Wprowadziliśmy nowatorską technikę obrazowania zwaną Optical Multilayer Interference Tomography (OMLIT), która umożliwia bezstronne obrazowanie wszystkich komórek w próbkach mózgu na mezoskali i może być płynnie zintegrowana z procesem obrazowania taśmowej szeregowej skaningowej mikroskopii elektronowej na tej samej próbce.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Metoda optycznego obrazowania zgodna z mikroskopią skaningową do mezoskopowego mapowania mózgu w całych komórkach
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Zrozumienie relacji strukturalnych i funkcjonalnych w złożonych sieciach neuronowych w mózgu wymaga stworzenia atlasów mózgu, które mają zarówno szerokie pole widzenia, jak i rozdzielczość subkomórkową. Jednak obecne metody obrazowania optycznego i mikroskopu elektronowego mają ograniczenia, co utrudnia obrazowanie wszystkich komórek w jednym próbku. Protokół ten wprowadza technikę obrazowania zwaną Optical Multilayer Interference Tomography (OMLIT), która umożliwia niedyskretne obrazowanie optyczne wszystkich komórek w próbkach mózgu pobranych po przygotowaniu próbki mikroskopii elektronowej, tworząc tym samym pełny atlas mózgu wszystkich komórek nerwowych. Ponadto obrazowanie OMLIT może być płynnie zintegrowane z procesem obrazowania w zautomatyzowanej ultramikrotomii ultramikrotomii skaningowej mikroskopii elektronowej (ATUM-SEM). Pozwala to badaczom na uzyskanie mezoskalowych informacji strukturalnych komórek przed mikroskopią elektronową, ułatwiając precyzyjny wybór obszarów zainteresowania i znacząco zmniejszając powierzchnię oraz objętość danych potrzebnych do obrazowania w mikroskopii elektronowej wysokiej rozdzielczości (EM). Zweryfikowaliśmy dokładność i kompatybilność tej metody w rzeczywistych próbkach z kory mózgowej dorosłych myszy, demonstrując jej szerokie możliwości zastosowania w wieloskalowej konstrukcji atlasu mózgu.
Wprowadzenie
Kompleksowe mapowanie obwodów nerwowych w rozdzielczości komórkowej i podkomórkowej jest niezbędne do ujawnienia struktury i funkcji mózgu. Tradycyjne metody obrazowania optycznego, takie jak mikroskopia dwufotonowa1, mikrooptyczna tomografia przekrojowa fluorescencyjna (fMOST)2,3,4 oraz system VISoR5, umożliwiły obrazowanie neuronów mezoskalowych oraz obrazowanie funkcjonalne in vivo. Jednak ze względu na uzależnienie od rzadkich znakowań nie udaje im się uchwycić całej populacji komórkowej. Z kolei techniki obrazowania optycznego bez oznakowania, takie jak funkcjonalna mikroskopia fotoakustyczna (fPAM)6,7, optyczna tomografia koherencji (OCT)8 oraz ilościowa mikroskopia fazowa9, mają potencjał do jednoczesnej wizualizacji wszystkich neuronów w polu widzenia. Niemniej jednak metody te są zazwyczaj ograniczone przez niską rozdzielczość osiową i płytką głębokość obrazowania, a ich złożoność sprzętowa utrudnia szerokie zastosowanie w konstrukcji atlasu mózgu. W przeciwieństwie do nich techniki mikroskopii elektronowej o przekroju szeregowym (ssEM), w tym szeregowe blokowe SEM (SBF-SEM)10,11, wiązka jonów skupionych SEM (FIB-SEM)12,13,14 oraz zautomatyzowana ultramikrotomia zbierania taśmy SEM (ATUM-SEM)15,16,17 , może ujawniać gęste sieci łączności synaptycznej w rozdzielczości nanometrów, dostarczając niezbędnych narzędzi do konektomiki o wysokiej rozdzielczości. Jednak techniki te cierpią na niską przepustowość, długie czasy akwizycji, ograniczone pola widzenia oraz wysokie koszty przetwarzania danych i sprzętu18.
