzepływowego skupiającego przepływ. Chip PDMS jest wytwarzany przez odlewanie z formy wzorcowej, jak pokazano na rysunku 1. Aby połączyć chip PDMS ze szkiełkiem podstawowym, stosuje się obróbkę plazmową. Obróbka plazmowa ma kluczowe znaczenie, ponieważ zmienia powierzchnię PDMS z hydrofobowej na hydrofilową. Ta hydrofilowość jest niezbędna do u...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten szczegółowo opisuje, jak wytwarzać i przechowywać stabilne mikropęcherzyki monodyspersyjne w temperaturze pokojowej za pomocą mikroprzepływowego układu skupiającego przepływ. Mikropęcherzyk monodyspersyjny może być stosowany do obrazowania ultrasonograficznego ze wzmocnieniem kontrastowym18, nieinwazyjnego wykrywania ciśnienia19 oraz dostarczania leków za pośrednictwem mikropęcherzyków22, zarówno in vitro , jak i in vivo

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prace te zostały częściowo sfinansowane przez Europejską Radę ds. Badań Naukowych (ERBN) w ramach programu Unii Europejskiej w zakresie badań naukowych i innowacji Horyzont 2020 (umowa o grant 805308) oraz częściowo przez Wydział Nauk Stosowanych i Inżynieryjnych TTW (VIDI-project 17543), będącego częścią NWO, oba przyznane K.K. Platforma mikroprzepływowa Horizon została opracowana dzięki dofinansowaniu z grantów EPSRC (granty nr EP/I000623 i EP/K023845). Autorzy dziękują Microbubble Consortium (http://www.microbubbles.leeds.ac.uk/) z Uniwersytetu w Leeds za użyteczne dyskusje, a także Stuartowi Westonowi i Andrew Price'owi za pomoc w konceptualizacji instrumentu i produkcji części do platformy mikroprzepływowej Horizon. Główna forma do produkcji chipów PDMS została uprzejmie dostarczona przez Uniwersytet w Leeds. Autorzy dziękują Robertowi Beurskensowi z Wydziału Inżynierii Biomedycznej Wydziału Kardiologii oraz Geertowi Springelingowi z Wydziału Eksperymentalnego Oprzyrządowania Medycznego, obaj z Erasmus MC w Holandii, za pomoc techniczną podczas eksperymentów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Dziurkacz do biopsji 1 mm Kai Medyczny143831
1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetrametylolindodikarbocyjanina (DiD)Thermo Fisher NaukowyZobacz materiał D307lipofilowy barwnik karbocyjaninowy
1,2-dipalmitoilo-sn-glicero-3-fosfoetanoloamino-N-[glikol karbonylowo-metoksypolietylenowy] (DPPE-PEG5000)LipoidNr CAS 384835-61-4
1,2-distearoilo-sn-glicero-3-fosfocholina (DSPC)LipoidNr CAS 816-94-4
Szklany cylinder miarowy 100 mlBLAUBRAND
Szklane kolby miarowe o pojemności 2 mlBLAUBRAND
250 ml szklanka ErlenmeyerBLAUBRAND
Fiolka szklana 30 ml DWK Nauki PrzyrodniczeSCERC40752700D0C2
70% etanolu
75 stopni Celsjusza; C płyta grzewcza 
Taśma klejąca
Aluminiowa nasadka Sigma-aldrich27016
Gaz argonowy  Linde Gas Benelux
C4F10 gazF2 Chemikalia
ChloroformMerck KGaA67-66-3
Dostępne klinicznie  ultradźwiękowy środek kontrastowy (np. mikropęcherzyki)Bracco,
Plan-LesOuates, Szwajcaria		SonoVueRysunek 6A.
Pobieranie i wentylacja igły 19G100 Sterican4657799
Licznik redlic Multisizer 3Beckman CoulterMaszyna do charakteryzacji cząstek
Wykonany na zamówienie ultradźwiękowy środek kontrastowy (tj. mikropęcherzyki monodyspersyjne)NIEF1-10PFRysunek 6A. Wyprodukowano zgodnie z opisem: Wang, Y. i wsp. Wpływ pluronu F68 na stabilność wielkości i zachowanie akustyczne monodyspersyjnych mikropęcherzyków pokrytych fosfolipidami wytwarzanych w temperaturze pokojowej. ACS Appl. Mater. Interfejsy 2025, 17, 8976−8986. (2025).
