Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Udoskonalenie OnePot PURE oraz surowej produkcji rybosomów dla powtarzalnej syntezy białek wolnych od komórek

1.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/68826

⸱

22 sierpnia 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Centre for Engineering Biology, Institute of Quantitative Biology, Biochemistry and Biotechnology, School of Biological Sciences, University of Edinburgh, 2Biophoundry Inc.

W tym artykule

Podsumowanie

Przedstawiamy zaktualizowany protokół produkcji systemu OnePot 'Protein Synthesis Using Recombinant Elements' (PURE) oraz prymitywnych rybosomów do syntezy białek wolnych od komórek, koncentrując się na kontrolowaniu wzrostu komórek w celu minimalizacji różnic między partiami.

Streszczenie

Najnowsze osiągnięcia umożliwiły produkcję systemu bezkomórkowego syntezy białek z użyciem elementów rekombinowanych (PURE) w indywidualnych laboratoriach w sposób ekonomiczny i przy mniejszym obciążeniu pracą. Jednak przygotowanie 36 składników białkowych i rybosomu, które tworzą PURE, pozostaje złożonym przedsięwzięciem, z dużym potencjałem na zmienność i błędy. Przedstawiamy szczegółową i zaktualizowaną procedurę produkcji PURE opartą na niedawno opublikowanym protokole OnePot, która obejmuje regulację kilku kluczowych kroków, w szczególności inokulacji hodowli za pomocą zapasów glicerolu o gęstości optycznej (OD), starannego monitorowania wzrostu komórek oraz kontroli końcowych stężeń glicerolu. Stosując to podejście, raportujemy powtarzalne przygotowania PURE od wielu biologicznych replikacji i użytkowników. Protokół ten służy jako punkt odniesienia i punkt wyjścia dla innych laboratoriów do produkcji i rozwiązywania problemów z własnymi systemami PURE, co zwiększa demokratyzację wielu zastosowań, które umożliwia PURE, takich jak budowa systemów biomolekularnych oddolnie czy rozwój syntetycznych komórek.

Wprowadzenie

Synteza białek wolnych komórek (CFPS) rozwinęła się jako technologia do różnych zastosowań, w tym bioprodukcji, biodetekcji i diagnostyki, prototypowania części i szlaków genetycznych oraz metabolicznych, szybkiej inżynierii białek oraz edukacji 1,2. Systemy CFPS wykorzystujące oczyszczone składniki, pierwotnie opracowane jako system3 "Protein Synthesis Using Recombinant Elements" (PURE), oferują szereg zalet w porównaniu z alternatywami opartymi na lizacie. Systemy PURE mają określony skład, składający się z 36 czynników białkowych, rybosomu 70S E. coli oraz określonej mieszaniny substratów chemicznych, w tym nukleozydowych trifosforanów (NTP), aminokwasów i tRNA, które można dowolnie dostosować do wymaganego zastosowania. Dlatego są one wysoce przystosowane do badań takich jak niekanoniczna inkorporacja aminokwasów, modelowanie mechanistyczne oraz konstrukcja systemów biomolekularnych i syntetycznych komórekoddolnych 1. Chociaż PURE jest dostępny u komercyjnych dostawców, jego koszt (0,34-1,63 USD za reakcję 1 μL) jest zbyt wysoki dla eksperymentów na dużą skalę; a alternatywna strategia produkcji PURE we własnej praktyce była jak dotąd utrudniona przez pracochłonne protokoły polegające na równoległym oczyszczaniu 36 białek i rybosomów4, które są trudne do przeprowadzenia w sposób odporny i powtarzalny, szczególnie dla niedoświadczonych użytkowników.

Najnowsze osiągnięcia wspomagają domową produkcję PURE. Na przykład Wang i in. zmodyfikowali szczepy E. coli tak, aby uwzględniały genomowo zintegrowane znaczniki heksa-histydyny na maszynie translacyjnej, co ułatwia jednoetapowe oczyszczanie5. Geny kodujące wszystkie białka PURE zostały złożone w niewielką liczbę plazmidów, które również zostały wykorzystane do zmniejszenia nakładu na oczyszczanie6. Villareal i in. stworzyli eleganckie konsorcja szczepów PURE, które równoważą ekspresję, aby produkować białka w odpowiednim stosunku, jednocześnie umożliwiając jednoetapowe oczyszczanie7.

Innowacyjny system OnePot PURE opracowany przez Lavickovu i in. niesie wielkie obietnice w zakresie łatwości użytkowania 8,9. W tym systemie oryginalne szczepy PURE są współhodowane i oczyszczane poprzez pojedynczy etap chromatografii. Chociaż nie jest możliwe dokładne określenie składu powstałego systemu PURE, autorzy wykazali, że wiele partii systemu jest w dużej mierze powtarzalnych, a przybliżony poziom kontroli można osiągnąć poprzez zmianę objętości szczepu każdego szczepu. Kompromis między precyzyjną kontrolą składu a łatwością produkcji jest akceptowalny dla wielu użytkowników, biorąc pod uwagę, że całkowity wynik syntezy białek z systemu OnePot jest podobny do tego uzyskanego komercyjnie. Jednak mimo szczegółowych protokołów dla systemu OnePot, pełne odtworzenie wyników Lavickovej i in. w innych laboratoriach było trudne. Na przykład zaobserwowano niestabilność wektorów ekspresji, powoli rosnące szczepy oraz proteolizę10.

W niniejszej pracy przedstawiamy szczegółowy i dopracowany protokół OnePot PURE, który kontroluje wzrost komórek poprzez wykorzystujące standaryzowane zapasy glicerolu i korekty podłoża, udziela wskazówek dotyczących monitorowania wzrostu i przedawkowania przedawkowania podczas zbioru oraz normalizuje ilość glicerolu w końcowym oczyszczaniu. Po drugie, przedstawiamy zoptymalizowaną prymitywną procedurę oczyszczania rybosomów wyłącznie z wykorzystaniem różnicowej ultrawirunki, która równoważy kompromis między aktywnością rybosomów a kosztami i złożonością bardziej zaawansowanych metod.

Chociaż wprowadza to więcej kroków do protokołu OnePot, daje użytkownikowi większą możliwość dokładniejszego diagnozowania procedury w razie potrzeby oraz modyfikacji jej do własnych potrzeb. Demonstrujemy powtarzalność procesu, pokazując wiele biologicznych replikacji przeprowadzonych przez wielu użytkowników w tym samym laboratorium. Uważamy, że kontrola zarówno komponentów PURE, jak i przygotowania rybosomu jest kluczowa dla zapewnienia wysokiej wydajności systemu z CFPS.

Przygotowanie PURE i rybosomu trwają odpowiednio 4 lub 5 dni i mogą być wykonywane kolejno przez jednego użytkownika lub jednocześnie przez dwóch użytkowników. Przygotowanie PURE obejmuje 4x500 mL płynnej hodowli, z których każda daje ~2 g pelletu komórkowego i ~1 mL białek PURE w stężeniu ~15 mg/mL. Przygotowanie rybosomów obejmuje 4 × 500 mL = 2 L hodowli ciekłej, co daje łącznie ~3 g granulek komórkowych i daje ~1 mL prymitywnych rybosomów o stężeniu ~17 μM. Obecny protokół generuje systemy PURE o wydajności syntezy do ~100 μg/mL GFP lub ~130 μg/mL mCherry na 2 godziny reakcji partii11, co wypada korzystnie zarówno w porównaniu z oryginalnym OnePot, jak i systemami komercyjnymi (~140-160 μg/mL)8,12. Dlatego jest to odpowiedni punkt wyjścia do dalszej optymalizacji poprzez uzupełnianie lub modulację wrażliwych składników, takich jak sole, czynniki stłoczające i pojedyncze czynniki białkowe.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Protokół podzielony jest na trzy części. Dla zwięzłości i jasności podkreślamy istotne zmiany specyficzne dla tej pracy, dlatego odwołujemy się do szczegółów takich samych jak te w innych publikacjach.

