Method Article

Wykrywanie sond fluorescencyjnych PCR Aspergillus Spp., Cryptococcus neoformans oraz Pneumocystis jirovecii

DOI:

10.3791/68819

⸱

May 8th, 2026

 ,  ,  ,  , 
1Clinical Laboratory, Foshan Sanshui District People's Hospital, 2Organization and Personnel Department and Neurology Department, Foshan Sanshui District People's Hospital

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiamy tutaj protokół badań klinicznych oparty na metodzie fluorescencyjnej sondy PCR do jednoczesnego wykrywania Aspergillus spp, Cryptococcus neoformans oraz Pneumocystis jirovecii.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten opisuje ustandaryzowaną procedurę jakościowego wykrywania Aspergillus spp., Cryptococcus neoformans i Pneumocystis jirovecii w klinicznych próbkach plwociny przy użyciu zestawu do wykrywania kwasów nukleinowych opartych na fluorescencyjnej sondzie PCR. Procedura obejmuje pobieranie próbek klinicznych, wstępne ukapnianie alkaliczne, automatyczną ekstrakcję kwasów nukleinowych oraz multipleksową detekcję PCR w czasie rzeczywistym. Aspergillus spp., C. neoformans i P. jirovecii są wykrywane za pomocą specyficznych dla celu sond fluorescencyjnych (odpowiednio kanały FAM, VIC i CY5), z wbudowaną wewnętrzną kontrolą (kanał ROX) dla zapewnienia jakości. Ważność testu i interpretacja wyników próby opierają się na określonych wartościach progu cyklu (Ct). Dodatnia kontrola musi wykazywać krzywe wzmacniania w kształcie litery S z Ct ≤ 33,7 we wszystkich kanałach, natomiast kontrola ujemna nie musi wykazywać wzmocnienia. W przypadku próbek klinicznych wartość Ct ≤ 33,7 w kanale FAM wskazuje na pozytywność dla Aspergillus spp., a wartość Ct ≤ 36 w kanale VIC lub CY5 wskazuje na pozytywność odpowiednio dla C. neoformans lub P. jirovecii.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Inwazyjne infekcje grzybiczne, takie jak te wywoływane przez Aspergillus spp., Cryptococcus neoformans oraz Pneumocystis jirovecii, stanowią poważne zagrożenie dla pacjentów z obniżoną odpornością, prowadząc do wysokiej zachorowalności i śmiertelności. Terminowa i precyzyjna diagnoza jest kluczowa dla rozpoczęcia odpowiedniej terapii przeciwgrzybiczej i poprawy wyników klinicznych1. Konwencjonalne metody diagnostyczne, w tym hodowla, mikroskopia i detekcja antygenów, mają istotne ograniczenia. Hodowla jest czasochłonna i wykazuje niską czułość, mikroskopia nie pozwala na identyfikację gatunkową i zależy od operatora, podczas gdy testy antygenowe (np. galaktomannan, β-D-glukan) mogą wykazywać reaktywność krzyżową i niespójne działanie. Diagnostyka molekularna, szczególnie PCR w czasie rzeczywistym, może wypełnić niektóre z tych luk, oferując szybsze czasy realizacji oraz potencjał wysokiej czułości i swoistości. Postępy w multipleksowym PCR umożliwiają jednoczesne wykrywanie wielu patogenów z jednej próbki, poprawiając efektywność diagnostyki.

Protokół ten opisuje multipleksowy fluorescencjonujący test PCR do jakościowego wykrywania DNA z Aspergillus spp., C. neoformans i P. jirovecii w próbkach plwociny ludzkiej poprzez celowanie w konserwowane obszary genu 18S rRNA (Aspergillus spp.), genu ITS (C. neoformans) oraz genu mtLSU rRNA (P. jirovecii). Kluczowe cechy tej metody to zdefiniowana czułość analityczna: granica wykrywania dla Aspergillus spp., C. neoformans i P. jirovecii wynosi 1 500 kopii/mL; Specyficzność skrętności zapalnika/sondy: zapalniki i sondy specyficzne dla celu minimalizują reakcję krzyżową z ludzkim DNA lub inną powszechną florą; Solidna kontrola zanieczyszczeń: zastosowanie systemów dUTP-UDG (glikozylaza uracelo-DNA) skutecznie zapobiega przenoszeniu zanieczyszczeń z wcześniejszych amplikonów PCR, co jest kluczową cechą dla utrzymania wiarygodności testu w środowisku laboratoryjnym2; Zintegrowana kontrola procesu: endogenna kontrola wewnętrzna skierowana na ludzki gen RP (białko rybosomalne), znakowany fluoroforem ROX, jest współamplifikowana w celu monitorowania integralności ekstrakcji kwasów nukleinowych i identyfikacji potencjalnej inhibicji PCR, co zmniejsza liczbę fałszywie ujemnychwyników 3. Podejście to jest wspierane przez ustalone wytyczne dotyczące zapewnienia jakości w diagnostyce molekularnej 4,5. Protokół ten ma zastosowanie głównie do próbek oddechowych (plwocina/BALF) z grup wysokiego ryzyka, takich jak pacjenci hematologiczno-onkologiczni lub biorcy przeszczepów. Omawiane są również potencjalne ograniczenia, w tym fałszywie pozytywne wyniki spowodowane skażeniem środowiska lub obniżoną czułość spowodowaną nadmiernym rozcieńczeniem próbki, a także strategie ograniczania efektów.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wykorzystanie próbek klinicznych zostało zatwierdzone przez odpowiednią komisję etyczną (Nr zatwierdzenia: ZYS-GCP-2025006). Wszyscy uczestnicy wyrazili szeroką świadomą zgodę na wykorzystanie swoich danych i próbek w badaniach. Wszystkie odczynniki i materiały zużywalne używane w tym protokole są wymienione w tabelimateriałów T.

