Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Model myszy nawrotu białaczki do indukcyjnej chemioterapii ostrej białaczki limfoblastycznej

1.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/68797

⸱

17 października 2025

 ,  ,  ,  , 
1Leukemia Biology Laboratory, Boldrini Children's Center, 2Graduate Program in Genetics and Molecular Biology, University of Campinas, 3Boldrini Children's Center, 4Department of Translational Medicine, Faculty of Medical Sciences, University of Campinas

W tym artykule

Podsumowanie

Protokół ma na celu opisanie mysiego modelu generującego nawroty ostrej białaczki limfoblastycznej, oparty na dynamice odpowiedzi na chemioterapię indukcyjną.

Streszczenie

Ostra białaczka limfoblastyczna (ALL) to nowotwor niedojrzałych komórek prekursorowych limfoidalnych i jeden z najczęstszych nowotworów dziecięcych. Chociaż wskaźniki wyleczenia w pediatryce ALL zbliżają się do 90%, nawroty i oporność na leki pozostają wyzwaniami. W tym kontekście badanie biologii nowotworów in vivo jest niezbędne, a ksenoprzeszczepy pochodzące od pacjentów (PDX) z modelami myszy są szeroko stosowane do tego celu. Jednak PDX z próbek nawrotowych – lub porównywane z diagnostycznymi – nie oceniają w pełni mechanizmów inicjacji i postępu nawrotu. Protokół ten opiera się na generowaniu nawrotów pdx B-ALL u myszy, co pozwala na zbieranie komórek białaczkowych podczas procesu nabycia oporności na leki. Zwierzęta przeszczepione komórkami B-ALL PDX są leczone kombinacją czterech leków powszechnie stosowanych w terapii ALL, reprezentujących odrębne mechanizmy działania: deksametazon, winkrystyna, L-asparaginaza i daunorubicyna. Po czterotygodniowej fazie indukcji remisji zwierzęta są monitorowane pod kątem nawrotów podczas okresu odpoczynku. Cykl leczenia i nawrotu powtarza się, aż czas nawrotu się skraca, pełniąc rolę zastępczej dla zwiększonej oporności na leki in vivo. Aby zbadać mechanizmy leżące u podstaw nawrotów i oporności, komórki białaczki są zbierane przed i po każdym cyklu leczenia w celu analizy fenotypowej i genetycznej. Aby zweryfikować model, przebadane były różne próbki ALL z dzieci, w tym zarówno osoby, które dobrze jak i słabo reagowały, oceniane na podstawie obecności blastocytów we krwi obwodowej po 7 dniach terapii kortykosteroidami oraz minimalnej choroby resztkowej (MRD) w dniach 15, 33 i 78/96. Wyniki obserwowane na myszach były zgodne z danymi pacjentów, potwierdzając dokładność modelu w naśladowaniu klinicznej odpowiedzi na chemioterapię. Takie podejście umożliwia dynamiczne badanie nawrotów i oporności na leki w B-ALL, wspierając badania mechanistyczne oraz rozwój nowych strategii terapeutycznych.

Wprowadzenie

Ostra białaczka limfoblastyczna (ALL) jest najczęściej występującym nowotworem u dzieci. Pomimo wysokich wskaźników wyleczenia osiągniętych w ostatnich dekadach, przy 5-letnim przeżyciu sięgającym 90% w krajach o wysokich dochodach1 oraz dużych wysiłków na rzecz poszukiwania nowych strategii terapeutycznych, w krajach rozwiniętych 15%-20% pacjentów nawraca chorobę, a wskaźnik przeżycia waha się między 30%-60% w zależności od tego, czy pierwszy nawrót nastąpi wcześnie (poniżej 18 miesięcy) czy później (36 miesięcy) po diagnozie2, 3. W związku z tym refraktorny i nawrót WSZYSTKICH pozostają wyzwaniami do pokonania. Pod względem diagnozy refrakcyjne ALL różni się od nawrotu słabą wrażliwością na chemioterapię, natomiast nawrót ALL charakteryzuje się nawrotem choroby po okresie remisji. Podobnie jak w przypadku innych nowotworów, ALL charakteryzuje się nieprawidłowościami genetycznymi, w tym aneuploidiami, przekształceniami chromosomów oraz różnymi mutacjami genów powiązanymi z różnymi odpowiedziami terapeutycznymi i ryzykiem nawrotu4. Ponieważ WSZYSTKIE nawroty występują częściej u pacjentów wysokiego ryzyka – którzy już przeszli chemioterapię o maksymalnym intensywnym – dalsze korekty dawek lub kombinacji leków raczej nie będą wystarczające. Zamiast tego wysiłki muszą być skierowane na identyfikację mechanizmów leżących u podstaw oporności na leki i nawrotów.

W związku z tym naukowcy próbowali zrozumieć, jak presja selekcyjna wywierana przez chemioterapię przyczynia się do powstawania komórek opornych. Większość istniejącej literatury przypisuje nawrót propagacji opornego złośliwego podklona, który był obecny już w momencie diagnozy5. Jednak niedawne badanie sugeruje istnienie alternatywnych mechanizmów, takich jak modyfikacje epigenetyczne regulujące programy transkrypcji, które również mogą przyczyniać się do nawrotu6.

Znaczne wysiłki zostały poświęcone stworzeniu dokładnych modeli in vivo do badania WSZYSTKICH nawrotów. Myszy z niedoborem odporności zostały skutecznie wykorzystane do WSZYSTKICH przeszczepów, zachowując oryginalne cechy choroby 7,8, co doprowadziło do opracowania ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów (PDX). Model ten umożliwia wszczepianie i proliferację oryginalnych komórek nowotworowych/białaczkowych w kompatybilnym mikrośrodowisku. Jedną z głównych zalet jest możliwość oceny odpowiedzi WSZYSTKICH przeszczepionych komórek na chemioterapię9.

Modele PDX były również wykorzystywane do naśladowania i badania WSZYSTKICH nawrotów. Na przykład protokół opracowany przez Samuelsa i in.10 wykorzystywał myszy nieotyłych diabetyków i ciężko niedoborowych (NOD/SCID) przeszczepionych z komórkami białaczki pacjenta do badania mechanizmów oporności na schemat chemioterapii podobnej do indukcji. Autorzy opisali leczenie winkrystyną, deksametazonem, L-asparaginazą i daunorubicyną (VXLD) oraz podali przykłady liczby cykli leczenia i czasu nawrotu. Model koncentrował się jednak na analizie komórek bezpośrednio po leczeniu – tych, które przetrwały początkową terapię – prawdopodobnie reprezentujących minimalną chorobę resztkową (MRD), a nie nawrót.

Nowsze badanie oceniało, czy krótkoterminowe leczenie CAŁKOWICIE przeszczepionym NOD. Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NOD scid gamma, czyli NSG) myszy niedoborne odpornościowe mogą przewidzieć nawrót u odpowiadających pacjentów.11. Wszystkie próbki o średnim ryzyku – zarówno od pacjentów nawracających, jak i nienawracających – zostały przeszczepione myszom i leczone schematem indukcyjnym składającym się z winkrystyny, deksametazonu i L-asparaginazy (VXL). Mierzono i porównywano czas do wszczepienia oraz nawroty po leczeniu. Wyniki sugerowały, że ten model PDX może służyć jako narzędzie prognostyczne do przewidywania wyników leczenia pacjentów. To odkrycie potwierdza przydatność modeli myszy PDX w badaniu biologii WSZYSTKICH nawrotów. Na przykład komórki nawracające mogły być badane w różnych momentach, aby odkryć mechanizmy leżące u podstaw nawrotu.

