Method Article

Wykrywanie sond fluorescencyjnych PCR Aspergillus Spp., Cryptococcus neoformans oraz Pneumocystis jirovecii

DOI:

10.3791/68819

⸱

May 8th, 2026

 ,  ,  ,  , 
1Clinical Laboratory, Foshan Sanshui District People's Hospital, 2Organization and Personnel Department and Neurology Department, Foshan Sanshui District People's Hospital

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiamy tutaj protokół badań klinicznych oparty na metodzie fluorescencyjnej sondy PCR do jednoczesnego wykrywania Aspergillus spp, Cryptococcus neoformans oraz Pneumocystis jirovecii.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten opisuje ustandaryzowaną procedurę jakościowego wykrywania Aspergillus spp., Cryptococcus neoformans i Pneumocystis jirovecii w klinicznych próbkach plwociny przy użyciu zestawu do wykrywania kwasów nukleinowych opartych na fluorescencyjnej sondzie PCR. Procedura obejmuje pobieranie próbek klinicznych, wstępne ukapnianie alkaliczne, automatyczną ekstrakcję kwasów nukleinowych oraz multipleksową detekcję PCR w czasie rzeczywistym. Aspergillus spp., C. neoformans i P. jirovecii są wykrywane za pomocą specyficznych dla celu sond fluorescencyjnych (odpowiednio kanały FAM, VIC i CY5), z wbudowaną wewnętrzną kontrolą (kanał ROX) dla zapewnienia jakości. Ważność testu i interpretacja wyników próby opierają się na określonych wartościach progu cyklu (Ct). Dodatnia kontrola musi wykazywać krzywe wzmacniania w kształcie litery S z Ct ≤ 33,7 we wszystkich kanałach, natomiast kontrola ujemna nie musi wykazywać wzmocnienia. W przypadku próbek klinicznych wartość Ct ≤ 33,7 w kanale FAM wskazuje na pozytywność dla Aspergillus spp., a wartość Ct ≤ 36 w kanale VIC lub CY5 wskazuje na pozytywność odpowiednio dla C. neoformans lub P. jirovecii.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Inwazyjne infekcje grzybiczne, takie jak te wywoływane przez Aspergillus spp., Cryptococcus neoformans oraz Pneumocystis jirovecii, stanowią poważne zagrożenie dla pacjentów z obniżoną odpornością, prowadząc do wysokiej zachorowalności i śmiertelności. Terminowa i precyzyjna diagnoza jest kluczowa dla rozpoczęcia odpowiedniej terapii przeciwgrzybiczej i poprawy wyników klinicznych1. Konwencjonalne metody diagnostyczne, w tym hodowla, mikroskopia i detekcja antygenów, mają istotne ograniczenia. Hodowla jest czasochłonna i wykazuje niską czułość, mikroskopia nie pozwala na identyfikację gatunkową i zależy od operatora, ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wykorzystanie próbek klinicznych zostało zatwierdzone przez odpowiednią komisję etyczną (Nr zatwierdzenia: ZYS-GCP-2025006). Wszyscy uczestnicy wyrazili szeroką świadomą zgodę na wykorzystanie swoich danych i próbek w badaniach. Wszystkie odczynniki i materiały zużywalne używane w tym protokole są wymienione w tabelimateriałów T.

1. Zbieranie próbek

  1. Pobierz 3–5 ml plwociny lub płynu płukania oskrzelowo-pęcherzykowego w sterylnych pojemnikach i niezwłocznie przekaż do badań.

2. Przygotowanie odczynnika

UWAGA: Te kroki z....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Reprezentatywne krzywe amplifikacyjne uzyskane za pomocą tego multipleksowego testu fluorescencyjnego PCR są przedstawione na Rysunku 1 i Rysunku 2. Ważność testu była ustalana na podstawie wcześniej określonych kryteriów kontrolnych. W prawidłowym przebiegu dodatnia kontrola generowała charakterystyczne krzywe wzmacniające w kształcie litery S w kanałach FAM, VIC, CY5 i ROX, z wartościami progu cyklu (Ct) ≤ 33,7 we wszystkich kanałach detekcji (

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół PCR multipleksu w czasie rzeczywistym opracowany w tym badaniu zapewnia ustandaryzowaną procedurę jednoczesnego i szybkiego wykrywania trzech kluczowych inwazyjnych patogenów grzybowych (Aspergillus spp., Cryptococcus neoformans i Pneumocystis jirovecii) w klinicznych próbkach plwociny. Metoda ta umożliwia bezpośrednie wykrywanie DNA patogena na podstawie próbek klinicznych. W przeciwieństwie do tradycyjnych metod diagnostycznych, takich jak hodowla, mikroskopia czy testy antygenów serologicznych, ta metoda mole.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają żadnych konfliktów interesów do zgłoszenia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chcielibyśmy podziękować Działowi Laboratoriów Klinicznych w Szpitalu Ludowym Dystryktu Shanshui w Foshan za zapewnienie sprzętu i wsparcia technicznego.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
10 μ Sterylne końcówki pipety z filtrem L (z rozciąganiem)Xiaorui BiotechnologyS20221126
1000 i mu; Końcówki do sterylnych pipetek LJiangsu Xinkang Medical Instrument Co.,Ltd241101
200 μ Sterylne końcówki pipety z rozszerzonym filtrem LXiaorui Biotechnology241001
Rurki lizyzoweBeijing ZC Bio-Science & Technology CoF1040
Zestaw do wykrywania kwasów nukleinowych dla Aspergillus spp, Cryptococcus neoformans oraz Pneumocystis jiroveciiBeijing ZC Bio-Science & Firma technologicznaCT8143-48T
Odczynnik do ekstrakcji kwasów nukleinowychBeijing ZC Bio-Science & Technology CoCN8053-B40T
Bufor rozcieńczania próbkiBeijing ZC Bio-Science & Technology CoSP7065

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Morrissey, C. O., et al. Aspergillus fumigatus—a systematic review to inform the World Health Organization priority list of fungal pathogens. Med Mycol. 62 (6), 6(2024).
  2. Higuchi, R., Fockler, C., Dollinger, G., Watson, R.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

PCR DetectionFluorescent ProbeAspergillus SppCryptococcus NeoformansPneumocystis JiroveciiMultiplex Real Time PCRNucleic Acid ExtractionClinical Sputum SamplesCycle ThresholdInternal Control

Related Articles