Artykuł metodologiczny

Badanie mechanizmu modulacji LINC00511 za pośrednictwem β-elemenu w celu tłumienia oporności na cisplatynę w raku płuc

DOI:

10.3791/68825

⸱

19 sierpnia 2025

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Pharmacy, Changchun University of Traditional Chinese Medicine, 2Health Care Department, The Affiliated Hospital to Changchun University of Chinese Medicine, 3Teaching Department, The Third Affiliated Clinical Hospital of Changchun University of Chinese Medicine, 4The Research Center of The Affiliated Hospital to Changchun University of Chinese Medicine, 5Northeast Asia Research Institute of Traditional Chinese Medicine, Changchun University of Chinese Medicine, 6Affiliated Hospital of Changchun University of Chinese Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Oporność na cisplatynę (DDP) ogranicza skuteczność chemioterapii w raku płuc. Badanie to miało na celu wyjaśnienie, w jaki sposób β-Elemen(β-Ele) odwraca oporność w komórkach A549 / DDP poprzez regulację w dół LINC00511. Analizy in vitro i sekwencje RNA wykazały, że regulacja ta hamuje glikolizę tlenową i sygnalizację Wnt/β-kateniny, oferując potencjalną strategię przezwyciężenia chemooporności.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Oporność na cisplatynę znacznie ogranicza skuteczność chemioterapii w niedrobnokomórkowym raku płuca, co wymaga opracowania nowych strategii pokonania tej bariery. To badanie in vitro miało na celu wyjaśnienie mechanizmu, za pomocą którego β-Ele odwraca oporność na cisplatynę w komórkach gruczolakoraka płuc za pośrednictwem glikolizy LINC00511 i szlaków sygnałowych Wnt/β-kateniny. Oporna na cisplatynę ludzka linia komórkowa gruczolakoraka płuc (A549/DDP), z nadekspresją LINC00511 lub knockdownem, została utworzona poprzez transfekcję plazmidu. Skuteczność transfekcji oceniano za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy odwrotnej transkryptazy (qRT-PCR) w celu wykrycia poziomów ekspresji LINC00511. Ocena za pomocą testu 5-etynylo-2'-deoksyurydyny (EdU) wykazała znaczące hamowanie proliferacji komórek A549 / DDP za pośrednictwem β-Ele. Dalsza analiza sekwencji RNA wykazała, że hamujący wpływ β-elemenu na oporność na cisplatynę był ściśle związany z zakłóceniem glikolizy komórkowej i supresją aktywacji szlaku sygnałowego Wnt / β-kateniny. Analiza Western blot kluczowych białek, w tym transportera glukozy 1 (GLUT1), kinazy pirogronianowej M2 (PKM2), dehydrogenazy mleczanowej A (LDHA), β-kateniny i kinazy syntazy glikogenu 3β (GSK-3β), wykazała, że β-elemene odwraca oporność na cisplatynę poprzez hamowanie glikolizy tlenowej i blokowanie aktywacji szlaku sygnałowego Wnt / β-kateniny poprzez regulację w dół LINC00511. Podsumowując, wyniki te pokazują, że β-elemene pokonuje oporność na cisplatynę w raku płuc poprzez celowanie w LINC00511 i związany z nią szlak glikolizy tlenowej / Wnt / β-kateniny. W ten sposób ustanawia się ramy teoretyczne dla przyszłych badań przedklinicznych i klinicznych, ujawniając jednocześnie potencjalne cele terapeutyczne.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wśród nowotworów złośliwych na całym świecie rak płuc wykazuje wyjątkowo wysoką częstość występowania i śmiertelność, charakteryzującą się złośliwą transformacją i inwazyjnym wzrostem komórek nabłonka oskrzeli 1,2. Na podstawie cech histopatologicznych rak płuc jest klasyfikowany jako rak niedrobnokomórkowy (NSCLC) lub rak drobnokomórkowy (SCLC)3. Warto wspomnieć, że NSCLC stanowi około 85% wszystkich przypadków raka płuc 4,5. Jako standard chemioterapeutyczny pierwszego rzutu w leczeniu niedrobnokomórkowego raka płuca, cisplatyna (DDP) jest klinicznie niezbędna6. Jednak obserwacje kliniczne wykazały, że komórki nowotworowe mogą rozwijać oporność na leki poprzez wiele mechanizmów, głównie obejmujących aktywację szlaków ucieczki immunologicznej, mutacje w genach docelowych leków i rozregulowanie szlaków metabolizmu leków 7,8,9.

Długie niekodujące RNA (lncRNA) reprezentują transkrypty > 200 nukleotydów (nt), które nie mają zdolności kodowania białek10. Coraz więcej dowodów wskazuje, że lncRNA może odwrócić oporność na cisplatynę w komórkach nowotworowych poprzez wiele mechanizmów, takich jak funkcjonowanie jako konkurencyjne endogenne RNA (ceRNA) do gąbczastych miRNA i uwalnianie ich docelowych genów11, modulowanie szlaków sygnałowych apoptozy12, udział w naprawie uszkodzeń DNA13 i regulacja autofagii komórkowej14. Co więcej, wraz z postępem badań nad przeprogramowaniem metabolicznym nowotworów, pojawiły się istotne dowody wskazujące, że lncRNA odgrywa kluczową rolę regulacyjną w tym procesie. Efekt Warburga, oznaczający glikolizę tlenową, stanowi podstawową cechę metaboliczną komórek nowotworowych15. Nie tylko dostarcza energii do szybkiej proliferacji komórek, ale także generuje metabolity pośrednie, które służą jako prekursory biosyntezy, wspierając syntezę białek i lipidów w celu zaspokojenia wymagań wzrostu nowotworówzłośliwych 16. W raku płuc potwierdzono, że lncRNA znacząco wpływa na progresję guza i oporność na chemioterapię poprzez regulację szlaku glikolizy tlenowej 17,18.

Wśród nich LINC00511, szeroko badana cząsteczka lncRNA w ostatnich latach, została uznana za ściśle związaną z inicjacją i rozwojem różnych nowotworów złośliwych19. Odkrycia te nie tylko wyjaśniają specyficzne mechanizmy udziału lncRNA w przeprogramowaniu metabolicznym guza, ale także stanowią teoretyczną podstawę dla strategii leczenia nowotworów ukierunkowanych na lncRNA, otwierając potencjalne ścieżki terapeutyczne.

Pochodzący z kłączy Curcuma zedoaria, β-Ele jest bioaktywnym seskwiterpenoidem o ustalonej skuteczności przeciwnowotworowej. Nasze poprzednie badania wykazały, że β-Ele służy jako selektywny inhibitor szlaku sygnałowego PI3K/Akt/mTOR i wywołuje efekt synergistyczny z cisplatyną poprzez celowanie w metabolizm guza. Znacząco zahamował wzrost guza w mysim ksenoprzeszczepie NDRP model20. Późniejsze badania wykazują zdolność β-Ele do tłumienia glikolizy tlenowej w komórkach NSCLC poprzez modulację osi sygnalizacyjnej miR-301a-3p/AMPKα, co skutkuje wynikami onkostatycznymi21. Na podstawie naszych wcześniejszych ustaleń potwierdziliśmy, że LINC00511 osłabia oporność na cisplatynę w raku płuc; Niemniej jednak dokładny molekularny mechanizm działania pozostaje w pełni wyjaśniony.

Biorąc pod uwagę kluczową rolę glikolizy tlenowej w przeprogramowaniu metabolicznym guza oraz krytyczną rolę LINC00511 w rozwoju i progresji guza, badanie to ma na celu zbadanie, czy β-Ele może odwrócić oporność na cisplatynę w raku płuc poprzez modulację szlaku glikolizy tlenowej za pośrednictwem LINC00511.