W tym manuskrypcie przedstawiamy ulepszenia modelu myszy PDX do badania nawrotu B-ALL. Naszym celem jest badanie nawrotów choroby oraz cech komórek nawrotu po ich ukształtowaniu przez chemioterapię indukcyjną. Standaryzowano czterolekowy program podobny do indukcji – winkrystynę, deksametazon, L-asparaginaza i daunorubycyna – z wykorzystaniem szczepu myszy NSG. Szczep ten ma ograniczenia w przetrwaniu powtarzających się cykli chemioterapii ze względu na mutację Prkdcscid oraz zwiększoną wrażliwość na stres genotoksyczny12. Dlatego masa ciała zwierzęcia była monitorowana jako wskaźnik toksyczności leczenia. Model nawrotu B-ALL można podzielić na trzy główne etapy: (1) przeszczepienie WSZYSTKICH komórek do myszy, z celem osiągnięcia progu wszczepienia na poziomie 0,2-1% ludzkich komórek CD45⁺ we krwi obwodowej; (2) 4 tygodnie leczenia chemioterapią, po którym następuje okres odpoczynku aż do pierwszego nawrotu (R1); oraz (3) po wykryciu R1, powtarzano tygodniowe cykle leczenia typu indukcji. Kolejne nawroty (R2, R3... RN) może wystąpić, a odstęp między leczeniem a nawrotem (Δt) jest rejestrowany. Stopniowe skracanie Δt interpretuje się jako oznakę nabytej oporności na leki. W ramach bardziej dogłębnych badań nad mechanizmami nawrotu, komórki B-ALL mogą być pobierane przed i po różnych etapach protokołu. Ważne jest, aby podkreślić, że w zależności od czasu między wystąpieniem nawrotu a powrotem do zdrowia komórek, mechanizmy tego zjawiska mogą nie być zachowane. W związku z tym niezwykle ważne jest, aby komórki nawrotu były zbierane szybko po potwierdzeniu nawrotu. Zebrane komórki mogą być wykorzystywane do przyszłych analiz fenotypowych i genetycznych, w tym do oceny dynamiki cyklu komórkowego, migracji komórek, częstotliwości komórek inicjującej białaczkę, zmian chromosomowych oraz modyfikacji epigenetycznych, między innymi.

Na potrzeby tego artykułu skupimy się na opisie modelu nawrotu myszy. Szczegółowe informacje zostaną przedstawione dla trzech faz eksperymentalnych – transplantacji, leczenia do pierwszego nawrotu (R1) oraz cyklicznego leczenia do wielokrotnych nawrotów (R2, R3...). Mamy nadzieję, że ten model pozwoli naukowcom generować odporne na chemioterapię komórki B-ALL z różnych podtypów, umożliwiając głębsze badania zmian komórkowych i molekularnych związanych z nawrotem. Ostatecznie może to przyczynić się do lepszego zrozumienia mechanizmów oporności i ułatwić rozwój bardziej skutecznych i spersonalizowanych terapii.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach przeprowadzono zgodnie z przepisami i wytycznymi etycznymi Comissão de Ética no Uso de Animais z Centro Infantil Boldrini (CEUA/Boldrini 0047-2024). Próbki białaczki użyte w tym badaniu pochodzą z biobankowanych fiolek pacjentów leczonych w Centro Infantil Boldrini, którzy zezwolili na wykorzystanie swoich komórek na podstawie formularza świadomej zgody. Projekt został zatwierdzony przez Komitet Etyki Instytucjonalnej (CAAE 34601120.7.0000.5376).

