Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Badanie mechanizmu modulacji LINC00511 za pośrednictwem β-elemenu w celu tłumienia oporności na cisplatynę w raku płuc

654 wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/68825

⸱

19 sierpnia 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Pharmacy, Changchun University of Traditional Chinese Medicine, 2Health Care Department, The Affiliated Hospital to Changchun University of Chinese Medicine, 3Teaching Department, The Third Affiliated Clinical Hospital of Changchun University of Chinese Medicine, 4The Research Center of The Affiliated Hospital to Changchun University of Chinese Medicine, 5Northeast Asia Research Institute of Traditional Chinese Medicine, Changchun University of Chinese Medicine, 6Affiliated Hospital of Changchun University of Chinese Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Oporność na cisplatynę (DDP) ogranicza skuteczność chemioterapii w raku płuc. Badanie to miało na celu wyjaśnienie, w jaki sposób β-Elemen(β-Ele) odwraca oporność w komórkach A549 / DDP poprzez regulację w dół LINC00511. Analizy in vitro i sekwencje RNA wykazały, że regulacja ta hamuje glikolizę tlenową i sygnalizację Wnt/β-kateniny, oferując potencjalną strategię przezwyciężenia chemooporności.

Streszczenie

Oporność na cisplatynę znacznie ogranicza skuteczność chemioterapii w niedrobnokomórkowym raku płuca, co wymaga opracowania nowych strategii pokonania tej bariery. To badanie in vitro miało na celu wyjaśnienie mechanizmu, za pomocą którego β-Ele odwraca oporność na cisplatynę w komórkach gruczolakoraka płuc za pośrednictwem glikolizy LINC00511 i szlaków sygnałowych Wnt/β-kateniny. Oporna na cisplatynę ludzka linia komórkowa gruczolakoraka płuc (A549/DDP), z nadekspresją LINC00511 lub knockdownem, została utworzona poprzez transfekcję plazmidu. Skuteczność transfekcji oceniano za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy odwrotnej transkryptazy (qRT-PCR) w celu wykrycia poziomów ekspresji LINC00511. Ocena za pomocą testu 5-etynylo-2'-deoksyurydyny (EdU) wykazała znaczące hamowanie proliferacji komórek A549 / DDP za pośrednictwem β-Ele. Dalsza analiza sekwencji RNA wykazała, że hamujący wpływ β-elemenu na oporność na cisplatynę był ściśle związany z zakłóceniem glikolizy komórkowej i supresją aktywacji szlaku sygnałowego Wnt / β-kateniny. Analiza Western blot kluczowych białek, w tym transportera glukozy 1 (GLUT1), kinazy pirogronianowej M2 (PKM2), dehydrogenazy mleczanowej A (LDHA), β-kateniny i kinazy syntazy glikogenu 3β (GSK-3β), wykazała, że β-elemene odwraca oporność na cisplatynę poprzez hamowanie glikolizy tlenowej i blokowanie aktywacji szlaku sygnałowego Wnt / β-kateniny poprzez regulację w dół LINC00511. Podsumowując, wyniki te pokazują, że β-elemene pokonuje oporność na cisplatynę w raku płuc poprzez celowanie w LINC00511 i związany z nią szlak glikolizy tlenowej / Wnt / β-kateniny. W ten sposób ustanawia się ramy teoretyczne dla przyszłych badań przedklinicznych i klinicznych, ujawniając jednocześnie potencjalne cele terapeutyczne.

Wprowadzenie

Wśród nowotworów złośliwych na całym świecie rak płuc wykazuje wyjątkowo wysoką częstość występowania i śmiertelność, charakteryzującą się złośliwą transformacją i inwazyjnym wzrostem komórek nabłonka oskrzeli 1,2. Na podstawie cech histopatologicznych rak płuc jest klasyfikowany jako rak niedrobnokomórkowy (NSCLC) lub rak drobnokomórkowy (SCLC)3. Warto wspomnieć, że NSCLC stanowi około 85% wszystkich przypadków raka płuc 4,5. Jako standard chemioterapeutyczny pierwszego rzutu w leczeniu niedrobnokomórkowego raka płuca, cisplatyna (DDP) jest klinicznie niezbędna6. Jednak obserwacje kliniczne wykazały, że komórki nowotworowe mogą rozwijać oporność na leki poprzez wiele mechanizmów, głównie obejmujących aktywację szlaków ucieczki immunologicznej, mutacje w genach docelowych leków i rozregulowanie szlaków metabolizmu leków 7,8,9.

Długie niekodujące RNA (lncRNA) reprezentują transkrypty > 200 nukleotydów (nt), które nie mają zdolności kodowania białek10. Coraz więcej dowodów wskazuje, że lncRNA może odwrócić oporność na cisplatynę w komórkach nowotworowych poprzez wiele mechanizmów, takich jak funkcjonowanie jako konkurencyjne endogenne RNA (ceRNA) do gąbczastych miRNA i uwalnianie ich docelowych genów11, modulowanie szlaków sygnałowych apoptozy12, udział w naprawie uszkodzeń DNA13 i regulacja autofagii komórkowej14. Co więcej, wraz z postępem badań nad przeprogramowaniem metabolicznym nowotworów, pojawiły się istotne dowody wskazujące, że lncRNA odgrywa kluczową rolę regulacyjną w tym procesie. Efekt Warburga, oznaczający glikolizę tlenową, stanowi podstawową cechę metaboliczną komórek nowotworowych15. Nie tylko dostarcza energii do szybkiej proliferacji komórek, ale także generuje metabolity pośrednie, które służą jako prekursory biosyntezy, wspierając syntezę białek i lipidów w celu zaspokojenia wymagań wzrostu nowotworówzłośliwych 16. W raku płuc potwierdzono, że lncRNA znacząco wpływa na progresję guza i oporność na chemioterapię poprzez regulację szlaku glikolizy tlenowej 17,18.

Wśród nich LINC00511, szeroko badana cząsteczka lncRNA w ostatnich latach, została uznana za ściśle związaną z inicjacją i rozwojem różnych nowotworów złośliwych19. Odkrycia te nie tylko wyjaśniają specyficzne mechanizmy udziału lncRNA w przeprogramowaniu metabolicznym guza, ale także stanowią teoretyczną podstawę dla strategii leczenia nowotworów ukierunkowanych na lncRNA, otwierając potencjalne ścieżki terapeutyczne.

Pochodzący z kłączy Curcuma zedoaria, β-Ele jest bioaktywnym seskwiterpenoidem o ustalonej skuteczności przeciwnowotworowej. Nasze poprzednie badania wykazały, że β-Ele służy jako selektywny inhibitor szlaku sygnałowego PI3K/Akt/mTOR i wywołuje efekt synergistyczny z cisplatyną poprzez celowanie w metabolizm guza. Znacząco zahamował wzrost guza w mysim ksenoprzeszczepie NDRP model20. Późniejsze badania wykazują zdolność β-Ele do tłumienia glikolizy tlenowej w komórkach NSCLC poprzez modulację osi sygnalizacyjnej miR-301a-3p/AMPKα, co skutkuje wynikami onkostatycznymi21. Na podstawie naszych wcześniejszych ustaleń potwierdziliśmy, że LINC00511 osłabia oporność na cisplatynę w raku płuc; Niemniej jednak dokładny molekularny mechanizm działania pozostaje w pełni wyjaśniony.

Biorąc pod uwagę kluczową rolę glikolizy tlenowej w przeprogramowaniu metabolicznym guza oraz krytyczną rolę LINC00511 w rozwoju i progresji guza, badanie to ma na celu zbadanie, czy β-Ele może odwrócić oporność na cisplatynę w raku płuc poprzez modulację szlaku glikolizy tlenowej za pośrednictwem LINC00511.