Aby przezwyciężyć powyższe ograniczenia, opracowaliśmy metodę obrazowania o nazwie Optical Multilayer Interference Tomography (OMLIT), która oferuje niskokosztowe i wysokoprzepustowe rozwiązanie do bezkrytycznego, wysokokontrastowego, szerokopolnego obrazowania wszystkich komórek na ultracienkich przekrojach, osiągając rozdzielczość submikronową na dużych obszarach tkanek. Jednocześnie OMLIT jest z natury kompatybilny z procesami pracy SEM o przekroju szeregowym: przed mikroskopią elektronową o wysokiej rozdzielczości OMLIT dostarczał informacji strukturalnych o tych samych przekrojach, umożliwiając precyzyjną nawigację ROI i znacząco zmniejszając powierzchnię oraz objętość danych potrzebne do późniejszego obrazowania EM. OMLIT oferuje unikalne zalety na poziomie obrazowania mezoskalowego i stanowi kluczowy most łączący mapy strukturalne neuronów na różnych skalach przestrzennych. Jej nieniszczący charakter zachowuje potencjał przyszłej integracji ze specyficznymi strategiami znakowania, takimi jak wykorzystanie fluorescencjonalnych białek odpornych na osm19 do przygotowania próbek i obrazowania. Metoda ta umożliwia mezoskalowe obrazowanie wybranych obszarów mózgu, umożliwiając szybkie przyswójanie morfologii, ilości, rozmieszczenia i gęstości neuronów w tych regionach. Ułatwia także ilościową charakterystykę projekcji aksonalnych i rozmieszczenia dendritów między neuronami w różnych obszarach mózgu. Dla konkretnych obszarów zainteresowanych wynikami obrazowania, szczegóły ultrastrukturalne in situ można dodatkowo badać za pomocą mikroskopii elektronowej.
Zasada obrazowania w OMLIT została opisana w pracy Hao Fana20. Krótko mówiąc, podczas obrazowania, ultracienka sekcja, warstwa powłokowa, taśma zbiorcza, taśma przewodząca oraz płytka tworzą wielowarstwową strukturę cienkowarstwową. Gdy fala płaska oddziałuje z tą strukturą, fale odbite powstają na różnych granicach i nakładają się w przestrzeni detekcji, co skutkuje interferencjami optycznymi spowodowanymi różnicami w odbiciu, współczynniku załamania i absorpcji między materiałami. Program symulacyjny oparty na MATLAB, opracowany na tej zasadzie, wykazał rozsądną zgodność z wynikami eksperymentalnymi.
Schemat obrazowania OMLIT można podzielić na dwa typy w zależności od strategii przetwarzania taśmy. Pierwszą jest strategia wysokiej refleksyjności, w której do pokrywania powierzchni taśmy stosuje się metale takie jak Cr, Cu, Al lub Ag, co skutkuje wyższą intensywnością optyczną w obszarach cytoplazmatycznych i światłach naczyń wypełnionych żywicą w porównaniu z otaczającymi obszarami. Drugą jest strategia o niskiej refleksyjności, która wykorzystuje taśmę Kapton bez powłoki, taśmę D-50 lub taśmę PET powlekaną CNT. W tym przypadku wynik obrazowania optycznego jest odwrotny do pierwszego: bogate w żywicę, wolne od błon obszary (np. cytoplazma i światła naczyniowe) pojawiają się z niższą intensywnością.
Systematycznie podsumowujemy i ustanawiamy ustandaryzowane protokoły dostosowane do dwóch odrębnych strategii obrazowania. Przedstawione tutaj protokoły oferują kompleksowe i szczegółowe procedury eksperymentalne. Dodatkowo podsumowano typowe problemy napotkane podczas eksperymentów wraz z proponowanymi rozwiązaniami. Skupiamy się na prezentacji zbioru danych kory myszy uzyskanych przy użyciu strategii niskiej refleksyjności (805 × 857,5 × 11,66 μm³), ilustrując charakterystyczne cechy i zalety podejścia OMLIT.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie procedury na zwierzętach były wykonywane zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi Uniwersytetu Nauki i Technologii Chin oraz odpowiednimi przepisami krajowymi. Przygotowanie próbki do obrazowania OMLIT stosuje ten sam protokół co w konwencjonalnej EM, a konkretna procedura, którą zastosowaliśmy, została opisana w innym miejscu21. Krótko mówiąc, po znieczuleniu myszy były przezkardialnie perfuzowane kolejno buforem kakodylatowym sodu, sztucznym płynem mózgowo-rdzeniowym (ACSF) oraz ostatecznie fiksatorem zawierającym glutaraldehyd i paraformaldehyd. Mózg został starannie usunięty, a około 1 × 1 × 1 mm³ bloków tkanki mózgowej zostały przecięte na sekcje. Próbki były następnie chemicznie utrwalane, poddawane seryjnemu barwieniu metali ciężkim, odwodnione i osadzone w żywicy. Ogólny przebieg pracy protokołu przedstawiono na Rysunku 1.
Rysunek 1: Przegląd przepływu pracy. (A) Taśmy zbiorcze wymienione w protokole (od lewej do prawej: poliimid, D-50 i PET pokryty CNT). (B) Sekcjonowanie seryjne i pobieranie przyciętych próbek. (C) Montaż wstążek zawierających zebrane fragmenty na okrągłej płytki krzemowej. (D) Obrazowanie mikroskopem świetlnym, skala 100 μm. (E) Powłoka węglowa. (F) Obrazowanie mikroskopem elektronowym odpowiada obszarowi przedstawionemu na rysunku 1D, skala: 10 μm. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.