1. Monitorowanie przeszczepów komórek białaczki i przeszczepu

  1. Przygotowanie próbek białaczki do przeszczepu myszy
    1. Wcześniej rozmrażaj próbki kriokonserwowane WSZYSTKICH komórek pobranych z aspiratu szpiku kostnego pacjenta. Użyj kąpieli wodnej ustawionej na 37°C. Rozmraź próbki, poruszając kriotubą w ruchu okrężnym.
    2. Przenieś rozmrożoną próbkę do probówki wirówki o pojemności 15 mL. Dodaj 14 mL 1x sterylnego PBS do próbki, aby umyć komórki i usunąć roztwór kriokonserwacyjny. Wiruj probówkę w 300 x g przez 5 minut. Usuń supernatant.
  2. Przygotowanie roztworu przeszczepowego
    1. Ponownie zawiesij rozmrożone komórki w sterylnym 1x PBS. Dla każdego zwierzęcia do przeszczepu należy użyć 5-10 x 10 x 10 żywotnych komórek w objętości 100 μL PBS. Przechowywać roztwór przeszczepu w lodzie aż do przeszczepu.
      UWAGA: Komórki były liczone metodąpółautomatyczną 13.
  3. Przeszczep myszy
    1. Wybierz 2-miesięcznego chłopca lub samiczkę NOD. MyszyCg-Prkdc scidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) do przeszczepu białaczki.
      UWAGA: Aby utrzymać jednorodny projekt eksperymentalny wolny od ingerencji ze strony płci ze zwierzętami, próbki ALL zostały przeszczepione do obu płci myszy, zapewniając, że wszystkie białaczki odpowiedzi na dobre i słabe reakcje były równie reprezentowane u obu płci. W efekcie odkryliśmy, że samice myszy przeszczepiają się wcześniej niż samce. Biorąc to pod uwagę, aby uniknąć potencjalnych zakłóceń płci myszy w przyszłych analizach (np. kinetyki przeszczepu), sugerujemy stosowanie tylko jednej płci myszy przy pracy z tą samą próbką białaczki. Nie stosowano innych parametrów, by preferencyjnie wybrać jedną płeć nad drugą.
    2. Umieść po jednej myszy na raz w bezpiecznej i zatwierdzonej pułapce, aby zapewnić prawidłowe zatrzymanie zwierzęcia. Upewnij się, że ogon zwierzęcia znajduje się poza pułapką i jest łatwo dostępny do przeszczepienia.
      UWAGA: Komórki białaczki są przeszczepiane myszom dożylnie (dożylnie). Ustalone protokoły wykorzystują boczne żyły ogona do tego celu11.
    3. Używaj światła podczerwonego, aby zapewnić prawidłowe rozszerzanie żył. Wstrzyknij 100 μL roztworu przeszczepowego za pomocą sterylnej, ostrej, jednorazowej igły do wstrzykiwania. Przetrzymuj przeszczepione myszy w konkretnym ośrodku wolnym od patogenów. Pozwól im odpocząć przez 15 dni.
      1. Aby użyć światła podczerwonego, trzymaj już unieruchomione zwierzę poza klatką i 30 cm od światła. W zależności od potencjalnej mocy światła dostosuj czas naświetlania. Przy użyciu światła o średniej mocy, okres 5 minut wystarcza, aby zapewnić rozszerzenie żyły. Pozostawienie ogona na odsłoniętym przez dłuższy czas może powodować oparzenia i stres u zwierzęcia.
      2. Do zastrzyku używaj strzykawki insulinowej z przymocowaną igłą, o objętości 1 mL i o rozmiarze igły 12,7 mm x 0,33 mm. Specyfikacja użytej igły znajduje się w Tabeli Materiałów. Utrzymuj myszy w cyklu światła/ciemności 12 godzin i 12 godzin. Dodatkowo zwierzęta użyte w tym badaniu umieścić w autoklawowej, przezroczystej bursztynowej klatce poliwęglanowej, z dodatkiem do tworzenia gniazd środowiskowych.
  4. Pobieranie krwi obwodowej
    1. Pobieraj 50 μL obwodowej próbki krwi od każdej myszy 2 tygodnie po szczepieniu i co tydzień później.
    2. Ręcznie unieruchom zwierzę lewą ręką, upewniając się, że jego głowa jest mocno utrzymana. Prawą ręką użyj sterylnego, ostrego, jednorazowego lanceta, aby przebić żyłę twarzową splotu podżuchwowego zwierzęcia.
      UWAGA: Jest to potencjalnie szkodliwy zabieg dla myszy i należy go wykonać ostrożnie.
      1. Upewnij się, że zwierzę może swobodnie oddychać podczas unieruchamiania. Zwracaj uwagę na zmiany w rytmie oddychania (duszności) oraz kolorze ust (nie powinny przybierać fioletowego ani ciemnoniebieskiego). Jeśli splot podżuchwy nie zostanie prawidłowo przebity, może wystąpić krwawienie w uchu z powodu przekłucia przewodu słuchowego. Aby poprowadzić przyszłych eksperymentatorów, dostępny jest Ilustrator Uzupełniający 1 , który zapewni prawidłowe umiejscowienie splotu.
        UWAGA: Alternatywnie krwawienia z żył ogonowych mogą być również wykorzystywane do pobierania próbek krwi.
    3. Po odbiorze nie zostawiaj zwierzęcia bez opieki. Musi być aktywny i nieuszkodzony. Jeśli mysz wykazuje oznaki upadku (głowy lub ciała) i braku aktywności, należy ją uśpić. Nie przekraczaj objętości 50 μL, ponieważ większe ilości krwi mogą prowadzić do śmierci zwierzęcia.
    4. Pobraną próbkę krwi przechowuj w probówce wirówki o pojemności 1,5 mL zawierającej 8 μL 50 mM EDTA, aby zapobiec krzepnięciu próbki.
      UWAGA: Tutaj użyliśmy wcześniej przygotowanego roztworu EDTA jako antykoagulanta. Jeśli jest to preferowane, na tym etapie można również użyć komercyjnie dostępnych rurek EDTA o niskiej objętości do pobierania krwi. Próbki krwi muszą zostać przetworzone tego samego dnia.
  5. Przygotowanie próbek krwi obwodowej do przetwarzania
    1. Ujednolic krew z EDTA. Przelej 50 μL mieszaniny do rurki cytometrii przepływowej.
    2. Przygotuj mieszankę przeciwciał do każdej próbki, składającą się z przeciwciał CD45 przeciw myszom (mCD45), przeciwciała CD45 przeciwludzkiego (hCD45), przeciwciała CD19 (hCD19) oraz bezpłodnego 1x PBS jako rozcieńczalnika.
  6. Przetwarzanie próbek krwi
    1. Do każdej próbki krwi dodaj 10 μL mieszaniny przeciwciał. Ujednolicaj się, delikatnie stukając palcem wskazującym. Inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej, osłonięty przed światłem.
      UWAGA: Wybierz odpowiednie przeciwciała opisane powyżej, biorąc pod uwagę dostępne kanały cytometru. Aby określić ilość przeciwciał użytych na próbkę, rozważ wykonanie krzywej miareczki dla każdego przeciwciała. Przeciwciała użyte w naszym badaniu, fluorochromy oraz objętość wybrana dla próbek są wymienione w Tabeli Uzupełniającej 1. Pełny opis numerów katalogowych przeciwciał oraz nazw klonów znajduje się w Tabeli Materiałów.
    2. Do każdej próbki dodaj 1 ml komercyjnego 1x roztworu lizy czerwonych krwinek (RBC). Ujednolicaj energicznie palcem wskazującym. Inkubuj przez 15 minut w temperaturze pokojowej, osłonięty przed światłem.