Wcześniejsze dowody wskazują, że β-Ele może odwrócić oporność na cisplatynę i wzmocnić jej działanie przeciwnowotworowe poprzez aktywację szlaków apoptotycznych22, regulację wydzielania egzosomów23 i zatrzymanie cyklu komórkowego24. Jednak te znane mechanizmy zazwyczaj wykazują szerokie efekty i brakuje im precyzyjnej regulacji określonych celów molekularnych, co ogranicza ich kliniczną przekładalność. W związku z tym istnieje pilna potrzeba zbadania nowych strategii, które są bardziej ukierunkowane, mają dobrze zdefiniowane mechanizmy i wykazują duży potencjał w zakresie przekładu klinicznego w celu przezwyciężenia oporności na cisplatynę. W przeciwieństwie do wcześniejszych badań podkreślających natychmiastowe działanie biologiczne β-Ele, badanie to charakteryzuje wpływ β-Ele na metabolizm Warburga i szlak sygnałowy Wnt / β-kateniny w komórkach A549 / DDP poprzez regulację szlaków molekularnych za pośrednictwem lncRNA, mając na celu wyjaśnienie nowego mechanizmu leżącego u podstaw odwrócenia chemosensytyzacji w raku płuc. Artykuł ten nie tylko odkrywa nowe podejście β-Ele do odwrócenia chemooporności poprzez celowanie w lncRNA, ale także zapewnia świeże podstawy teoretyczne i potencjalne cele interwencji w klinicznym leczeniu raka płuc. Odkrycia te, dzięki szczegółowemu wyjaśnieniu specyficznego celu molekularnego (LINC00511) i kluczowych szlaków sygnałowych (Warburg i Wnt/β-katenina), wykazują znacznie zwiększony kliniczny potencjał translacyjny. Oczekuje się, że zapewnią one solidną podstawę naukową do poprawy wrażliwości na chemioterapię u pacjentów z rakiem płuca i poprawy jakości ich życia, a także do przyspieszenia rozwoju precyzyjnych strategii leczenia raka płuc.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Przygotowanie rozpuszczalnika

  1. Przygotowanie roztworu pożywki dla komórek A549/DDP: Hodować komórki A549/DDP w pełnej pożywce Ham's F-12K (szczegóły w Tabeli materiałów), uzupełnionej o 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS, szczegóły w Tabeli materiałów), 1% roztwór penicyliny-streptomycyny (P/S, szczegóły w Tabeli materiałów) oraz 2 μg/mL cisplatyny (DDP, szczegóły w Tabeli materiałów).
    1. Przygotowanie pełnego roztworu pożywki: Przygotować pełny roztwór pożywki, dodając 50 mL FBS i 5 mL P/S do 500 mL pożywki Ham's F-12K, a następnie dokładnie wymieszać.
    2. Przygotowanie pełnego roztworu pożywki z cisplatyną: Odważyć 1 mg proszku cisplatyny (DDP, szczegóły w Tabeli materiałów) i rozpuścić go w 1 mL wody podwójnie destylowanej (ddH2O>), aby przygotować roztwór zapasowy. Dodać 200 μL roztworu zapasowego do 100 mL pełnej pożywki (przygotowanej zgodnie z krokiem 1.1.1) i dokładnie wymieszać, aby przygotować roztwór roboczy pełnej pożywki zawierający 2 μg/mL cisplatyny.
      UWAGA: Ponieważ cisplatyna jest substancją cytotoksyczną, wszystkie procedury należy przeprowadzać w dygestorium lub komorze bezpieczeństwa biologicznego, stosując środki ochrony osobistej, takie jak rękawiczki, fartuchy laboratoryjne i okulary ochronne.
  2. Roztwór do podawania β-Ele: Stężenie leku zastosowane w niniejszym badaniu oparto na wynikach wcześniejszych eksperymentów przeprowadzonych przez nasz zespół badawczy20,21. Rozpuścić 1 mg β-Ele (szczegóły w Tabeli materiałów) w 20 μL dimetylosulfotlenku (DMSO, szczegóły w Tabeli materiałów), aby przygotować roztwór zapasowy. Rozcieńczyć roztwór zapasowy do objętości 25 mL za pomocą pełnej pożywki, aby otrzymać roztwór roboczy β-Ele o stężeniu 40 μg/mL.
    UWAGA: Ponieważ DMSO może zwiększać wchłanianie innych substancji przez skórę, wszystkie etapy operacyjne należy przeprowadzać w dygestorium lub komorze bezpieczeństwa biologicznego, stosując środki ochrony osobistej, takie jak rękawiczki, odzież laboratoryjna i okulary ochronne.

2. Hodowla komórek 

  1. W badaniu wykorzystano linię komórkową gruczolaka płuca człowieka oporną na cisplatynę (A549/DDP, Procell, szczegóły w Tabeli Materiałów). Należy potwierdzić, że linia ta została zidentyfikowana za pomocą analizy krótkich tandemowych powtórzeń (STR) i pomyślnie dopasowana do standardowych linii w ATCC oraz innych bazach danych.
    1. W celu przeprowadzenia analizy STR należy zebrać około 1 x 106 komórek i wyekstrahować genomowe DNA przy użyciu komercyjnego zestawu do ekstrakcji DNA (szczegóły w Tabeli Materiałów).
    2. Należy zastosować zwalidowany system multipleksowy STR odpowiedni do typowania DNA w celu amplifikacji 20 loci STR wraz z locusem określającym płeć. Amplifikację PCR należy przeprowadzić w następujących warunkach cyklu termicznego: denaturacja wstępna w 95 °C przez 2 min, następnie 29 cykli obejmujących denaturację w 94 °C przez 30 s, przyłączanie w 59 °C przez 45 s oraz elongację w 72 °C przez 45 s, z końcowym etapem elongacji w 72 °C przez 10 min.
    3. Otrzymane produkty PCR należy analizować za pomocą elektroforezy kapilarnej przy użyciu automatycznego analizatora genetycznego zgodnie z instrukcjami producenta. W tym przypadku typowanie alleli przeprowadzono za pomocą oprogramowania do analizy fragmentów (szczegóły w Tabeli Materiałów), przy progu detekcji piku ustawionym na 150 względnych jednostek fluorescencji (RFU).
      UWAGA: Wygenerowany profil STR dla 20 loci porównano z profilami referencyjnymi linii komórkowych A549/DDP dostępnymi w publicznych bazach danych. Stopień dopasowania przekraczający 80% uznano za dowód homologii. Brak obcych pików allelowych dodatkowo potwierdził brak kontaminacji krzyżowej.
  2. Komórki należy wyłowić z ciekłego azotu i umieścić w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C w celu szybkiego rozmrożenia, aż ciecz całkowicie się rozpuści. Zawiesinę komórkową należy przenieść do probówki wiriówkowej o pojemności 5 mL, dodać dwie objętości pełnej pożywki i delikatnie resuspendować mieszaninę. Po wirowaniu (358 × g, 5 min, temperatura pokojowa) należy ostrożnie odpić supernatant.
    UWAGA: Podczas korzystania z probówek do krio konserwacji komórek wyjmowanych z ciekłego azotu należy nosić rękawice ochronne przeciw zamrożeniu oraz gogle lub maskę ochronną i nie kierować ust otworem probówki w stronę twarzy.
  3. Osad komórkowy należy resuspendować w 1 mL pełnej pożywki poprzez delikatne pipetowanie, a następnie rozcieńczyć zawiesinę do 10 mL, dodając 9 mL pełnej pożywki. Komórki należy wysiać do szalek hodowlanych o średnicy 100 mm i inkubować w inkubatorze (szczegóły w Tabeli Materiałów) w temperaturze 37 °C i 5% CO2. Stosunek pasażowania komórek utrzymywano w zakresie od 1:2 do 1:3.
    UWAGA: Cisplatyna jest cytotoksycznym chemioterapeutykiem platynowym. W tej metodzie komórki A549/DDP są hodowane w pożywce zawierającej cisplatynę. W związku z tym zużytą pożywkę hodowlaną zawierającą cisplatynę należy zbierać do specjalnego pojemnika na odpady ciekłe i regularnie przekazywać wyspecjalizowanej firmie utylizacyjnej w celu profesjonalnej utylizacji odpadów niebezpiecznych.