Wcześniejsze dowody wskazują, że β-Ele może odwrócić oporność na cisplatynę i wzmocnić jej działanie przeciwnowotworowe poprzez aktywację szlaków apoptotycznych22, regulację wydzielania egzosomów23 i zatrzymanie cyklu komórkowego24. Jednak te znane mechanizmy zazwyczaj wykazują szerokie efekty i brakuje im precyzyjnej regulacji określonych celów molekularnych, co ogranicza ich kliniczną przekładalność. W związku z tym istnieje pilna potrzeba zbadania nowych strategii, które są bardziej ukierunkowane, mają dobrze zdefiniowane mechanizmy i wykazują duży potencjał w zakresie przekładu klinicznego w celu przezwyciężenia oporności na cisplatynę. W przeciwieństwie do wcześniejszych badań podkreślających natychmiastowe działanie biologiczne β-Ele, badanie to charakteryzuje wpływ β-Ele na metabolizm Warburga i szlak sygnałowy Wnt / β-kateniny w komórkach A549 / DDP poprzez regulację szlaków molekularnych za pośrednictwem lncRNA, mając na celu wyjaśnienie nowego mechanizmu leżącego u podstaw odwrócenia chemosensytyzacji w raku płuc. Artykuł ten nie tylko odkrywa nowe podejście β-Ele do odwrócenia chemooporności poprzez celowanie w lncRNA, ale także zapewnia świeże podstawy teoretyczne i potencjalne cele interwencji w klinicznym leczeniu raka płuc. Odkrycia te, dzięki szczegółowemu wyjaśnieniu specyficznego celu molekularnego (LINC00511) i kluczowych szlaków sygnałowych (Warburg i Wnt/β-katenina), wykazują znacznie zwiększony kliniczny potencjał translacyjny. Oczekuje się, że zapewnią one solidną podstawę naukową do poprawy wrażliwości na chemioterapię u pacjentów z rakiem płuca i poprawy jakości ich życia, a także do przyspieszenia rozwoju precyzyjnych strategii leczenia raka płuc.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie rozpuszczalnika

  1. Przygotowanie roztworu pożywki dla komórek A549/DDP: Hodować komórki A549/DDP w kompletnym pożywce F-12K Hama (szczegóły w Tabeli Materiałów ), uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS, szczegóły w Tabeli Materiałów ), 1% roztworem penicyliny-streptomycyny (P/S, szczegóły w Tabeli Materiałów ) i 2 μg/ml cisplatyny (DDP, zobacz Tabelę materiałów , aby uzyskać szczegółowe informacje).
    1. Przygotowanie kompletnego roztworu pożywki: Przygotuj kompletny roztwór pożywki, dodając 50 ml FBS i 5 ml P/S do 500 ml pożywki F-12K szynki, a następnie dokładnie wymieszaj.
    2. Przygotowanie kompletnego roztworu zawierającego cisplatynę: Odważyć 1 mg cisplatyny w proszku (DDP, szczegóły w Tabeli Materiałów ) i rozpuścić w 1 ml podwójnie destylowanej wody (ddH2O) w celu przygotowania roztworu podstawowego. Dodać 200 μl roztworu podstawowego do 100 ml kompletnej pożywki (przygotowanej zgodnie z etapem 1.1.1) i dokładnie wymieszać w celu przygotowania roztworu roboczego kompletnej pożywki zawierającej 2 μg/ml cisplatyny.
      UWAGA: Ponieważ cisplatyna jest substancją cytotoksyczną, wszystkie procedury należy wykonywać pod wyciągiem lub w komorze bezpieczeństwa biologicznego i nosić sprzęt ochronny, taki jak rękawice, fartuchy laboratoryjne i gogle.
  2. Roztwór do podawania β-Ele: Stężenie leku zastosowane w tym badaniu zostało oparte na wynikach poprzednich eksperymentów przeprowadzonych przez nasz zespół badawczy20,21. Rozpuścić 1 mg β-Ele (szczegóły patrz Tabela materiałów) w 20 μl dimetylosulfotlenku (DMSO, szczegóły patrz Tabela materiałów) w celu przygotowania roztworu podstawowego. Rozcieńczyć roztwór podstawowy do 25 ml przy użyciu kompletnego podłoża, aby otrzymać roztwór roboczy β-Ele o stężeniu 40 μg/mL.
    UWAGA: Ponieważ DMSO może zwiększyć wchłanianie innych substancji przez skórę, wszystkie czynności operacyjne należy wykonywać w dygestorii lub komorze bezpieczeństwa biologicznego i nosić sprzęt ochronny, taki jak rękawice, odzież laboratoryjna i gogle.

2. Hodowla komórkowa

  1. W tym badaniu należy wykorzystać ludzką linię komórkową oporną na cisplatynę gruczolakoraka płuc (A549/DDP, Procell, szczegółowe informacje znajdują się w Tabeli Materiałów ). Potwierdź, że ta linia komórkowa została zidentyfikowana za pomocą analizy krótkich powtórzeń tandemowych (STR) i pomyślnie dopasowana do standardowych linii w ATCC i innych bazach danych.
    1. W przypadku metody analizy STR należy zebrać około 1 x 106 komórek i wyekstrahować genomowe DNA za pomocą komercyjnego zestawu do ekstrakcji DNA (szczegółowe informacje znajdują się w Tabeli materiałów ).
    2. Zastosuj zwalidowany multipleksowy system STR odpowiedni do typowania DNA w celu amplifikacji 20 loci STR wraz z locus determinującym płeć. Przeprowadzić amplifikację PCR w następujących warunkach cykli termicznych: początkowa denaturacja w temperaturze 95 °C przez 2 minuty, następnie 29 cykli denaturacji w temperaturze 94 °C przez 30 s, wyżarzanie w temperaturze 59 °C przez 45 s i przedłużenie w temperaturze 72 °C przez 45 s, z końcowym etapem wydłużania w temperaturze 72 °C przez 10 minut.
    3. Analizuj otrzymane produkty PCR za pomocą elektroforezy kapilarnej przy użyciu automatycznego analizatora genetycznego zgodnie z instrukcjami producenta. W tym przypadku typowanie alleli przeprowadzono przy użyciu oprogramowania do analizy fragmentów (szczegółowe informacje można znaleźć w Tabeli materiałów ), z progiem wykrywania piku ustalonym na 150 względnych jednostek fluorescencji (RFU).
      UWAGA: Wygenerowany 20-locus profil STR porównano z profilami referencyjnymi linii komórkowych A549/DDP dostępnymi w publicznych bazach danych. Współczynnik dopasowania przekraczający 80% został uznany za wskazujący na homologię. Brak obcych pików alleli dodatkowo potwierdził brak zanieczyszczenia krzyżowego.
  2. Pobrać komórki z ciekłego azotu i umieścić je w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C w celu szybkiego rozmrożenia, aż ciecz całkowicie się rozpuści. Przenieść zawiesinę komórek do probówki wirówkowej o pojemności 5 ml, dodać dwie objętości kompletnego roztworu pożywki i delikatnie zawiesić mieszaninę. Po odwirowaniu (358 × g, 5 min, temperatura pokojowa) należy ostrożnie usunąć supernatant.
    UWAGA: Podczas korzystania z probówek do krioprezerwacji komórek z ciekłego azotu należy nosić rękawice zapobiegające zamarzaniu oraz gogle lub maskę na twarz i nie kierować się w stronę wylotu rurki.
  3. Zawiesić osad komórkowy w 1 ml kompletnej pożywki, delikatnie pipetując, a następnie rozcieńczyć zawiesinę do 10 ml dodając 9 ml kompletnej pożywki. Zasiać komórki na 100-milimetrowych szalkach do hodowli komórkowych i wyhodować je w inkubatorze (szczegółowe informacje znajdują się w tabeli materiałów ) w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Stosunek pasażu komórkowego utrzymywał się na poziomie od 1:2 do 1:3.
    UWAGA: Cisplatyna jest platynowym lekiem chemioterapeutycznym o cytotoksyczności. W tej metodzie komórki A549/DDP są hodowane z pożywką zawierającą cisplatynę. W związku z tym należy zebrać odpadową pożywkę hodowlaną zawierającą cisplatynę do specjalnej beczki na zużytą ciecz i regularnie wysyłać ją do zakładu przetwarzania odpadów niebezpiecznych w celu profesjonalnej utylizacji.