      UWAGA: Roztwór lizyczny używany w tym etapie to dostępny komercyjnie roztwór lizy 10x RBC. Jeśli użyto innego odczynnika, należy dostosować objętość roboczą 1x do lizy.
    3. Do każdej próbki dodaj 2 mL sterylnego 1x PBS na pierwszy etap płukania. Próbki w wirówce w dawce 200 x g (w wirniku obrotowym) przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Delikatnie wyrzuć supernatant, odwracając i wysusz pozostałą ciecz na górze tubki, delikatnie smacząc ręcznikami papierowymi.
      UWAGA: Podczas płukania komórki białaczki są osadzane na dnie rurki cytometru, a pozostała płyn zostanie wyrzucona. Należy zachować ostrożność podczas obchodzenia się z próbkami, ponieważ w niektórych przypadkach granulki mogą nie być widoczne. Aby zapewnić integralność pelletu, unikaj potrząsania próbką, ponieważ może to prowadzić do jej utraty.
    4. Powtórz krok 1.6.3. Ponownie zawiesij komórki białaczki 200 μL bezpłodnego 1x PBS, delikatnie stukając palcem wskazującym w rurkę cytometriczną. Próbki są gotowe do analizy za pomocą cytometrii przepływowej. Monitorowanie przeszczepu musi być przeprowadzone tego samego dnia co pobieranie krwi.
  7. Monitorowanie wszczepiania za pomocą cytometrii przepływowej
    1. Zastosowanie standardowych metod cytometrii przepływowej 9,14 do określenia procentu ludzkich komórek CD45+ we krwi obwodowej w porównaniu do komórek CD45+ myszy (% hCD45+).
    2. Zbieranie danych uzyskanych za pomocą cytometrii przepływowej do późniejszej analizy procentu hCD45+ w całkowitych komórkach CD45 (hCD45+ plus mCD45+) za pomocą oprogramowania do analizy cytometrii przepływowej.
      UWAGA: Aby zapewnić właściwe monitorowanie wszczepienia, następujące kroki analizy powinny być przeprowadzone tego samego dnia. Ta codzienna sekwencja jest szczególnie ważna przy rozważaniu rozpoczęcia przyszłego harmonogramu leczenia, który sugerujemy rozpocząć w poniedziałek. W przypadku niemożliwości rozpoczęcia leczenia w poniedziałek, leczenie może rozpocząć się w dowolny dzień tygodnia, w zależności od osiągnięcia hCD45+% (0,2%-1%) krwi obwodowej.
  8. Przygotowanie środowiska do analizy danych cytometrii przepływowej
    1. Uruchom oprogramowanie do analizy cytometrii przepływowej. Zaimportuj zebrane dane i poczekaj na ich rozpoznanie przez narzędzie.
    2. Otwórz dane z początkowej próbki, aby utworzyć bramkę oznaczoną Limfocytami. Sprawdź ustawienia osi: wybierz FSC-A dla osi X i SSC-A dla osi Y. W górnym panelu tworzenia bramek wybierz narzędzie poly-liner i wyznacz główną populację komórek.
      UWAGA: Limfocyty zazwyczaj pojawiają się w przedziale od 50 000 do 100 000 na osi X oraz od 0 do 50 000 na osi Y. Wartości mogą się różnić w zależności od charakterystyki każdej białaczki.
    3. Kliknij dwukrotnie na Ograniczoną Populację , aby utworzyć nową bramę. Aby wykluczyć dublety komórek, ustaw FSC-A na osi X, a FSC-H na osi Y. Użyj narzędzia poly-liner, aby wyizolować populację komórek pierwotnych. Narysuj bramę blisko populacji, z wyłączeniem zdarzeń odległych wzdłuż osi X.
      UWAGA: Ten krok rozróżnia poszczególne zdarzenia komórkowe.
  9. Tworzenie panelu cytometrii do rozróżniania populacji komórek
    1. Kliknij dwukrotnie wybraną populację , aby odróżnić komórki ludzkie od myszy CD45. Ustaw oś X na fluorofor mCD45, a oś Y na SSC-A. Za pomocą narzędzia kształt narysuj kwadrat wokół populacji mCD45-ujemnej.
    2. Kliknij dwukrotnie na Powstałą Populację , aby odróżnić komórki hCD19+ i/lub hCD45+. Ustaw oś X na fluoroforze hCD19, a oś Y na hCD45. W panelu tworzenia bram wybierz Linie prostopadłe, aby oddzielić odrębne populacje.
      UWAGA: Alternatywnie badacz może użyć bramki lub możliwości do rozróżniania komórek hCD45 i mCD45. Ta możliwość uwzględnia sumę zdarzeń jako 100%, tworząc precyzyjniejszą strategię identyfikacji populacji.
  10. Zastosowanie statystyk do utworzonego panelu
    1. Oblicz procent każdej populacji izolowanych komórek względem wszystkich nabytych zdarzeń. W głównym oknie oprogramowania kliknij prawym przyciskiem myszy ikonę Subgraph pochodzącą z głównego grafu każdej próbki i wybierz Stwórz statystyki. W otwartym oknie kliknij Częstotliwość i wybierz Pojedyncze komórki. Wykonaj ten krok indywidualnie dla każdego podgrafu.
    2. Wybierz wszystkie modyfikacje wprowadzone w celu zastosowania strategii bramkowania i powiązanych statystyk do wszystkich próbek. Następnie, używając lewego przycisku myszy, przeciągnij wybrane modyfikacje do opcji Wszystkie próbki w głównym oknie oprogramowania.
    3. Kliknij Edytor tabel w głównym oknie, aby wygenerować tabelę ze wszystkimi obliczonymi częstotliwościami. W oknie wyskakującym wybierz format pliku .xls, wyznacz docelowy folder i kliknij Utwórz tabelę.
      UWAGA: Wszystkie kroki wykonywane przy użyciu oprogramowania do analizy cytometrii przepływowej można zobrazować na Dodatkowym Rysunku 2. Ostatnia tabela wygenerowana w tym etapie zawiera procent hCD45+ potrzebny do wygenerowania wykresów analizujących postęp wszczepiania w czasie.
  11. Wykres postępu wszczepiania
    1. Uruchom oprogramowanie do wykresów i analizy grafów. Wybierz format tabeli XY. W głównym oknie wybierz Wprowadź lub Importuj dane do nowej tabeli, ustaw X na Liczby, a Y do Wprowadź replikujące wartości w podkolumnach obok siebie.
    2. W otwartej tabeli uporządkuj tytuły kolumn: wpisz Dni przeszczepienia dla kolumny X oraz % hCD45+ dla PB dla pierwszej grupy podkolumn Y. Wypełnij kolumnę X dniami po podaniu podania odpowiadającymi dniom pobrania krwi do monitorowania przeszczepu. Ręcznie wprowadź tygodniowy procent zebranych danych hCD45+ dla każdej myszy w podkolumnach Y.
    3. W menu oprogramowania, w podzbiorze Rodzina, wybierz Dane 1. W oknie wyskakującym wybierz drugą opcję wykresu o nazwie Points & Connection Line with Error Bars oraz włącz wykresy średnich i błędów.
    4. Dostosuj osie wykresu do pożądanych zakresów. Kliknij Eksport w prawym górnym rogu menu, aby pobrać ostateczny wykres.
      UWAGA: Wszystkie dane zebrane podczas eksperymentów z dowolnym pojedynczym ALL muszą być narysowane na tym samym wykresie, aby ułatwić analizę w czasie od początku eksperymentu. Opisowy przykład wykresu można znaleźć w Dodatkowym Rysunku 3.