3. Transfekcja plazmidowa 

  1. Do transfekcji komórek wykorzystaj konstrukt plazmidowy do nadekspresji LINC00511 oraz specyficzne dla genu siRNA nakierowane na LINC00511 (gene ID: 400619; transcript ID: NR_033876.1). Sekwencje zastosowanych siRNA znajdują się w Tabeli 1.
 sekwencje siRNA
NazwaSens 5'-3'Antysens 5'-3'
LINC00511-Homo-1625
CAGCUGUGAACUUCCUUUATT
UAAAGGAAGUUCACAGCUGTT

Tabela 1: Lista sekwencji siRNA

  1. Losowo wybrać komórki A549/DDP, które po reanimacji zostały poddane pasażowaniu do trzeciego pokolenia, a następnie wysiać je równomiernie do płytek 6-dołkowych z gęstością 1 x 105 komórek/dołek. Każdy dołek został ponumerowany losowo, a następnie przypisano je do grup eksperymentalnych na podstawie tych liczb losowych.
  2. Przeprowadź transfekcję komórek przy użyciu odczynnika do transfekcji (patrz Tabela materiałów (szczegóły patrz.) w momencie, gdy ich gęstość osiągnie około 70%.
    1. Przygotować roztwór do transfekcji siRNA.
      1. Wymieszać 250 μL zoptymalizowanej minimalnej esencjalnej pożywki (Opti-MEM, patrz Tabela materiałów (po szczegóły) z 5 μL odczynnika do transfekcji, delikatnie wymieszać na wortexie 3–5 razy w celu zapewnienia homogeniczności, a następnie inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 min.
      2. Rozcieńczyć 5 μL siRNA (50 nM) w 250 μL do Opti-MEM, delikatnie wymieszaj na wortexie 3–5 razy do pełnego połączenia. Połącz rozcieńczony odczyn do transfekcji z roztworem siRNA i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 20 min w celu utworzenia kompleksów transfekcyjnych siRNA.
    2. Przygotuj roztwór do transfekcji plazmidowej.
      1. Wymieszać 250 μL medium Opti-MEM z 5 μL odczynnika do transfekcji, delikatnie wymieszać w wstrząsarce wirowej (vortex) 3–5 razy w celu zapewnienia homogeniczności, a następnie inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 min.
      2. Rozcieńczyć 2 μg plazmidu w 250 μL do medium Opti-MEM, delikatnie wymieszać na wortexie (3–5 razy), aby zapewnić dokładne połączenie składników. Połączyć rozcieńczony odczyn do transfekcji z roztworem plazmidu i inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 min w celu przygotowania roztworu do transfekcji plazmidem.
      3. Do płytek 6-dołkowych dodać odpowiednio roztwór do transfekcji siRNA oraz roztwór do transfekcji plazmidu. Dodać 1,500 μL pożywki kompletnej do każdej studni. Delikatnie wymieszaj zawartość płytek z komórkami przed i po dodaniu, aby zapewnić równomierne rozłożenie. Inkubuj płytki w temperaturze 37 °C, 5% CO22 przez 24 h po transfekcji przed przeprowadzeniem analizy.

4. Ocena wydajności transfekcji za pomocą ilościowej reakcji polimerazy łańcuchowej z odwrotną transkrypcją (qRT-PCR)

UWAGA: Komórki po 24 h od transfekcji przeprowadzonej w kroku 3.3 należy pobrać do analizy qRT-PCR zgodnie z poniższą procedurą. Wszystkie eksperymenty wykonano w trzech niezależnych powtórzeniach biologicznych (n = 3).

  1. Ekstrakcja RNA 
    1. Należy użyć zestawu do ekstrakcji ultrapure RNA (szczegóły w Tabeli materiałów). Medium z płytki 6-dołkowej należy usunąć zgodnie z instrukcją zestawu, a następnie przemyć komórki PBS. Następnie do każdego dołka należy dodać 500 μL roztworu reagentu lizującego na bazie fenolu i guanidyny, delikatnie podwiewać komórki końcówką pipety w celu ich całkowitego zawieszenia i przenieść mieszaninę do probówki do wirowania. Próbkę należy pozostawić na 5 min, aby zapewnić całkowitą lizę komórek.
    2.  Należy dodać 100 μL reagentu lizującego izotiocyjanian fenolo-guanidynowy, energicznie wstrząsać przez 15 s i pozostawić na 2 min w temperaturze pokojowej. Na koniec należy ostrożnie odpompować górną fazę wodną, przenieść ją do kolumny adsorpcyjnej i wirować przy 13 400 x g przez 10 min w temperaturze 4 °C.
    3. RNA wiąże się z membraną z żelu krzemionkowego. Następnie należy ją przemyć buforem RW1 i buforem RW2 w celu usunięcia białek. Następnie dodaje się DNazę I w celu trawienia pozostałego DNA i wykonuje wtórne płukanie buforem RW2, aby zapewnić całkowite usunięcie zanieczyszczeń. Na koniec próbki RNA zbiera się poprzez elucję RNA wodą wolną od RNaz i wirowanie przy 13 400 x g przez 1 min.
  2. Pomiar stężenia RNA.
    1. Każde 1,5 μL roztworu RNA z próbki należy umieścić w mikrodetektorze kwasów nukleinowych (szczegóły w Tabeli materiałów) i odczytać wartości A260/A280.
      UWAGA: Jeśli zmierzone wartości A260/A280 mieszczą się w zakresie od 1,8 do 2,0, a stężenie RNA wynosi od 20 ng/μL do 200 ng/μL, świadczy to o akceptowalnej jakości RNA, które może być wykorzystane w kolejnych eksperymentach.
    2. Na podstawie pomiarów należy rozcieńczyć roztwór RNA wodą z pirokarbonianem dwuetylowym (DEPC), aby zapewnić spójne stężenia RNA dla wszystkich próbek, przyjmując zmierzone minimalne stężenie RNA jako punkt odniesienia, a następnie przeprowadzić eksperymenty PCR.
  3. Transkrypcja odwrotna RNA
    1. Wyekstrahowany całkowity RNA należy wykorzystać jako matrycę i zsyntetyzować cDNA zgodnie z instrukcją zestawu do transkrypcji odwrotnej (szczegóły w Tabeli materiałów). Układ reakcyjny należy przygotować zgodnie z wymaganiami zestawu.
    2. Wyekstrahowany roztwór RNA oraz układ reakcyjny należy przenieść do probówek w pasku ośmiomiejscowym, ustawiając dwie replikacje dla każdej grupy. Reakcję należy rozpocząć zgodnie z następującymi warunkami: inkubacja przez 15 min w 37 °C, denaturacja termiczna przez 5 s w 85 °C oraz chłodzenie przez 5 min w 4 °C.
  4. Reakcja PCR
    1. Amplifikację PCR należy przeprowadzić w systemie ilościowego PCR z detekcją fluorescencyjną w czasie rzeczywistym (szczegóły w Tabeli materiałów), używając gotowej mieszaniny PCR master mix opartej na SYBR Green (szczegóły w Tabeli materiałów). Jako gen referencyjny należy zastosować GADPH, którego sekwencje starterów znajdują się w Tabeli 2. Mieszaninę reakcyjną należy przygotować w następujący sposób: do probówek w pasku ośmiomiejscowym należy kolejno dodać 0,4 μL odpowiedniego startera, 2 μL matrycy cDNA oraz mieszaninę reakcyjną, aby uzyskać końcową objętość reakcji.
    2. Przebieg amplifikacji PCR: 95 °C 30 s (1 cykl), 95 °C 5 s (40 cykli), 60 °C 20 s (40 cykli). Poziomy względnej ekspresji genów docelowych należy obliczyć metodą 2 -ΔΔCt25. Wszystkie eksperymenty należy powtórzyć niezależnie trzykrotnie, aby zapewnić wiarygodność danych.
      UWAGA: Odpady chemiczne powstające podczas procedur eksperymentalnych muszą być zbierane do wyznaczonych pojemników na odpady niebezpieczne i utylizowane przez certyfikowane służby zarządzania odpadami niebezpiecznymi zgodnie z polityką instytucji.
Sekwencje starterów
StarterSekwencja (5'-3')
human-LINC00511-FTTTCCCAGCACAGCTCAATC
human-LINC00511-RTCCCTTCTCCCTCGGTCA
GAPDH-FAATCCCATCACCATCTTCCA
GAPDH-RAAATGAGCCCCAGCCTTCT