1. Przygotowanie taśmy
UWAGA: Następujące procedury należy wykonywać w pomieszczeniu czystym, aby zapobiec zanieczyszczeniu taśmą przez kurz.
- Strategia wysokiej refleksyjności
- Wybierz Kapton (dalej nazywany taśmą poliimidową, o grubości 50 μm) lub folię Panlite (dalej D-50, grubość 50 μm) i zamontuj ją na zmotoryzowanym systemie uzwojenia. Tutaj jako przykład użyto taśmy poliimidowej.
UWAGA: W tym badaniu zastosowano zmotoryzowane uzwojenie, zaprojektowane do napędzania silnikiem krokowym sterowanym przez płytkę Arduino, które prowadziło taśmę z jednej szpuli na drugą przez stożek plazmy sputtera. Aby zrekompensować rosnącą prędkość translacji taśmy spowodowaną gromadzeniem taśmy na szpuli, co zwiększało średnicę szpuli, napisano program do stopniowego strojenia prędkości kątowej szpuli po każdym obrócie o 360°. - Nałóż jednolitą cienką warstwę Cr (lub innych metali, takich jak Al, Ag czy Cu) na powierzchnię taśmy za pomocą systemu rozpylania magnetronu (podwójny rozpylający się fragment). Umieść taśmę w odległości 80 mm od celu rozbrzmiewającego, aby uzyskać optymalne osadzenie. Proces ten przeprowadza się pod prądem stałym i przy ciśnieniu 1,0 Pa regulowanym przez 99,99% gazu argonowego.
- Ustaw prędkość nawijania taśmy na 0,6 mm/s, aby uzyskać metalową powłokę o grubości 50 nm. Po osadzaniu powoli chłodzić komorę do temperatury pokojowej (RT) w wysokiej próżni, aby zminimalizować naprężenia powłoki.
UWAGA: Optymalna grubość powłoki dla tej samej taśmy może się różnić w zależności od rodzaju użytego metalu. Dostosuj prędkość translacji taśmy, aby uzyskać różne grubości powłoki, takie jak 50, 70, 100, 150 i 200 nm. - Oceń grubość i jednolitość powłoki za pomocą profilera igły, mikroskopii siły atomowej lub skaningowej mikroskopii elektronowej.
- Oczyść i sprawić, że taśma będzie hydrofilowa, używając filtra plazmowego o mocy 80 W, z prędkością ruchu taśmy 7 mm/s. Po zabiegu krople wody umieszczone na powierzchni taśmy powinny szybko rozprzestrzeniać się w cienką warstwę (Rysunek 2A).
- Wybierz Kapton (dalej nazywany taśmą poliimidową, o grubości 50 μm) lub folię Panlite (dalej D-50, grubość 50 μm) i zamontuj ją na zmotoryzowanym systemie uzwojenia. Tutaj jako przykład użyto taśmy poliimidowej.
- Strategia niskiej refleksyjności
UWAGA: Protokół ten pozwala na użycie taśmy D-50 lub komercyjnej taśmy nanorurek węglowych (CNT) powlekanej polietylen-tereftalanem (PET). Ponieważ ten ostatni może wprowadzać pewne szumy tła podczas obrazowania mikroskopem elektronowym – choć nie jest silny – może potencjalnie wpływać na segmentację obrazów EM. Dlatego poniższy opis nadal będzie używał taśmy D-50 jako przykładu.- Przygotować filmy D-50 i pociąć cały arkusz na taśmy o szerokości około 7 mm. Jedną odsłoniętą stronę taśmy używaj do zbierania fragmentów, a drugą zabezpiecz warstwą matowej folii, aby zapobiec zarysowaniu i zanieczyszczeniom. Usuń matową folię podczas kolejnego etapu montażu płytki krzemowej.
- Aby uzyskać większą liczbę sekcji, łącz różne sekcje taśmy D-50. Zabezpiecz połączenia między segmentami taśmy za pomocą dwustronnej taśmy klejącej.
UWAGA: Podczas przyklejania segmentów taśmy upewnij się, że taśma prowadząca nakłada się na taśmę prowadzącą od góry do dołu za pomocą taśmy dwustronnej. Zminimalizuj powierzchnię kleju i pozostawij margines na krawędziach taśmy, aby zapobiec wyciskaniu kleju podczas nawijania, co może ją zanieczyścić (rysunek 2B). - Oczyść i uczynić taśmę hydrofilową za pomocą środka do czyszczenia plazmowego, stosując tę samą procedurę i osiągając ten sam efekt jak wcześniej opisany.
UWAGA: Poza powlekaniem metalu i krokami sputteringu węglowego, pozostałe kroki w obu strategiach są takie same.