2. Leczenie myszy

  1. Przygotowanie roztworów do pracy z lekami
    1. Przygotuj roztwór roboczy winkrystyny w stężeniu 1 mg/mL. Przygotuj roztwór działający deksametazonu w dawce 4 mg/mL. Przygotuj roztwór roboczy L-asparaginazy w dawce 2 000 IU/mL. Przygotuj roztwór działający daunorubycyny w dawce 2 mg/mL.
      UWAGA: Leki stosowane w tym protokole są równoważne tym stosowanym w leczeniu klinicznym pacjentów15. Roztwór roboczy deksametazonu składa się z kreatyniny, cytrynianu sodu, wodorotlenku sodu, bisulfitu sodu, metylparabenu, propylparabenu oraz wody do zastrzyków. Roztwór roboczy winkrystyny składa się z mannitolu, kwasu siarkowego, wodorotlenku sodu oraz wody do wstrzykiwania. L-asparaginaza i daunorubycyna są często dostępne w formie liofilizowanej. W takich przypadkach zalecanym środkiem rekonstrukcji jest woda sterylna do wstrzykiwania, która musi być użyta, aby uzyskać właściwe stężenie. Aby zapobiec utracie aktywności leku spowodowanej powtarzającymi się cyklami rozmrażania, leki muszą być podzielone na działające alikwoty używane nie więcej niż 3 razy.
  2. Zwierzęta ważące się po wykryciu białaczki
    1. Rozpocznij leczenie w momencie, gdy procent komórek hCD45+ we krwi obwodowej myszy osiągnie medianę od 0,2% do 1%. Po dotarciu do niej podziel przeszczepione myszy na dwie wyraźne grupy: jedną do leczenia i drugą do służenia jako kontrola.
    2. Po osiągnięciu ustalonego progu kontynuuj cotygodniowe monitorowanie postępu białaczki. Ciągłe zbieranie danych hCD45% w celu monitorowania reakcji na leczenie, występowania nawrotów oraz wykrywania oporności na leki.
    3. Waż zwierzęta do leczenia. Użyj arytmetycznej średniej wag, aby określić dawkę każdego leku podawanego grupie. Zważ zwierzęta z grupy kontrolnej, aby porównać przyrost i utratę masy ciała między grupami.
      1. Stosuj następujące dawki leku: winkrystyna, 0,15 mg/kg; deksametazon, 5 mg/kg; L-asparaginaza, 1 000 IU/kg; oraz daunorubicyny, 1,2 mg/kg. Waż wszystkie zwierzęta co najmniej 3 razy w tygodniu: w poniedziałek, środę i piątek. Używaj wag do korekty dawek leczenia leków oraz monitorowania poziomu toksyczności leczenia.
  3. Przygotowanie rozwiązań podawania leków na podstawie aliquotów roztworu roboczego
    UWAGA: Roztwory do podawania leków składają się ze sterylnego 1x PBS jako rozcieńczalnika oraz odpowiedniej objętości (zgodnie z wagą zwierzęcia) roztworów leków roboczych (woda sterylna używana jest wyłącznie do rekonstrukcji, a nie do zastrzyków) podawanych każdego dnia tygodnia. Leki podawane dootrzewnowkowo można łączyć w tym samym roztworze; Jednak jeśli jakiś lek jest podawany dożylnie, powinien być podawany w indywidualnym roztworze. Objętość roztworu podawanego do podawania leków każdemu zwierzęciu wynosi 100 μL.
    UWAGA: W opisanym powyżej kroku użyto sterylnej strzykawki insulinowej z przymocowaną igłą (1 mL, wymiary igły 12,7 mm x 0,33 mm). Pełny opis strzykawki można znaleźć w Tabeli Materiałów.
    1. W poniedziałek przygotuj lek do podawania leków składający się z deksametazonu, winkrystyny i PBS. Podawaj leki dootrzewnowkowo.
    2. We wtorek i czwartek przygotuj preparat do podawania leków zawierający deksametazon, L-asparaginazę i PBS. Podawaj leki dootrzewnowkowo.
    3. W środę przygotuj roztwór do podawania leków składający się z deksametazonu i PBS i podaj go dootrzewnootrzewkowo. Przygotuj drugi lek do podawania leków składający się z daunorubycyny i PBS. Podawaj dożylnie.
    4. W piątek przygotuj lek do podawania leków zawierający deksametazon i PBS. Podawaj lek dootrzewnowkowo.
    5. Pozwól zwierzętom odpocząć w weekendy. Powtarzaj cykl leczenia przez 4 tygodnie.
      UWAGA: Kompleksowy harmonogram leczenia można znaleźć w Tabeli Uzupełniającej 2. Ważne jest, aby wyjaśnić, że inne już ustalone protokoły leczenia mysmi zostały przetestowane, ale skutkowały wysokim poziomem toksyczności szczepu NSG. Dlatego proponowany harmonogram leczenia został najpierw poddany procesowi standaryzacji redukcji toksyczności, co zaowocowało dawkami i częstotliwością podawania przedstawionymi w tym protokole. Oczekuje się, że odsetek hCD45+ w leczonej grupie zmniejszy się w porównaniu do odsetka hCD45+ w grupie kontrolnej z powodu podawania leczenia.
  4. Podawanie leków i monitorowanie reakcji na białaczkę
    1. Ręcznie unieruchom zwierzę lewą ręką, aby podać leki dootrzewnowkowe. Trzymaj zwierzaka z częścią brzuszną uniesioną. Na części brzusznej zlokalizuj dolny prawy kwadrant.
    2. Prawą ręką użyj sterylnej, ostrej, jednorazowej igły do wstrzyknięcia i wstrzyknij 100 μL roztworu podawającego lek w dolny prawy kwadrant myszy.
      UWAGA: Bądź ostrożny podczas unieruchamiania zwierzęcia; Nie powinno to być szkodliwe dla myszy. Podobnie jak przy pobieraniu krwi, należy być świadomym ewentualnych komplikacji układu oddechowego. W przypadku zastrzyków wewnątrzotrzewnowych zawsze trzymaj igłę prostopadle, aby uniknąć wiercenia organów.
    3. Stosuj się do tych samych instrukcji, co przy przeszczepianiu komórek białaczki, aby podawać leki dożylnie. Pozwól myszom odpocząć po 4 tygodniach podawania do czasu ponownego pojawienia się WSZYSTKICH komórek, tutaj zwanych pierwszym nawrotem (R1).
      UWAGA: Pomimo różnic w sposobie podawania, zastrzyk dożylny wymaga tej samej objętości co podawanie dootrzewkowo. Jeśli jakiekolwiek zwierzę wykazuje objawy obciążenia białaczkowego, takie jak mimika twarzy wskazująca na ból, utratę apetytu, nagłą utratę masy ciała lub zmniejszoną ruchomość, można zastosować wczesny punkt końcowy dla człowieka. Eutanazja humanitarna przebiega zgodnie z procedurą eutanazji opisaną w krokach 4.4.1 do 4.4.2 dalej.
  5. Monitorowanie reakcji na białaczkę i wykrycie pierwszego nawrotu (R1)
    1. Nie przerywaj cotygodniowego monitorowania białaczki cytometrią przepływową podczas leczenia lub faz odpoczynku.
      UWAGA: Biorąc pod uwagę leczenie realizowane 5 dni w tygodniu, zdecydowanie zaleca się przeprowadzenie monitoringu na początku tygodnia. W naszym badaniu pobieranie krwi, przetwarzanie próbek i analiza zawsze odbywały się w poniedziałki.
    2. Wykonaj pobieranie krwi oraz wszelkie kolejne procedury wymagane do monitorowania zgodnie z krokami 1.4 - 1.11.
      UWAGA: Po upływie określonego okresu spoczynku komórki R1 zostaną wykryte przez nagły wzrost procentu hCD45+ we krwi obwodowej myszy. Okres między zakończeniem leczenia a wystąpieniem nawrotu jest zmienny i może być różny dla każdej badanej białaczki. Po wykryciu R1 należy wykonać trzecią i ostatnią fazę proponowanego modelu nawrotu myszy. Aby poprawić monitorowanie i analizy odpowiedzi, sugerujemy stosowanie obiektywnych miar odpowiedzi, takich jak postępująca choroba, choroba stabilna, poziom reakcji (częściowej, pełnej lub utrzymywanej), remisja i oporność, zgodnie z wytycznymi opisanymi przez Randall i in. (2024)16.

3. Powtarzające się cykle leczenia aż do pojawienia się komórek opornych

  1. Wykrycie pierwszego nawrotu
    1. Należy podawać cały tydzień leczenia typu indukcyjnego każdej myszy z nawrotem białaczki (nazwanej R1), czyli gdy osiągnie się próg 0,2% hCD45+ we krwi obwodowej. Przez tydzień, od poniedziałku do piątku, stosuj harmonogram podawania leków stosowany przy 4-tygodniowym leczeniu typu wprowadzenia na szczepienie.
      UWAGA: Stosowanie tylko tygodniowego leczenia na tym etapie ma na celu sprawdzenie in vivo , czy komórki białaczki zyskały oporność na chemioterapię, a następnie stopniowo prowadzić postęp białaczki do kolejnych nawrotów w czasie, pod presją chemioterapii. Zdecydowaliśmy się nie wprowadzać drugiego, czterotygodniowego harmonogramu, aby uniknąć nadmiernej toksyczności i utraty zwierząt.
    2. Pozwól myszom odpocząć po całym tygodniu podawania leków. Kontynuuj cotygodniowe monitorowanie odpowiedzi na białaczkę za pomocą cytometrii przepływowej zgodnie z krokami 1.4 - 1.11.
      UWAGA: Na tym etapie oczekuje się, że komórki białaczki pozostaną w reakcji na leczenie. W konsekwencji, podczas monitorowania białaczki, procent hCD45+ u myszy powinien spadać i pozostawać ujemny przez pewien czas.
  2. Monitorowanie wyglądu R2
    1. Poczekaj na pojawienie się nawrotu R2 (komórki hCD45+ ≥ 0,2%). Gdy się pojawi, policz czas upływu od zakończenia leczenia do pojawienia się R2. Nazwijmy ten okres Δt1.
    2. Przejdź do drugiego pełnego tygodnia terapii typu indukcji. Stosuj się do tych samych wytycznych, co przy pierwszym podaniu tego harmonogramu.
    3. Po zakończeniu zabiegu pozwól myszom odpocząć. Kontynuuj monitorowanie białaczki.
  3. Monitorowanie wyglądu R3
    1. Poczekaj na nawrót R3. Licz czas tak samo jak w kroku 3.2.1. Nazwij to Δt2.
    2. Porównaj Δt1 i Δt2. Powtórz powyższe kroki N razy, aby uzyskać wielokrotne nawroty białaczki (R1, R2... RN), jeśli okres Δt pozostaje taki sam. Przerwij cykle leczenia, gdy okres Δt się skróci.
      UWAGA: Zmniejszenie Δt do nawrotu jest oznaką oporności na leki nabywanej przez komórki białaczki. Ten wynik wzmacnia zdolność modelu myszy o nawrotach do generowania WSZYSTKICH komórek opornych na chemioterapię.
    3. Odzyskaj komórki białaczki zgodnie z krokiem 4 poniżej. Przechowuj je żywe poprzez kriokonserwację lub dowolny środek konserwujący zgodny z planowanymi późniejszymi analizami.
      UWAGA: Zalecanym zdarzeniem dla regeneracji komórek białaczki jest do 25% hCD45+ we krwi obwodowej, zgodnie z najnowszą literaturą16.