Tabela 2: Sekwencje starterów do testów PCR

5. Detekcja EdU

  1. Ocenić wpływ zmienionej ekspresji LINC00511 na proliferację komórek A549/DDP przy użyciu zestawu do analizy EdU (szczegóły znajdują się w Tabeli materiałów).
    1. Losowo wybrać komórki A549/DDP, które zostały pasażowane do trzeciego pokolenia po reanimacji, i równomiernie zasiać je do płytek 24-dołkowych w gęstości 2 x 104 komórek/dołek.
      UWAGA: W tym przypadku wszystkie eksperymenty przeprowadzono w trzech niezależnych powtórzeniach biologicznych (n = 3).
    2. Losowo ponumerować każdy dołek i przypisać dołki do jednej z czterech grup eksperymentalnych na podstawie tych liczb losowych: grupy kontrolnej, grupy β-Ele, grupy z nadekspresją LINC00511 (β-Ele + OV-LINC00511) oraz grupy z wyciszeniem LINC00511 (β-Ele + si-LINC00511).
  2. Gdy gęstość komórek osiągnie około 70%, przeprowadzić transfekcję plazmidową i traktowanie interferencyjne zgodnie z krokiem 3.3. Po 24 h od transfekcji usunąć pierwotne medium i dodać do każdego dołka grupy traktowanej lekiem 1 mL roztworu medium zawierającego β-Ele (40 μg/mL).
  3. Po traktowaniu komórek 40 μg/mL β-Ele przez 24 h inkubować je z EdU w celu znakowania. Następnie utrwalić komórki 4% paraformaldehydem przez 10 min i poddać permeabilizacji 0,5% Tritonem X-100.
  4. W ciemności dodać roztwór do reakcji typu click (przygotowany przez rozpuszczenie jednej fiolki odczynnika Click Additive z zestawu w 1,3 mL wody dejonizowanej przy dokładnym wymieszaniu) i utrzymać reakcję w ciemności przez 30 min. Po zakończeniu reakcji przemyć komórki PBS, a następnie przeprowadzić barwienie Hoechst przez 5 min. Na koniec zaobserwować wyniki za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej (Rysunek 1 i Rysunek 2).
    UWAGA: DMSO jest cieczą wysoce przenikliwą i łatwopalną. W tym schemacie roztwór do podawania β-Ele zawiera DMSO. Dlatego po użyciu zebrać roztwór do podawania β-Ele do specjalnego pojemnika na odpady płynne i przekazać go firmie utylizującej odpady niebezpieczne w celu profesjonalnej utylizacji w regularnych odstępach czasu.

6. Oznaczanie zawartości glukozy 

UWAGA: Wszystkie eksperymenty przeprowadzono w trzech niezależnych powtórzeniach biologicznych (n = 3).

  1. Losowo wybrać komórki A549/DDP, które zostały przepasażowane do trzeciego pokolenia po reanimacji, i wysiać je równomiernie do płytek 6-dołkowych w gęstości 1 x 105 komórek/dołek. Ponumerować losowo każdy dołek i przypisać je do grup eksperymentalnych na podstawie tych liczb losowych.
  2. Gdy gęstość komórek osiągnie około 70%, przeprowadzić transfekcję plazmidową i interferencję zgodnie z opisem w kroku 3.3. Po 24 h od transfekcji poddać komórki w grupach traktowanych działaniu 40 μg/mL β-Ele.
  3. Po 24 h leczenia lekiem zebrać znad komórek górną pożywkę hodowlaną i odwirować ją przy 1000 × g przez 5 min. Zebrać nadsącz. Zgodnie z instrukcją do zestawu testowego do oznaczania glukozy (szczegóły w Tabeli Materiałów), przygotować roztwór reakcyjny i dokładnie wymieszać go z nadsączem.
  4. Przenieść próbki do płytek 96-dołkowych, stosując pięć powtórzeń na grupę. Delikatnie wstrząsnąć płytkami i inkubować je w temperaturze 37 °C przez 10 min. Zmierzyć absorbancję każdego dołka za pomocą czytnika mikro Tween przy długości fali 505 nm i obliczyć zawartość glukozy, korzystając z wzoru dostarczonego w zestawie testowym:
    Wzór na stężenie glukozy, stosowany w analizach biochemicznych i spektroskopii.
    Gdzie Cstandard = 5,55 mmol/L, N = czynnik rozcieńczenia.
    UWAGA: Odpady chemiczne powstające podczas procedur eksperymentalnych muszą być gromadzone w wyznaczonych pojemnikach na odpady niebezpieczne i utylizowane przez certyfikowane służby zarządzania odpadami niebezpiecznymi zgodnie z polityką instytucji.

7. Oznaczanie zawartości kwasu mlekowego 

UWAGA: Wszystkie eksperymenty przeprowadzono w trzech niezależnych powtórzeniach biologicznych (n = 3).

  1. Losowo wybrać komórki A549/DDP, które zostały pasażowane do trzeciego pokolenia po reanimacji, i jednorodnie zasiać je w płytkach 6-dołkowych (1 × 105 komórek/dołek). Losowo ponumerować każdy dołek i przypisać do nich grupy eksperymentalne na podstawie tych liczb. Gdy gęstość komórek osiągnie około 70%, przystąpić do transfekcji plazmidowej i interferencji zgodnie z opisem w kroku 3.3. 24 h po transfekcji potraktować komórki w grupach badawczych 40 μg/mL β-Ele.
  2. Po 24 h traktowania lekiem zebrać górną pożywkę hodowlaną z komórek i odwirować ją przy 1000 x g przez 5 min. Zebrać nadnadkład. Zgodnie z instrukcją do zestawu testowego kwasu mlekowego (szczegóły w Tabeli Materiałów), przygotować roztwór reakcyjny i dokładnie zmieszać go z nadnadkładem.
  3. Dodać łącznie 250 μL próbki do każdego dołka płytki 96-dołkowej, przygotowując pięć powtórzeń dla każdej grupy. Delikatnie wstrząsnąć płytką i inkubować w 37 °C przez 10 min. Zmierzyć absorbancję każdego dołka przy długości fali 530 nm za pomocą czytnika mikropłytek (szczegóły w Tabeli Materiałów) i obliczyć zawartość mleczanu, korzystając z formuły dostarczonej w zestawie testowym:
    Formuła obliczeniowa kwasu mlekowego; równanie absorbancji dla analizy stężenia.
    Gdzie Cstandard = 3 mmol/L, N = współczynnik rozcieńczenia.
    UWAGA: Odpady chemiczne powstające podczas procedur eksperymentalnych muszą być zbierane w wyznaczonych pojemnikach na odpady niebezpieczne i utylizowane przez certyfikowane usługi zarządzania odpadami niebezpiecznymi zgodnie z polityką instytucji.