Prace wstępne wystarczy wykonać tylko raz. Cztery sekcje obejmują przygotowanie zapasów glicerolu i talerzy startowych dla białek PURE oraz weryfikację i pomiar czasu ekspresji szczepów. Zastosowanie płytek startowych eliminuje zmienność związaną z bezpośrednią inokulacją z zeskrobowanych zapasów glicerolu. Kluczowe jest, aby prace zostały wykonane dokładnie przed przejściem do etapu produkcji. Ze względu na dużą liczbę różnych zapasów glicerolu zaangażowanych w przygotowanie PURE, niezbędne jest zweryfikowanie integralności i ekspresji plazmidów każdego szczepu przed próbą wyprodukowania systemu.

Schemat przepływu pracy przedstawiono na Rysunku 1, a zalecany harmonogram w Tabeli 1. Wymagane materiały oraz etapy ich wykorzystania są przedstawione w Tabeli Materiałów, a zarys i nośników wymaganych na każdym etapie jest podsumowany w Rysunku Uzupełniającym S1.

1. Prace wstępne

  1. Generowanie zapasów glicerolu
    UWAGA: Wszystkie plazmidy są dostępne od Addgene.
    1. Wygeneruj 25% zapasów glicerolu w/v dla wszystkich szczepów wymienionych w Tabeli 2, zgodnie ze standardowymi procedurami9, i przechowuj w kriovialach w temperaturze -80 °C.
  2. Przygotowanie talerzy startowych PURE (na noc)
    1. Przygotuj 20 mL podłoża LB uzupełnionego 100 μg/mL ampicyliną (LB+AMP).
    2. Oznacz 36x sterylne rurki mikrowirówki o pojemności 1,5 mL od #1 do #36.
    3. Dodaj 500 μL LB+AMP do każdej lampy. Zaszczep każdą probówkę odpowiednim szczepem, używając końcówki pipety, aby zeskrobać niewielką ilość z oryginalnego bulionu glicerolowego. Upewnij się, że zapasy glicerolu się nie rozmrozią. Wir do dokładnego wymieszania.
    4. Z każdej zaszczepionej rurki dodaj 300 μL do odpowiadającej jej studni sterylnej płytki głębokiej o pojemności 1 mL 96, zgodnie z układem pokazanym na Rysunku 2.
      UWAGA: We wszystkich kolejnych etapach dotyczących tablic należy zachować ten sam układ płyt przez cały czas.
    5. Inkubuj płytkę przez noc w potrząsaczce w temperaturze 37 °C, 1000 obr./min przez 15 godzin.
    6. Następnego dnia przygotuj 25 mL podłoża LB uzupełnionego 100 μg/mL ampicyliną (LB+AMP) oraz 15 mL bezpłodnego gliceru 50% (v/v).
    7. Przenieś 30 μL każdej hodowli z płytki głębokiej studni na dno optycznej płyty 96-dołkowej, używając pipety wielokanałowej. Dodaj 270 μL podłoża LB+AMP do każdej studni zawierającej hodowle, aby uzyskać 10-krotne rozcieńczenie każdej kultury.
    8. Zmierz przedawkowanie600 w każdej hodowli za pomocą czytnika płyt. Oblicz objętość każdej hodowli potrzebną do zaszczepienia 650 μL świeżego LB+AMP do początkowego OD600 0,2. Arkusz kalkulacyjny wspomagający obliczenia jest udostępniony jako Tabela Uzupełniająca S1.
    9. Przygotuj trzy nowe sterylne płytki głębokoodwiertowe o pojemności 1 mL 96. Na jednej płytce dodaj 650 μL LB+AMP do 36 dołków i zainokuluj każdą odwierć obliczoną objętością nocnej hodowli, aby uzyskać OD600 = 0,2.
    10. Przelej 300 μL zaszczepionej kultury do pozostałych dwóch płyt. Jedna płytka będzie posłowana, a druga służy do monitorowania przedawkowania. Inkubuj obie płytki w potrząsance płytowej w temperaturze 37 °C, 1000 obr./min, aż hodowle osiągną przedawkowanie600 ~1 (~1,5-2 godziny). Monitoruj przedawkowanie po 1 godzinie, a następnie ponownie w razie potrzeby, usuwając próbki 30 μL z drugiej płyty i dodając do 270 μL LB+AMP, co daje 10-krotne rozcieńczenie.
    11. Gdy poszczególne doły osiągną OD600 ~ 1, wyjmij je z wstrząsaczka. Do każdej hodowli należy dodać równą ilość bezpłodnego glicerolu 50% (v/v), aby uzyskać końcowe stężenie OD600 = 0,5 w 25% gliceroli. Dokładnie wymieszaj i przechowuj te rurki na lodzie. To są główne kolby robocze.
    12. Maksymalnie 40 μL każdego materiału głównego należy umieścić na płytach PCR z 96 dołkami, zachowując oryginalny wzór odwiertu. Rozdziel na jak najwięcej płyt w zależności od pojemności magazynowej. Uszczelnij za pomocą foliowych uszczelek i przechowuj te płytki startowe PURE w temperaturze -80 °C.
      UWAGA: Te płytki startowe powinny być rozmrażane maksymalnie 3 razy. Jeśli przekracza ten limit, wymień na nowe płyty, aby zachować integralność odkształcenia i powtarzalność.
  3. Określanie czasu wzrostu hodowli zakwasowej (przez noc)
    1. Rozmroź talerz startowy PURE na lodzie.
    2. Dodaj 50 μL ampicyliny o stężeniu 100 mg/mL do 50 mL sterylnego nośnika LB w sterylnej stożkowej rurce (LB+AMP).
    3. Oznacz 36 rurek mikrowirówek sterylnych o pojemności 1,5 mL od #1 do #36 i dodaj 1 mL LB+AMP do każdej probówki.
    4. Dodaj po 10 μL każdego z zapasów glicerolu do odpowiedniej oznaczonej rurki i dobrze wymieszaj przez wirowanie.
    5. Dodaj 300 μL zaszczepionej kultury z każdej rurki do odpowiadającej jej studni sterylnej płyty o głębokości 1 mL 96 odwiertów. Zamknąć płytki za pomocą oddychalnej uszczelki i inkubować płytkę hodowlową w potrząsaczce płytowej przy 1000 obr./min, 37 °C. Określić i zapisać czas potrzebny do osiągnięcia OD600 ~2-3 bez przekraczania OD600 = 3. Ustal ten parametr przed dalszą pracą.
      UWAGA: W naszym laboratorium zajmuje to 15 godzin.
  4. Próba ekspresji szczepów PURE
    1. Przygotuj 38 mL podłoża LB wzbogaconego o 100 μg/mL ampicylinę (LB+AMP), 10 mM IPTG oraz 1x odczynnik do ekstrakcji białek.
    2. Rozmroź talerz startowy PURE na lodzie.
    3. Do każdego z 36 odwiertów sterylnej płyty o pojemności 2 mL 96 głębokiej odwiertów należy dodać 1 mL LB+AMP. Zaszczep każdą dołek 20 μL odpowiedniej hodowli startowej. Inkubuj płytkę w shakerze płytowej przy 1000 obr./min, 37 °C, przez około 1 godzinę, czyli do osiągnięcia OD600 = 2.
    4. Indukuj ekspresję białek, dodając 10 μL 10 mM IPTG do każdego dołka, co daje końcowe stężenie IPTG 0,1 mM. Konduj inkubację przez 3 godziny przy 1000 obr./min, 37 °C.
    5. Po upływie 3-godzinnego okresu ekspresji przelej 700 μL każdej hodowli do 36 rurek mikrowirówek sterylnych o pojemności 1,5 mL. Wirówka w 20 000 × g przez 10 minut w 4 °C. Ostrożnie wyrzuć supernatant.
    6. Każdą granulkę ponownie zawiesić w 70 μL reagenta do ekstrakcji białkowej 1x. Inkubuj przez 30 minut w temperaturze pokojowej pod delikatnym poruszeniem, aby umożliwić lizę komórek.
    7. Lizaty w wirówce w dawce 20 000 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C, aby rozpuścić nierozpuszczalną frakcję.
    8. Wykonaj małoskalowe oczyszczanie każdego białka za pomocą His-tag za pomocą kulek magnetycznych Ni-NTA zgodnie z instrukcjami producenta.
    9. Przeanalizuj oczyszczone białka za pomocą SDS-PAGE, aby potwierdzić ekspresję każdego białka i/lub zanieczyszczenie krzyżowe między szczepami9.
      UWAGA: Szczepy ekspresyjne białka będą wykazywać wyraźne pasma na SDS-PAGE odpowiadające oczekiwanej masie cząsteczkowej docelowego białka. Jeśli nie wykryto pasm, szczep może nie wyrażać białka. W takich przypadkach izoluj i sekwencjonuj plazmid, aby potwierdzić tożsamość i integralność sekwencji, a w razie potrzeby wymień plazmid.