Wykonany na zamówienie ultradźwiękowy środek kontrastowy (tj. mikropęcherzyki monodyspersyjne)NIEF2-10 PFRysunek 6A. Wyprodukowano zgodnie z opisem: Wang, Y. i wsp. Wpływ pluronu F68 na stabilność wielkości i zachowanie akustyczne monodyspersyjnych mikropęcherzyków pokrytych fosfolipidami wytwarzanych w temperaturze pokojowej. ACS Appl. Mater. Interfejsy 2025, 17, 8976−8986. (2025).
Woda Demi
Zewnętrzne światło LEDCertyfikat GSVITECGS02370
LiofilizatorMertin Christ GmbHAlfa 1– 2 LD plus
Generator przebiegów funkcyjnych Agilent33220A
Fiolka ze szkła gazoszczelnegoSigma-aldrichZ113964-288EA
Zjeżdżalnia szklanaFirma VWR631-1552
Szybka kameraFototronNova S16
Platforma mikroprzepływowa HorizonUniwersytet w Leeds, AngliaPlatforma jest dostępna komercyjnie i szczegółowo opisana w: Abou-Saleh, R. H. et al. Horizon: Microfluidic platform for the production of therapeutic microbubbles and nanobubbles. Przegląd instrumentów naukowych. 92 (7), 074105 (2021).
Matlab (Matlab)W ramach projektu MathWorksCzynnik chłodniczy R2023a
MetanolMerck KGaA67-56-1
Woda Milli-Q
Żel PDMSSYLGARDSYLGARD®   184
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS 1x) Gibco (firma Gibco)10010023
Czyścik plazmowyHenniker NaukowyZobacz materiał HPT-100
Pluroniczny F68Thermo Fisher Naukowy24040032
Gumowy korekSigmaZ166065-100EA
RuryTechnologia MasterflexMFLX06407-41PTFE, 1/32" ID x 1/16" OD; 25 stóp
Pęseta
Wir Sigma-aldrichZ654779
Sonikator do kąpieli wodnejEMAG (Przedsiębiorstwo EMAG)EMMI 30HC

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kooiman, K., et al. Ultrasound-responsive cavitation nuclei for therapy and drug delivery. Ultrasound Med Biol. 46 (6), 1296-1325 (2020).
  2. Langeveld, S. A. G., Meijlink, B., Kooiman, K. Phospholipid-coated targeted microbubbles for ultrasound molecular imaging and therapy. Curr Opin Chem Biol. 63, 171-179 (2021).
  3. Frinking, P., et al. Three decades of ultrasound contrast agents: A review of the past, present and future improvements. Ultrasound Med Biol. 46 (4), 892-908 (2020).
  4. Greis, C. Ultrasound contrast agents as markers of vascularity and microcirculation. Clin Hemorheol Microcirc. 43 (1-2), 1-9 (2009).
  5. Correas, J. M., et al. Ultrasound contrast agents. Examples of blood pool agents. Acta Radiol Suppl. 412, 101-112 (1997).
  6. Kooiman, K., et al. Acoustic behavior of microbubbles and implications for drug delivery. Adv Drug Deliv Rev. 72C, 28-48 (2014).
  7. de Jong, N., et al. Ultrasonic characterization of ultrasound contrast agents. Med Biol Eng Comput. 47 (8), 861-873 (2009).
  8. Cosgrove, D., Harvey, C. Clinical uses of microbubbles in diagnosis and treatment. Med Biol Eng Comput. 47 (8), 813-826 (2009).
  9. Langeveld, S. A. G., et al. The impact of lipid handling and phase distribution on the acoustic behavior of microbubbles. Pharmaceutics. 13 (1), 119(2021).
  10. Dicker, S., et al. Influence of shell composition on the resonance frequency of microbubble contrast agents. Ultrasound Med Biol. 39 (7), 1292-1302 (2013).
  11. Doinikov, A. A., Haac, J. F., Dayton, P. A. Resonance frequencies of lipid-shelled microbubbles in the regime of nonlinear oscillations. Ultrasonics. 49 (2), 263-268 (2009).
  12. Sennoga, C. A., et al. Evaluation of methods for sizing and counting of ultrasound contrast agents. Ultrasound Med Biol. 38 (5), 834-845 (2012).
  13. Schneider, M., et al. Br1: A new ultrasonographic contrast agent based on sulfur hexafluoride-filled microbubbles. Invest Radiol. 30 (8), 451-457 (1995).
  14. Wang, S., et al. Microbubble type and distribution dependence of focused ultrasound-induced blood-brain barrier opening. Ultrasound Med Biol. 40 (1), 130-137 (2014).
  15. Whittingham, T. A. Contrast-specific imaging techniques: Technical perspective. , Springer. Berlin, Heidelberg. (2005).