8. Masowe sekwencjonowanie RNA (Bulk RNA-seq)

  1. Utworzenie bazy próbek
    1. Wybierz komórki A549/DDP do eksperymentu i podziel je na następujące grupy: grupę kontrolną, grupę DDP, grupę β-Ele (40 μg/mL) + DDP (48 μM), grupę β-Ele + DDP + OV-LINC00511 oraz grupę β-Ele + DDP + si-LINC00511. Uwzględnij 3 próbki w każdej grupie.
    2. Wyizoluj całkowite RNA z każdej grupy komórek. Użyj zestawu do izolacji mRNA opartego na kuleczkach magnetycznych (szczegóły znajdują się w Tabeli materiałów), aby wzbogacić eukariotyczny mRNA, w którym kuleczki pokryte Oligo(dT) selektywnie wiążą się z ogonami poli(A) mRNA via parowanie zasad A-T. Dodaj bufor do fragmentacji (1 μL/μg RNA, szczegóły w Tabeli materiałów) i inkubuj w 94 °C przez 7 min, aby pofragmentować mRNA na krótkie segmenty.
    3. Przeprowadź syntezę pierwszej nici cDNA przy użyciu losowych starterów heksamerowych zgodnie z instrukcjami producenta. W celu syntezy drugiej nici cDNA dodaj odpowiednie ilości buforu reakcyjnego, RNazy H oraz polimerazy DNA I, aby zakończyć proces.
    4. Wykonaj naprawę końców oraz dołączanie ogona A (A-tailing) w dwuniciowym cDNA poprzez inkubację w 25 °C przez 30 min (naprawa końców), a następnie bezpośrednio w 72 °C przez 30 min (dołączanie ogona A). Przyłącz adaptery sekwencyjne do fragmentów po naprawie końców.
    5. Oczyść i wyselekcjonuj produkty ligacji pod kątem wielkości, używając magnetycznych kuleczek krzemionkowych zmodyfikowanych grupami karboksylowymi (szczegóły w Tabeli materiałów). Na koniec skonstruuj bibliotekę sekwencyjną poprzez amplifikację PCR.
    6. Po przygotowaniu próbek przeanalizuj bibliotekę sekwencyjną na platformie DNBSEQ-T7 (szczegóły w Tabeli materiałów). Nałóż próbkę na chip matrycy Patterned Array w celu sekwencjonowania.
      UWAGA: Urządzenie gromadziło, odczytywało i identyfikowało sygnały optyczne za pomocą systemu obrazowania o wysokiej rozdzielczości, aby określić informacje o sekwencji poszczególnych zasad. Następnie wykonano dodatkowe cykle sekwencjonowania, aby uzyskać sekwencję kolejnych zasad. Po wielu cyklach wygenerowano surowe dane sekwencyjne.
  2. Analiza bioinformatyczna
    1. Zsekwencjonuj próbki na urządzeniu, aby uzyskać surowe dane, znane również jako dane off-machine. Następnie przetwórz dane sekwencyjne za pomocą programu fastp (v 0.21.0). Usuń odczyty zawierające sekwencje adapterów 3' i wyeliminuj odczyty o niskiej jakości ze średnim wynikiem jakości poniżej Q20 w ramach głównych kryteriów filtrowania. Wszystkie analizy dalsze przeprowadź w oparciu o oczyszczone dane wysokiej jakości.
      UWAGA: Przeprowadź wstępne filtrowanie danych sekwencyjnych za pomocą fastp. W celu uzyskania konkretnych parametrów linii poleceń zapoznaj się z oficjalną dokumentacją dla zbiorów danych transkrypcyjnych (https://github.com/OpenGene/fastp#rna-seq-processing).
    2. Użyj programu FastQC (v 0.12.0), aby ocenić jakość oczyszczonych danych sekwencyjnych. Wymagania jakościowe są następujące: co najmniej 90% zasad musi mieć wynik jakości wyższy niż Q20, a procent pozostałych sekwencji adapterów nie powinien przekraczać 1%. Dane spełniające te kryteria uznaje się za kwalifikujące i mogą być one wykorzystane do dalszych analiz.
      UWAGA: Oceń jakość oczyszczonych danych sekwencyjnych za pomocą FastQC, zgodnie z oficjalnymi wytycznymi (https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/).
  3. Analiza ekspresji genów
    1. Użyj oprogramowania DESeq2 do przeprowadzenia analizy ekspresji różnicowej pomiędzy dwiema grupami porównawczymi.
      1. Najpierw wprowadź dane do oprogramowania, aby skonstruować zbiór danych (DataSet) DESeq. Następnie odfiltruj geny, których całkowita liczba odczytów we wszystkich próbkach jest mniejsza niż 10.
      2. Na koniec przeprowadź analizę różnicową genów i wyodrębnij wyniki. Warunki selekcji genów o różnicowej ekspresji są następujące: zmiana krotności ekspresji |log2FoldChange| > 1 oraz istotność padj ≤ 0,05.
        UWAGA: Szczegółowe kroki obsługi oprogramowania DESeq2 można znaleźć na oficjalnej stronie internetowej: https://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/DESeq2.html.

9. Wykrywanie zmian poziomu ekspresji białek za pomocą metody Western blot (WB) 

UWAGA: Wszystkie eksperymenty przeprowadzono w trzech niezależnych powtórzeniach biologicznych (n = 3).