2. OnePot PURE oczyszczanie białek (4 dni)

UWAGA: Pojedyncze przygotowanie systemu PURE wymaga przetworzenia 500 mL kultury ciekłej. Zaleca się jednoczesne wytwarzanie 4 x 500 mL preparatów, aby uzyskać cztery niezależne partie PURE w jednym cyklu. Te partie można następnie ilościowo określić niezależnie lub łączyć, jeśli to stosowne. Protokół 4-dniowy można skrócić do 3 dni, wykonując etap inkubacji żywicy w nocy, ale wiąże się to z długim trzecim dniem. Obie opcje szczegółowo opisano poniżej.

  1. Dzień 1: przygotowanie materiałów i wzrost hodowli startowych
    1. Przygotuj roztwory i do przygotowania PURE zgodnie z opisem w Tabeli Uzupełniającej S2 i Rysunku Uzupełniającym S1.
      UWAGA: Przygotuj odpowiednie nośniki i wymagane bezpośrednio przed wykonaniem każdej części protokołu i przechowywaj je tylko przez maksymalną liczbę dni przed użyciem, zgodnie z wskazaniami.
    2. Rozmroź talerz startowy PURE na lodzie.
    3. Dodaj 50 μL ampicyliny 100 mg/mL do 50 mL sterylnego medium LB w sterylnej stożkowej rurce o pojemności 50 mL (LB+AMP).
    4. Oznacz 36 rurek sterylnych mikrowirówek o pojemności 1,5 mL w rozmiarach #1-#36 i dodaj 1 mL LB+AMP do każdej probówki.
    5. Dodaj po 10 μL każdego z zapasów glicerolu do odpowiedniej oznaczonej rurki i dobrze wymieszaj przez wirowanie.
      UWAGA: Aby łatwo śledzić inokulację każdego szczepu, po dodaniu odkształcenia do każdej rurki należy wyrzucić końcówkę pipety do odpowiedniej jamy płytki startowej PURE. Powtarzaj ten proces dla wszystkich szczepów. Po zakończeniu ostrożnie zdejmij końcówki pipety z płyty, następnie ponownie zabezpiecz ją folią i taśmą autoklawową oraz przechowywaj w temperaturze -80°C.
    6. Dodaj 300 μL zaszczepionej kultury z każdej rurki do odpowiadającej jej studni sterylnej płyty o głębokości 1 mL 96 odwiertu, z wyjątkiem szczepu #25 (EF-Tu). Uszczelnij płyty oddychającą plombą płytową. Inkubuj płytkę hodowlę w potrząsaczce płytowej przy 1000 obr./min, 37 °C, przez 14 godzin.
    7. Dodaj 1 mL zaszczepionej kultury z probówki #25 do 10 mL LB w stożkowej probówce o pojemności 50 mL, aby przygotować hodowlę startową EF-Tu. Inkubuj probówkę w inkubatorze przy 260 obr./min, 37 °C przez 14 godzin.
      UWAGA: Szczep #25, EF-Tu, jest wymagany w znacznie wyższym stężeniu niż pozostałe składniki i dlatego jest przetwarzany oddzielnie, zgodnie z oryginalnym protokołem8.
    8. Włóż 2 litry sterylnego medium 2x YTP do szklanej butelki o pojemności 2 litrów i umieść w inkubatorze statycznym w temperaturze 37°C, aby podgrzać go przez noc.
  2. Dzień 2: wzrost i granulowanie
    1. Przygotuj wymagane odczynniki:
      1. 2 litry sterylnego, podgrzanego materiału 2x YTP (od pierwszego dnia)
      2. 2 mL ampicyliny o stężeniu 100 mg/mL
      3. 100 mM IPTG, sterylne
      4. 100 mL PBS, sterylny, lodowato zimny
      5. Nośniki LB 10 mL
    2. Przelej 30 μL każdej kultury rozruszającej z płytki głębokiej studni startowej oraz rurki rozruszającej EF-Tu na dno optycznej płyty 96-dołkowej, używając pipety wielokanałowej.
    3. Dodaj 270 μL podłoża LB do każdej studni zawierającej kultury, aby uzyskać 10-krotne rozcieńczenie każdej kultury.
    4. Zmierz przedawkowanie600 w każdej hodowli za pomocą czytnika płyt. Wszystkie odkształcenia powinny być ustawione przy OD600 = 2-3.
      UWAGA: Jeśli hodowla przerosła powyżej OD600 = 3, rozcieńcz do OD600 = 3, używając 2x YTP+AMP (Tabela Uzupełniająca S1). Rozcieńczanie przeroślonych zakwasów może być czasochłonne i podatne na błędy. W związku z tym zaleca się ustalenie dokładnego czasu inkubacji wymaganego do osiągnięcia OD600 2-3, zgodnie z opisem w Sekcji 1.3 prac wstępnych.
    5. Przelej 500 mL podgrzanego medium 2x YTP oraz 500 μL ampicyliny 100 mg/mL do sterylnej kolby 2,5 L z przegrodą (2x YTP+AMP).
    6. Do jednej sterylnej stożkowej rurki o pojemności 15 mL dodaj po 55 μL każdej hodowli z płyty zapoczątkowającej oraz 1675 μL kultury EF-Tu. Dobrze mieszaj przez wirowanie.
      UWAGA: To jest kultura OnePot, która łączy wszystkie szczepy PURE razem. Na tym etapie można tworzyć systemy knockout (ΔPURE), pomijając niektóre odkształcenia, lub można dodać inne komponenty wymagające współoczyszczania.
    7. Dodaj zawartość tej probówki do 2,5 l kolby z przegrodami zawierającej 500 mL 2x YTP+AMP. Powtórz kroki 5-7, aby uzyskać 4x niezależne hodowle.
    8. Inkubuj kolby w temperaturze 260 obr./min, 37 °C, przez 1,5-2 godziny, aż OD600 = 0,2-0,3.
    9. Po osiągnięciu OD600 = 0,2-0,3, zaszczep każdą kolbę 500 μL 100 mM IPTG, aby uzyskać końcowe stężenie indukcyjne 0,1 mM IPTG.
    10. Inkubuj hodowle przez kolejne 3 godziny przy 260 obr./min, 37 °C.
    11. Podczas inkubacji zważ i oznacz cztery sterylne stożkowe probówki o pojemności 50 mL.
    12. Wirówki wstępne do 4 °C w razie potrzeby oraz oznakowanie i wstępne schładzanie czterech butli w wirówkach z kopolimerem polipropylenowym.
    13. Umieść cztery oznaczone butelki szklane o pojemności 500 ml do kąpieli z lodowatą wodą.
    14. Po 3-godzinnej inkubacji ostrożnie przelej każdą hodowlę do szklanej butelki na lodzie, aby zakończyć wzrost.
      UWAGA: Przeniesienie hodowli do schłodzonych butelek jest niezbędne, aby szybko zatrzymać wzrost: umieszczenie gorących kolb bezpośrednio w kąpieli w lodowatej wodzie nie spowoduje skutecznego zatrzymania wzrostu. Wszystkie kolejne etapy wykonuje się na lodzie, chyba że zaznaczono inaczej.
    15. Dodaj 250 ml każdej hodowli do odpowiednich butelek wirówek i wiruj w 3 220 × g, 4 °C, przez 10 minut, a pozostałe 250 ml pozostaje w kąpieli lodowatej.
    16. Ostrożnie przelej supernatant i wysusz na ręcznikach papierowych.
    17. Dodaj pozostałe 250 ml z każdej hodowli do odpowiednich butelek wirówek i ponownie wiruj w 3 220 × g, 4 °C, przez 10 minut.
    18. Ostrożnie przelej supernatant i wysusz na ręcznikach papierowych.
    19. Dodaj 20 ml sterylnego, lodowatego PBS do każdej butelki do wirówki i dokładnie zawiesz osad osad komórkowy.
    20. Przelej każdą respensję do przygotowanych 50 mL stożkowych probówek.
    21. Wiruj probówki w 2 000 × g, 4 °C, przez 8 minut.
    22. Usuń supernatant przez ostrożne przelewanie.
    23. Ponownie wiruj rurki w 2 000 × g, 4 °C, przez 2 minuty.
    24. Usuwaj pozostałości supernatantu przez pipetowanie i trzymaj granulki komórkowe na lodzie.
    25. Każda probówka zawiera teraz osad komórkowy z pojedynczej hodowli 500 mL. Waż każdą probówkę, obliczaj masę osadu ogniwa (zazwyczaj ~2 g), odejmując masę pustą każdej probówki, i zapisuj.
    26. Zamroz granulki komórkowe i przechowuj w temperaturze -80 °C aż do lizy.
      UWAGA: Opcjonalnie protokół może zostać ukończony w ciągu 3 dni, przechodząc bezpośrednio do etapu lizy na tym etapie.
  3. Dzień 3: liza, oczyszczanie i dializa
    1. Przygotuj wymagane odczynniki:
      1. Przygotuj 50 ml bufora resuspendacyjnego.
      2. Przygotuj 0,5 M TCEP.
    2. Rozmrażajcie granulki komórkowe na lodzie.
    3. Należy zastosować 50 mL bufora resuspension do stożkowej rurki o pojemności 50 mL i dodać 100 μL 0,5 M TCEP. Dobrze mieszaj przez wirowanie.
    4. Ponownie zawiesnij pellety komórkowe w buforze resuspendacyjnym + TCEP w proporcji 2 mL na 1 g pelletu komórkowego. Dokładnie Vortex, aby ponownie zawiesić.
    5. Rozprowadź zawiesinę ogniwową w stożkowych rurkach o pojemności 50 mL tak, aby każda miała 5 mL zawiesiny. Oznacz rurki zgodnie z potrzebami, aby śledzić 4 niezależne kultury. Przechowywać na lodzie.