2. Serialne ultracienkie sekcjonowanie i kolekcja taśmowa
- Używając małego szlifierki lub podobnego narzędzia tnącego, surowo przycinaj żywicę po stronie z próbką, usuwając otaczającą żywicę czystą, aby odsłonić obszar próbki.
- Umieść blok w żywicy w uchwycie próbki i dokręć pokrętło, aby mocno zabezpieczyć blok.
- Zamontuj uchwyt próbki na ruchomym ramieniu mikrotomu. Zamontuj nóż szklany lub diamentowy nóż do przycinania (pod kątem 45°) na uchwytie noża. Pod mikroskopem przytnij powierzchnię próbki do kształtu piramidy i wygładź powierzchnię.
UWAGA: Przednia i tylna krawędź przyciętego bloku próbek powinny być jak najbardziej równoległe (patrz Rysunek 2C). - Przytnij i wygładz cztery boki bloku próbki, aby usunąć nadmiar żywicy wokół krawędzi, zapobiegając potencjalnym kolizjom z nożem diamentowym. Obróć pokrętło, aby upewnić się, że przednie i tylne krawędzie przyciętego bloku są ustawione poziomo.
- Wyjmij nóż do przycinania i załóż go na nóż diamentowy ustawiony pod kątem 45°. Ustaw kąt nachylenia podstawy mikrotomu na 6°. Powoli przesuwaj uchwyt noża za pomocą pokrętła, aż przednia krawędź noża diamentowego będzie oddalona o 1-2 mm od powierzchni próbki.
- Obserwuj jasny pas między powierzchnią próbki a krawędzią noża i dostosuj kąt nachylenia tak, aby pas był równy od góry do dołu i na boki. Pomaga to zapewnić, że pierwsza część obejmuje całą powierzchnię próbki, a nie tylko róg.
- Wtryskuj wodę destylowaną do rowka noża diamentowego, pozwalając na wzrost poziomu cieczy i zapewniając, że ostrze jest wilgotne. Następnie użyj strzykawki, aby usunąć część wody, aż poziom cieczy spadnie, a odbicie będzie wyglądać na srebrzyste.
- Ustaw grubość przekroju (posuwanie), prędkość cięcia i okno cięcia w jednostce sterującej. Reguluj prędkość sekcjonowania do 0,6 mm/s i ustaw grubość przekroju na 60 nm (prędkość i grubość zależy od jakości próbki).
- Rozpocznij sekcjonowanie. Gdy mikrotom działa stabilnie i zostaną uzyskane jednolite przekroje, wstrzymaj proces sekcji. Użyj cienkiego pędzla, aby usunąć przecięte fragmenty i wszelkie zanieczyszczenia.
- Zamontuj zarówno szpulę taśmy powlekanej, jak i pustą szpulę nawijającą w automatycznym systemie zbierania ultracienkich sekcji. Zabezpiecz mechanizm blokujący i wykonaj próbny przebieg, aby upewnić się, że taśma porusza się płynnie i ze stałą prędkością oraz jest prawidłowo zebrana na pustej szpuli.
- Zanurz głowicę zbiorczą taśmy w kąpieli wodnej noża diamentowego. Ustawij pozycję głowicy zbiorczej tak, aby była równoległa do krawędzi noża, w odległości 1,5 razy długości fragmentu próbki, zapewniając płynne zebranie wyciętych fragmentów na taśmę. Zabezpiecz urządzenie do zbierania i wznowij sekcjonowanie, jednocześnie uruchamiając urządzenie do zbierania taśmy.
- Po zebraniu wystarczającej liczby ciągłych przekrojów zatrzymaj proces cięcia. Przetnij taśmę w obszarze sekcji, gdzie nie zebrano żadnych sekcji, i kontynuuj uruchamianie urządzenia do zbierania taśmy, aż cała pozostała taśma zostanie zebrana na szpuli.
- Wyjmij szpulę zawierającą zebrane fragmenty i umieść ją w elektronicznym suszarniu. Wyczyść urządzenie do zbierania taśmy i mikrotom, a wszystkie akcesoria odłóż na właściwe miejsce.
Rysunek 2: Przygotowania przed cięciem na sekcje. (A) Krople wody na powierzchni taśmy D-50 przed (górą) i po (dolnym) zabiegu hydrofilowym. (B) Schematyczne widoki górne i boczne obszaru złącza taśmy D-50. Niebieski: taśma D-50; pomarańczowy: klej dwustronny; Zielona Strzałka: Taśma kierunku ruchu. (C) Widok frontalny próbki po przycięciu, pokazujący równoległe górne i dolne krawędzie. (D) Automatyczne urządzenie do zbierania taśm. a: Szpula taśmy do wyprowadzania taśmy D-50; b: Szpula taśmy do wyciągania taśmy; Czerwona strzałka: kierunek ruchu taśmy. (E) Pozycja głowicy zbiorczej na automatycznym urządzeniu do zbierania taśmy. Żółte ramki w prawym dolnym rogu oznaczają świeżo wyciętą sekcję, którą urządzenie ma odebrać. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.