1. Zbieranie próbek

  1. Pobierz 3–5 ml plwociny lub płynu płukania oskrzelowo-pęcherzykowego w sterylnych pojemnikach i niezwłocznie przekaż do badań.

2. Przygotowanie odczynnika

UWAGA: Te kroki zostały wykonane w pomieszczeniu do przygotowania odczynników.

  1. Wyjmij zestaw detekcyjny z zamrażarki o temperaturze -28 °C i rozmroź całkowicie w temperaturze pokojowej (25–30 °C) przez 30 minut.
  2. Oblicz łączną liczbę reakcji (N): N = liczba próbek testowych (n) + kontrolę dodatnią/ujemną (2) + 1
  3. Przygotuj mieszankę reakcyjną w sterylnej mikrowirówce. Dla pojedynczej reakcji: 35 μL mieszanki amplifikacyjnej kwasu nukleinowego + 5 μL mieszanki zapalno-sondowej, dokładnie przeszukaj wiry i krótko wiruj.
  4. Zachowaj 40 μL mieszanki reakcyjnej do każdej probówki PCR (zgodnie z protokołem producenta zestawu) i przelej do okna przejściowego w pomieszczeniu do przetwarzania próbek.

3. Przetwarzanie próbek

UWAGA: Te kroki zostały wykonane w Sali Przetwarzania Próbek. Utylizacja odpadów: Z etapu 3.2.2 wyrzuć supernatant oraz inne ciekłe odpady zawierające NaOH do wyznaczonego pojemnika na odpady chemiczne.

  1. Upłynnienie
    1. Dodaj płyn do płukania plwociny/oskrzelowo-pęcheolowego (BALF) do rurki z nakrętką 50 mL.
    2. Dodaj 1–2 objętości roztworu trawienia NaOH o stężeniu 4% (w stosunku do lepkości plwociny).
      UWAGA: NaOH jest żrący. Unikaj kontaktu ze skórą i oczami.
    3. Dokręć pokrywkę, zacznij w wirze przez 1 minutę i inkubuj w szafce zabezpieczającej w temperaturze pokojowej przez 15–20 minut.
  2. Wzbogacanie
    1. Wirówka ukapniała próbki z prędkością 3000 obr./min przez 5 minut.
    2. Odrzucając supernatant pipetą, zatrzymując 1 000 μL osadu.
    3. Dokładnie przeszukaj osad.
  3. Liza
    1. Przenieś 500 μL osadu do rurki lizy. Wiruj przez 10 minut i krótko wiruj.
  4. Ekstrakcja
    UWAGA: Utylizacja odpadów: Zużyte płytki, końcówki i probówki do wydobycia próbek biologicznych muszą być wyrzucane do zatwierdzonego pojemnika na odpady biologiczne.
    1. Przenieś cały nadmiar lizatu oraz 100 μL kontroli ujemnej/dodatniej do kolumny 2 płytki ekstrakcyjnej.
    2. Ekstracja kwasów nukleinowych wykonuje się przy użyciu zautomatyzowanego systemu ekstrakcji kwasów nukleinowych z wyznaczonym programem6.
  5. Ładowanie próbek
    1. Przelej 10 μL ekstraktowanego kwasu nukleinowego (kolumna 6) i sterów do rurek PCR. Krótko wiruj i przenieś do okna przejściowego w pomieszczeniu wzmacniającym.

4. Amplifikacja kwasów nukleinowych

UWAGA: Te kroki zostały wykonane w Sali Wzmacniającej.