    6. Limfocyty lizowe przez sonakację z amplitudą 30%, 20 sekund włączone, 20 sekund przerwane, przez 10 cykli w kąpieli wodnej z użyciem schłodzonej sondy sondowej (Rysunek 3A,B).
      UWAGA: Podczas sonakacji do każdej rurki powinno zostać przekazane około 1000 J energii. Używaj zabezpieczonego podstawka, aby utrzymać rurkę na miejscu podczas sonifikacji, aby zapewnić spójność transferu energii.
    7. Rozprowadz lizat do 2 mL sterylnych mikrowirówek, tak aby każda zawierała 1 ml lizatu. Powtórz kroki 2.3.6 i 2.3.7, aby zlizować wszystkie cztery kultury. Następujące kroki wykonywane są dla 4 lizatów równolegle.
    8. Wirówka w 15 923 × g, 4 °C, przez 20 minut.
    9. Podczas wirowania przemyj i wyrównaj 5 mL żywicy oczyszczającej białko (przygotuj cztery kolumny dla czterech lizatów):
      1. Dodaj 2 mL świeżej żywicy do oczyszczania białek do kolumny chromatografii grawitacyjnej.
      2. Dwukrotnie przemyj kolumnę 30 mL sterylnej wody destylowanej, aby usunąć etanol magazynowany.
      3. Uzupełnij 30 mL buforu resuspendacyjnego o 60 μL 0,5 M TCEP do końcowego stężenia 1 mM.
      4. Ponieważ kolumna ma objętość 30 mL, wlej bezpośrednio do kolumny, aby ją napełnić. Upewniając się, że zawór jest zamknięty, wyrównaj kolumnę, dodając 30 mL bufora resuspension + TCEP.
      5. Otwórz zawór, aby przepuścić ~25 mL bufora, a następnie zamknąć zawór kolumnowy, zostawiając ~5 mL bufora nad warstwą żywicy, aby zapobiec wyschaniu. Kolumna jest już gotowa do użycia.
    10. Po wirowaniu połącz cały klarowany, wolny od pelletów supernatant z każdej hodowli w 4x świeże stożkowe rurki o pojemności 50 mL na lodzie.
    11. Ponownie zawiesij żywicę w pozostałych 5 ml buforu resuspension + TCEP w każdej kolumnie i dodaj bufor oraz żywicę do każdej stożkowej rurki zawierającej nadnadanek lizatanowy.
    12. Zamknij i zabezpiecz pokrywkę Parafilmem, a następnie inkubuj w rożnie w shakerze do rożna w temperaturze 4 °C przez 5 godzin.
      UWAGA: Jeśli liza została wykonana bezpośrednio po wzroście, lizat ten może być inkubowany żywicą przez noc.
    13. Przygotuj wymagane odczynniki:
      1. Dodaj TCEP w końcowym stężeniu 1 mM do płuczki i elucijnej i przechowuj w temperaturze 4 °C do czasu użycia.
      2. Miej gotowy etanol 20% (v/v).
    14. Po inkubacji krótko pulsuj rurki w wirówce, aby zebrać żywicę na dno rurki.
    15. Ponownie zawiesij żywicę za pomocą pipety i dodaj ją z powrotem do kolumny oczyszczającej białka.
    16. Gdy żywica osiada w warstwie na dole kolumny, pozwól buforowi przejść.
      UWAGA: Opcjonalnie należy zbierać przepływ i płukanie podczas oczyszczania białek do analizy za pomocą SDS-PAGE w celu rozwiązania problemów z procedurą oczyszczania
    17. Kolumna płuczka z jedną kolumną objętości bufora płukania + TCEP.
    18. Dodaj 5 mL Bufora Elution + TCEP do kolumny, kilka razy ponownie zawiesij żywicę pipetą i inkubuj przez 10 minut.
    19. Po inkubacji zbierz elucię do oznaczonej rurki bijoux o pojemności 5 mL i przechowuj ją w lodzie.
    20. Oczyść i przechować żywicę oczyszczającą białko:
      1. Po zakończeniu elucii przemyj kolumnę 30 mL buforu elucijnego, aby usunąć pozostałe związane białka.
      2. Przepłucz żywicę 30 ml sterylnej wody destylowanej, powtarzaj 3 razy.
      3. Przepuszcz 30 mL etanolu 20% (v/v) przez kolumnę raz.
      4. Napełnij kolumnę 20% etanolem i zabezpiecz pokrywką lub parafilmem. Przechowywać w temperaturze 4 °C do następnego użycia.
        UWAGA: Wymagane jest tylko sprzątanie – nie próbuj zdzierać niklu z żywicy. Oczyszczona żywica jest odpowiednia do ponownego użycia w standardowych przygotowaniach systemu PURE; jednak w wariantach systemu ΔPURE zawsze używaj świeżej żywicy, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego.
    21. Namocz kasetę dializową o pojemności 15 mL 2 kDa w Buffer HT (bez TCEP) przez 10 minut.
    22. Dodaj 5 mL roztworu białka eluowanego do kasety dializy.
    23. Usuń jak najwięcej powietrza z kasety przed ponownym założeniem pokrywy.
    24. Dializuj 5 ml eluowanego białka przeciwko 1 litrowi buforowego HT (bez TCEP) przez 2 godziny, a następnie kolejne 1 litr świeżego buforowego hormonu przez noc w 4 °C z delikatnym mieszaniem.
      UWAGA: Jeśli łączy się eluzje z wielu oczyszczań, można dializować do 10 ml elucii względem 2 litrów buforowego HT przez 2 godziny, a następnie kolejnych 2 litrów buforowego HT przez noc w temperaturze 4 °C. Jeśli inkubacja żywicy była przeprowadzana przez noc, dializę można przeprowadzić w ciągu dnia według protokołu trwającego 2 godziny, następnie 4 godziny, a następnie zaraz po poniższych etapach stężenia białka.
  4. Dzień 4: koncentracja i przechowywanie
    1. Przygotowanie niezbędnych odczynników:
      1. Przygotuj odświeżanie HT bufora + TCEP.
      2. Przygotuj Stock-60 + TCEP.
    2. Po zakończeniu dializ należy usunąć 5 mL zdializowanej próbki z kasety i rozprowadzić 500 μL alikwotów do 5 x 2 mL sterylnych mikrowirówek.
    3. Skręcaj, aby wytrącić wytrącone białka w ilości 14 000 × g, 4 °C, przez 10 minut.
    4. Ponownie połącz supernatant bez granulek i dodaj do odśrodkowego filtra MWCO o mocy 3 kDa, uzupełniając objętość o 10 mL Buffer HT Refresh + TCEP.
    5. Wirować w 3 220 × g, 4 °C, przez 30 minut OR, aż objętość próbki zmniejszy się do 1,5 mL.
      UWAGA: Wytrącanie białek podczas etapów stężenia może znacząco obniżyć ogólną wydajność CFPS. Po każdym 30-minutowym cyklu wirowania użyj pipety o pojemności 1 mL, aby ponownie zawiesić próbkę w rurce filtra odśrodkowego, aby usunąć wytrącone białka z dna filtra.
    6. Pobierz próbkę z jednostki odśrodkowej i rozprowadz 500 μL aliquotów do 3 x 2 mL sterylnych probarek mikrowirówek.
    7. Skręcaj, aby wytrącić białka wytrącone w granulacji 14 000 × g, 4 °C, przez 10 minut.
    8. Połącz supernatant bez granulek z nową sterylną rurką mikrowirówki na lodzie.
    9. Określ stężenie białek w roztworze za pomocą testu Bradforda, zgodnie z instrukcjami producenta.
    10. Roztwór białka skoncentruj przez dodanie do świeżego filtra MWCO o mocy 3 kDa i wirowanie w 14 862 × g, 4 °C, przez 15 minut OR aż do osiągnięcia objętości próbki, aby uzyskać końcowe stężenie 25-30 mg/mL.
    11. Pobierz próbkę z jednostki odśrodkowej i rozprowadz 500 μL aliquotów do 2 mL sterylnych mikrowirówek.
    12. Skręcaj, aby wytrącić białka wytrącone w granulacji 14 000 × g, 4 °C, przez 10 minut.
    13. Określ stężenie białka za pomocą testu Bradforda. Przejdź do kolejnego kroku tylko wtedy, gdy stężenie wynosi od 25 do 30 mg/mL.
    14. Ponownie połącz supernatant bez granulek w świeżej rurce mikrowirówki na lodzie.
    15. Dodaj równą ilość Stock-60 + TCEP do skoncentrowanego roztworu białkowego i wymieszaj delikatnie pipetowaniem.
    16. Określ końcowe stężenie białka za pomocą testu Bradforda.
      UWAGA: Białko jest obecnie w buforze HT + 30% glicerolu, a każde dodatkowe rozcieńczenie Stock-30 nie zmienia stężenia glicerolu.
    17. W razie potrzeby rozcieńcz próbkę Stock-30 + TCEP, aby uzyskać końcowe stężenie około 12,5 mg/mL.
    18. Aliquot roztwór białka PURE w probówkach PCR o pojemności 20 μL aliquotów, zamrożenie w ciekłym azocie i przechowywanie w temperaturze -80 °C.
      UWAGA: Kluczowe jest dokładne określenie stężenia białka przed dodaniem Stock-60, ponieważ koncentrujące roztwory białkowe zawierające glicerol mogą powodować nierówne działanie CFPS, z powodu zmiennych ilości glicerolu w końcowej reakcji CFPS. Zapas-60 powinien być więc dodawany dopiero po potwierdzeniu, że stężenie białka mieści się w optymalnym zakresie 25-30 mg/mL.