3. Montaż na płytkach krzemowych
UWAGA: Upewnij się, że przestrzeń robocza jest czysta, aby uniknąć skażenia taśmy kurzem podczas kolejnych kroków.
- Użyj okrągłej płytki krzemowej o średnicy 4 cali, wcześniej oczyszczonej i hydrofilizowanej w systemie plazmowym (moc 80 W, 3 minuty).
- Załóż czyste rękawiczki, połóż płytkę krzemową na płaskiej powierzchni i wytnij kawałek dwustronnej przewodzącej taśmy węglowej na odpowiednią długość (z 2-3 cm występem na obu końcach). Zdejmij białą warstwę ochronną z jednej strony dwustronnej taśmy przewodzącej i nałóż ją od góry do dołu na płytkę krzemową.
UWAGA: Obie strony taśmy przewodzącej powinny być oddalone od siebie o około 2 mm, a krawędzie taśmy powinny być widoczne na płytkach krzemowych. Dla taśmy przewodzącej o szerokości 25 mm można nałożyć trzy segmenty taśmy na jedną płytkę krzemową o średnicy 4 cali. - Narysuj kontur 4-calowej płytki krzemowej na stole i zaznacz przybliżoną długość każdego segmentu taśmy, który zostanie przyklejony do płytki. Przetnij taśmę, która zebrała przekroje zgodnie z wcześniej zaznaczonymi długościami.
UWAGA: Taśma cięta nie powinna przekraczać krawędzi płytki krzemowej i nie powinna ciąć w poszczególnych częściach. - Zdejmij przezroczystą folię ochronną z dwustronnej taśmy przewodzącej, a w przypadku taśmy D-50 zdejmij folię ochronną z tyłu taśmy w tym miejscu. Taśmę naklej równolegle do dwustronnej taśmy przewodzącej. Na każdy kawałek dwustronnej taśmy przewodzącej należy nałożyć do trzech segmentów taśmy.
UWAGA: Aby zmniejszyć ryzyko nieprawidłowego ustawienia lub skażenia taśmy D-50, należy pokryć część taśmy przewodzącej przezroczystą folią, która wcześniej została odklejona, pozostawiając jedynie niewielką część taśmy przewodzącej, aby przymocować koniec taśmy D-50. Pozwala to na łatwiejszą regulację kierunku taśmy. Następnie powoli zdejmuj pozostałą przezroczystą taśmę, pozwalając pozostałej części taśmy D-50 delikatnie opaść i przykleić się do przewodzącej taśmy. - Po zamontowaniu taśmy mogą powstawać pęcherzyki powietrza między taśmą przewodzącą, które mogą zakłócać dalszy proces obrazowania. Włóż płytkę krzemową do komory próżniowej (lub innego sprzętu próżniowego) i zastosuj podciśnienie. Po zakończeniu procesu próżniowego upewnij się, że pęcherzyki powietrza zniknęły.
4. Po barwieniu
- Przygotuj 4% octan uranylu i 3% cytrynian ołowiu i podgrzej je do 50°C w garnku w kąpieli wodnej.
UWAGA: Octan uranylu jest radioaktywny i ma znaczną toksyczność dla wątroby i nerek. Cytrynian ołowiu może powodować zatrucie ołowiem, wpływając na układ nerwowy, nerki i układ hematopoezowy. Praca z tymi odczynnikami powinna odbywać się w okapie wyparowniczym, a także należy nosić odpowiedni osobisty sprzęt ochronny (PPE), w tym fartuch laboratoryjny, rękawice nitrylowe, maseczkę oraz okulary ochronne. W przypadku kontaktu ze skórą lub wzrokami natychmiast umyj dużą ilością wody, zgłoś się do personelu ochrony laboratorium i zgłoś się po pomoc medyczną. - Włóż płytkę krzemową, która została odkurzona i wolna od pęcherzyków, do systemu hydrofilyzacji plazmowej w celu hydrofilyzacji i czyszczenia.
- Używając strzykawki 10 mL z wyjętą igłą, podłącz filtr strzykawkowy o pojemności 0,22 μm i przefiltruj 4% octan uranilu. Roztwór rozlewaj na przekroj, aż cała powierzchnia przekroju na wafli krzemowej będzie pokryta, a następnie odczekaj 3 minuty.
- Przemyj wodą destylowaną przez 3 minuty, powtarzając 3 razy, a następnie susz powierzchnię próbki azotem.
- Używając strzykawki 10 mL z wyjętą igłą, podłącz filtr strzykawkowy o pojemności 0,22 μm i przefiltruj cytrynian ołowiu o stężeniu 3%. Roztwór rozsypuj na przekroj, aż cała powierzchnia przekroju na wafli krzemowej będzie pokryta, a potem odczekaj 5 minut.