4. Regeneracja komórek białaczkowych poprzez pobieranie narządów

  1. Eutanazja myszy z przedawkowaniem środków znieczulających chemicznych
    1. Eutanazja myszy przez przedawkowanie chemicznych środków znieczulania, a następnie zwichnięcie szyjki macicy w celu potwierdzenia eutanazji, jak opisano poniżej.
    2. Przygotuj mieszankę zawierającą trzy środki znieczulające rozcieńczone sterylnym 1x PBS do głębokiego znieczulenia. Dla każdego zwierzęcia do uśpienia użyj 150 μL komercyjnego maleianu acepromazyny, 50 μL komercyjnej ksylazyny, 80 μL komercyjnej ketaminy oraz 220 μL PBS.
    3. Podaj 500 μL przygotowanej mieszaniny przez iniekcję dootrzewną. Stosuj się do tych samych wytycznych dotyczących unieruchamiania i zastrzyków, jak opisano w kroku 2.4.
    4. Pod wpływem przedawkowania środków znieczulanych myszy kładą się na dnie klatki. Po kilku minutach sprawdź, czy myszy mają zatrzymanie oddechu. Jeśli tak, poczekaj, aż wysiłek oddechowy ustanie. Aby zweryfikować skuteczność procedury eutanazji, sprawdź obecność odruchu mimowolnego, naciskając na jedną z tylnych nóg zwierzęcia. Aby potwierdzić eutanazję, należy przejść do zwichnięcia szyjki macicy.
  2. Zwichnięcie szyjki
    1. Przytrzymaj ciało tyłem do kratki do paszi klatki. Użyj palca wskazującego i kciuka lewej ręki, aby utworzyć kształt pęsety. Włóż palce w kształcie pęsety bezpośrednio pod głowę zwierzęcia. Mocno dociskaj do części szyjnej kręgosłupa.
    2. Chwyć ogon zwierzęcia prawą ręką. Cofnij go mocnym i równomiernym ruchem, aż głowa zwierzęcia oddzieli się od reszty ciała.
      UWAGA: Zwichnięcie szyjki macicy jest jedną z akceptowanych metod potwierdzania eutanazji 17,18,19. Inne metody, takie jak ciągła ekspozycja naCO2 przez co najmniej 15 minut po zatrzymaniu oddechu, mogą być stosowane jako alternatywa.
  3. Przygotowanie zwierząt do pobierania organów
    1. Dezynfekuj myszy, nakładając 70% alkoholu na całe ich ciało. Umieść ciało zwierzęcia na platformie chirurgicznej dla gryzoni, z częścią brzuszną uniesioną. Ogol brzuch ciała.
      UWAGA: Pełny opis platformy operacyjnej chirurgicznej dla gryzoni można znaleźć w Tabeli Materiałów.
  4. Zbieranie śledziony
    1. Wykonaj małe nacięcie sterylnymi nożyczkami chirurgicznymi i pęsetą na skórze brzucha. Usuń ją z okolic brzucha, odsłaniając otrzewną.
    2. Zrób małe nacięcie w otrzewnej. Tnij ją, aż uzyskasz pełny dostęp do narządów znajdujących się w jamie brzusznej.
    3. Zlokalizuj śledzionę, tuż pod żołądkiem zwierzęcia. Usuń śledzionę. Umieść go w pojemniku zawierającym sterylny 1x PBS do dalszego przetwarzania.
  5. Zbieranie kości udowej
    1. Przejdź do otwarcia jamy otrzewnej, aby uzyskać dostęp do tylnych łap zwierzęcia.
    2. Zlokalizuj kość udową. Usuń ją, przecinając stawy łączące ją z kością miednicy oraz z piszczelą i strzałką. Wykonaj ten proces dla obu kości udowych.
    3. Oczyść kości, usuwając wszelkie pozostałe mięśnie, skórę lub tkanki. Umieść je w pojemniku zawierającym sterylny 1x PBS do dalszego przetwarzania. Usuwać tuszą zwierzęcia zgodnie z wytycznymi Komisji Etyki Zwierząt.
      UWAGA: W zależności od celów badania, WSZYSTKIE komórki mogą być również pobrane z wątroby, ośrodkowego układu nerwowego, grasice, węzłów chłonnych itd. W tym manuskrypcie, jako przykład, opisujemy zbiór WSZYSTKICH komórek śledziony i szpiku kostnego.
  6. Przygotowanie do obróbki organów
    1. Zbierz jedną rurkę do wirówki sterylnej 50 mL, dwie sterylne strzykawki 1 mL, jedną igłę strzykawkową o wymiarach 25 mm x 0,6 mm oraz dwa sterylne sita komórek 70 μm.
  7. Przetwarzanie śledziony
    1. Umieść jedno sitko na górze otwartej rurki wirówki 50 mL. Połóż śledzionę na powierzchni sita komórkowego. Rozbij narząd płaską częścią tłoka strzykawki, aż nie widać większych fragmentów.
    2. Dodaj sterylny 1x PBS do rozszarpanej śledziony. Wykonuj ruchy okrężne płaskim miejscem tłoka strzykawki, aby zapewnić filtrację komórek.
      UWAGA: Nalewanie PBS można robić stopniowo; jednak ostateczna objętość nie może przekroczyć 6 mL. Po zakończeniu procesu śledziony sitko komórkowe powinno być przezroczyste i pozbawione pozostałości tkanki. W przypadku nasycenia sitkiem komórkowym możliwe jest zastosowanie alternatywnego sitnika komórkowego. Zawartość początkowego sita można przenieść do drugiego, a następnie kontynuować przetwarzanie. Aby uzyskać dostęp do obciążenia guza w tym narządzie, część śledziony może zostać oddzielona do oceny histologicznej.
  8. Przetwarzanie szpiku kostnego
    1. Włącz nowe sitko komórkowe do przetwarzania szpiku kostnego do już używanej rurki wirówki. Przetnij krawędzie kości udowej tak, aby otwory szpiku były dostępne. Włóż igłę strzykawkę do nowej strzykawki. Dodaj 1 ml bezpłodnego 1x PBS do strzykawki.
      UWAGA: W zależności od celów badania, WSZYSTKIE komórki pobrane ze śledziony i szpiku kostnego powinny być pobierane osobno. W takim przypadku dla każdej tkanki należy użyć osobnej rurki wirówki. Część kości udowej może być oddzielona w celu oceny histoskopologicznej w celu oceny obciążenia guzami w tym narządzie.
    2. Wykonaj przelew szpiku kostnego nad filtrem komórkowym. Włóż końcówkę igły w jedną stronę otworu szpiku kostnego. Naciskaj tłok strzykawki mocnym i stałym ruchem. Powtórz procedurę z drugą kością udową.
    3. Odłącz igłę. Użyj płaskiej części strzykawki do rozcięcia zaczerwienionego szpiku kostnego. Dodaj sterylny 1x PBS do roztrzepniętego szpiku kostnego. Wykonuj ruchy okrężne płaskim miejscem tłoka strzykawki, aby zapewnić filtrację komórek. Po zakończeniu procesu przetwarzania rurka wirówki o pojemności 50 mL będzie zawierać łączną objętość 10 mL, składającą się z mieszaniny komórek śledziony i szpiku kostnego rozcieńczonych w PBS.
      UWAGA: Proces nalewania PBS może być wykonywany stopniowo; jednak konieczne jest, aby końcowa objętość nie przekraczała 2 mL.