3. Prymitywne przygotowanie rybosomów (5 dni)

UWAGA: Protokół oczyszczania rybosomów został zoptymalizowany do przetwarzania 2 L (4 kolby o pojemności 500 mL) hodowli ciekłej, co daje łącznie ~3 g granulatu komórkowego i daje ~1 mL surowych rybosomów w stężeniu 15-24 μM.

  1. Dzień 1: przygotowanie i wzrost hodowli startowych
    1. Przygotuj roztwory i dla przygotowania rybosomu, zgodnie z opisem w Tabeli Uzupełniającej S2 i Rysunku Uzupełniającym S1.
      UWAGA: przygotuj odpowiednie nośniki i wymagane bezpośrednio przed uruchomieniem każdej części protokołu i przechowuj tylko przez maksymalną liczbę dni przed użyciem, zgodnie z wskazaniami.
    2. Przygotuj dwie stożkowe probówki o pojemności 50 mL: dodaj 10 mL medium LB do jednej probówki i 5 mL medium LB do drugiej.
    3. Wyjmij bulion glicerol BL21(DE3) z zamrażarki o temperaturze -80 °C i umieść na lodzie, aby upewnić się, że kolejne kroki zostaną ukończone przed rozmroziem.
    4. Zaszczep 10 mL podłoża LB skrobem komórek z zapasu glicerolowego, aby stworzyć "mini-kulturę" LB. Inkubuj w temperaturze 37 °C, 220 obr./min, razem z drugą (niezaszczepioną) rurką, aby sprawdzić zanieczyszczenie podłoża, ponieważ wszystkie przyrosty odbywają się bez antybiotyku.
    5. Wymień bulion glicerol w zamrażarce o temperaturze -80 °C.
    6. Włóż 2,2 litra sterylnego bulionu Terrific (TB) do sterylnych szklanych butelek i przechowuj w inkubatorze statycznym w temperaturze 37 °C, aby podgrzać go na noc.
  2. Dzień 2: wzrost i granulowanie
    1. Usuń hodowle z inkubatora i upewnij się, że nie ma zanieczyszczenia w tubce niezaszczepionej lub podgrzanej butelce przed rozpoczęciem leczenia.
    2. Przygotuj rozcieńczenie 10-krotnie, dodając 100 μL kultury mini-hodowli do 900 μL LB w kuwecie o średnicy 1 cm, a następnie zmierz OD600 spektrofotometrem (sprawdź, czy wynosi ~4-6).
    3. Dodaj 200 mL wcześniej podgrzanej TB do sterylnej kolby stożkowej o pojemności 500 mL i zaszczep odpowiednią objętością mini-hodowli, aby uzyskać początkowy przedawkowanie600 = 0,05 (Tabela Uzupełniająca S1). To jest "kultura midi".
    4. Inkubuj hodowlę midi-kulturę w temperaturze 37 °C, 220 obr./min aż do OD600 = 1, co powinno zająć około 1,5-2 godzin.
    5. Dodaj 500 mL TB do każdego z 4 sterylnych kolb 2,5 L z przegrodą. Zaszczep każdy odpowiednią objętość kultury midi, aby uzyskać początkowy OD600 = 0,05 (Tabela Uzupełniająca S1). To są 4 "maxi-kultury".
    6. Inkubuj maksykultury w temperaturze 37 °C, 220 obr./min do przedawkowania600 = 0,7-0,8, co powinno zająć około 1,5-2 godzin.
    7. W międzyczasie oznacz i umieść na lodzie cztery czyste butelki z kopolimerem polipropylenowym oraz 4 czyste butelki szklane po 500 mL, aby schłodziły.
      UWAGA: Mierz gęstość maksymalnej hodowli co 15 minut po 1 godzinie wzrostu, aby uniknąć przekroczenia OD600 = 0,7.
    8. Gdy osiągniesz OD600 = 0,7, szybko przełóż hodowle do schłodzonych szklanych butelek i umieść w kąpieli wodnej lodowej na 20 minut, aby zakończyć wzrost.
      UWAGA: Przeniesienie hodowli do schłodzonych butelek jest niezbędne do szybkiego zatrzymania wzrostu: umieszczenie kolb bezpośrednio w kąpieli z wodą lodowatą nie spowoduje skutecznego zatrzymania wzrostu. Wszystkie kolejne etapy wykonuje się na lodzie, chyba że zaznaczono inaczej.
    9. Podczas chłodzenia hodowli w kąpieli lodowej należy podgrzewać wirówkę do granulowania komórek i umieścić 500 ml roztworu PBS na lodzie do ostygnięcia.
    10. Po 20 minutach przelej 250 ml każdej hodowli do odpowiedniej wcześniej schładzonej butelki wirówki i wiruj w 3 220 × g, 4 °C, przez 10 minut, a pozostałe 250 ml trzymaj w lodzie.
    11. Ostrożnie przelej supernatant i wysusz na ręcznikach papierowych.
    12. Dodaj pozostałe 250 ml każdej hodowli do odpowiedniej butelki wirówki i ponownie wiruj w 3 220 × g, 4 °C, przez 10 minut.
    13. Usuń supernatant przez przelewanie i wysusz butelki na ręcznikach papierowych, zanim ponownie umieścisz granulki komórkowe na lodzie.
    14. Dodaj 30 ml sterylnego, lodowatego PBS do każdej butelki do wirówki i dokładnie ponownie zawiesij granulki komórkowe.
    15. Waż i oznaczaj 4x czyste stożkowe rurki o pojemności 50 mL.
    16. Przenieś zawiesinę ogniwa do stożkowych rurek o pojemności 4 x 50 mL.
    17. Ponownie wirować w 3 220 × g, 4 °C, przez 10 minut.
    18. Usuń supernatant przez przelewanie i wysusz rurki na ręcznikach papierowych, zanim ponownie umieścisz granulki komórkowe na lodzie.
    19. Dodaj 30 ml sterylnego, lodowatego PBS do każdej stożkowej rurki i dokładnie zawiesz pellet komórkowy poprzez wirowanie.
    20. Ponownie wirować w 3 220 × g, 4 °C, przez 10 minut.
    21. Usuń supernatant przez przelewanie i wysusz rurki na ręcznikach papierowych, zanim ponownie umieścisz granulki komórkowe na lodzie.
    22. Dodaj 30 ml sterylnego, lodowatego PBS do każdej stożkowej rurki i dokładnie zawiesz pellet komórkowy poprzez wirowanie.
    23. Ponownie wirować w 3 220 × g, 4 °C, przez 10 minut.
    24. Usuń supernatant przez przelewanie i wysusz butelki na ręcznikach papierowych, zanim ponownie włożysz granulki komórkowe na lód.
    25. Ostatni raz wiruj w 3 220 × g, 4 °C, przez 2 minuty.
    26. Usuń nadmiar supernatantu przez pipetowanie.
    27. Zważ i zapisz masę każdej stożkowej lampy. Masa pelletu komórkowego to różnica między tymi wartościami a masą pustą rurek (powinna wynosić ~1 g).
    28. Rozmraź pellety ogniowe za pomocą ciekłego azotu i przechowuj w temperaturze -80 °C.
  3. Dzień 3: liza, ultrawirowanie i moczenie w Buffer B
    1. Rozmrażajcie granulki komórkowe na lodzie.
    2. Dodaj 50 ml buforu rybosomowego A do czystej stożkowej rurki.
    3. Weź 100 μL buforu rybosomowego A z stożkowej rurki i dodaj do fiolki DTT bez wagi. Całkowicie rozpuszcz pellet DTT, aby uzyskać 0,5 m materiału DTT.
      UWAGA: Przygotuj kolejne 0,5 mln akcji DTT, jak opisano tutaj, ale z wykorzystaniem odpowiedniego bufora dla każdego etapu.
    4. Dodaj 100 μL 0,5 M DTT z powrotem do 50 mL stożkowej rurki, aby uzyskać końcowe stężenie 1 mM DTT w 50 mL Ribosom Buffer A. Utrzymuj roztwór na lodzie.