- Przemyj wodą destylowaną przez 3 minuty, powtarzając 3 razy, a następnie susz powierzchnię próbki azotem.
5. Pozyskiwanie danych
- Mikroskopia optyczna
UWAGA: W tej sekcji jako przykład mikroskopii optycznej użyto Skanera Slajdów Badawczych (VS200, Olympus). Inne mikroskopy, takie jak Axio Imager.A2 Vario (Zeiss, Niemcy), również nadają się do opisanego tutaj obrazowania optycznego. Kroki dla innych mikroskopów optycznych są zazwyczaj takie same.- Umieść płytkę krzemową na scenie mikroskopu optycznego i zabezpiecz ją taśmą samoprzylepną, która nie pozostawia resztek.
- Użyj obiektywu 5x, aby uzyskać obraz ogólny płytki krzemowej, taśmy i próbki.
- Na obrazku przeglądowym zarysuj każdą sekcję i posortuj je, a następnie dodaj punkty ostrości i ekspozycji, aby wykonać automatyczne obrazowanie z powiększeniem 20x lub 50x na całej płytki krzemowej ze wszystkimi sekcjami.
- Po zakończeniu obrazowania zapisz obrazy, a następnie sprawdź jakość obrazu. Jeśli są obrazy nieostre lub słabej jakości, przeostrz ostrość i ponowne obrazowanie.
- Mikroskopia elektronowa
UWAGA: Różne typy mikroskopów elektronowych mogą wykonywać ciągłe obrazowanie ultracienkich przekrojów umieszczonych na płytkach krzemowych. Przykładem jest Multibeam 505 (Zeiss).- Wykonaj powłokę węglową na powierzchni próbki za pomocą warstwy sputter coater w wysokiej próżni o grubości węgla 5,7 nm.
UWAGA: Ten krok można pominąć w przypadku taśm powlekanych metalem w strategii wysokiej refleksyjności lub pokrycia nanorurkami węglowymi (CNT) w strategii niskiej refleksyjności. - Użyj mikroskopu optycznego (Axio Imager.A2 Vario, Zeiss) do uchwycenia optycznej mapy nawigacyjnej płytki krzemowej.
- Umieść płytkę krzemową w komorze próbki SEM-a. Połącz optyczną mapę nawigacyjną z obrazem mikroskopu elektronowego, wskazując kolejno dwa zagnieżdżone znaczniki w kształcie litery L na etapie próbki.
- Użyj modułu SAT w oprogramowaniu mikroskopowym (v3.2, 64-bitowy) do półautomatycznego identyfikowania pozycji przekrojów i obszarów obrazowania na podstawie mapy nawigacji optycznej.
- Ustaw rozmiar piksela obrazu na 4 nm, czas zatrzymania na 0,8 μs, punkty ostrości i pozycje oraz miejsca przechowywania.
- Rozpocznij ciągłe obrazowanie.
- Wykonaj powłokę węglową na powierzchni próbki za pomocą warstwy sputter coater w wysokiej próżni o grubości węgla 5,7 nm.
6. Przetwarzanie danych
UWAGA: Łączenie 2D obrazów OMLIT jest automatycznie wykonywane przez oprogramowanie. Do rejestracji i segmentacji obrazów OMLIT na dużą skalę 3D dostępne są inne, bardziej zaawansowane algorytmy AI. Dla wygody większości laboratoriów w weryfikacji procesu, demonstrowano zszywanie, rejestrację i segmentację z wykorzystaniem Fiji (v1.54p, 64-bit) oraz VAST (v1.5.0, 64-bit).
- Otwórz zbiór danych obrazów na Fidżi, przeciągając folder zawierający wszystkie pliki obrazów do interfejsu Fidżi i wybierz Wirtualny stos po wywołaniu pytania.
- Użyj narzędzia Rectangle Tool , aby wybrać obszar zainteresowania (ROI), a następnie przyciąć zbiór danych za pomocą Image > Crop.
- Wyrównaj stos obrazów za pomocą wtyczki Register Virtual Stack Slices (Plugins > Registration > Register Virtual Stack Slices).
- Zapisz wyrównany zbiór danych w formacie TIFF (File > Save As > Tiff).
- Zaimportuj stos obrazów TIFF do VAST22 za pomocą Import > Import volume obrazu z obrazów do . Plik VSV.
UWAGA: Szczegółowy samouczek znajdziesz na stronie internetowej: https://lichtman.rc.fas.harvard.edu/vast/ - Podłączając zewnętrzny tablet, użyj narzędzia pędzel w trybie Draw Segment , aby rozpocząć ręczną segmentację i śledzenie (użyj skrótów A i Z , aby szybko nawigować między fragmentami obrazu).
- Wizualizuj segmentowaną strukturę w 3D za pomocą Window > 3D Viewer > View > Update.