5. Izolacja komórek białaczkowych za pomocą wirowania gradientowego

  1. Przygotowanie do izolacji komórek białaczkowych
    1. Zbierz jedną rurkę do wirówki o pojemności 15 mL, sterylne jednorazowe pipety Pasteura, rurkę wirówki 50 mL zawierającą przetworzone narządy oraz ośrodek gradientu gęstości do izolacji limfocytów.
      UWAGA: Medium ułatwia izolację komórek jednojądrowych poprzez tworzenie gradientu gęstości poprzez wirowanie. Komórki monojądrowe (limfocyty, monocyty i WSZYSTKIE komórki) tworzą warstwę na styku między ośrodkiem a osoczem.
  2. Izolacja komórek białaczkowych
    1. Dodaj 5 mL medium gradientu gęstości do izolacji limfocytów do rurki wirówki 15 mL za pomocą jednorazowej pipety Pasteura. Stopniowo dodaj 10 mL mieszaniny komórek śledziony i szpiku kostnego na warstwę podłoża. Trzymaj rurkę pod płytkim kątem, około 30° lub mniej, i powoli dodawaj mieszankę komórek wzdłuż ściany rurki, aby warstwa medium gęstości nie została zakłócona.
      UWAGA: Zachowaj ostrożność podczas tego procesu, aby upewnić się, że komórki nie mieszają się z ośrodkiem gęstości. Zakłócenia podczas tego procesu mogą prowadzić do niepowodzenia tworzenia gradientu gęstości podczas wirowania.
    2. Wiruj rurkę 15 mL o pojemności 420 x g na wirniku łyżkowym przez 30 minut, bez przyspieszenia i przerw, aby nie zakłócać uformowanych faz.
      UWAGA: Komórki białaczkowe tworzą warstwę pomiędzy ośrodkiem gęstości a fazą wodną.
    3. Usuń i wyrzuć górną fazę wodną za pomocą sterylnej jednorazowej pipety Pasteura. Zbierz warstwę komórek białaczkowych utworzoną za pomocą sterylnej jednorazowej pipety Pasteura. Przelej ją do nowej rurki do wirówki 15 mL.
      UWAGA: Nie martw się, jeśli część warstwy medium o niższej gęstości zostanie połączona z komórkami białaczki.
  3. Płukanie komórek białaczkowych
    1. Dodaj bezpłodny 1x PBS do probówki zawierającej zebrane komórki, aż osiągnie się limit 15 mL.
    2. Wiruj ogniwa w 300 x gprzez 5 minut. Przywróć maksymalne przyspieszenie i hamowanie. Usuń i wyrzuć supernatant. Ponownie zawiesij komórki w nowym sterylnym zimnie 1x PBS.5.3.3. Przejdź do kontroli żywotności komórek. Przestrzegaj standardowych wytycznych dotyczących liczenia komórek13. Umyte komórki można barwić przeciwciałem CD45 przeciw myszom (mCD45), przeciwciałem CD45 (hCD45) oraz przeciwciałem CD19 (hCD19), a następnie przejść procedury mycia i zbieranie danych.
      UWAGA: W przypadku przetwarzania komórek śledziony i szpiku kostnego w różnych probówkach wirówkowych, część tych próbek może być użyta do oceny obciążenia guza w tych narządach za pomocą cytometrii przepływowej.
  4. Kriokonserwacja komórek białaczkowych
    1. Rozpuszczaj ogniwa w granulatach przez wirowanie w dawce 300 x g przez 5 minut. Usuń nadmiar. Trzymaj komórki w lodzie.
    2. Przygotuj medium zamrażające składające się w 90% z jałowego, zimnego surowicy płodowej bydła (FBS) i 10% dimetylosulfoksydu (DMSO). Użyj 1 ml tego roztworu do każdej fiolki kriopkonserwacyjnej.
    3. Na lodzie ponownie zawiesni komórki w przygotowanym roztworze w stężeniu 2 x 107 komórek /mL. Umieść komórki w rurkach krioprezerwacji. Komórki kriokonserwacyjne według standardowych wytycznych dotyczących kriokonserwacji kultury komórkowej20.
      UWAGA: Te komórki mogą być wykorzystywane do dalszych analiz. Zamiast zamrażać żywotne komórki, można także aliquotować i przechowywać je w różnych konserwantach na potrzeby kolejnych analiz DNA, RNA, białek i metabolitów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W kontekście naszych badań, próbki prekursorowych komórek B ALL zostały wybrane z dwóch grup pacjentów: jednej z nich wykazując pozytywną odpowiedź, co wynika z braku komórek białaczkowych w krwi obwodowej dnia 8 oraz braku pozostałych komórek białaczki w szpiku kostnym w dniach 15, 33 i 78/96. Druga grupa została utworzona przez ALL odpowiadające molekularnym podgrupom poprzednich, uzyskanych od pacjentów z słabą odpowiedzią kliniczną ocenianą przez Minimalną Resztkową Chorobę (MRD), jak...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Zrozumienie biologicznych mechanizmów leżących u podstaw chorób nowotworowych jest kluczowe dla opracowania skuteczniejszych terapii i poprawy wyników leczenia pacjentów. W schorzeniach takich jak ostra białaczka limfoblastyczna u dzieci, te podejścia badawcze są nie tylko istotne dla zwiększenia wskaźników wyleczenia, ale także mają szczególną wartość dla pacjentów, u których standardowe leczenie osiągnęło granice intensywności i tolerancji terapeutycznej. W przypadku nawrotów i oporności na leczenie, problem ten nie mo...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Podziękowania