    5. Każdą granulkę komórkową ponownie zawiesić w buforze rybosomowym A + DTT, w proporcji 2 mL na 1 g granulki komórkowej, poprzez dokładne wirowanie. Połącz wszystkie komórki zawieszone w jednej stożkowej probówce, aby zweryfikować całkowitą objętość zawiesiny – powinna wynosić 10 ml z 2 L hodowli. Jeśli trzeba, uzupełnij objętość do 10 mL dodatkowym buforem rybosomowym A + DTT.
    6. Podziel zawiesinę na 2 x 5 mL próbki w oddzielnych stożkowych probówkach.
    7. Lizuj komórki w każdej probówce za pomocą sonakacji o amplitudzie 30%, 20 sekund włączone, 20 sekund wyłączone przez 10 cykli (całkowity czas trwania programu 3 min 20 sekund), w kąpieli wodnej lodowatej, używając schłodzonej sondy sonifikacyjnej (Rysunek 3A, 3C).
      UWAGA: Podczas sonifikacji powinno być przekazane około 1 000 J energii na probówkę. Używaj zabezpieczonego podstawka, aby utrzymać rurkę na miejscu podczas sonnikowania i zapewnić spójność transferu energii.
    8. Uzupełnij objętość każdej próbki lizowanej do 25 mL z buforem rybosomowym A + DTT i krótko przemieszaj do wymieszania.
    9. Przelej zawartość do 2x chłodzonych rurek wirówek S30.
    10. Wirówka w 30 000 × g przez 1 godzinę w 4 °C (rysunek 3E).
    11. Odzyskać maksymalnie 75% supernatantu wolnego od granulek (aby uniknąć zanieczyszczenia błony przez granulki) z każdej rurki S30 do dwóch czystych, wstępnie schładzonych rurek S30.
    12. Wirówka w 30 000 × g przez 30 minut w temperaturze 4 °C.
    13. Odzyskaj maksymalnie 75% supernatantu wolnego od granulek do dwóch czystych stożkowych rurek o pojemności 50 mL i uzupełnij objętość każdej do 25 mL buforem rybosomowym A + DTT.
    14. Przelej próbkę do dwóch czystych, schłodzonych probówek S100.
      UWAGA: Upewnij się, że rurki są dokładnie wyważone (maksymalna różnica 0,01 g między przeciwległymi rurkami) przed ultrawirowaniem i napełnione do objętości 25 mL (maksymalna pojemność probówki S100).
    15. Wirówka w 100 000 × g przez 4 godziny w 4 °C (rysunek 3F).
    16. Trzydzieści minut przed końcem cyklu S100 przygotuj 0,5 M DTT z użyciem lodowatego buforu rybosomowego B zgodnie z powyższymi instrukcjami i wygeneruj ostateczny roztwór 1 mM DTT w 50 mL buforu rybosomowego B.
    17. Usuń supernatant z rurek ultrawirówki przez dekantowanie. Dodaj 5 ml lodowatego Ribosom Buffer B + DTT do każdej probówki S100 zawierającej pellet rybosomalny. Pozostały bufor rybosomu B + DTT przechowuj w temperaturze 4 °C do użycia następnego dnia.
    18. Inkubuj rurki na lodzie w zimnym pomieszczeniu, aby pellet rybosomu nasiąkł w Ribosom Buffer B + DTT na noc.
      UWAGA: Upewnij się, że pellet rybosomu jest całkowicie zanurzony w Buforze Rybosomowym B + DTT. Można to osiągnąć, umieszczając rury w lodzie pod kątem (rysunek 3D).
  4. Dzień 4: ultrawirówka i moczenie w Buffer C
    1. Następnego dnia dodaj kolejne 5 ml lodowatego Ribosom Buffer B + DTT do każdej probówki S100 zawierającej pellet rybosomu namoczony przez noc.
    2. Delikatnie próbuj ponownie zawiesić pellet przez pipetowanie. Użyj końcówki pipety, aby zeskrobać granulki ze ściany rury i zawiesić je w ten sposób. Przelej zawartość do dwóch czystych, wstępnie schłodzonych rurek S30.
    3. Dodaj kolejne 10 ml lodowatego Ribosom Buffer B + DTT do każdej probówki S100 zawierającej pellet rybosomu i powtórz kroki zawieszania jak powyżej.
    4. Złóż zawieszenie do tej samej rurki S30 co wcześniej.
    5. Wirówka w 30 000 × g przez 1 godzinę w 4 °C (rysunek 3G).
    6. Odzyskaj maksymalnie 75% supernatantu wolnego od pelletów do dwóch czystych stożkowych probówek po 50 mL i uzupełnij objętość do 25 mL Ribosom Buffer B + DTT.
    7. Przelej tę próbkę do dwóch czystych, schłodzonych probówek S100.
      UWAGA: Upewnij się, że probówki są dokładnie wyważone przed ultrawirowaniem i napełnione do objętości 25 mL (maksymalna pojemność probówki S100).
    8. Wirówka w 100 000 × g przez 4 godziny w temperaturze 4 °C (rysunek 3H).
    9. Trzydzieści minut przed końcem cyklu S100 przygotuj zapas DTT o pojemności 0,5 M, używając lodowatego Ribosom Buffer C, zgodnie z powyższymi instrukcjami, i wygeneruj ostateczny roztwór 1 mM DTT w 5 mL Ribosom Buffer C. Trzymaj ten bufor na lodzie.
    10. Po ultrawirowaniu usuń supernatant i usuń resztki buforu przez pipetowanie. Pracuj szybko, aby nie zostawiać pelletu zbyt długo bez pokrycia przez bufor.
    11. Dodaj 400 μL lodowatego Ribosom Buffer C + DTT do każdej ultrawirówki zawierającej pellet rybosomalny.
    12. Inkubuj rurki na lodzie w zimnym pomieszczeniu, aby pellet rybosomu nasiąkł w Ribosom Buffer C + DTT przez całą noc.
      UWAGA: Upewnij się, że pellet rybosomu jest całkowicie zanurzony w Buforze Rybosomowym C + DTT. Można to osiągnąć, umieszczając rury pod kątem w lodzie.
  5. Dzień 5: odbiór
    1. Następnego dnia delikatnie zawiesz osad rybosomu za pomocą pipety o pojemności 1 mL i delikatnie mieszając ją, aby całkowicie rozpuścić przezroczysty osad rybosomu halo.
      UWAGA: Pellet rybosomu powinien całkowicie rozpuścić się w buforze na tym etapie: nie powinno być w tym momencie nierozpuszczalnego pelletu, ale jeśli żółty nierozpuszczalny pellet pozostaje, nie próbuj go ponownie zawiesować: jedynie zawiesijny przezroczysty pellet rybosomu halo.
    2. Przelej roztwór rybosomu do dwóch sterylnych rurek mikrowirówek o pojemności 2 mL i wiruj w dawce 20 000 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C, aby rozpuścić pozostałe materiały nierozpuszczalne.
    3. Zbierz supernatant bez granulek do czystej probówki i przechowuj na lodzie (Rysunek 3I).
    4. Stwórz 100-krotne rozcieńczenie roztworu rybosomowego, dodając 2 μL do 198 μL Buforu Rybosomu C, w potrójnych egzemplarzach.
    5. Zmierz stężenie RNA na 260 nm; 10 jednostek absorpcji rozcieńczonej próbki odpowiada 24 μM rybosomów13.
    6. Roztwory rybosomów aliquot (np. w alikwotach 50 μL, w zależności od potrzeb użytkownika), zamrożenie w ciekłym azocie w maksymalnym stężeniu 24 μM i przechowywanie w temperaturze -80 °C do momentu użycia.
      UWAGA: Protokół powinien prowadzić do około 1 mL rybosomów przy stężeniu 12-18 μM. Jeśli rybosomy są zbyt rozcieńczone, stężenie można osiągnąć za pomocą filtra MWCO8 o mocy 3 kDa.