- Zapisz wyniki segmentacji w pliku > Zapisz segmentację.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Cały proces działania protokołu (Rysunek 1) rozpoczyna się od przygotowania różnych taśm zbiorczych. Rysunek 1 pokazuje trzy typy taśm wymienione w protokole (od lewej do prawej: Kapton, D-50 oraz PET pokryty CNT), które wykazują odrębne właściwości optyczne po umieszczeniu na tym samym podłożu tła. Po przygotowaniu próbki i przycięciu bloków należy najpierw pobrać kilka sekcji do obrazowania mikroskopem elektronowym, aby upewnić się, że przygotowanie spełnia oc...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Opracowaliśmy tutaj podejście optyczne, nazwane OMLIT, które umożliwia obrazowanie mezoskopowe i jest kompatybilne z procesami pracy w seryjnej mikroskopii elektronowej opartej na taśmie. Dzięki metodzie OMLIT mikroskopia optyczna może być wykorzystywana do rejestrowania mezoskopowych cech strukturalnych z próbek mózgu, w tym naczyń krwionośnych, ciał komórkowych, jąder, głównych gałęzi dendrytycznych oraz niektórych dużych mielinizowanych aksonów. Ponadto OMLIT może być płynnie zintegrowany z szeregowym pipeline'em SEM,...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Nie zgłoszono konfliktów interesów.
Podziękowania
Prace te zostały wsparte przez Narodową Fundację Nauki Chin (32271430, 62361166631) oraz Ministerstwo Nauki i Technologii Chin (2023YFF0715904). Dziękujemy Publicznemu Centrum Technicznemu Instytutu Inżynierii Biomedycznej i Technologii w Suzhou oraz Ośrodku Obrazowania Mózgu Instytutu Sztucznej Inteligencji, Hefei Comprehensive National Science Center, za ich wsparcie w zakresie OMLIT i seryjnego obrazowania EM.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Taśma klejąca | 3M | B5005094008 | Klej dwustronny |
| Mikroskop sił atomowych | Bruker | Ikona Wymiaru | |
| Automatyczny system zbierania ultracienkich przekrojów; | Lehua | AutoCUTS II | |
| Przewodząca taśma klejąca | Ted Pella | FP16084-8 | |
| Dektak Stylus Profilers | Bruker | DektakXT | |
| Nóż diamentowy do krojonowania | Diatoma | DUJ3530 | Nóż Diatome Jumbo |
| Nóż diamentowy do przycinania | Diatoma | DTB90 | Szklany nóż |
| Mikroskop elektronowy | Zeiss | MultiSEM505 | Alternatywa: GeminiSEM 300, Zeiss |
| FIJI (v1.54p, 64-bit) | Open source | https://fiji.sc | |
| Nóż do przycinania szkła | Własnoręcznie zrobione | ||
| Cytrynian ołowiu | Leica | T534/2 | |
| Mikroskop świetlny | Olympus | VS200 | Alternatywa: Axio Imager. A2 Vario, Zeiss |
| mikroskop świetlny | Zeiss | Axio Imager.A2 Vario | |
| Oczyszczacz plazmowy | Yidon Technologies | Hydro-S4 | Alternatywy: Ted Pella Pelco lub inne środki do czyszczenia plazmy laboratoryjnej |
| Taśma polimerowa | Melton | Kapton | Strona internetowa firmy nie jest już dostępna. Zalecamy, aby badacze wypróbowali lokalnie dostępne taśmy KAPTON. |
| Taśma polimerowa | Teijin | PET | https://www.teijin.com/ |
| Taśma polimerowa | Teijin | D-50 | https://www.teijin.com/ |
| Płytka krzemowa | Saichi | 912303 | Płytka jest wypolerowana z jednej strony. |
| Sutter Coater | Leica | ACE600 | Alternatywa: Podwójny Sutter, Yujie |
| Ultramikrotom | Leica | UC7 | Alternatywa: RMC PT-PC |
| Uranylacetate | EMS | 22400 | |
| VAST (v1.5.0, 64-bitowy) | Instytut Medyczny Howarda Hughesa | https://software.dvid.io/vast/ | VAST A1:D32Lite to bezpłatne narzędzie do ręcznej adnotacji i segmentacji dużych zbiorów danych mikroskopii 3D. |
| Oprogramowanie ZEN (v3.2, 64-bit) | Zeiss | https://www.zeiss.com/microscopy/zh/products/software/zeiss-zen.html |
Bibliografia
- Economo, M. N., et al. A platform for brain-wide imaging and reconstruction of individual neurons. eLife. 5, e10566(2016).
- Gong, H., et al. Continuously tracing brain-wide long-distance axonal projections in mice at a one-micron voxel resolution. Neuroimage. 74, 87-98 (2013).