3. Transfekcja plazmidu

  1. Zastosuj konstrukt plazmidu do nadekspresji LINC00511 i specyficzny dla genu LINC00511 celowania w siRNA (identyfikator genu: 400619; identyfikator transkryptu: NR_033876.1) do transfekcji komórek. Wykorzystane sekwencje siRNA przedstawiono w tabeli 1.
Sekwencje siRNA
NazwaZmysł 5'-3'Antysens 5'-3'
LINC00511-Homo-1625
CAGCUGUGAACUUCCUUUATT
UAAAGGAAGUUCACAGCUGTT

Tabela 1: Lista sekwencji siRNA

  1. Losowo wybierz komórki A549 / DDP, które zostały pasażowane do trzeciej generacji po resuscytacji i równomiernie zaszczepij je na 6-dołkowych płytkach o gęstości 1 x 105 komórek / dołek. Każda studnia została losowo ponumerowana, a studnie zostały przydzielone do grup eksperymentalnych na podstawie tych losowych liczb.
  2. Transfekcję komórek za pomocą odczynnika do transfekcji (szczegółowe informacje znajdują się w Tabeli materiałów ), gdy ich gęstość osiągnie około 70%.
    1. Przygotować roztwór do transfekcji siRNA.
      1. Wymieszaj 250 μl zoptymalizowanej minimalnej pożywki niezbędnej (Opti-MEM, szczegółowe informacje znajdują się w tabeli materiałów ) z 5 μl odczynnika do transfekcji, delikatnie zwiruj 3–5 razy, aby zapewnić jednorodność, i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
      2. Rozcieńczyć 5 μl siRNA (50 nM) w 250 μl Opti-MEM, delikatnie przemieszać 3–5 razy, aby dokładnie wymieszać. Połączyć rozcieńczony odczynnik do transfekcji z roztworem siRNA i inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 minut, aby utworzyć kompleks transfekcji siRNA.
    2. Przygotować roztwór do transfekcji plazmidu.
      1. Wymieszać 250 μl Opti-MEM z 5 μl odczynnika do transfekcji, delikatnie zwirować 3–5 razy, aby zapewnić jednorodność, i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
      2. Rozcieńczyć 2 μg plazmidu w 250 μl Opti-MEM, delikatnie przemieszać 3–5 razy, aby zapewnić dokładne wymieszanie. Połączyć rozcieńczony odczynnik do transfekcji z roztworem plazmidu i inkubować w temperaturze pokojowej przez 20 minut w celu przygotowania roztworu do transfekcji plazmidu.
      3. Dodaj odpowiednio roztwór do transfekcji siRNA i roztwór do transfekcji plazmidu do płytek 6-dołkowych. Dodać 1 500 μl kompletnego podłoża do każdego dołka. Delikatnie wymieszaj płytki komórkowe przed i po dodaniu, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 24 godziny po transfekcji przed analizą.

4. Wykrywanie skuteczności transfekcji za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkryptazą (qRT-PCR)

UWAGA: Pobieraj komórki po transfekcji przez 24 godziny w kroku 3.3 w celu wykrycia qRT-PCR zgodnie z poniższą procedurą. Wszystkie doświadczenia przeprowadzono w trzech niezależnych kontrpróbach biologicznych (n = 3).

  1. Ekstrakcja RNA
    1. Użyj zestawu do ekstrakcji ultraczystego RNA (szczegółowe informacje można znaleźć w tabeli materiałów ). Wyrzucić pożywkę z płytki 6-dołkowej zgodnie z instrukcją dołączoną do zestawu i przemyć komórki PBS. Następnie dodaj 500 μl roztworu odczynnika do lizy na bazie fenolu i guanidyny do każdej studzienki, delikatnie przedmuchaj komórki końcówką pistoletu, aby całkowicie je zawiesić, i przenieś mieszaninę do probówki wirówkowej. Pozostaw na 5 minut, aby zapewnić całkowitą lizę próbki komórek.
    2. Dodać 100 μl odczynnika do lizy izotiocyjanianu fenolu-guanidyny, mocno wstrząsać przez 15 s i pozostawić na 2 minuty w temperaturze pokojowej. Na koniec ostrożnie odessać górną fazę wodną, przenieść ją do kolumny adsorpcyjnej i odwirować przy 13 400 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
    3. Zwiąż RNA z membraną żelu krzemionkowego. Umyj go buforem RW1 i buforem RW2 w celu usunięcia białek. Następnie dodaj DNazę I, aby strawić resztki DNA i wykonaj wtórne płukanie buforem RW2, aby zapewnić całkowite usunięcie zanieczyszczeń. Na koniec zbierz próbki RNA, eluując RNA wodą wolną od RNaz i odwirowując przy 13 400 x g przez 1 minutę.
  2. Zmierz stężenie RNA.
    1. Umieść każde 1,5 μl próbki roztworu RNA w detektorze kwasów mikronukleinowych (szczegółowe informacje znajdują się w Tabeli materiałów ) i odczytaj wartości A260/A280.
      UWAGA: Jeśli zmierzone wartości A260/A280 mieszczą się w zakresie od 1,8 do 2,0, a stężenie RNA wynosi od 20 ng/μL do 200 ng/μL, oznacza to, że jakość RNA jest akceptowalna i może być wykorzystana do kolejnych eksperymentów.
    2. Na podstawie pomiarów rozcieńczyć roztwór RNA wodą z pirowęglanu dietylu (DEPC), aby zapewnić stałe stężenia RNA dla wszystkich próbek, stosując zmierzone minimalne stężenie RNA jako punkt odniesienia, a następnie przeprowadzić eksperymenty PCR.
  3. Odwrotna transkrypcja RNA
    1. Użyj wyekstrahowanego całkowitego RNA jako matrycy i zsyntetyzuj cDNA zgodnie z instrukcjami zestawu do odwrotnej transkrypcji (szczegółowe informacje znajdują się w Tabeli materiałów ). Przygotować układ reakcyjny zgodnie z wymaganiami zestawu.
    2. Dodaj wyekstrahowany roztwór RNA i układ reakcyjny do ośmiorzędowej probówki i ustaw dwie studzienki replikacji w każdej grupie. Rozpocząć reakcję w warunkach sekwencyjnych: 15 minut inkubacji w temperaturze 37 °C, 5 s denaturacji cieplnej w temperaturze 85 °C, 5 minut chłodzenia w temperaturze 4 °C.
  4. Reakcja PCR
    1. Przeprowadź amplifikację PCR w ilościowym systemie PCR do fluorescencji w czasie rzeczywistym (szczegółowe informacje znajdują się w Tabeli materiałów ) przy użyciu wstępnie zmieszanej mieszanki wzorcowej PCR na bazie SYBR Green (szczegółowe informacje można znaleźć w Tabeli materiałów ). Użyć GADPH jako genu referencyjnego, z sekwencjami starterów wymienionymi w tabeli 2, i przygotować mieszaninę reakcyjną w następujący sposób: kolejno dodać 0,4 μl odpowiedniego startera, 2 μl matrycy cDNA i mieszaninę reakcyjną do ośmiodołkowej probówki paskowej, aby uzyskać końcową objętość reakcji.
    2. Uruchom amplifikację PCR: 95 °C 30 s (1 cykl), 95 °C 5 s (40 cykli), 60 °C 20 s (40 cykli). Obliczyć względne poziomy ekspresji docelowych genów przy użyciu metody 2 -ΔΔCt 25. Niezależnie powtórz wszystkie eksperymenty trzy razy, aby zapewnić wiarygodność danych.
      UWAGA: Odpady chemiczne powstające podczas procedur eksperymentalnych muszą być zbierane w wyznaczonych pojemnikach na odpady niebezpieczne i utylizowane przez certyfikowane służby gospodarki odpadami niebezpiecznymi zgodnie z polityką instytucjonalną.
Sekwencje podkładowe
PodkładSekwencja (5'-3')
człowiek-LINC00511-FTTTCCCAGCACAGCTCAATC powiedział:
człowiek-LINC00511-RTCCCTTCTCCCTCGGTCA powiedział:
GAPDH-FAATCCCATCACCATCTTCCA (Angielski)
GAPDH-RAAATGAGCCCCAGCCTTCT powiedział:

Tabela 2: Sekwencje starterów do testów PCR

5. Wykrywanie EdU

  1. Oceń wpływ zmienionej ekspresji LINC00511 na proliferację komórek A549 / DDP za pomocą zestawu testowego EdU (szczegółowe informacje można znaleźć w Tabeli materiałów ).
    1. Losowo wybierz komórki A549 / DDP, które zostały pasażowane do trzeciej generacji po resuscytacji i równomiernie zaszczepij je na 24-dołkowych płytkach o gęstości 2 x 104 komórek / dołek.
      UWAGA: Tutaj wszystkie eksperymenty przeprowadzono w trzech niezależnych kontrpróbach biologicznych (n = 3).
    2. Losowo ponumeruj każdą studzienkę i przypisz studzienki do jednej z czterech grup eksperymentalnych na podstawie tych liczb losowych: grupa kontrolna, grupa β-Ele, grupa β-Ele + LINC00511 nadekspresji (β-Ele + OV-LINC00511) oraz grupa β-Ele + LINC00511 knockdown (β-Ele + si-LINC00511).
  2. Gdy gęstość komórek osiągnie około 70%, wykonaj transfekcję plazmidu i leczenie interferencyjne zgodnie z krokiem 3.3. Po 24 godzinach od transfekcji wyrzucić oryginalną pożywkę i dodać 1 ml roztworu pożywki zawierającego β-Ele (40 μg/ml) do każdego dołka w grupie leczonej lekiem.
  3. Inkubować komórki z EdU do znakowania po potraktowaniu ich 40 μg/ml β-Ele przez 24 godziny. Następnie utrwal komórki 4% paraformaldehydem przez 10 minut i przepuszczaj je 0,5% Triton X-100.
  4. Dodaj roztwór reakcji kliknięcia (przygotowany przez rozpuszczenie jednej fiolki odczynnika dołączonego do zestawu Click Additive w 1,3 ml wody dejonizowanej z dokładnym wymieszaniem) w ciemności i utrzymuj reakcję w ciemności przez 30 minut. Po zakończeniu reakcji przemyć komórki PBS, a następnie wybarwić Hoechst przez 5 minut. Na koniec obserwuj wyniki za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej (ryc. 1 i ryc. 2).
    UWAGA: DMSO jest wysoce przepuszczalną i łatwopalną cieczą. W tym schemacie rozwiązanie administracyjne β-Ele zawiera DMSO. Dlatego po użyciu roztwór do podawania β-Ele należy przelać do specjalnej beczki na zużyte płyny i regularnie przekazywać je do zakładu utylizacji odpadów niebezpiecznych w celu profesjonalnej utylizacji.

6. Wykrywanie zawartości glukozy

UWAGA: Wszystkie eksperymenty przeprowadzono w trzech niezależnych kontrpróbach biologicznych (n = 3).

  1. Losowo wybierz komórki A549 / DDP, które zostały pasażowane do trzeciej generacji po resuscytacji i równomiernie zaszczepij je na 6-dołkowych płytkach o gęstości 1 x 105 komórek / dołek. Losowo ponumeruj każdą studnię i przypisz ją do grup eksperymentalnych na podstawie tych losowych liczb.
  2. Gdy gęstość komórek osiągnie około 70%, przystąp do transfekcji plazmidu i interferencji, jak opisano w kroku 3.3. Po 24 godzinach od transfekcji potraktuj komórki w grupach poddanych działaniu 40 μg/ml β-Ele.
  3. Po 24 godzinach leczenia farmakologicznego należy pobrać górną pożywkę hodowlaną z komórek i odwirować ją pod ciśnieniem 1000 × g przez 5 minut. Zebrać supernatant. Zgodnie z instrukcją dołączoną do zestawu do badania stężenia glukozy (szczegóły w Tabeli Materiałów ) przygotuj roztwór reakcyjny i dokładnie wymieszaj go z supernatantem.
  4. Umieść próbki na 96-dołkowych płytkach z pięcioma powtórzonymi dołkami na grupę. Delikatnie wstrząsnąć płytkami i inkubować je w temperaturze 37 °C przez 10 minut. Zmierzyć absorbancję każdej studzienki za pomocą czytnika mikropłytek o długości fali 505 nm i obliczyć zawartość glukozy, korzystając ze wzoru dostarczonego w zestawie testowym:
    figure-protocol-1
    Tutajnorma C = 5,55 mmol/L, N = współczynnik rozcieńczenia.
    UWAGA: Odpady chemiczne powstające podczas procedur eksperymentalnych muszą być zbierane w wyznaczonych pojemnikach na odpady niebezpieczne i utylizowane przez certyfikowane służby gospodarki odpadami niebezpiecznymi zgodnie z polityką instytucjonalną.

7. Wykrywanie zawartości kwasu mlekowego

UWAGA: Wszystkie eksperymenty przeprowadzono w trzech niezależnych kontrpróbach biologicznych (n = 3).

  1. Losowo wybierz komórki A549 / DDP, które zostały przeniesione do trzeciego pokolenia po resuscytacji i równomiernie zaszczepij je w 6-dołkowych płytkach (1 × 105 komórek / dołek). Losowo ponumeruj każdą studnię i przypisz ją do grup eksperymentalnych na podstawie tych losowych liczb. Gdy gęstość komórek osiągnie około 70%, przystąp do transfekcji plazmidu i interferencji, jak opisano w kroku 3.3. 24 godziny po transfekcji potraktuj komórki w leczonych grupach 40 μg/ml β-Ele.
  2. Po 24 godzinach leczenia farmakologicznego należy pobrać górną pożywkę hodowlaną z komórek i odwirować ją przy 1000 x g przez 5 minut. Zebrać supernatant. Zgodnie z instrukcją zawartą w zestawie do testowania kwasu mlekowego (szczegóły w Tabeli materiałów ) należy przygotować roztwór reakcyjny i dokładnie wymieszać go z supernatantem.
  3. Dodaj łącznie 250 μl próbki do każdego dołka na 96-dołkowej płytce, ustawiając pięć powtórzonych dołków dla każdej grupy. Delikatnie wstrząsnąć płytką i inkubować ją w temperaturze 37 °C przez 10 minut. Zmierzyć absorbancję każdej studzienki przy długości fali 530 nm za pomocą czytnika mikropłytek (szczegółowe informacje znajdują się w Tabeli Materiałów ) i obliczyć zawartość mleczanu, korzystając ze wzoru dostarczonego w zestawie testowym:
    figure-protocol-2
    Tutaj norma C = 3 mmol/L, N = współczynnik rozcieńczenia.
    UWAGA: Odpady chemiczne powstające podczas procedur eksperymentalnych muszą być zbierane w wyznaczonych pojemnikach na odpady niebezpieczne i utylizowane przez certyfikowane służby gospodarki odpadami niebezpiecznymi zgodnie z polityką instytucjonalną.