4. Tworzenie eksperymentów CFPS

  1. Prace wstępne
    1. Przygotuj szablon DNA (liniowy lub plazmidowy) zgodnie z ustalonymi protokołami9.
      UWAGA: W naszym laboratorium używamy szablonów DNA opartych na systemie ekspresji T7p14, zoptymalizowanym pod kątem ekspresji wolnej od komórek14. Produkty PCR oczyszczone mogą być używane jako szablony liniowe. Ważne jest, aby pamiętać, że plazmidy muszą być oczyszczane po miniprepie, a różne komercyjne zestawy dają różne wyniki15.
    2. Przygotuj roztwór energetyczny 5x, jak opisano w Tabeli 3.
    3. Przygotuj rozwiązanie macierzy 6x, jak opisano w Tabeli 4.
  2. Ustawianie i monitorowanie reakcji PURE
    UWAGA: Protokół ten opisuje konfigurację potrójnego pomiaru przy użyciu miksu głównego. Liczbę reakcji można skalować lub zmniejszać w zależności od potrzeb, korzystając z arkusza kalkulacyjnego podanego w Tabeli Uzupełniającej S3, ale zalecamy minimum potrójnych powtórzeń dla jednego warunku eksperymentalnego.
    1. Rozmrażenie wymagało aliquotów PURE, rybosomów, roztworu energetycznego i roztworu macierzowego na lodzie.
    2. Przygotuj mieszankę główną do pojedynczego zestawu potrójnych reakcji w probówce PCR, o łącznej pojemności 17 μL, jak pokazano w Tabeli 5, składając składniki w następującej kolejności: roztwór energetyczny, białka PURE, rybosomy, roztwór matrycy, woda wolna od nukleazy do 17 μL.
    3. Ustaw pipetę na 5,1 μL i delikatnie zasysaj roztwór 5-6 razy, aby wymieszać, zapewniając jednorodność.
    4. Stosując to samo ustawienie pipety (5,1 μL), załaduj mieszankę główną do trzech indywidualnych otworów na optycznej płycie 384-dołkowej. Unikaj przepychania pipety poza pierwszy ogranicznik, aby zapobiec powstawaniu pęcherzyków. Zostaw jedną jamkę między każdym replikacją, aby zminimalizować przesłuchy fluorescencji.
    5. Uszczelnij płytkę za pomocą uszczelki z lepką do płyty.
    6. W razie potrzeby należy kontynuować inkubację lub pomiary czytnika płyt.
      UWAGA: Przy dodawaniu dodatkowych składników zawierających glicerol (np. białka wzmacniające) należy upewnić się, że końcowa objętość tych składników nie przekracza 10% objętości reakcji. Na przykład składnik zawierający 30% glicerolu powinien być ograniczony do 1,7 μL na mieszankę główną 17 μL.
      Nie wiruj płyty 384-dołkowej po załadunku. Wirowanie może powodować rozdzielenie składników bogatych w glicerol (np. układu PURE), co skutkuje nieregularnym poziomem ekspresji. Konstrukcja płyt umożliwia reakcje o małych objętościach, a staranne pipetowanie zapewnia odpowiednie osiadanie bez wirowania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Przepływ pracy dla PURE i preparatów rybosomowych przedstawiono na Rysunku 1, a zalecany harmonogram pracy w Tabeli 1. Zazwyczaj reakcje monitoruje się poprzez produkcję białek fluorescencjących, takich jak GFP czy mCherry, a odczyty RFU można przeliczyć na stężenia za pomocą kalibracji11. Jednak wydajność CFPS zależy od konkretnego produkowanego białka, dlatego ważne jest zoptymalizowanie systemu, aby wyprodukować poż...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Przedstawiliśmy szczegółową procedurę, która pozwoliła nam uzyskać powtarzalne systemy PURE w wielu partiach i z użytkowników w tym samym laboratorium. Do osiągnięcia tego celu potrzebnych jest szereg kluczowych kroków.

Pierwszym ważnym krokiem jest zapewnienie integralności 36 szczepów PURE: oprócz sekwencjonowania wszystkich plazmidów, konieczne jest przeprowadzenie badania ekspresyjnego, aby potwierdzić, że wszystkie szczepy mają prawidłową nadekspresję, ponieważ utrata jednego szczepu może...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

SL jest współzałożycielem i CTO firmy Biophoundry Inc., która rozwija technologię wolnokomórkową dla inżynierii fagów.

Podziękowania

NL, SL, AB i NZ są wspierane przez stypendium UKRI Future Leaders Fellowship (MR/V027107/1) NL. SL jest dodatkowo wspierane przez Biophoundry Inc. SY jest wspierane przez stypendium doktoranckie Darwin Trust z Uniwersytetu Edynburskiego. CW jest wspierany przez stypendium doktoranckie BBSRC Eastbio. Autorzy dziękują A. Pompa za pomoc w użyciu ultrawirówki, która została wsparta finansowo z Wellcome Discovery Research Platform for Hidden Cell Biology [226791]. Dodatkowo dziękujemy B. Lavickovej i S. J. Maerkl za pomoc w uruchomieniu oryginalnego protokołu OnePot. W celu otwartego dostępu autor zastosował licencję Creative Commons Attribution (CC BY) do każdej wersji rękopisu zaakceptowanego przez autora wynikającej z tego zgłoszenia. Rysunek 1 został częściowo stworzony w BioRender. Laohakunakorn, N. (2025) [https://BioRender.com/wj65i81].