  16. Wang, Y., et al. Influence of pluronic f68 on size stability and acoustic behavior of monodisperse phospholipid-coated microbubbles produced at room temperature. ACS Appl. Mater. Interfaces. , (2025).
  17. Segers, T., de Jong, N., Versluis, M. Uniform scattering and attenuation of acoustically sorted ultrasound contrast agents: Modeling and experiments. J Acoust Soc Am. 140 (4), 2506(2016).
  18. Segers, T., et al. Monodisperse versus polydisperse ultrasound contrast agents: Non-linear response, sensitivity, and deep tissue imaging potential. Ultrasound Med Biol. 44 (7), 1482-1492 (2018).
  19. van Hoeve, W., et al. Improved sensitivity of ultrasound-based subharmonic aided pressure estimation using monodisperse microbubbles. J Ultrasound Med. 41 (7), 1781-1789 (2022).
  20. Wang, P., et al. Sensitivity improvement of subharmonic-based pressure measurement using phospholipid-coated monodisperse microbubbles. Ultrason Sonochem. 104, 106830(2024).
  21. Spiekhout, S., et al. Ambient pressure sensitivity of subharmonic vibrating single microbubbles. Ultrasound Med Biol. 51 (6), 931-940 (2025).
  22. van Elburg, B., et al. Dependence of sonoporation efficiency on microbubble size: An in vitro monodisperse microbubble study. J Control Release. 363, 747-755 (2023).
  23. Goertz, D. E., et al. Attenuation and size distribution measurements of definity and manipulated definity populations. Ultrasound Med Biol. 33 (9), 1376-1388 (2007).
  24. Emmer, M., et al. Pressure-dependent attenuation and scattering of phospholipid-coated microbubbles at low acoustic pressures. Ultrasound Med Biol. 35 (1), 102-111 (2009).
  25. Feshitan, J. A., et al. Microbubble size isolation by differential centrifugation. J Colloid Interface Sci. 329 (2), 316-324 (2009).
  26. Pulsipher, K. W., et al. Engineering theranostic microbubbles using microfluidics for ultrasound imaging and therapy: A review. Ultrasound Med Biol. 44 (12), 2441-2460 (2018).
  27. Castro-Hernández, E., et al. Microbubble generation in a co-flow device operated in a new regime. Lab Chip. 11 (12), 2023(2011).
  28. Nisisako, T., Torii, T. Microfluidic large-scale integration on a chip for mass production of monodisperse droplets and particles. Lab Chip. 8 (2), 287-293 (2008).
  29. Xu, S., et al. Generation of monodisperse particles by using microfluidics: Control over size, shape, and composition. Angew Chem Int Ed Engl. 44 (5), 724-728 (2005).
  30. Stride, E., et al. Microbubble agents: New directions. Ultrasound Med Biol. 46 (6), 1326-1343 (2020).
  31. Segers, T., et al. Improved coalescence stability of monodisperse phospholipid-coated microbubbles formed by flow-focusing at elevated temperatures. Lab Chip. 19 (1), 158-167 (2019).
  32. Dixon, A. J., et al. Enhanced intracellular delivery of a model drug using microbubbles produced by a microfluidic device. Ultrasound Med Biol. 39 (7), 1267-1276 (2013).
  33. Borden, M. A., Longo, M. L. Dissolution behavior of lipid monolayer-coated, air-filled microbubbles: Effect of lipid hydrophobic chain length. Langmuir. 18 (24), 9225-9233 (2002).
  34. Daeichin, V., et al. Microbubble composition and preparation for high-frequency contrast-enhanced ultrasound imaging: In vitro and in vivo evaluation. IEEE Trans Ultrason Ferroelectr Freq Control. 64 (3), 555-567 (2017).
  35. Chen, W., et al. Determination of the main phase transition temperature of phospholipids by nanoplasmonic sensing. Sci Rep. 8 (1), 14815(2018).
  36. Kwan, J. J., Borden, M. A. Lipid monolayer collapse and microbubble stability. Adv Colloid Interface Sci. 183-184, 82-99 (2012).
  37. Abou-Saleh, R. H., et al. Horizon: Microfluidic platform for the production of therapeutic microbubbles and nanobubbles. Rev Sci Instrum. 92 (7), 074105(2021).
  38. Segers, T., et al. Universal equations for the coalescence probability and long-term size stability of phospholipid-coated monodisperse microbubbles formed by flow focusing. Langmuir. 33 (39), 10329-10339 (2017).
  39. Kaneshina, S., et al. Barotropic phase transitions of dioleoylphosphatidylcholine and stearoyl-oleoylphosphatidylcholine bilayer membranes. Biochim Biophys Acta. 1374 (1-2), 1-8 (1998).