  1. Wykonaj Western blotting w celu ilościowego oznaczenia poziomu ekspresji białek komórkowych.
    1. Losowo wybierz komórki A549/DDP, które zostały spasażowane do trzeciego pokolenia po reanimacji, i wysiej je równomiernie na płytki 6-dołkowe w zagęszczeniu 1 x 105 komórek/dołek.
    2. Ponumeruj losowo każdy dołek i przypisz je do jednej z sześciu grup eksperymentalnych na podstawie tych liczb losowych: Control, β-Ele, OV-LINC00511, si-LINC00511, β-Ele + OV-LINC00511 oraz β-Ele + si-LINC00511.
    3. Gdy zagęszczenie komórek osiągnie około 70%, przeprowadź transfekcję plazmidową i interferencję zgodnie z opisem w punkcie 3.3. Po 24 h od transfekcji poddaj grupę traktowaną działaniu β-Ele (40 μg/mL), natomiast grupie kontrolnej dostarcz świeżą pożywkę. Hoduj obie grupy przez kolejne 24 h.
    4. Następnie zbierz osady komórkowe poprzez wirowanie przy 1675 × g przez 5 min. Zlizuj każdą grupę komórek za pomocą 500 μL buforu do lizy RIPA zawierającego 1 mM PMSF na lodzie przez 30 min (szczegóły patrz w Table of Materials).
  2. Odwirowuj lizaty komórkowe przy 13 400 × g przez 10 min w temperaturze 4 °C i zbierz nadsącz. Zmierz stężenia białek, używając zestawu BCA Protein Concentration Assay Kit (szczegóły patrz w Table of Materials). Rozdziel równe ilości próbek białek metodą 10% SDS-PAGE i przenieś je na membrany z polifluorku winylidenu (PVDF) poprzez elektroforezę.
  3. Zanurz membrany w roztworze blokującym (5% mleka odtłuszczonego/buforze fosforanowo-solnym z 0,1% Tween-20 (TBST)) na 2 h w temperaturze pokojowej, a następnie inkubuj je przez noc w 4 °C z przeciwciałami pierwszorzędowymi przeciwko GLUT1, PKM2, LDHA, β-catenin, GSK-3β (1:1000) oraz β-Actin (1:2000, szczegóły patrz w Table of Materials).
    1. Następnego dnia przemyj membrany trzy razy roztworem TBST, po 5 min każde przemycie, w temperaturze pokojowej przy delikatnym wstrząsaniu.
  4. Następnego dnia inkubuj membrany z roztworami przeciwciał wtórniczych (kozie anty-królicze IgG znakowane HRP, 1:2000) i delikatnie wstrząsaj w temperaturze pokojowej przez 1 h.
  5. Na koniec dodaj 0,1 mL/cm2 dostępnego komercyjnie chromogennego roztworu ECL, aby całkowicie pokryć membrany PVDF. Inkubuj przez 1 min w temperaturze pokojowej przed naświetleniem. Wizualizuj i analizuj prążki, używając systemu wzmocnionej chemiluminescencji (szczegóły patrz w Table of Materials). Patrz Rycina 4C oraz Rycina 5B.
    UWAGA: Odpady chemiczne powstające podczas procedur eksperymentalnych muszą być zbierane do wyznaczonych pojemników na odpady niebezpieczne i utylizowane przez certyfikowane usługi zarządzania odpadami niebezpiecznymi zgodnie z polityką instytucji.

10. Analiza statystyczna 

UWAGA: Wszystkie eksperymenty przeprowadzono w trzech niezależnych powtórzeniach biologicznych (n = 3).

  1. Uporządkuj dane eksperymentalne według grup i wprowadź je do oprogramowania GraphPad Prism (wersja 8.0.2; szczegóły znajdują się w Tabeli materiałów). Przeprowadź wizualizację danych i analizę istotności statystycznej zgodnie z wytycznymi oprogramowania. Dane pomiarowe przedstawiono jako średnia ± odchylenie standardowe. Różnice statystyczne między grupami oceniono za pomocą jednoczynnikowej analizy wariancji (One-way ANOVA) z obliczeniem wielkości efektu η² (eta-kwadrat), a następnie testem wielokrotnych porównań Tukeya26. Przyjmij wartość **P < 0,01 za istotną statystycznie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

β-Ele znacząco hamuje proliferację komórek A549/DDP

W niniejszym eksperymencie stężenia podawanych związków β-Ele oraz DDP określono na podstawie wyników naszych poprzednich badań20,21. Komórki A549/DDP poddano działaniu β-Ele, samodzielnie lub w połączeniu z DDP, aby przeanalizować jego wpływ na chemorezystencję na DDP. Analiza EdU (

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Badanie to koncentrowało się na krytycznym zagadnieniu klinicznym, jakim jest oporność na cisplatynę w raku płuca. Rak płuc, odpowiedzialny za największą liczbę zgonów z powodu nowotworów na świecie, nadal ma pięcioletni wskaźnik przeżycia poniżej 20%29,30. Cisplatyna, jako podstawa leków chemioterapeutycznych na bazie platyny, jest skutecznym środkiem przeciwnowotworowym o szerokim spektrum działania, który hamuje replikację DNA, wywierając działanie przeciwnowo...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Żaden z autorów nie ma do zadeklarowania konfliktu interesów.

Podziękowania

Finansowanie tego badania zostało zapewnione przez Jilin Provincial Natural Science Foundation w ramach nagrody nr. YDZJ202401058ZYTS.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Ogniwa A549/DDPKomórka ProcellCL-0519 (wersja angielska)Adresy URL:https://www.procell.com.cn/p/a549-ddp--cl-0519
Wyjątkowo czysty stół warsztatowySuzhou Antai AirtechSW-CJ-2FDAdresy URL:http://www.sz-antai.com
Zestaw do oznaczania stężenia białka BCASolarbio (Słoneczna Biologia)Zobacz materiał PC0020Adresy URL:https://www.solarbio.com
Wirówka stołowaThermoPico17 powiedział:Adresy URL:https://www.thermofisher.com
Komora do hodowli komórkowychThermo3111Adresy URL:https://www.thermofisher.com
Naczynie do hodowli komórkowychBIOFILTCD000100Adresy URL:http://www.biofil.com.cn
Analizator chemiluminescencjiInstrumenty Qinxiang 4300Adresy URL:https://www.clinx.cn/about_us
CisplatynaAladdinC295225-250mgAdresy URL:https://www.aladdin-e.com/
Instrument do sekwencjonowania genów DNBSEQ-T7MGI Tech CO., Sp. z o.o.Zobacz materiał T7Adresy URL:https://www.mgitech.cn/
EasyPure  Zestaw mikrogenomicznego DNATransGen BiotechnologiaEE181-01 powiedział:Adresy URL:https://www.transgen.com/
Roztwór chromogeniczny ECLSolarbio (Słoneczna Biologia)PE0010 powiedział:Adresy URL:https://www.solarbio.com
Zestaw detekcji EDUBeyotimeZobacz materiał C0071SAdresy URL:https://www.beyotime.com
Przyrząd znakowany enzymatycznieSprzęt DetieHBS-1096AAdresy URL:https://www.detiebio.cn/
Surowica bydlęca płodu FBS)CLARKFB15015Adresy URL:https://zn.clarkbio.com/
Bufor Frag/Prime Yeasen powiedział:11277ESAdresy URL:https://www.yeasen.com/products/detail/2151
GeneMapper  Oprogramowanie  6ThermoWersja 6Oprogramowanie do analizy fragmentów. Adresy URL:https://www.thermofisher.cn/   
Platforma GenReaderPekin Yuewei Gene Technology Co., Ltd.https://yyigou.com/product/detail/0000037250.htmlZautomatyzowany analizator genetyczny stosowany do elektroforezy kapilarnej
Zestaw do badania stężenia glukozyJiancheng BioA154-1-1Adresy URL:http://www.njjcbio.com
Przeciwciało poliklonalne GLUT1Grupa Proteintech21829-1-APAdresy URL:https://www.ptglab.com
Pryzmat GraphPadOprogramowanie GraphPadWersja 8.0.2Adresy URL:https://www.graphpad.com
GSK-3 i wersja beta; PrzeciwciałoPowinowactwoAF5016 powiedział:Adresy URL:https://www.affbiotech.com
Krótkofalowiec F-12KKomórka ProcellPM150910Adresy URL:https://www.procell.com.cn/
Kulki selekcji DNA Hieff NGSYeasen powiedział:12601ESAdresy URL:https://www.yeasen.com/products/detail/939
Główny zestaw do izolacji mRNA HieffNGSYeasen powiedział:12603ZHAdresy URL:https://www.yeasen.com/products/detail/1119
IgG przeciwko królikom znakowane przez HRPSerwis bioGB23303Adresy URL:https://www.servicebio.cn
Test na mleczanJiancheng BioA019-2-1Adresy URL:http://www.njjcbio.com
Przeciwciało poliklonalne swoiste dla LDHAGrupa Proteintech19987-1-APAdresy URL:https://www.ptglab.com
Cykler świetlny 96RocheLC96 powiedział:Adresy URL:https://lifescience.roche.com
Lipofektamina 2000Invitrogen11668-019Adresy URL:https://www.thermofisher.com/invitrogen
Opti-MEMGibco (firma Gibco)31985-070Adresy URL:https://www.thermofisher.com/gibco
Penicylina-streptomycyna(P/S)Ostrze biologiczneBL505AAdresy URL:https://www.biosharp.cn/
Przeciwciało poliklonalne specyficzne dla PKM2Grupa Proteintech15822-1-APAdresy URL:https://www.ptglab.com
PMSF BeyotimeZobacz materiał ST506Adresy URL:https://www.beyotime.com
Zestaw odczynników PrimeScript RT (Perfect Real Time)TakaraZobacz materiał RR037AAdresy URL:https://www.takarabio.com
Lizat RIPABeyotimeZobacz materiał P0013BAdresy URL:https://www.beyotime.com
Platforma sekwencjonowaniaJęzyk BGIDNBSEQ-T7 (Biblioteka DNBSEQ-T7)Adresy URL:https://www.bgi.com/global
TB Zielony Premiks Ex TaqTakaraPrzekaźnik RR420AAdresy URL:https://www.takarabio.com
Tester śladowych kwasów nukleinowychAosheng InstrumentNano-100Adresy URL:http://www.hzaosheng.com
TRIzon PaICanvax BiotechCW0597SAdresy URL:https://www.canvaxbiotech.com
TrypsynaOstrze biologiczneBL501AAdresy URL:https://www.biosharp.cn/
Zestaw ultraczystego RNA (DNaza I)Canvax BiotechCW0597SAdresy URL:https://www.canvaxbiotech.com
β-Przeciwciało aktynoweGrupa Proteintech60008-1-IGAdresy URL:https://www.ptglab.com
β-katenina Przeciwciało PowinowactwoZobacz materiał DF6794 powiedział:Adresy URL:https://www.affbiotech.com
β-ElemeneSigma63965-25MGAdresy URL:https://www.sigmaaldrich.com