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
2x YTSigmaY2377-250G
AminokwasySigmaLAA21-1KT
Wolny od octana amonu RNAseThermo ScientificAM9070G
Chlorek amonuSigma09718-1KG
AmpicylinySigmaA8351-5G
BL21(DE3) kompetentny E. coliNEBC2527H
Butelka, wirówka (Nalgene)Thermo Scientific3120-9500Butelka z polipropylenowym kopolimerem
butelka, szklana (Duran) 250 mL, 500 mL, 1 L, 2 LVWR215-1593, 215-1594, 215-1595, 215-1596
Test Bradforda, Quick Start 1x Dye ReagentBio-Rad5000205
wirówkaThermo ScientificHeraeus Megafuge 16R
Wirówka, mikroEppendorf5424R 
Kolumna chromatograficznaBio-Rad7321010
Fosforan kreatynySigma27920
Cuwettes, półmikro 1,6 mLFisherbrandFB55147
Di-sodowy ortofofosforanFisher ChemicalS/4450/60
Kaseta dializowa, Slide-A-Lyzer G3, 2 kDa MWCO, 15 mLThermo ScientificA52962
Dwutasowy ortofosforan bezwodnyFisher ChemicalP/5240/60
DTT bez ważeniaThermo ScientificA39255
jednostka filtra, odśrodkowa 3kDa MWCO Amicon Ultra 15EMD MilliporeUFC900324
Kolba, 500 mLVWR214-1133
flaska, przepusta 2,5 L TunairSS-5013
Kwas folinowySigmaF7878-100MG
glicerolSigmaG5516-1L
HclFisherbrandH/1200/PB17
Bufor HEPES, 1 M roztworu pH 7,3Thermo ScientificBP299
ImidazolSigmaI2399-500G
inkubatorEppendorfNew Brunswick Innova® 42
IPTGThermo ScientificR0392
Śruty KOHThermo ScientificP1767-500G
L-kwas glutaminowy, hemimagnesium soleny tetrahydratSigma49605-250G
Kwas L-glutaminowy, sól monopotasa monohydratSigma49601-500G
Tetrahydrat octana magnezuSigmaM5661-50G
Chlorek magnezuFluka63020-1L
Układ mieszania magnetycznegoStuartUS152
NanodropThermo ScientificNanodrop 2000
NEBExpress Ni-NTA Mag BeadsNEBS1423S
ParafilmSigmaP7543-1EA
pipeta, wielokanałowy Eppendorf Research Plus 30-300 & mikro; LEppendorf3125000052
Uszczelka do czytnika płytekExcelScientificSTR-SEAL-PLT (Sterylny)
Płyta uszczelniająca do przepuszczaniaStarlabE2796-3005
Uszczelka foliowa płytowaExcelScientificFCS-25
czytnik tablicBioTekSynergia H1
Shaker płytAllshengMBI100-4A
Płyta, studnia 384Thermo Scientific242764
płytka, 96 głęboka studnia 1 mLThermo Scientific736-0601
płytka, 96 głęboki odwiert, 2 mLSarstedt82.1972.002
płytka, 96-dołkowy PCRSarstedt721,978
płytka, optyczna jamka 96Thermo Scientific10057581
Chlorek potasuSigmaP5405-500G
Orthofosforan diwodoru potasuFisher ChemicalP/4800/53
Odczynnik z ekstrakcją białek (BugBuster)EMD Millipore70584-3
Żywica oczyszczająca białka (cOmplete)Roche5893682001
Shaker do rożnaStarlabRM-Multi 1
chlorek soduFisher ChemicalS/3105/70
Sonda sonifikacji, FisherBrand 15-50 mLThermo Scientific12931181
SonifikacjiFisher ScientificFB120
SpektrofotometrJenwayGenova Plus
spermidynaSigmaS2626-1G
TCEP 0,5 MSupelco646547
NTP Thermo Fisher, buforowany TrisThermo ScientificR1481
tRNA z E. coli MRE600Roche10109541001
tryptonFormediumTRP02
lampa, 0,2 mL klasy PCRSarstedt72,737,002
rurka, błyskawica Sterilin 7 mL polistyrenThermo Scientific129A
lampa, stożkowa (Falcon) 15 mLSarstedt62.554.502
lampa, stożkowa (Falcon) 50 mLSarstedt62.547.254
rurka, mikrowirówka (Eppendorf) 1,5 mLSarstedt72.690.001
rurka, mikrowirówka (Eppendorf) 2 mLSarstedt72.695.700
rurka, wirowanie S100 Beckman-Coulter355619
rurka, wirowanie S30 Thermo Scientific3118-0050
UltracentrifugaBeckman-CoulterOptima XPN-100
Wirnik ultrawirówkiBeckman-CoulterWirnik o stałym kącie 70Ti
Woda destylowana wolna od ultraczystej DNazy/RNazyThermo Scientific10977049
vortexerVWR444-2791
Ekstrakt drożdżowyOksoidLP0021T

Bibliografia

  1. Laohakunakorn, N., et al. Bottom-up construction of complex biomolecular systems with cell-free synthetic biology. Front Bioeng Biotechnol. 8 (213), 1-26 (2020).
  2. Silverman, A. D., Karim, A. S., Jewett, M. C. Cell-free gene expression: an expanded repertoire of applications. Nat Rev Genet. 21 (3), 151-170 (2019).
  3. Shimizu, Y., et al. Cell-free translation reconstituted with purified components. Nat Biotechnol. 19 (8), 751-755 (2001).
  4. Shimizu, Y., Ueda, T. Pure technology. Methods Mol Biol. 607, 11-21 (2010).
  5. Wang, H. H., et al. Multiplexed in vivo His-tagging of enzyme pathways for in vitro single-pot multienzyme catalysis. ACS Synth Biol. 1 (2), 43-52 (2012).
  6. Shepherd, T. R., et al. De novo design and synthesis of a 30-cistron translation-factor module. Nucleic Acids Res. 45 (18), 10895-10905 (2017).
  7. Villarreal, F., et al. Synthetic microbial consortia enable rapid assembly of pure translation machinery. Nat Chem Biol. 14 (1), 29-35 (2018).
  8. Lavickova, B., Maerkl, S. J. A simple, robust, and low-cost method to produce the PURE cell-free system. ACS Synth Biol. 8 (2), 455-462 (2019).
  9. Grasemann, L., Lavickova, B., Elizondo, C. OnePot PURE cell-free system. J Vis Exp. (172), e62625(2021).
  10. Zhang, Y., et al. Optimizing protein expression in the One-Pot PURE system: insights into reaction composition and translation efficiency. ACS Synth Biol. 14 (5), 1496-1508 (2025).
  11. Yadav, S., Perkins, A. J. P., Liyanagedera, S. B. W., Bougas, A., Laohakunakorn, N. ATP regeneration from pyruvate in the PURE system. ACS Synth Biol. 14 (1), 247-256 (2025).
  12. Doerr, A., et al. Modelling cell-free RNA and protein synthesis with minimal systems. Phys Biol. 16 (2), 025001(2019).
  13. Christodoulou, J., et al. Heteronuclear NMR investigations of dynamic regions of intact Escherichia coli ribosomes. PNAS. 101 (30), 10949-10954 (2004).
  14. Garenne, D., Thompson, S., Brisson, A., Khakimzhan, A., Noireaux, V. The all-E coli TXTL toolbox 3.0: new capabilities of a cell-free synthetic biology platform. Synth Biol. 6 (1), 1-8 (2021).
  15. Romantseva, E., Alperovich, N., Ross, D., Lund, S. P., Strychalski, E. A. Effects of DNA template preparation on variability in cell-free protein production. Synth Biol. 7 (1), 1-17 (2022).
  16. Thornton, E. L., Boyle, J. T., Laohakunakorn, N., Regan, L. Cell-free protein synthesis as a method to rapidly screen machine learning-generated protease variants. ACS Synth Biol. 14 (5), 1710-1718 (2025).
  17. Laohakunakorn, N. Cell-free 3PGA energy solution. , Protocols.io. (2020).
  18. Kalpaxis, D. L., Theocharis, D. A., Coutsogeorgopoulos, C. Kinetic studies on ribosomal peptidyltransferase: the behaviour of the inhibitor blasticidin S. Eur J Biochem. 154 (2), 267-271 (1986).
  19. Blaha, G., et al. Preparation of functional ribosomal complexes and effect of buffer conditions on tRNA positions observed by cryoelectron microscopy. Methods Enzymol. 317, 292-309 (2000).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

System PUREprzygotowanie rybosomówbiologia syntetycznaultrawirowaniefluorescencja GFPnormalizacja gęstości optycznejstężenie gliceroluekspresja białek
Udoskonalenie OnePot PURE oraz surowej produkcji rybosomów dla powtarzalnej syntezy białek wolnych od komórek
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.