  40. Shih, R., et al. Flow-focusing regimes for accelerated production of monodisperse drug-loadable microbubbles toward clinical-scale applications. Lab Chip. 13 (24), 4816(2013).
  41. Cleve, S., et al. Microbubble formation by flow focusing: Role of gas and liquid properties, and channel geometry. J Fluid Mech. 972, A27(2023).
  42. Rodeheaver, G. T., et al. Pluronic f-68: A promising new skin wound cleanser. Ann Emerg Med. 9 (11), 572-576 (1980).
  43. Moloughney, G., Weisleder, J. Poloxamer 188 (p188) as a membrane resealing reagent in biomedical applications. Recent Pat Biotechnol. 6 (3), 200-211 (2012).
  44. Segers, T., et al. Stability of monodisperse phospholipid-coated microbubbles formed by flow-focusing at high production rates. Langmuir. 32 (16), 3937-3944 (2016).
  45. Izadiamoli, S., et al. A comprehensive experimental approach to understanding the effects of surface wettability on bubble formation at submerged orifices. Energy Equip Syst. 13 (2), 169-191 (2025).
  46. Dollet, B., et al. Role of the channel geometry on the bubble pinch-off in flow-focusing devices. Phys Rev Lett. 100 (3), 034504(2008).
  47. Shih, R., Lee, A. P. Post-formation shrinkage and stabilization of microfluidic bubbles in lipid solution. Langmuir. 32 (8), 1939-1946 (2016).
  48. Segers, T., et al. Foam-free monodisperse lipid-coated ultrasound contrast agent synthesis by flow-focusing through multi-gas-component microbubble stabilization. Appl Phys Lett. 116 (17), 173701(2020).
  49. Beekers, I., et al. Internalization of targeted microbubbles by endothelial cells and drug delivery by pores and tunnels. J Control Release. 347, 460-475 (2022).
  50. Beekers, I., et al. Opening of endothelial cell-cell contacts due to sonoporation. J Control Release. 322, 426-438 (2020).
  51. Zhang, W. Q., et al. Influence of molecular weight of polydimethylsiloxane precursors and crosslinking content on degree of ethanol swelling of crosslinked networks. React Funct Polym. 86, 264-268 (2015).
  52. Ren, K., et al. Materials for microfluidic chip fabrication. Acc Chem Res. 46 (11), 2396-2406 (2013).
  53. Segers, T., et al. High-precision acoustic measurements of the nonlinear dilatational elasticity of phospholipid coated monodisperse microbubbles. Soft Matter. 14 (47), 9550-9561 (2018).
  54. Jeong, H. H., et al. Liter-scale production of uniform gas bubbles via parallelization of flow-focusing generators. Lab Chip. 17 (15), 2667-2673 (2017).
  55. Jiang, C., et al. Microfluidic-assisted formation of multifunctional monodisperse microbubbles for diagnostics and therapeutics. Micro Nano Lett. 6 (6), 417(2011).
  56. Hashimoto, M., et al. Formation of bubbles and droplets in parallel, coupled flow-focusing geometries. Small. 4 (10), 1795-1805 (2008).
  57. Maskarinec, S. A., et al. Direct observation of poloxamer 188 insertion into lipid monolayers. Biophys J. 82 (3), 1453-1459 (2002).
  58. Frey, S. L., Lee, K. Y. C. Temperature dependence of poloxamer insertion into and squeeze-out from lipid monolayers. Langmuir. 23 (5), 2631-2637 (2007).
  59. Borden, M. A., et al. Lateral phase separation in lipid-coated microbubbles. Langmuir. 22 (9), 4291-4297 (2006).
  60. Borden, M. A., et al. Surface phase behavior and microstructure of lipid/peg-emulsifier monolayer-coated microbubbles. Colloids Surf B Biointerfaces. 35 (3-4), 209-223 (2004).
  61. van den Broek, M. R. P., et al. Functionalized monodisperse microbubble production: Microfluidic method for fast, controlled, and automated removal of excess coating material. Microsyst Nanoeng. 10 (1), 120(2024).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Monodyspersyjnych mikrop cherzykipow oka fosfolipidowarodki kontrastowe do ultrasonografiiprodukcja w temperaturze pokojowejstabilno mikrop cherzyk wmikrofluidyczne chipy PDMSkontrola wielko ci mikrop cherzyk wsurfaktant Pluronic F68terapeutyczne zastosowania mikrop cherzyk w
Film wkrótce dostępny

Powiązane artykuły