- Zheng, T., et al. Visualization of brain circuits using two-photon fluorescence micro-optical sectioning tomography. Opt Express. 21 (8), 9839(2013).
- Lin, R., et al. Cell-type-specific and projection-specific brain-wide reconstruction of single neurons. Nat Methods. 15 (12), 1033-1036 (2018).
- Wang, H., et al. Scalable volumetric imaging for ultrahigh-speed brain mapping at synaptic resolution. Natl Sci Rev. 6 (5), 982-992 (2019).
- Yao, J., et al. High-speed label-free functional photoacoustic microscopy of mouse brain in action. Nat Methods. 12 (5), 407-410 (2015).
- Li, X., Kang, L., Zhang, Y., Wong, T. T. W. High-speed label-free ultraviolet photoacoustic microscopy for histology-like imaging of unprocessed biological tissues. Opt Lett. 45 (19), 5401(2020).
- Kut, C., et al. Detection of human brain cancer infiltration ex vivo and in vivo using quantitative optical coherence tomography. Sci Transl Med. 7 (292), (2015).
- Hu, C., Popescu, G. Quantitative phase imaging (QPI) in neuroscience. IEEE J Sel Top Quantum Electron. 25 (1), 1-9 (2019).
- Denk, W., Horstmann, H. Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLoS Biol. 2 (11), e329(2004).
- Titze, B., Genoud, C. Volume scanning electron microscopy for imaging biological ultrastructure. Biol Cell. 108 (11), 307-323 (2016).
- Heymann, E. W. Scent marking strategies of new world primates. Am J Primatol. 68 (6), 650-661 (2006).
- Echlin, M. P., et al. Recent developments in femtosecond laser-enabled TriBeam systems. JOM. 73 (12), 4258-4269 (2021).
- Randolph, S., Geurts, R., Wang, J., Winiarski, B., Rue, C. Femtosecond laser-enabled TriBeam as a platform for analysis of thermally- and charge-sensitive materials. Microsc Microanal. 25 (S2), 352-353 (2019).
- Horstmann, H., Körber, C., Sätzler, K., Aydin, D., Kuner, T. Serial section scanning electron microscopy (S3EM) on silicon wafers for ultra-structural volume imaging of cells and tissues. PLoS One. 7 (4), e35172(2012).
- Hayworth, K. J., et al. Imaging ATUM ultrathin section libraries with WaferMapper: A multi-scale approach to EM reconstruction of neural circuits. Front Neural Circuits. 8, 68(2014).
- Schalek, R., et al. Development of high-throughput, high-resolution 3D reconstruction of large-volume biological tissue using automated tape collection ultramicrotomy and scanning electron microscopy. Microsc Microanal. 17 (S2), 966-967 (2011).
- Kasthuri, N., et al. Saturated reconstruction of a volume of neocortex. Cell. 162 (3), 648-661 (2015).
- Fu, Z., et al. mEosEM withstands osmium staining and Epon embedding for super-resolution CLEM. Nat Methods. 17 (1), 55-58 (2020).
- Fan, H., et al. Optical multilayer interference tomography compatible with tape-based serial SEM for mesoscale neuroanatomy. ACS Photonics. 9 (1), 25-33 (2022).
- Hua, Y., Laserstein, P., Helmstaedter, M. Large-volume en-bloc staining for electron microscopy-based connectomics. Nat Commun. 6 (1), 7923(2015).
- Berger, D. R., Seung, H. S., Lichtman, J. W. VAST (volume annotation and segmentation tool): Efficient manual and semi-automatic labeling of large 3D image stacks. Front Neural Circuits. 12, 88(2018).
- Shannon, C. E. A mathematical theory of communication. Bell Syst Tech J. 27 (3), 379-423 (1948).
- Tsai, D. -Y., Lee, Y., Matsuyama, E. Information entropy measure for evaluation of image quality. J Digit Imaging. 21 (3), 338-347 (2008).
- Wang, T., et al. A convenient all-cell optical imaging method compatible with serial SEM for brain mapping. Brain Sci. 13 (5), 711(2023).
- Kuwajima, M., Mendenhall, J. M., Harris, K. M. Large-volume reconstruction of brain tissue from high-resolution serial section images acquired by SEM-based scanning transmission electron microscopy. Methods Mol Biol. 950, 253-273 (2013).
- Kislinger, G., et al. ATUM-Tomo: A multi-scale approach to cellular ultrastructure by combined volume scanning electron microscopy and electron tomography. eLife. 13, e90565(2024).
- Böhm, T., Felfer, P., Thiele, S. A modular and automated serial section collection system for ultramicrotomy and subsequent imaging. Microsc Microanal. 29 (1), 212-218 (2023).
- Wacker, I. U., et al. Multimodal hierarchical imaging of serial sections for finding specific cellular targets within large volumes. J Vis Exp. (133), e57059(2018).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