Bibliografia

  1. Thandra, K. C., Barsouk, A., Saginala, K., Aluru, J. S., Barsouk, A. Epidemiology of lung cancer. Contemp Oncol (Pozn). 25 (1), 45-52 (2021).
  2. Huang, J., et al. Distribution risk factors, and temporal trends for lung cancer incidence and mortality: A Global Analysis. Chest. 161 (4), 1101-1111 (2022).
  3. Wang, H., Hu, Y., Lu, H., Wu, Z., Zhang, Y. Association between SOX gene family expression, DNA methylation, and miRNA regulation in lung adenocarcinoma progression. Discov Oncol. 16 (1), 188(2025).
  4. Sung, H., et al. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin. 71 (3), 209-249 (2021).
  5. Qin, Z., et al. Phase separation of EML4-ALK in firing downstream signaling and promoting lung tumorigenesis. Cell Discov. 7 (1), 33(2021).
  6. Wang, X., Wang, H., Jiang, H., Qiao, L., Guo, C. Circular RNAcirc_0076305 promotes cisplatin (DDP) resistance of non-small cell lung cancer cells by regulating ABCC1 through miR-186-5p. Cancer Biother Radiopharm. 38 (5), 293-304 (2023).
  7. La Montagna, M., Ginn, L., Garofalo, M. Mechanisms of drug resistance mediated by long non-coding RNAs in non-small-cell lung cancer. Cancer Gene Ther. 28 (3-4), 175-187 (2021).
  8. Wu, S. G., Shih, J. Y. Management of acquired resistance to EGFR TKI-targeted therapy in advanced non-small cell lung cancer. Mol Cancer. 17 (1), 38(2018).
  9. Altorki, N. K., et al. The lung microenvironment: an important regulator of tumour growth and metastasis. Nat Rev Cancer. 19 (1), 9-31 (2019).
  10. Zhang, H., Wang, Y., Liu, X., Li, Y. Progress of long noncoding RNAs in anti-tumor resistance. Pathol Res Pract. 216 (11), 153215(2020).
  11. Li, H. Q., Fu, X. B., Guo, H. Y., Sun, Y., Wang, D., Zhang, Z. Z. Sevoflurane reverses cisplatin resistance in neuroblastoma cells through the linc00473/miR-490-5p/AKT1 axis. Saudi Medical Journal. 43 (11), 1209-1216 (2022).
  12. Guo, F., Cao, Z., Guo, H., Li, S. The action mechanism of lncRNA-HOTAIR on the drug resistance of non-small cell lung cancer by regulating Wnt signaling pathway. Exp Ther Med. 15 (6), 4885-4889 (2018).
  13. Ren, L., et al. The DDUP protein encoded by the DNA damage-induced CTBP1-DT lncRNA confers cisplatin resistance in ovarian cancer. Cell Death Dis. 14 (8), 568(2023).
  14. Chen, L., et al. H19/miR-107/HMGB1 axis sensitizes laryngeal squamous cell carcinoma to cisplatin by suppressing autophagy in vitro and in vivo. Cell Biol Int. 45 (3), 674-685 (2021).
  15. Peng, X., Li, S., Zeng, A., Song, L. Regulatory function of glycolysis-related lncRNAs in tumor progression: Mechanism, facts, and perspectives. Biochem Pharmacol. 229, 116511(2024).
  16. Kryczka, J., Kryczka, J., Czarnecka-Chrebelska, K. H., Brzeziańska-Lasota, E. Molecular mechanisms of chemoresistance induced by cisplatin in NSCLC cancer therapy. Int J Mol Sci. 22 (16), 8885(2021).
  17. Liu, J., Zhu, Y., Wang, H., Han, C., Wang, Y., Tang, R. LINC00629, a HOXB4-downregulated long noncoding RNA, inhibits glycolysis and ovarian cancer progression by destabilizing c-Myc. Cancer Sci. 115 (3), 804-819 (2024).
  18. Liao, M., et al. Targeting the Warburg effect: A revisited perspective from molecular mechanisms to traditional and innovative therapeutic strategies in cancer. Acta Pharm Sin B. 14 (3), 953-1008 (2024).
  19. Song, Z., Luo, J., Wu, M., Zhang, Z. linc00511 knockdown inhibits lung cancer progression by regulating miR-16-5p/MMP11. Crit Rev Eukaryot Gene Expr. 33 (7), 17-30 (2023).
  20. Cheng, G., et al. β-elemene suppresses tumor metabolism and stem cell-like properties of non-small cell lung cancer cells by regulating PI3K/AKT/mTOR signaling. Am J Cancer Res. 12 (4), 1535-1555 (2022).
  21. Li, L., et al. β-elemene suppresses Warburg effect in NCI-H1650 non-small-cell lung cancer cells by regulating the miR-301a-3p/AMPKα axis. Biosci Rep. 40 (6), BSR20194389(2020).
  22. Yao, C., Jiang, J., Tu, Y., Ye, S., Du, H., Zhang, Y. β-elemene reverses the drug resistance of A549/DDP lung cancer cells by activating intracellular redox system, decreasing mitochondrial membrane potential and P-glycoprotein expression, and inducing apoptosis. Thorac Cancer. 5 (4), 304-312 (2014).
  23. Song, H., et al. β-elemene ameliorates cisplatin resistance of gastric cancer via regulating exosomal METTL3-m6A-ARF6 axis. Cell Biochem Biophys. 83 (2), 2047-2058 (2025).
  24. He, J., et al. β-Elemene promotes ferroptosis and reverses radioresistance in gastric cancer by inhibiting the OTUB1-GPX4 interaction. Front Pharmacol. 15, 1469180(2024).
  25. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  26. Yang, L., Tao, Y., Luo, L., Zhang, Y., Wang, X., Meng, X. Dengzhan Xixin injection derived from a traditional Chinese herb Erigeron breviscapus ameliorates cerebral ischemia/reperfusion injury in rats via modulation of mitophagy and mitochondrial apoptosis. J Ethnopharmacol. 288, 114988(2022).
  27. Zhang, Z., Zhang, Y., Qin, X., Wang, Y., Fu, J. FGF9 promotes cisplatin resistance in colorectal cancer via regulation of Wnt/β-catenin signaling pathway. Exp Ther Med. 19 (3), 1711-1718 (2020).
  28. He, J., et al. Sox2 inhibits Wnt-β-catenin signaling and metastatic potency of cisplatin-resistant lung adenocarcinoma cells. Mol Med Rep. 15 (4), 1693-1701 (2017).
  29. Bray, F., et al. Global cancer statistics 2022: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin. 74 (3), 229-263 (2024).