8. Masowe sekwencjonowanie RNA

  1. Ustanawianie przykładowej bazy danych
    1. Wybierz komórki A549 / DDP do eksperymentu i podziel je na następujące grupy: grupa kontrolna, grupa DDP, grupa β-Ele (40 μg / mL) + DDP (48 μM), grupa β-Ele + DDP + OV-LINC00511 i grupa β-Ele + DDP + si-LINC00511. Uwzględnij 3 próbki w każdej grupie.
    2. Wyodrębnij całkowite RNA z każdej grupy komórek. Użyj zestawu do izolacji mRNA na bazie kulek magnetycznych (szczegółowe informacje można znaleźć w Tabeli materiałów ), aby wzbogacić eukariotyczne mRNA, w którym kulki pokryte oligo(dT) selektywnie wiążą się z ogonami poli(A) mRNA poprzez parowanie zasad AT. Dodać bufor fragmentacyjny (1 μl/μg RNA, szczegółowe informacje można znaleźć w tabeli materiałów ) i inkubować w temperaturze 94 °C przez 7 minut, aby rozdrobnić mRNA na krótkie segmenty.
    3. Kontynuuj syntezę pierwszej nici cDNA przy użyciu losowych starterów heksamerowych zgodnie z instrukcjami producenta. W przypadku syntezy drugiej nici cDNA dodaj odpowiednie ilości buforu reakcyjnego, RNazy H i polimerazy DNA I, aby zakończyć proces.
    4. Przeprowadzić naprawę końców i ogon A na dwuniciowym cDNA przez inkubację w temperaturze 25 °C przez 30 minut (naprawa końcowa), a następnie bezpośrednio w temperaturze 72 °C przez 30 minut (ogon A). Podłącz adaptery sekwencjonowania do naprawionych fragmentów na końcu.
    5. Oczyść i dobierz rozmiarowo ligowane produkty za pomocą magnetycznych kulek krzemionkowych modyfikowanych karboksylem (szczegółowe informacje znajdują się w Tabeli materiałów ). Na koniec skonstruuj bibliotekę sekwencjonowania przez amplifikację PCR.
    6. Po przygotowaniu próbki przeanalizuj bibliotekę sekwencjonowania na platformie DNBSEQ-T7 (szczegółowe informacje można znaleźć w Tabeli materiałów ). Załaduj próbkę do układu mikromacierzy Patterned Array w celu sekwencjonowania.
      UWAGA: Przyrząd zbierał, odczytywał i identyfikował sygnały optyczne za pomocą systemu obrazowania o wysokiej rozdzielczości w celu określenia informacji o sekwencji poszczególnych baz. Następnie wykonaj dodatkowe cykle sekwencjonowania, aby uzyskać sekwencję następujących zasad. Po wielu cyklach wygenerowano surowe dane sekwencjonowania.
  2. Analiza bioinformatyczna
    1. Sekwencjonowanie próbek na maszynie w celu uzyskania nieprzetworzonych danych, znanych również jako dane poza maszyną. Następnie przetwarzaj dane sekwencjonowania za pomocą fastp (v 0.21.0). Usuń odczyty zawierające 3-calowe sekwencje adapterów i wyeliminuj odczyty niskiej jakości ze średnim wynikiem jakości poniżej Q20 w ramach podstawowych kryteriów filtrowania. Przeprowadzaj wszystkie dalsze analizy w oparciu o oczyszczone, wysokiej jakości dane.
      UWAGA: Przeprowadź wstępne filtrowanie danych sekwencjonowania za pomocą fastp. Zapoznaj się z oficjalną dokumentacją zestawów danych transkryptomicznych (https://github.com/OpenGene/fastp#rna-seq-processing), aby uzyskać szczegółowe parametry wiersza polecenia.
    2. Użyj FastQC (v 0.12.0), aby ocenić jakość oczyszczonych danych sekwencjonowania. Wymagania jakościowe są następujące: co najmniej 90% zasad musi mieć wynik jakości wyższy niż Q20, a procent pozostałych sekwencji adapterów nie powinien przekraczać 1%. Dane, które spełniają te kryteria, są uważane za kwalifikowane i mogą być wykorzystywane do dalszej analizy.
      UWAGA: Oceń jakość oczyszczonych danych sekwencjonowania za pomocą FastQC, postępując zgodnie z oficjalnymi wytycznymi (https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/).
  3. Analiza ekspresji genów
    1. Użyj oprogramowania DESeq2, aby przeprowadzić analizę różnicową wyrażeń między dwiema grupami porównawczymi.
      1. Najpierw wprowadź dane do oprogramowania, aby skonstruować zestaw danych DESeq. Następnie odfiltruj geny o łącznej liczbie mniejszej niż 10 we wszystkich próbkach.
      2. Na koniec przeprowadź różnicową analizę genów i wyodrębnij wyniki. Warunki badania przesiewowego genów o zróżnicowanej ekspresji są następujące: krotna zmiana ekspresji |log2FoldChange| > 1, a istotność PADJ ≤ 0,05.
        UWAGA: Aby uzyskać szczegółowe instrukcje obsługi oprogramowania DESeq2, zapoznaj się ze szczegółowymi krokami na oficjalnej stronie internetowej: https://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/DESeq2.html.

9. Wykrywanie zmian poziomu ekspresji białek za pomocą Western blot (WB)

UWAGA: Wszystkie eksperymenty przeprowadzono w trzech niezależnych kontrpróbach biologicznych (n = 3).