Dziękujemy Centro Infantil Boldrini oraz wszystkim pacjentom, którzy przekazali swoje próbki do badania. Manuella M. Hoff otrzymała stypendium Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior-Brasil (CAPES) od São Paulo Research Foundation (FAPESP, 2024/03383-2). José A. Yunes otrzymał stypendium produktywności od National Counsel of Technological and Scientific Development (CNPq, 308399/2021-8). Prace te były wspierane przez badania z brazylijskiego Ministerstwa Zdrowia w ramach programu PRONON (Programa Nacional de Apoio à Atenção Oncológica, NUP 25000.211174/2019-45).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1 mL  strzykawkaBD #309628Pobieranie organów
10 mL sterylnej wody do wstrzykiwaniaHalex Istar Indú stria Farmaceutica LTDAhttps://www.medstoremaringa.com.br/produtos/agua-destilada-10ml-pack-c-5un-isofarma/Odbudowa leku
10X Roztwór Lizy RBCBioLegend#420302Przetwarzanie próbek krwi myszy
Analizator komórek 5 kanałówBD Biosciences658226R1Przepływowy cytometr  
Sitnik komórek 70 uMFalcom#352350Pobieranie organów
Acepromazyna maleat Inj Vetnil LTDAhttps://vetnil.com.br/produto/acepran-r-1Znieczulenie myszy
APC anty-human CD45 - izotyp myszy IgG1 - klon HI30BioLegend#304037Zabarwienie limfocytów
Asparaginaza 10000 UAginaza/medac#88660100Leczenie myszy
Brilliant-Violet 605 anty-mysz CD45 - mysz izotypu IgG2 - klon 30-F11BioLegend#103139Zabarwienie limfocytów
DaunorubycynaFarmarin#116880025Leczenie myszy
DeksametazonAché#00000066Leczenie myszy
DimetylsulfoksydSigma-Aldrich#589569Kriokonserwacja limfocytów
Igła jednorazowa - 0,60 x 25 mm (23G x 1' ’)BD#300388Pobieranie organów
Esterylowy jednorazowy lancet  Yancheng Huida Medical Instruments https://www.cralplast.com.br/produto/lanceta-manual/Zbieranie krwi myszy
Kwas etylendiaminetetracetowyTechnologie życia#15576-O28Roztwór EDTA
Serum bydlęce płodoweCultilab#F083Kriokonserwacja limfocytów
Analiza oprogramowania do cytometrii przepływowej - wersja 10.10.0BD Bioscienceshttps://www.flowjo.com/Analiza cytometrii przepływowej
Oprogramowanie do analizy grafów i wykresów - wersja 9.5.1Dotmatykahttps://www.graphpad.com/featuresWykresy i analiza
Strzykawka insulinowa z dołączoną igłą 1mL FX 12,7 mm x 0,33 mmDescarpacke0342101Przeszczep myszy i podawanie leków
Ketamine InjSespo Indú stria e Comé rcio LTDAhttps://www.bassopancotte.com.br/produto/dopalen-pecuaria/Znieczulenie myszy
Wielofunkcyjna platforma chirurgiczna dla gryzoniKent Scientific Corporationhttps://www.kentscientific.com/products/surgisuite/Zabiegi chirurgiczne z myszy
PE anty-ludzki CD19 - mysz izotypowa IgG1 - klon HIB19BioLegend#302208Zabarwienie limfocytów
Chlorek potasuSigma-AldrichP3911-1KGRozwiązanie PBS
Dwubaziz fosforanu potasuSigma-AldrichP0662-1KGRozwiązanie PBS
Odczynnik do izolacji limfocytówCytiva#17-1440-02, paczka 6 & razy; 100  MlIzolacja limfocytów od pobranych organów
Chlorek soduSigma-AldrichS9888-1kgRozwiązanie PBS
Fosforan sodu dibazowy Sigma-AldrichS9763-1KGRozwiązanie PBS
Sterylne pęsety do anatomicznych sekcji - 12 cm ABC 0170Lab Lí Der120Procedury chirurgiczne na myszach
Nożyczki sterylne 12 cm - ABC 0321Lab Lí Der136Procedury chirurgiczne na myszach
WinkrystynaLibbs#7896094208483Leczenie myszy
Xylazine InjSespo Indú stria e Comé rcio LTDAhttps://www.bassopancotte.com.br/produto/anasedan-10-ml-bovinos-e-equinos/Znieczulenie myszy

Bibliografia

  1. Hunger, S. P., Mullighan, C. G. Acute Lymphoblastic Leukemia in Children. N Engl J Med. 373 (16), 1541-1552 (2015).
  2. Mengxuan, S., Fen, Z., Runming, J. Novel treatments for pediatric relapsed or refractory acute B-cell lineage lymphoblastic leukemia: Precision medicine era. Front Pediatr. 10, 923419(2022).
  3. Bailey, L. C., Lange, B. J., Rheingold, S. R., Bunin, N. J. Bone-marrow relapse in paediatric acute lymphoblastic leukaemia. Lancet Oncol. 9 (9), 873-883 (2008).
  4. Inaba, H., Mullighan, C. G. Pediatric acute lymphoblastic leukemia. Haematologica. 105 (11), 2524-2539 (2020).
  5. Mullighan, C. G., et al. Genomic analysis of the clonal origins of relapsed acute lymphoblastic leukemia. Science. 322 (5906), 1377-1380 (2008).
  6. Turati, V. A., et al. Chemotherapy induces canalization of cell state in childhood B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia. Nat Cancer. 2 (8), 835-852 (2021).
  7. Uckun, F. M., et al. Prognostic significance of B-lineage leukemic cell growth in SCID mice: a Children's Cancer Group Study. Leuk Lymphoma. 30 (5-6), 503-514 (1998).
  8. Borgmann, A., et al. Childhood all blasts retain phenotypic and genotypic characteristics upon long-term serial passage in NOD/SCID mice. Pediatr Hematol Oncol. 17 (8), 635-650 (2000).
  9. Lock, R. B., et al. The nonobese diabetic/severe combined immunodeficient (NOD/SCID) mice model of childhood acute lymphoblastic leukemia reveals intrinsic differences in biologic characteristics at diagnosis andrelapse. Blood. 99 (11), 4100-4108 (2002).
  10. Samuels, A. L., et al. A pre-clinical model of resistance to induction therapy in pediatric acute lymphoblastic leukemia. Blood Cancer J. 4 (8), e232(2014).
  11. Alruwetei, A. M., et al. Examining treatment responses of diagnostic marrow in murine xenografts to predict relapse in children with acute lymphoblastic leukaemia. Br J Cancer. 123 (5), 742-751 (2020).
  12. Wunderlich, M., et al. Improved chemotherapy modeling with RAG-based immune deficient mice. PLoS One. 14 (11), e0225532(2019).
  13. Cadena-Herrera, D., et al. Validation of three viable-cell counting methods: Manual, semi-automated, and automated. Biotechnol Rep. 7, 9-16 (2015).
  14. Liem, N. L., et al. Characterization of childhood acute lymphoblastic leukemia xenograft models for the preclinical evaluation of new therapies. Blood. 103 (10), 3905-3914 (2004).
  15. Treatment protocol for children and adolescents with acute lymphoblastic leukemia - AIEOP-BFM ALL 2017. , AIEOP-BFM Study Group. https://clinicaltrials.gov/study/NCT03643276#study-overview (2017).
  16. Randall, J., et al. In vivo activity of the second-generation proteasome inhibitor ixazomib against pediatric T-cell acute lymphoblastic leukemia xenografts. Exp Hematol. 132, 104176(2024).
  17. Carbone, L., et al. Assessing cervical dislocation as a humane euthanasia method in mice. J Am Assoc Lab Anim Sci. 51 (3), 352-356 (2012).
  18. Guidelines to promote the wellbeing of animals used for scientific purpose. , National Health and Medical Research Council (NHMRC). https://www.nhmrc.gov.au/about-us/publications/guidelines-promote-wellbeing-animals-used-scientific-purposes (2008).
  19. AVMA guidelines for the euthanasia of animals: 2020 edition. , American Veterinary Medical Association (AVMA). https://www.avma.org/resources-tools/avma-policies/avma-guidelines-euthanasia-animals (2020).
  20. Ramos, T. V., Mathew, A. J., Thompson, M. L., Ehrhardt, R. O. Standardized cryopreservation of human primary cells. Curr Protoc Cell Biol. 64, A.3I.1-A.3I.8 (2014).
  21. Liu, Y., et al. Patient-derived xenograft models in cancer therapy: Technologies and applications. Sig Transduct Target Ther. 8, 160(2023).
  22. Jin, J., Yoshimura, K., Sewastjanow-Silva, M., Song, S., Ajani, J. A. Challenges and prospects of patient-derived xenografts for cancer research. Cancers. 15 (17), 4352(2023).
  23. Duy, C., et al. Chemotherapy induces senescence-like resilient cells capable of initiating AML recurrence. Cancer Discov. 11 (6), 1542-1561 (2021).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Ksenoprzeszczep pochodzenia pacjentaoporno na lekicytometria przep ywowablasty krwi obwodowejminimalna choroba resztkowaizolacja kom rek bia aczkowych
Model myszy nawrotu białaczki do indukcyjnej chemioterapii ostrej białaczki limfoblastycznej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.