  1. Załaduj lampy PCR do automatycznego instrumentu wzmacniającego jądrów i wybierz odpowiedni szablon wzmacniający.
  2. Przypisz kanały detekcyjne: Aspergillus spp.: kanał FAM; C. neoformans: kanał VIC; P. jirovecii: kanał CY5; Kontrola wewnętrzna: kanałyROX 7, 8, 9.
  3. Ustaw nazwy próbek i uruchom program.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Reprezentatywne krzywe amplifikacyjne uzyskane za pomocą tego multipleksowego testu fluorescencyjnego PCR są przedstawione na Rysunku 1 i Rysunku 2. Ważność testu była ustalana na podstawie wcześniej określonych kryteriów kontrolnych. W prawidłowym przebiegu dodatnia kontrola generowała charakterystyczne krzywe wzmacniające w kształcie litery S w kanałach FAM, VIC, CY5 i ROX, z wartościami progu cyklu (Ct) ≤ 33,7 we wszystkich kanałach detekcji (

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół PCR multipleksu w czasie rzeczywistym opracowany w tym badaniu zapewnia ustandaryzowaną procedurę jednoczesnego i szybkiego wykrywania trzech kluczowych inwazyjnych patogenów grzybowych (Aspergillus spp., Cryptococcus neoformans i Pneumocystis jirovecii) w klinicznych próbkach plwociny. Metoda ta umożliwia bezpośrednie wykrywanie DNA patogena na podstawie próbek klinicznych. W przeciwieństwie do tradycyjnych metod diagnostycznych, takich jak hodowla, mikroskopia czy testy antygenów serologicznych, ta metoda mole...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają żadnych konfliktów interesów do zgłoszenia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chcielibyśmy podziękować Działowi Laboratoriów Klinicznych w Szpitalu Ludowym Dystryktu Shanshui w Foshan za zapewnienie sprzętu i wsparcia technicznego.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
10 μ Sterylne końcówki pipety z filtrem L (z rozciąganiem)Xiaorui BiotechnologyS20221126
1000 i mu; Końcówki do sterylnych pipetek LJiangsu Xinkang Medical Instrument Co.,Ltd241101
200 μ Sterylne końcówki pipety z rozszerzonym filtrem LXiaorui Biotechnology241001
Rurki lizyzoweBeijing ZC Bio-Science & Technology CoF1040
Zestaw do wykrywania kwasów nukleinowych dla Aspergillus spp, Cryptococcus neoformans oraz Pneumocystis jiroveciiBeijing ZC Bio-Science & Firma technologicznaCT8143-48T
Odczynnik do ekstrakcji kwasów nukleinowychBeijing ZC Bio-Science & Technology CoCN8053-B40T
Bufor rozcieńczania próbkiBeijing ZC Bio-Science & Technology CoSP7065

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Morrissey, C. O., et al. Aspergillus fumigatus—a systematic review to inform the World Health Organization priority list of fungal pathogens. Med Mycol. 62 (6), 6(2024).
  2. Higuchi, R., Fockler, C., Dollinger, G., Watson, R. Kinetic PCR analysis: real-time monitoring of DNA amplification reactions. Biotechnology (N Y). 11 (9), 1026-1030 (1993).
  3. Longo, M. C., Berninger, M. S., Hartley, J. L. Use of uracil DNA glycosylase to control carry-over contamination in PCR. Gene. 93 (1), 125-128 (1990).
  4. Vandesompele, J., et al. Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes. Genome Biol. 3 (7), research0034.1-research0034.12 (2002).
  5. Bustin, S. A., et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clin Chem. 55 (4), 611-622 (2009).
  6. Boom, R., et al. Rapid and simple method for purification of nucleic acids. J Clin Microbiol. 28 (3), 495-503 (1990).
  7. Loeffler, J., et al. Quantification of fungal DNA by using fluorescence resonance energy transfer and the LightCycler system. J Clin Microbiol. 38 (10), 3463-3466 (2000).
  8. Bovers, M., et al. Six monophyletic lineages identified within Cryptococcus neoformans and Cryptococcus gattii by multi-locus sequence typing. Fungal Genet Biol. 43 (5), 353-359 (2008).
  9. Wakefield, A. E., et al. Detection of Pneumocystis carinii with DNA amplification. Lancet. 336 (8726), 751-753 (1990).
  10. Schrader, C., et al. PCR inhibitors—occurrence, properties and removal. J Appl Microbiol. 113 (5), 1014-1026 (2012).
  11. White, T. J., et al. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications. Innis, M. A., Gelfand, D. H., Sninsky, J. J., White, J. J. , Academic Press. 315-322 (1990).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

PCR DetectionFluorescent ProbeAspergillus SppCryptococcus NeoformansPneumocystis JiroveciiMultiplex Real Time PCRNucleic Acid ExtractionClinical Sputum SamplesCycle ThresholdInternal Control

Related Articles