  30. Im, J. Y., et al. CYB5R3 functions as a tumor suppressor by inducing ER stress-mediated apoptosis in lung cancer cells via the PERK-ATF4 and IRE1α-JNK pathways. Exp Mol Med. 56 (1), 235-249 (2024).
  31. Manguinhas, R., et al. Impact of the APE1 Redox Function Inhibitor E3330 in non-small cell lung cancer cells exposed to cisplatin: Increased cytotoxicity and impairment of cell migration and invasion. Antioxidants (Basel). 9 (6), 550(2020).
  32. Jiang, L., et al. HCP5 is a SMAD3-responsive long non-coding RNA that promotes lung adenocarcinoma metastasis via miR-203/SNAI axis. Theranostics. 9 (9), 2460-2474 (2019).
  33. Singh, D., Assaraf, Y. G., Gacche, R. N. Long non-coding RNA mediated drug resistance in breast cancer. Drug Resist Updat. 63, 100851(2022).
  34. Sun, W., Zu, Y., Fu, X., Deng, Y. Knockdown of lncRNA-XIST enhances the chemosensitivity of NSCLC cells via suppression of autophagy. Oncol Rep. 38 (6), 3347-3354 (2017).
  35. Lu, Y., Tian, M., Liu, J., Wang, K. LINC00511 facilitates Temozolomide resistance of glioblastoma cells via sponging miR-126-5p and activating Wnt/β-catenin signaling. J Biochem Mol Toxicol. 35 (9), e22848(2021).
  36. Kong, X. Z., et al. Regulation of aerobic glycolysis by long non-coding RNAs in cancer. Biochem Biophys Res Commun. 479 (1), 28-32 (2016).
  37. Mao, Y., Xia, Z., Xia, W., Jiang, P. Metabolic reprogramming, sensing, and cancer therapy. Cell Rep. 43 (12), 115064(2024).
  38. Vaupel, P., Schmidberger, H., Mayer, A. The Warburg effect: essential part of metabolic reprogramming and central contributor to cancer progression. Int J Radiat Biol. 95 (7), 912-919 (2019).
  39. Ward, P. S., Thompson, C. B. Metabolic reprogramming: a cancer hallmark even warburg did not anticipate. Cancer Cell. 21 (3), 297-308 (2012).
  40. Nagao, A., Kobayashi, M., Koyasu, S., Chow, C. C. T., Harada, H. HIF-1-dependent reprogramming of glucose metabolic pathway of cancer cells and its therapeutic significance. Int J Mol Sci. 20 (2), 238(2019).
  41. Xie, Y., Wang, M., Xia, M., Guo, Y., Zu, X., Zhong, J. Ubiquitination regulation of aerobic glycolysis in cancer. Life Sci. 292, 120322(2022).
  42. Hua, G., Zeng, Z. L., Shi, Y. T., Chen, W., He, L. F., Zhao, G. F. LncRNA XIST contributes to cisplatin resistance of lung cancer cells by promoting cellular glycolysis through sponging miR-101-3p. Pharmacology. 106 (9-10), 498-508 (2021).
  43. Yin, D., Hua, L., Wang, J., Liu, Y., Li, X. Long Non-coding RNA DUXAP8 facilitates cell viability, migration, and glycolysis in non-small-cell lung cancer via regulating HK2 and LDHA by inhibition of miR-409-3p. Onco Targets Ther. 13, 7111-7123 (2020).
  44. Vallée, A. Aerobic glycolysis activation through canonical WNT/β-catenin pathway in ALS. Med Sci (Paris). 34 (4), 326-330 (2018).
  45. Rathee, M., et al. Canonical WNT/β-catenin signaling upregulates aerobic glycolysis in diverse cancer types. Mol Biol Rep. 51 (1), 788(2024).
  46. Li, R., Lv, M., Liu, J., Sun, Q. Tumor necrosis factor receptor-associated protein 1 promotes aerobic glycolysis and cisplatin resistance by regulating the Wnt/β-catenin signaling pathway in lung cancer. Histol Histopathol. , (2024).
  47. Zhao, Q., Chen, L., Zhang, X., Yang, H., Li, Y., Li, P. β-elemene promotes microglial M2-like polarization against ischemic stroke via AKT/mTOR signaling axis-mediated autophagy. Chin Med. 19 (1), 86(2024).
  48. Jiang, Z., Jacob, J. A., Loganathachetti, D. S., Nainangu, P., Chen, B. β-Elemene: mechanistic studies on cancer cell interaction and its chemosensitization effect. Front Pharmacol. 8, 105(2017).
  49. Li, J., Li, Y., Meng, F., Fu, L., Kong, C. Knockdown of long non-coding RNA linc00511 suppresses proliferation and promotes apoptosis of bladder cancer cells via suppressing Wnt/β-catenin signaling pathway. Biosci Rep. 38 (4), BSR20171701(2018).
  50. Tan, Z., et al. Small peptide LINC00511-133aa encoded by LINC00511 regulates breast cancer cell invasion and stemness through the Wnt/β-catenin pathway. Mol Cell Probes. 69, 101913(2023).
  51. Ghafouri-Fard, S., Safarzadeh, A., Hussen, B. M., Taheri, M., Ayatollahi, S. A. A review on the role of LINC00511 in cancer. Front Genet. 14, 1116445(2023).
  52. Liu, J., et al. Targeting Wnt-driven cancer through the inhibition of Porcupine by LGK974. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (50), 20224-20229 (2013).
  53. Wang, W. J., et al. Serum lncRNAs (CCAT2, LINC01133, LINC00511) with squamous cell carcinoma antigen panel as novel non-invasive biomarkers for detection of cervical squamous carcinoma. Cancer Manag Res. 12, 9495-9502 (2020).
  54. Fan, K., Liu, Z., Gao, M., Tu, K., Xu, Q., Zhang, Y. Targeting nutrient dependency in cancer treatment. Front Oncol. 12, 820173(2022).
  55. Liu, B., et al. Knockdown of LINC00511 decreased cisplatin resistance in non-small cell lung cancer by elevating miR-625 level to suppress the expression of leucine rich repeat containing eight volume-regulated anion channel subunit E. Hum Exp Toxicol. 41, 9603271221089000(2022).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Beta-elemeneWnt beta-kateninaglikoliza tlenowakomórki A549 DDPWestern blotqRT-PCRtest EdU

Ten artykuł został opublikowany

Film wkrótce dostępny

Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.