  1. Wykonaj Western blot, aby określić ilościowo poziomy ekspresji białek komórkowych.
    1. Losowo wybierz komórki A549 / DDP, które zostały pasażowane do trzeciej generacji po resuscytacji i równomiernie zaszczepij je na 6-dołkowych płytkach o gęstości 1 x 105 komórek / dołek.
    2. Losowo ponumeruj każdą studzienkę i przypisz studzienki do jednej z sześciu grup eksperymentalnych na podstawie tych liczb losowych: Kontrola, β-Ele, OV-LINC00511, si-LINC00511, β-Ele + OV-LINC00511 i β-Ele + si-LINC00511.
    3. Gdy gęstość komórek osiągnie około 70%, wykonaj transfekcję plazmidu i interferencję zgodnie z opisem w kroku 3.3. Po 24 godzinach od transfekcji należy wystawić grupę badaną na działanie β-Ele (40 μg/ml), jednocześnie dostarczając świeże podłoże grupie kontrolnej. Hodowla obu grup przez dodatkowe 24 godziny.
    4. Następnie zebrać granulki komórkowe przez odwirowanie w temperaturze 1675 × g przez 5 minut. Każdą grupę komórek poddać lizie za pomocą 500 μl buforu do lizy RIPA zawierającego 1 mM PMSF na lodzie przez 30 minut (szczegółowe informacje znajdują się w Tabeli Materiałów ).
  2. Odwirować lizaty komórkowe w temperaturze 13 400 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i zebrać supernatant. Zmierz stężenie białka za pomocą zestawu do oznaczania stężenia białka BCA (szczegółowe informacje można znaleźć w tabeli materiałów ). Oddzielić równe ilości próbek białek przez 10% SDS-PAGE i przenieść je do membran z polifluorku winylidenu (PVDF) za pomocą elektroforezy.
  3. Zanurzyć membrany w roztworze blokującym (5% odtłuszczone mleko/sól fizjologiczna buforowana tris z 0,1% Tween-20 (TBST)) na 2 godziny w temperaturze pokojowej i inkubować je przez noc w temperaturze 4 °C z pierwszorzędowymi przeciwciałami przeciwko GLUT1, PKM2, LDHA, β-kateninie, GSK-3β (1:1000) i β-aktynie (1:2000, szczegóły w Tabeli Materiałów ).
    1. Następnego dnia umyj membrany trzykrotnie TBST, po 5 minut każda, w temperaturze pokojowej delikatnie wstrząsając.
  4. Następnego dnia inkubować błony z drugorzędowymi roztworami przeciwciał (kozie przeciwciało IgG znakowane HRP, 1:2000) i delikatnie wstrząsać w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
  5. Na koniec dodaj 0,1 ml/cm2 dostępnego w handlu roztworu chromogenicznego ECL, aby całkowicie pokryć membrany PVDF. Inkubować przez 1 minutę w temperaturze pokojowej przed ekspozycją. Wizualizuj i analizuj pasma za pomocą ulepszonego systemu chemiluminescencji (szczegółowe informacje znajdują się w Tabeli materiałów ). Proszę zapoznać się z Rys. 4C i Rys. 5B.
    UWAGA: Odpady chemiczne powstające podczas procedur eksperymentalnych muszą być zbierane w wyznaczonych pojemnikach na odpady niebezpieczne i utylizowane przez certyfikowane służby gospodarki odpadami niebezpiecznymi zgodnie z polityką instytucjonalną.

10. Analiza statystyczna

UWAGA: Wszystkie eksperymenty przeprowadzono w trzech niezależnych kontrpróbach biologicznych (n = 3).

  1. Uporządkuj dane eksperymentalne według grup i wprowadź je do oprogramowania GraphPad Prism (wersja 8.0.2; szczegóły w Tabeli materiałów ). Wykonywanie wizualizacji danych i analizy istotności statystycznej zgodnie z wytycznymi oprogramowania. Dane pomiarowe wyrażono jako średnią ± odchylenie standardowe. Różnice statystyczne między grupami oceniano za pomocą jednoczynnikowej ANOVA z obliczaniem wielkości efektu η² (eta-kwadrat), a następnie testu wielokrotnych porównańTukeya 26. Uznaj, że **P < 0,01 jest statystycznie istotny.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

β-Ele znacząco hamuje proliferację komórek A549/DDP

W tym eksperymencie stężenia podawane β-Ele i DDP zostały określone na podstawie wyników naszych poprzednich badań20,21. Komórki A549/DDP potraktowano β-Ele, samodzielnie lub w połączeniu z DDP, w celu zbadania jego wpływu na chemooporność DDP. Analiza EdU (ryc. 1) wykazała...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badanie to koncentrowało się na krytycznym zagadnieniu klinicznym, jakim jest oporność na cisplatynę w raku płuca. Rak płuc, odpowiedzialny za największą liczbę zgonów z powodu nowotworów na świecie, nadal ma pięcioletni wskaźnik przeżycia poniżej 20%29,30. Cisplatyna, jako podstawa leków chemioterapeutycznych na bazie platyny, jest skutecznym środkiem przeciwnowotworowym o szerokim spektrum działania, który hamuje replikację DNA, wywierając działanie przeciwnowo...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Żaden z autorów nie ma do zadeklarowania konfliktu interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Finansowanie tego badania zostało zapewnione przez Jilin Provincial Natural Science Foundation w ramach nagrody nr. YDZJ202401058ZYTS.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Ogniwa A549/DDPKomórka ProcellCL-0519 (wersja angielska)Adresy URL:https://www.procell.com.cn/p/a549-ddp--cl-0519
Wyjątkowo czysty stół warsztatowySuzhou Antai AirtechSW-CJ-2FDAdresy URL:http://www.sz-antai.com
Zestaw do oznaczania stężenia białka BCASolarbio (Słoneczna Biologia)Zobacz materiał PC0020Adresy URL:https://www.solarbio.com
Wirówka stołowaThermoPico17 powiedział:Adresy URL:https://www.thermofisher.com
Komora do hodowli komórkowychThermo3111Adresy URL:https://www.thermofisher.com
Naczynie do hodowli komórkowychBIOFILTCD000100Adresy URL:http://www.biofil.com.cn
Analizator chemiluminescencjiInstrumenty Qinxiang 4300Adresy URL:https://www.clinx.cn/about_us
CisplatynaAladdinC295225-250mgAdresy URL:https://www.aladdin-e.com/
Instrument do sekwencjonowania genów DNBSEQ-T7MGI Tech CO., Sp. z o.o.Zobacz materiał T7Adresy URL:https://www.mgitech.cn/
EasyPure  Zestaw mikrogenomicznego DNATransGen BiotechnologiaEE181-01 powiedział:Adresy URL:https://www.transgen.com/
Roztwór chromogeniczny ECLSolarbio (Słoneczna Biologia)PE0010 powiedział:Adresy URL:https://www.solarbio.com
Zestaw detekcji EDUBeyotimeZobacz materiał C0071SAdresy URL:https://www.beyotime.com
Przyrząd znakowany enzymatycznieSprzęt DetieHBS-1096AAdresy URL:https://www.detiebio.cn/
Surowica bydlęca płodu FBS)CLARKFB15015Adresy URL:https://zn.clarkbio.com/
Bufor Frag/Prime Yeasen powiedział:11277ESAdresy URL:https://www.yeasen.com/products/detail/2151
GeneMapper  Oprogramowanie  6ThermoWersja 6Oprogramowanie do analizy fragmentów. Adresy URL:https://www.thermofisher.cn/   
Platforma GenReaderPekin Yuewei Gene Technology Co., Ltd.https://yyigou.com/product/detail/0000037250.htmlZautomatyzowany analizator genetyczny stosowany do elektroforezy kapilarnej
Zestaw do badania stężenia glukozyJiancheng BioA154-1-1Adresy URL:http://www.njjcbio.com
Przeciwciało poliklonalne GLUT1Grupa Proteintech21829-1-APAdresy URL:https://www.ptglab.com
Pryzmat GraphPadOprogramowanie GraphPadWersja 8.0.2Adresy URL:https://www.graphpad.com
GSK-3 i wersja beta; PrzeciwciałoPowinowactwoAF5016 powiedział:Adresy URL:https://www.affbiotech.com
Krótkofalowiec F-12KKomórka ProcellPM150910Adresy URL:https://www.procell.com.cn/
Kulki selekcji DNA Hieff NGSYeasen powiedział:12601ESAdresy URL:https://www.yeasen.com/products/detail/939
Główny zestaw do izolacji mRNA HieffNGSYeasen powiedział:12603ZHAdresy URL:https://www.yeasen.com/products/detail/1119
IgG przeciwko królikom znakowane przez HRPSerwis bioGB23303Adresy URL:https://www.servicebio.cn
Test na mleczanJiancheng BioA019-2-1Adresy URL:http://www.njjcbio.com
Przeciwciało poliklonalne swoiste dla LDHAGrupa Proteintech19987-1-APAdresy URL:https://www.ptglab.com
Cykler świetlny 96RocheLC96 powiedział:Adresy URL:https://lifescience.roche.com
Lipofektamina 2000Invitrogen11668-019Adresy URL:https://www.thermofisher.com/invitrogen
Opti-MEMGibco (firma Gibco)31985-070Adresy URL:https://www.thermofisher.com/gibco
Penicylina-streptomycyna(P/S)Ostrze biologiczneBL505AAdresy URL:https://www.biosharp.cn/
Przeciwciało poliklonalne specyficzne dla PKM2Grupa Proteintech15822-1-APAdresy URL:https://www.ptglab.com
PMSF BeyotimeZobacz materiał ST506Adresy URL:https://www.beyotime.com
Zestaw odczynników PrimeScript RT (Perfect Real Time)TakaraZobacz materiał RR037AAdresy URL:https://www.takarabio.com
Lizat RIPABeyotimeZobacz materiał P0013BAdresy URL:https://www.beyotime.com
Platforma sekwencjonowaniaJęzyk BGIDNBSEQ-T7 (Biblioteka DNBSEQ-T7)Adresy URL:https://www.bgi.com/global
TB Zielony Premiks Ex TaqTakaraPrzekaźnik RR420AAdresy URL:https://www.takarabio.com
Tester śladowych kwasów nukleinowychAosheng InstrumentNano-100Adresy URL:http://www.hzaosheng.com
TRIzon PaICanvax BiotechCW0597SAdresy URL:https://www.canvaxbiotech.com
TrypsynaOstrze biologiczneBL501AAdresy URL:https://www.biosharp.cn/
Zestaw ultraczystego RNA (DNaza I)Canvax BiotechCW0597SAdresy URL:https://www.canvaxbiotech.com
β-Przeciwciało aktynoweGrupa Proteintech60008-1-IGAdresy URL:https://www.ptglab.com
β-katenina Przeciwciało PowinowactwoZobacz materiał DF6794 powiedział:Adresy URL:https://www.affbiotech.com
β-ElemeneSigma63965-25MGAdresy URL:https://www.sigmaaldrich.com

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Thandra, K. C., Barsouk, A., Saginala, K., Aluru, J. S., Barsouk, A. Epidemiology of lung cancer. Contemp Oncol (Pozn). 25 (1), 45-52 (2021).
  2. Huang, J., et al. Distribution risk factors, and temporal trends for lung cancer incidence and mortality: A Global Analysis. Chest. 161 (4), 1101-1111 (2022).
  3. Wang, H., Hu, Y., Lu, H., Wu, Z., Zhang, Y. Association between SOX gene family expression, DNA methylation, and miRNA regulation in lung adenocarcinoma progression. Discov Oncol. 16 (1), 188(2025).
  4. Sung, H., et al. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin. 71 (3), 209-249 (2021).
  5. Qin, Z., et al. Phase separation of EML4-ALK in firing downstream signaling and promoting lung tumorigenesis. Cell Discov. 7 (1), 33(2021).
  6. Wang, X., Wang, H., Jiang, H., Qiao, L., Guo, C. Circular RNAcirc_0076305 promotes cisplatin (DDP) resistance of non-small cell lung cancer cells by regulating ABCC1 through miR-186-5p. Cancer Biother Radiopharm. 38 (5), 293-304 (2023).
  7. La Montagna, M., Ginn, L., Garofalo, M. Mechanisms of drug resistance mediated by long non-coding RNAs in non-small-cell lung cancer. Cancer Gene Ther. 28 (3-4), 175-187 (2021).
  8. Wu, S. G., Shih, J. Y. Management of acquired resistance to EGFR TKI-targeted therapy in advanced non-small cell lung cancer. Mol Cancer. 17 (1), 38(2018).
  9. Altorki, N. K., et al. The lung microenvironment: an important regulator of tumour growth and metastasis. Nat Rev Cancer. 19 (1), 9-31 (2019).
  10. Zhang, H., Wang, Y., Liu, X., Li, Y. Progress of long noncoding RNAs in anti-tumor resistance. Pathol Res Pract. 216 (11), 153215(2020).
  11. Li, H. Q., Fu, X. B., Guo, H. Y., Sun, Y., Wang, D., Zhang, Z. Z. Sevoflurane reverses cisplatin resistance in neuroblastoma cells through the linc00473/miR-490-5p/AKT1 axis. Saudi Medical Journal. 43 (11), 1209-1216 (2022).
  12. Guo, F., Cao, Z., Guo, H., Li, S. The action mechanism of lncRNA-HOTAIR on the drug resistance of non-small cell lung cancer by regulating Wnt signaling pathway. Exp Ther Med. 15 (6), 4885-4889 (2018).
  13. Ren, L., et al. The DDUP protein encoded by the DNA damage-induced CTBP1-DT lncRNA confers cisplatin resistance in ovarian cancer. Cell Death Dis. 14 (8), 568(2023).
  14. Chen, L., et al. H19/miR-107/HMGB1 axis sensitizes laryngeal squamous cell carcinoma to cisplatin by suppressing autophagy in vitro and in vivo. Cell Biol Int. 45 (3), 674-685 (2021).
  15. Peng, X., Li, S., Zeng, A., Song, L. Regulatory function of glycolysis-related lncRNAs in tumor progression: Mechanism, facts, and perspectives. Biochem Pharmacol. 229, 116511(2024).
  16. Kryczka, J., Kryczka, J., Czarnecka-Chrebelska, K. H., Brzeziańska-Lasota, E. Molecular mechanisms of chemoresistance induced by cisplatin in NSCLC cancer therapy. Int J Mol Sci. 22 (16), 8885(2021).
  17. Liu, J., Zhu, Y., Wang, H., Han, C., Wang, Y., Tang, R. LINC00629, a HOXB4-downregulated long noncoding RNA, inhibits glycolysis and ovarian cancer progression by destabilizing c-Myc. Cancer Sci. 115 (3), 804-819 (2024).
  18. Liao, M., et al. Targeting the Warburg effect: A revisited perspective from molecular mechanisms to traditional and innovative therapeutic strategies in cancer. Acta Pharm Sin B. 14 (3), 953-1008 (2024).
  19. Song, Z., Luo, J., Wu, M., Zhang, Z. linc00511 knockdown inhibits lung cancer progression by regulating miR-16-5p/MMP11. Crit Rev Eukaryot Gene Expr. 33 (7), 17-30 (2023).
  20. Cheng, G., et al. β-elemene suppresses tumor metabolism and stem cell-like properties of non-small cell lung cancer cells by regulating PI3K/AKT/mTOR signaling. Am J Cancer Res. 12 (4), 1535-1555 (2022).
  21. Li, L., et al. β-elemene suppresses Warburg effect in NCI-H1650 non-small-cell lung cancer cells by regulating the miR-301a-3p/AMPKα axis. Biosci Rep. 40 (6), BSR20194389(2020).
  22. Yao, C., Jiang, J., Tu, Y., Ye, S., Du, H., Zhang, Y. β-elemene reverses the drug resistance of A549/DDP lung cancer cells by activating intracellular redox system, decreasing mitochondrial membrane potential and P-glycoprotein expression, and inducing apoptosis. Thorac Cancer. 5 (4), 304-312 (2014).
  23. Song, H., et al. β-elemene ameliorates cisplatin resistance of gastric cancer via regulating exosomal METTL3-m6A-ARF6 axis. Cell Biochem Biophys. 83 (2), 2047-2058 (2025).
  24. He, J., et al. β-Elemene promotes ferroptosis and reverses radioresistance in gastric cancer by inhibiting the OTUB1-GPX4 interaction. Front Pharmacol. 15, 1469180(2024).
  25. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  26. Yang, L., Tao, Y., Luo, L., Zhang, Y., Wang, X., Meng, X. Dengzhan Xixin injection derived from a traditional Chinese herb Erigeron breviscapus ameliorates cerebral ischemia/reperfusion injury in rats via modulation of mitophagy and mitochondrial apoptosis. J Ethnopharmacol. 288, 114988(2022).
  27. Zhang, Z., Zhang, Y., Qin, X., Wang, Y., Fu, J. FGF9 promotes cisplatin resistance in colorectal cancer via regulation of Wnt/β-catenin signaling pathway. Exp Ther Med. 19 (3), 1711-1718 (2020).
  28. He, J., et al. Sox2 inhibits Wnt-β-catenin signaling and metastatic potency of cisplatin-resistant lung adenocarcinoma cells. Mol Med Rep. 15 (4), 1693-1701 (2017).
  29. Bray, F., et al. Global cancer statistics 2022: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA Cancer J Clin. 74 (3), 229-263 (2024).
  30. Im, J. Y., et al. CYB5R3 functions as a tumor suppressor by inducing ER stress-mediated apoptosis in lung cancer cells via the PERK-ATF4 and IRE1α-JNK pathways. Exp Mol Med. 56 (1), 235-249 (2024).
  31. Manguinhas, R., et al. Impact of the APE1 Redox Function Inhibitor E3330 in non-small cell lung cancer cells exposed to cisplatin: Increased cytotoxicity and impairment of cell migration and invasion. Antioxidants (Basel). 9 (6), 550(2020).
  32. Jiang, L., et al. HCP5 is a SMAD3-responsive long non-coding RNA that promotes lung adenocarcinoma metastasis via miR-203/SNAI axis. Theranostics. 9 (9), 2460-2474 (2019).
  33. Singh, D., Assaraf, Y. G., Gacche, R. N. Long non-coding RNA mediated drug resistance in breast cancer. Drug Resist Updat. 63, 100851(2022).
  34. Sun, W., Zu, Y., Fu, X., Deng, Y. Knockdown of lncRNA-XIST enhances the chemosensitivity of NSCLC cells via suppression of autophagy. Oncol Rep. 38 (6), 3347-3354 (2017).
  35. Lu, Y., Tian, M., Liu, J., Wang, K. LINC00511 facilitates Temozolomide resistance of glioblastoma cells via sponging miR-126-5p and activating Wnt/β-catenin signaling. J Biochem Mol Toxicol. 35 (9), e22848(2021).
  36. Kong, X. Z., et al. Regulation of aerobic glycolysis by long non-coding RNAs in cancer. Biochem Biophys Res Commun. 479 (1), 28-32 (2016).
  37. Mao, Y., Xia, Z., Xia, W., Jiang, P. Metabolic reprogramming, sensing, and cancer therapy. Cell Rep. 43 (12), 115064(2024).
  38. Vaupel, P., Schmidberger, H., Mayer, A. The Warburg effect: essential part of metabolic reprogramming and central contributor to cancer progression. Int J Radiat Biol. 95 (7), 912-919 (2019).
  39. Ward, P. S., Thompson, C. B. Metabolic reprogramming: a cancer hallmark even warburg did not anticipate. Cancer Cell. 21 (3), 297-308 (2012).
  40. Nagao, A., Kobayashi, M., Koyasu, S., Chow, C. C. T., Harada, H. HIF-1-dependent reprogramming of glucose metabolic pathway of cancer cells and its therapeutic significance. Int J Mol Sci. 20 (2), 238(2019).
  41. Xie, Y., Wang, M., Xia, M., Guo, Y., Zu, X., Zhong, J. Ubiquitination regulation of aerobic glycolysis in cancer. Life Sci. 292, 120322(2022).
  42. Hua, G., Zeng, Z. L., Shi, Y. T., Chen, W., He, L. F., Zhao, G. F. LncRNA XIST contributes to cisplatin resistance of lung cancer cells by promoting cellular glycolysis through sponging miR-101-3p. Pharmacology. 106 (9-10), 498-508 (2021).
  43. Yin, D., Hua, L., Wang, J., Liu, Y., Li, X. Long Non-coding RNA DUXAP8 facilitates cell viability, migration, and glycolysis in non-small-cell lung cancer via regulating HK2 and LDHA by inhibition of miR-409-3p. Onco Targets Ther. 13, 7111-7123 (2020).
  44. Vallée, A. Aerobic glycolysis activation through canonical WNT/β-catenin pathway in ALS. Med Sci (Paris). 34 (4), 326-330 (2018).
  45. Rathee, M., et al. Canonical WNT/β-catenin signaling upregulates aerobic glycolysis in diverse cancer types. Mol Biol Rep. 51 (1), 788(2024).
  46. Li, R., Lv, M., Liu, J., Sun, Q. Tumor necrosis factor receptor-associated protein 1 promotes aerobic glycolysis and cisplatin resistance by regulating the Wnt/β-catenin signaling pathway in lung cancer. Histol Histopathol. , (2024).
  47. Zhao, Q., Chen, L., Zhang, X., Yang, H., Li, Y., Li, P. β-elemene promotes microglial M2-like polarization against ischemic stroke via AKT/mTOR signaling axis-mediated autophagy. Chin Med. 19 (1), 86(2024).
  48. Jiang, Z., Jacob, J. A., Loganathachetti, D. S., Nainangu, P., Chen, B. β-Elemene: mechanistic studies on cancer cell interaction and its chemosensitization effect. Front Pharmacol. 8, 105(2017).
  49. Li, J., Li, Y., Meng, F., Fu, L., Kong, C. Knockdown of long non-coding RNA linc00511 suppresses proliferation and promotes apoptosis of bladder cancer cells via suppressing Wnt/β-catenin signaling pathway. Biosci Rep. 38 (4), BSR20171701(2018).
  50. Tan, Z., et al. Small peptide LINC00511-133aa encoded by LINC00511 regulates breast cancer cell invasion and stemness through the Wnt/β-catenin pathway. Mol Cell Probes. 69, 101913(2023).
  51. Ghafouri-Fard, S., Safarzadeh, A., Hussen, B. M., Taheri, M., Ayatollahi, S. A. A review on the role of LINC00511 in cancer. Front Genet. 14, 1116445(2023).
  52. Liu, J., et al. Targeting Wnt-driven cancer through the inhibition of Porcupine by LGK974. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (50), 20224-20229 (2013).
  53. Wang, W. J., et al. Serum lncRNAs (CCAT2, LINC01133, LINC00511) with squamous cell carcinoma antigen panel as novel non-invasive biomarkers for detection of cervical squamous carcinoma. Cancer Manag Res. 12, 9495-9502 (2020).
  54. Fan, K., Liu, Z., Gao, M., Tu, K., Xu, Q., Zhang, Y. Targeting nutrient dependency in cancer treatment. Front Oncol. 12, 820173(2022).
  55. Liu, B., et al. Knockdown of LINC00511 decreased cisplatin resistance in non-small cell lung cancer by elevating miR-625 level to suppress the expression of leucine rich repeat containing eight volume-regulated anion channel subunit E. Hum Exp Toxicol. 41, 9603271221089000(2022).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Beta elemeneWnt beta kateninaglikoliza tlenowakom rki A549 DDPWestern blotqRT PCRtest EdU
Film wkrótce dostępny

Powiązane artykuły